Les phosphoantigènes (P-Ag) de P. falciparum (P.f.) induisent une forte activation et une expansion des lymphocytes T (LT) Vγ9Vδ2 par un mécanisme encore mal décrit. Les LT Vγ9Vδ2 actives inhibent le cycle sanguin de P. f. par des médiateurs cytotoxiques solubles, inhibant ainsi la capacité invasive des mérozoites. Il a été montre in vitro que des LT Vγ9Vδ2 activés par les P-Ag peuvent présenter des antigènes et activer les LT αβ, agissant ainsi comme des cellules présentatrices d’antigènes (APC). Cette fonction n’a cependant pas été démontrée dans un contexte physiopathologique. Le but de ce projet est i) d’étudier les mécanismes d’activation des LT Vγ9Vδ2 par les stades sanguins P. f. et ii) d’evaluer le potentiel APC des LT Vγ9Vδ2 stimules par P. f. Nous montrons que l’activation des LT Vγ9Vδ2 par des globules rouges parasites par P. f. (GRP) intacts ne dépend ni d’un contact cellulaire, ni de l’expression de butyrophiline par le GRP. Les LT Vγ9Vδ2 sont activés par des molécules contenues dans les surnageants de culture de GRP, ayant les caractéristiques de P-Ags et étant libérées lors de la rupture des GRP. In vitro, les LT Vγ9Vδ2 stimules par les GRP expriment des marqueurs de surface associés à un rôle d’APC et cross-présentent un antigène modèle à une lignée T CD8 spécifique. In vivo, nous montrons une expression augmentée des marqueurs APC à la surface de LT Vγ9Vδ2 de patients infectés par P. falciparum. L’ensemble de ces données suggèrent que les P-Ag libérés par les GRP dans le milieu extracellulaire pourraient activer les LT Vγ9Vδ2 à distance, et ouvrent de nouvelles perspectives quant au rôle des LT Vγ9Vδ2 dans la réponse immunitaire adaptative anti-palustre. / P. falciparum derived phosphoantigens (P‐Ag) induce potent activation and expansion of Vγ9Vδ2 T-cells by a poorly described mechanism. Activated Vγ9Vδ2 T cells inhibit the Plasmodium falciparum blood cycle through soluble cytotoxic mediators, abrogating merozoite invasion capacity. In vitro, P-Ag activated Vγ9Vδ2 T lymphocytes have been shown to present antigens and induce αβ T lymphocyte responses, i.e. to act as an antigen presenting cell (APC). Whether this activity can be involved in a pathophysiological context is unknown. The aim of this PhD project is to a) investigate the mechanisms of Vγ9Vδ2 T cell activation by blood stage P. falciparum and b) assess the potential of P. falciparum activated Vγ9Vδ2 T cells to display APC functionality. We show that Vγ9Vδ2 T-cell activation by intact iRBCs is independent of iRBC contact and butyrophilin expression. Blood stage culture supernatants can potently activate Vγ9Vδ2 T-cells and bioactivity is found to be attributable to P-Ags released at the time of parasite egress from the RBC. In vitro iRBC stimulated Vγ9Vδ2 T cells up-regulate surface expression of APC associated markers and can cross-present a model antigen to specific CD8 T cell responders. In vivo we demonstrate an increase in surface expression of APC makers on Vγ9Vδ2 T cells from P. falciparum infected patients.Altogether, these data outline a framework whereby P‐Ag release by iRBC into extracellular milieu can promote activation of distant Vγ9Vδ2 T cells, and opens the door to a new aspect of Vγ9Vδ2 T cell contribution to P. falciparum adaptive immune responses.

Résumé : Le carcinome hépatocellulaire (HCC) est la troisième cause commune de décès de cancer et affecte plus les hommes que les femmes. Le HCC résulte d’une dérégulation des voies de signalisation impliquées dans l’initiation de l’inflammation menant ainsi à des répercussions désastreuses. De part la complexité de ce type de cancer, les traitements qui existent à ce jour ne sont pas très prometteurs et ont un faible pourcentage de « rémission ». L’immunothérapie soulève beaucoup d’espoir quant à l’orientation vers un traitement efficace plausible. En effet, plusieurs suppresseurs de tumeur se retrouvent réprimés, parmi lesquels le SOCS1. C’est dans cette optique que nos recherches se sont orientées en mettant la lumière sur le SOCS1 «suppresseur de signalisation des cytokines 1 (SOCS1) » qui est réprimé au niveau du HCC et dont la restauration pourrait contribuer à un pronostic favorable à la rémission. La protéine SOCS1 a beaucoup attisé la curiosité des chercheurs de part son rôle suppresseur de tumeur. Pour comprendre les mécanismes d’action de SOCS1 et son implication dans la neutralisation de la tumeur, nous avons généré trois types stables de la lignée cellulaire du carcinome hépatocellulaire de souris Hepa1-6, une portant un vecteur vide, l’autre exprimant le type sauvage du gène SOCS1 (SOCS1-WT; Hepa-S) et une portant une mutation au niveau du domaine SH2 (SOCS1-R105K; Hepa-R). Le mutant ne peut plus inhiber la signalisation des cytokines. Lors de l'implantation sous-cutanée des cellules Hepa1-6 modifiées, chez des souris C57BL/6 et NOD.scid.gamma (NSG). Nous avons observé que les cellules Hepa1-6 exprimant le vecteur de contrôle (Hepa-V) formaient de grosses tumeurs tandis que les cellules Hepa-S formaient de petites tumeurs chez les deux types de souris. Les cellules Hepa-R quant à elles, formaient de grosses tumeurs seulement chez des souris immunodéficientes (NSG) mais montraient une croissance nettement retardée lorsqu’elles étaient greffées aux souris (C57BL/6) immunocompétentes. Partant de ce constat intrigant, nous avons postulé que SOCS1 favorise l'immunogénicité des cellules tumorales par son domaine SOCS Box. Par conséquent, les cellules Hepa-R offrent une occasion unique de démêler le potentiel pro-immunogène de SOCS1, et ceci dans le but d'élucider les fonctions immunogènes de SOCS1 dans le cancer du foie. Jusqu'à présent aucune précédente recherche ne s’est aventurée à chercher l’implication de SOCS1 dans l’augmentation de l’immunogénicité. / Abstract : Hepatocellular carcinoma (HCC) is the third common cause of cancer deaths and affects men more than women. HCC results from a disregulation that affects many factors including inflammation, leading to disastrous repercusions. Due to the complexity of this type of cancer, existing treatments nowadays are not promising and have a low remission percentage. Immunotherapy raises great hope regarding the direction towards a plausible effective treatment. It is in this context that our research has focused on shedding light on the SOCS1 "signaling suppressor of cytokine 1 '(SOCS1)" which was found to be suppressed in HCC and whose restoration could contribute to a favorable prognosis. The SOCS1 many fueled the curiosity of researchers due to its suppressor role in tumor. To understand the underlying mechanisms, we generated three types of stable mice cell line hepatocellular carcinoma Hepa1-6, one carrying an empty vector, the other expressing the wild-type gene SOCS1 (SOCS1-WT; hepatic S) and carrying a mutation in the SH2 domain (SOCS1-R105K; Hepa-R). These mutants cannot inhibit JAK-STAT cytokine signaling. Upon subcutaneous implantation of the modified Hepa1-6 cells in C57BL/ 6 and NOD.scid.gamma (NSG) mice, the Hepa1-6 cells expressing the control (Hepa-V) formed large tumors while the Hepa-S cells formed small tumors in both types of mice. Hepa-R cells in turn, formed large tumors only in immunodeficient mice (NSG), but showed a markedly delayed growth when transplanted into (C57BL / 6) immunocompetent mice. Based on this intriguing finding, we speculate that SOCS1 could promote immunogenicity of tumor cells, which was masked by the ability of SOCS1 to inhibit signaling of growth factors. Therefore, Hepa-R cells provide a unique opportunity to unravel the pro-immunogenic potential of SOCS1, and this in order to elucidate the immunogenic functions of SOCS1 in liver cancer. So far no previous research studied the potentiel of SOCS1 in increasing immunogenicity.

Chez les mammifères, les lymphocytes T CD4 sont essentiels à la défense de l’organisme contre des infections par des pathogènes ou le développement de tumeurs. Après activation, les lymphocytes T CD4 naïfs ont la capacité de se différencier en divers lymphocytes T helper (Th1, Th2, Th17…) en fonction des signaux reçus. Le choix du lignage permet d’adapter le phénotype et la fonction des cellules au type de danger détecté. Le processus de différenciation des lymphocytes T helper implique l’établissement de programmes d’expression des gènes distincts. La dynamique et la stabilité de ces programmes sont notamment régulées par l’activité d’éléments cis-régulateurs. Le but de ma thèse était de comprendre les mécanismes épigénétiques qui contrôlent la programmation des lymphocytes T CD4. Dans cet objectif, nous avons étudié le rôle de la H3K9 méthyl-transférase SETDB1 dans la différenciation des lymphocytes T CD4 en Th1 et Th2, deux lignages T helper fortement antagonistes. Nous avons découvert que SETDB1 réprime de manière critique le programme d’expression des gènes Th1. En effet, en l’absence d’expression de Setdb1, la différenciation Th1 est exacerbée. De plus, lorsqu’elles sont exposées à un signal pro-Th1, les cellules Th2 franchissent les barrières de lignage et se transdifférencient en Th1. De manière surprenante, SETDB1 ne cible pas directement les enhancers Th1. Au contraire, l’enzyme dépose de manière type cellulaire spécifique la marque répressive H3K9me3 au niveau d’un set restreint de rétrovirus endogènes (ERVs). Des analyses bio-informatiques ont indiqué que les rétrotransposons ciblés sont fortement associés à des gènes impliqués dans les processus immunitaires. La suite de ces analyses a indiqué que ces ERVs flanquent et répriment l’activité d’éléments cis-régulateurs des gènes Th1, ou agissent eux même comme des enhancers du lignage. En conclusion, la déposition de H3K9me3 par SETDB1 garantit l’intégrité des lymphocytes T helper en réprimant un panel d’ERVs qui ont été exaptés en modules cis-régulateurs pour façonner et contrôler le réseau de gènes Th1. / CD4 T lymphocytes play a central role in the defense of mammal organisms against infections by pathogens and the development of tumors. Upon activation, naïve CD4 T cells differentiate into distinct helper cell subsets depending on environmental cues. T helper cells are key players of the immune system as they finely orchestrate immune responses in a danger-adapted manner. The process of T helper differentiation relies on the establishment of complex and lineage-specific gene expression programs. The dynamics and stability of these programs are regulated at the chromatin level through epigenetic control of cis-regulatory elements. My thesis objective was to investigate the epigenetic pathways involved in the regulation of enhancer activity in CD4 T cells. In this purpose, we studied the role of the H3K9 specific methyltransferase SETDB1 in the differentiation of Th1 and Th2 cells, which are strongly antagonistic. We report that SETDB1 critically represses the Th1 gene expression program. Indeed, Setdb1-deficient naïve T cells show exacerbated Th1 priming. Moreover, when exposed to a Th1-instructive signal, SETDB1-deficient Th2 cells cross lineage boundaries and transdifferentiate into Th1 cells. Surprisingly, SETDB1 does not directly target Th1 enhancers to heterochromatin. Instead, SETDB1 deposits the repressive H3K9me3 mark at a restricted and cell type specific set of endogenous retroviruses, strongly associated with genes involved in immune processes. Further bioinformatic analyses indicated that these retrotransposons flank and repress Th1 gene cis-regulatory elements or behave themselves as Th1 gene enhancers. Thus, H3K9me3 deposition by SETDB1 ensures T cell lineage integrity by repressing a repertoire of ERVs that have been exapted into cis-regulatory modules to shape and control the Th1 gene network.

L’équipe a identifié une nouvelle GAP de RhoA, ARHGAP19, majoritairement exprimée dans le système hématopoïétique. Le projet a consisté à étudier la régulation de cette protéine dans des lymphocytes T humains. Pour cela, les analyses se sont portées sur la phosphorylation d’ARHGAP19 et sur sa localisation au cours de la division des lymphocytes T. ARHGAP19 est phosphorylée par l’effecteur de RhoA, la protéine kinase ROCK, sur la Sérine 422 et par la protéine kinase mitotique CDK1 sur les Thréonines 404 et 476. La phosphorylation par ROCK permet à ARHGAP19 d’interagir avec la famille de protéines 14-3-3 qui la protège des déphosphorylations pouvant avoir lieu au cours de la division cellulaire. L'ensemble des phosphorylations est primordial pour la régulation de la localisation cellulaire d'ARHGAP19 et contribue à une division cellulaire correcte. En effet, en absence de phosphorylation, on observe des défauts lors de la cytodiérèse entrainant la formation de cellules multinucléées. De plus, des dérégulations de RhoGTPases comme l’absence de GAP, sont aujourd’hui mises en évidence dans les cancers. C’est pourquoi nous avons généré des souris arhgap19 KO pour étudier les conséquences de l’absence du gène codant pour ARHGAP19, dans le système hématopoïétique murin. L’ensemble des cellules progénitrices et matures intervenant dans l’hématopoïèse murine a été analysé. Par ce modèle d’invalidation conditionnelle d’arhgap19, aucun rôle majeur de la protéine n'a été mis en évidence mais les résultats suggèrent une implication aux différents stades de la différenciation hématopoïétique et un impact sur l'ensemble des populations de ce système. / The team identified a new GAP of RhoA, ARHGAP19, mostly expressed in the hematopoietic system. The project consisted in studying the regulation of this protein in human T lymphocytes. For this, the analyzes focused on the phosphorylation of ARHGAP19 and on its localization during the division of the T lymphocytes. ARHGAP19 is phosphorylated by the effector of RhoA, the protein kinase ROCK, on the Serine 422 and by the protein CDK1 mitotic kinase on Threonines 404 and 476. ROCK phosphorylation allows ARHGAP19 to interact with the 14-3-3 family of proteins that protects it from dephosphorylation that occur during cell division. All phosphorylations are essential for regulating the cellular localization of ARHGAP19 and contribute to correct cell division. Indeed, in the absence of phosphorylation, defects are observed during cytodiérèse resulting in the formation of multinucleate cells. In addition, deregulation of RhoGTPases, such as the absence of GAP, are now highlighted in cancers. This is why we generated arhgap19 KO mice to study the consequences of the absence of the gene coding for ARHGAP19, in the murine hematopoietic system. All progenitor and mature cells involved in murine hematopoiesis were analyzed. By this model of conditional invalidation of arhgap19, no major role of the protein has been demonstrated but the results suggest an involvement at different stages of hematopoietic differentiation and an impact on all populations of this system.

Les lymphocytes T CD4 naïfs sont des cellules plastiques, capables de moduler finement leur programmation selon les signaux environnementaux qu'ils intègrent. Ils adaptent ainsi leur phénotype et leur fonction au type de danger Lors d'une infection par un agent pathogène intracellulaire par exemple, ils acquièrent un phénotype Th1 sous l'influence de médiateurs solubles tels que l'IL-12 et l' IFN-γ. Ces signaux mobilisent un set restreint de facteurs de transcription, coordonné par Tbet, qui programment la cellule afin qu'elle induise l'élimination du danger par des mécanismes impliquant une production massive d'IFN-γ. En réponse à des allergènes ou à des parasites extracellulaires, les lymphocytes T peuvent aussi acquérir un phénotype Th2, caractérisé par l'expression du facteur de transcription Gata-3 et par la production d'IL-4, d'IL-5 et d'IL-13. Afin de garantir la stabilité des lignages, ces processus de différenciation peuvent s'accompagner d'une perte de potentialité. Contrairement aux cellules T naïves, les cellules Th1 sont par exemple incapables d'allumer le programme d'expression génique Th2 en présence d'IL-4, et les lymphocytes Th2 verrouillent le programme Th1. Si nous savons aujourd'hui que l'acquisition des fonctions effectrices, comme l'équilibre entre détermination cellulaire et plasticité, sont régulés par des mécanismes épigénétiques, la plupart des acteurs moléculaires qui contrôlent la programmation des lymphocytes T au niveau de la chromatine reste encore à identifier. Durant ma thèse, j'ai étudié le rôle de la lysine méthyltransférase SETDB1, qui catalyse la di- ou tri-méthylation de la lysine 9 de l'histone 3 (H3K9me3), dans la différenciation des lymphocytes T CD4. Il avait déjà été proposé qu'H3K9me3 ait un impact sur la programmation de ces cellules en réponse aux signaux de l'environnement, mais personne n'avait encore étudié le rôle de SETDB1 dans ces processus lorsque j'ai commencé ma thèse. A l'aide d'une lignée murine déficiente pour SETDB1 spécifiquement dans les lymphocytes T, nous avons montré in vitro et in vivo que la balance Th1/Th2 est fortement augmentée en l'absence de l'enzyme, et que cette dérégulation résulte d'une perte de répression du réseau génique Th1. [...] / Upon activation, naïve CD4 T cells differentiate into distinct helper or regulatory T cell subsets depending on environmental signals received. This process relies on complex and lineage-specific gene expression programs whose dynamics and stability are regulated at the level of the chromatin. The epigenetic pathways involved, however, remain largely unknown. Here, we report that the histone methyltransferase SETDB1 critically controls the Th1 gene expression program. SETDB1-deficient naïve CD4 T cells show exacerbated Th1 priming, and when exposed to a Th1-instructive signal, SETDB1-deficient Th2 cells cross lineage boundaries and transdifferentiate into Th1 cells. Surprisingly, SETDB1 does not appear to control Th1 gene promoter activity. Instead, it deposits the repressive H3K9me3 mark at a restricted and cell-type specific set of endogenous retroviruses (ERVs) strongly associated with genes involved in immune processes. Refined bioinformatic analyses indicated that these retrotransposons either flank and repress Th1 gene cis-regulatory elements or behave themselves as Th1 gene enhancers. In conclusion, H3K9me3 deposition by SETDB1 ensures T cell lineage integrity by repressing a repertoire of ERVs that have been exapted into cis-regulatory modules to shape and control the Th1 gene network.

A key step in the development of an adaptive immune response is the activation of naive T cells by dendritic cells (DCs). DCs sample antigens in the periphery and migrate to the lymphoid organs were they provide different signals to T cells: they present antigenic peptides in the context of MHC molecules, express costimulatory or coinhibitory ligands and produce cytokines that influence T cell fate. The integration of these signals will either induce tolerance or lead to the activation and expansion of effector T cells which will mediate the immune response.<p>The costimulatory CD70/CD27 pathway plays important roles in the development of pro-inflammatory Th1 and CTL responses. CD70 expression on DCs has also been described as a molecular switch from tolerance to immunity. Accordingly, its activity is tightly regulated in vivo. The aim of this work was to investigate the mechanisms controlling the expression of CD70 on dendritic cells and CD27 on T lymphocytes.<p>First, we described a cell-extrinsic mechanism of inhibition exerted on DCs by regulatory T cells (Tregs). Indeed, Tregs controlled Th1 priming in vivo and in vitro by downregulating CD70 on DCs. This control involved a transfer of the CD27 receptor to DCs, possibly via the production of CD27-bearing microvesicles by T cells at the immunological synapse. Acquisition of CD27 by DCs induced the internalization of both CD27 and CD70 and probably their lysosomal degradation. As a consequence, DCs were impaired in their ability to efficiently prime Th1 cells. Second, we analyzed CD70 and CD27 expression in the periphery and provided evidence for a cell-intrinsic control of CD27 expression by ectodomain shedding in the gastrointestinal tract.<p>While they efficiently clear infections, inflammatory responses can also be deleterious to the organism. By restraining CD70 expression on DCs, Tregs would promote tolerance and limit inflammation. Interestingly, tolerance is particularly important in the intestines, which are in constant contact with dietary antigens and the commensal microbiota. Accordingly, we propose that a second layer of control of CD27-driven costimulation takes place in the gut :by shedding CD27, T cells would be desensitized for any potential CD70-dependent costimulation.<p>To further investigate the physiological significance of the mechanisms described above, the immune response will be monitored in animals specifically lacking CD27 expression in the Treg population or expressing a nonsheddable CD27 receptor.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs), tels que le benzo(a)pyrène (B[a]P), sont des contaminants environnementaux ubiquistes générés lors de la combustion de matière organique. Ces composés ont été associés au développement d'effets toxiques sur la santé humaine, notamment des effets cancérigènes et immunotoxiques, principalement liés à l'activation du récepteur aux hydrocarbures aromatiques (RAh). Parmi les cellules du système immunitaire, les lymphocytes T apparaissent comme des cibles majeures des HAPs. Des résultats antérieurs, obtenus au laboratoire, ont montré que l'activation des lymphocytes T humains en culture primaire conduit à l’augmentation de l'expression et de la fonction du RAh, suggérant la capacité accrue de ces cellules à répondre à une exposition aux HAPs. Nos objectifs sont : (1) de déterminer les effets du B[a]P sur les profils d'expression génique dans les lymphocytes humains normaux en utilisant des approches à haut débit telle que l'analyse transcriptomique sur puce à ADN, (2) d’évaluer les effets génotoxiques et immunotoxiques du B[a]P en mesurant respectivement les dommages à l'ADN induits et leurs actions immunosuppressives et (3) d’analyser la modulation de ces effets en présence d'autres HAPs. Notre travail identifie les lymphocytes T humains normaux comme un bon modèle pour étudier les effets génotoxiques et immunotoxiques des HAPs, et pour prédire les problèmes de santé humaine liés à l’exposition à ces contaminants. Il permet également de mieux comprendre la régulation par les HAPs de la réponse immune et propose de nouveaux biomarqueurs potentiels de l'exposition à ces contaminants environnementaux. / Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), such as benzo(a)pyrene (B[a]P), are ubiquitous environmental contaminants generated during organic matter combustion. These compounds have been associated with the development of toxic effects on human health, including carcinogenic and immunotoxic effects, mainly related to Aryl hydrocarbon Receptor (AhR) activation. Among the immune system cells, T lymphocytes appear as major targets of PAHs. Previous results, obtained in the laboratory, have shown that activation of primary human T lymphocytes leads to a functional AhR expression increase, suggesting their ability to respond to PAH exposure. Our specific aims are: (1) to determine the effects of B[a]P on gene expression profiles in human normal lymphocytes by using large-scale approaches such as microarray-based transcriptome analysis, (2) to monitor the genotoxic and immunotoxic effects of B[a]P by measuring DNA damage and immunosuppressive actions, respectively and, (3) to analyze the modulation of these effects by the presence of other PAHs. Our work propose primary cultures of activated human T lymphocytes as a good model for studying both genotoxic and immunotoxic effects of environmental contaminants such as PAHs and predicting human health issues. It also gains a comprehensive insight into the immune response regulation after PAH exposure and provides potential new biomarkers of exposure to these environmental contaminants.

Les allergies aux produits chimiques et aux médicaments constituent un problème majeur de santé publique. L’objectif de ce travail est de mieux comprendre l’interaction entre les cellules dendritiques (DC) et les lymphocytes T (LT) dans les allergies induites par les haptènes métalliques (nickel et cobalt) et les médicaments [benzylpénicilline (BP)]. En présence des signaux de danger, les DC acquièrent un phénotype dit « mature » et présentent l’antigène apprêté aux LT spécifiques de cet antigène. Les LT représentent les cellules effectrices responsables d’une manière directe ou non des symptômes observés lors des réactions allergiques. Dans un premier temps, nous montrons que le nickel est capable d’induire un ratio d’interleukines (IL) IL-23/IL-12p70 élevé dans les DC favorisant ainsi la polarisation Th17 qui est détectée chez la majorité des patients allergiques au nickel. Nous montrons aussi pour la première fois une production de l’IL-27 par les DC activées par le nickel. Nous avons ensuite montré l’implication du TLR4 et de la voie Jak-STAT dans la régulation des cytokines membres de la famille de l’IL-12. L’activation de la voie Jak-STAT est nécessaire pour la réponse Th1 en favorisant la production de l’IL-12p70 et en inhibant la production de l’IL-23 par les DC activées par du nickel. Par ailleurs, nous avons identifié et, pour la première fois, une activation du facteur de transcription NFIL-3, au sein des DC, par le nickel et le cobalt voire d’une manière plus intense avec ce dernier. D’autre part, nous avons mis en évidence l’existence d’un répertoire de LT naïfs CD4+ et CD8+, provenant de la population générale, spécifiques du nickel. L’activation de ces LT requiert les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) et ils présentent un faible taux de réactivité croisée avec le cobalt. Simultanément, nous avons mis en évidence la possibilité de détecter des LT naïfs CD8+ spécifiques de la BP. L’activation de ces LT dépend des molécules du CMH de classe I et du protéasome. D’une manière générale, notre travail contribue à une meilleure compréhension des mécanismes des réactions allergiques d’une part, en montrant la fine régulation des cytokines membres de la famille de l’IL-12 dans les DC et d’autre part en élucidant les mécanismes de l’immunisation contre les molécules allergisantes. / Drug and chemical allergy is a major public health concern. The aim of this work is to understand the interaction between dendritic cells (DCs) and T-lymphocytes (LT) in allergic manifestations induced by metallic haptens (nickel and cobalt) and benzylpenicillin (BP). DCs capture the antigen, start maturation, migrate to the regional lymph node and activate hapten-specific T-cells. The latter will represent the effector cells responsible directly or not for the symptoms observed during allergic reactions. We showed that nickel induced a high ratio of interleukin (IL) IL-23 compared to IL-12p70 in DCs leading to Th17 polarization as seen in allergic patients. We also showed for the first time the production of IL-27 by nickel-activated DCs. Moreover, we showed the involvement of TLR4 and Jak-STAT pathways in IL-12 cytokine family regulation. The activation of the Jak-STAT pathway seems to maintain the IL-23/IL-12p70 balance by limiting IL-23 production and promoting Th1 polarization. Furthermore, we identified for the first time the activation of NFIL-3 in DC by nickel and cobalt, more intensely with the latter. In addition, nickel-recognizing CD4+ and CD8+ naïve T-cells repertoire was identified from the general population. These positive T-cells were shown to recognize nickel in the context of major histocompatibility complex (MHC) molecules. We also showed that a low frequency of nickel-recognizing CD4+ naïve T-cells cross-reacted with cobalt. Simultaneously, we showed the possibility of detecting a naïve CD8+ T-cells repertoire for BP. The activation of these specific T-cells requires MHC class I molecule and proteasome. In resume, our work contributes to a better understanding of allergic reactions, on one hand, by studying the fine regulation of the IL-12 cytokines family in DCs and on the other hand, by clarifying the mechanisms of immunization against drugs and chemicals.

Les allergies représentent un problème majeur dans le domaine des maladies professionnelles et ont un impact sérieux sur la vie des travailleurs. Les allergies professionnelles sont principalement cutanées et respiratoires ; elles peuvent être causées par des produits chimiques de bas poids moléculaire. Dans le passé, les tests destinés à identifier les produits susceptibles d’entraîner des allergies étaient réalisés sur l’animal. Or, la législation européenne engage à limiter le recours à l’expérimentation animale pour évaluer le pouvoir sensibilisant des substances chimiques, incitant à développer des tests in vitro de substitution. C’est dans ce contexte que nous avons cherché à développer des modèles de cultures cellulaires destinés à identifier les substances sensibilisantes. Un premier modèle utilisant des cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse (BMDC) de souris BALB/c a été développé et a donné des résultats prometteurs pour l’identification des produits sensibilisants et leur catégorisation selon leur puissance sensibilisante. De plus, la voie de signalisation Nrf2/Keap1 semble être impliquée dans la réponse de ce modèle cellulaire aux sensibilisants. Dans le but de compléter ce modèle et d’évaluer la capacité des BMDC à activer les lymphocytes T (LT), un modèle de coculture de BMDC et LT a été mis au point avec un sensibilisant de référence avant d’être testé sur un ensemble de produits de référence (sensibilisants cutanés et respiratoires, irritants et non sensibilisants). Les BMDC de notre modèle, exposées à des sensibilisants, se sont révélées capables d’activer les LT en coculture. Enfin, des essais préliminaires utilisant des cellules de souris de souche C57BL6/J dans notre modèle de coculture ont donné des résultats comparables à ceux obtenus avec des cellules issues de la souche BALB/c. Les modèles de cultures cellulaires BMDC et de coculture BMDC-LT sont prometteurs dans le cadre du développement de méthodes de substitution à l’expérimentation animale pour l’évaluation du pouvoir sensibilisant de substances chimiques / Allergies constitute an important issue in the field of occupational health and have a serious impact on the lives of workers. Occupational allergies are mainly contact and respiratory allergies and can be caused by low molecular weight chemicals. In the past, the tests that were used to identify the potential allergens were carried out on animals. However, European legislation has provided the impetus for reducing the use of animal testing to assess the sensitization potential of chemicals and promoted the development of alternative in vitro tests. In this context, we aimed to develop cell culture models to identify sensitizers. A first model using bone marrow derived dendritic cells (BMDC) from BALB/c mice was developed and showed promising results for identifying sensitizers and classify them according to their allergenic potency. Moreover, the Nrf2/Keap1 pathway seems to be involved in the response of this cell model to sensitizers. In order to supplement this model and to assess the functionality of BMDC, a BMDC-T cell (TC) coculture model was developed with a reference sensitizer before being tested on a range of reference sensitizers (cutaneous and respiratory sensitizers, irritants and non-sensitizers). The BMDC of our model, while exposed to sensitizers, were able to activate TC in coculture. Finally, preliminary tests using the cells of C57BL6/J mice in our coculture model showed that similar results to those obtained with cells from the BALB/c strain. The models of BMDC cultures and BMDC-TC coculture are promising for the development of alternative methods to animal experimentation assessing the sensitizing potential of chemicals

Le Saccharopolyspora rectivirgula (SR) est le principal agent responsable du Poumon du fermier, une forme d'alvéolite allergique extrinsèque. Des modèles expérimentaux ont permis de mieux comprendre cette maladie qui est caractérisée par une réponse immune exacerbée et une lymphocytose pulmonaire marquée. Des cofacteurs, tels l'infection virale, sont probablement nécessaires au développement de la maladie puisque la majorité des sujets exposés demeurent asymptomatiques. Par contre, les mécanismes expliquant le maintient de la tolérance à l'antigène chez ces individus ou le développement de la maladie chez les patients sont inconnus. L'objectif premier de ce projet de doctorat était donc d'examiner le rôle potentiel des cellules T régulatrices (Trég) dans le contrôle de la réponse immune dans l'alvéolite chez la souris et chez l'humain. Chez la souris, nos résultats démontrent que, des expositions répétées à une préparation antigénique de SR induisent des Trég capables de supprimer la prolifération de cellules T activées. Des données similaires ont été obtenues chez les sujets asymptomatiques ce qui pourrait expliquer la réponse tolérante retrouvée chez ces individus. Notre modèle murin démontre également qu'une infection virale altère cette tolérance à l'antigène. À la suite d'une infection au virus Sendai, les Trég ne peuvent inhiber la prolifération de cellules T activées et ne contrôlent plus l'inflammation causée par des expositions subséquentes au SR. Des Trég non-fonctionnelles sont également observées chez les patients. Au cours de nos recherches, nous avons remarqué que la stimulation de la réponse immune par un lysat de SR protège contre une infection mortelle au virus Sendai. Nous avons caractérisé cet effet antiviral et démontré qu'une seule instillation d'une préparation antigénique de SR (200 pg) administrée de 24 à 120 heures avant l'infection virale protège efficacement le système pulmonaire en diminuant le nombre de cellules inflammatoires. Cette protection est efficace pendant une semaine. Cette thèse a donc permis de constater que l'inhalation de SR, selon l'historique des expositions et des co-infections, peut soit induire l'alvéolite ou générée une protection efficace contre l'infection virale.