Les bactéries du genre Streptomyces produisent de nombreux métabolites secondaires, dont certains possèdent des propriétés intéressantes en agriculture et en pharmaceutique. Avec le développement de la génomique, de nombreux outils bioinformatiques de recherche de groupes de gènes du métabolisme secondaire ont été développés au cours de la dernière décennie pour explorer les génomes. Ces outils sont basés sur la recherche de similarité de séquences et de ce fait, les clusters atypiques, constitués de gènes non caractérisés, ne peuvent être détectés par ces approches. L'isolement de tels clusters nécessite donc la mise en œuvre de nouvelles stratégies. La comparaison d’espèces d'Actinomycetes proches a révélé que les îlots génomiques, régions présentes dans un seul génome, sont très souvent enrichis en gènes du métabolisme secondaire. Nous avons participé (en collaboration avec les équipes d’Olivier Lespinet et de Pierre Leblond et Bertrand Aigle) au développement d’un outil, Break Viewer, permettant de localiser les îlots génomiques en comparant des génomes proches de Streptomyces. Cet outil a permis l'identification d'un îlot non détecté par les approches classiques, îlot dont l'étude a montré qu'il contenait un groupe de gènes du métabolisme secondaire. L’étude de ce groupe de gènes a montré qu'il dirige la synthèse de trois composés, le produit majoritaire étant le sphydrofurane. Une analyse fonctionnelle du cluster sphydrofurane a permis de déterminer les gènes impliqués dans la biosynthèse et la régulation de la biosynthèse du sphydrofurane et de proposer un modèle préliminaire pour la biosynthèse de ce métabolite. / Streptomyces are soil-dwelling bacteria that produce numerous secondary metabolites, some of which have interesting properties in agriculture and pharmaceuticals. With the development of genomics, many bioinformatics tools to search genomes for secondary metabolism gene clusters have been developed over the last decade. These tools are based on sequence similarity searches and therefore atypical clusters, consisting of uncharacterized genes, cannot be detected by these approaches. The isolation of such atypical clusters therefore requires the implementation of new strategies.Comparing closely related Actinomycetes species revealed that genomic islands (regions that are present in one genome only), are often enriched in secondary metabolite genes. We participated (in collaboration with the team of Olivier Lespinet and the team of Pierre Leblond and Bertrand Aigle) to the development of a new tool, Break Viewer, to locate genomic islands by comparing the genomes of closely related Streptomyces. This tool allowed the identification of an island, undetected by conventional approaches, island whose study showed that it contained a secondary metabolism gene cluster. The study of this cluster has shown that it directs the synthesis of three compounds, the major product being sphydrofuran. A functional analysis of the sphydrofuran gene cluster allowed us to identify the genes involved in the biosynthesis and regulation of sphydrofuran and to propose a preliminary model for the biosynthesis of this metabolite.

Ma thèse comporte deux volets: d’une part, le développement de ligands ciblant les protéines antiapoptotiques et d’autre part, l’étude par RMN des protéines CGC impliquées dans la biosynthèse de la congocidine, métabolite secondaire chez Streptomyces.La famille de protéines Bcl-2 est impliquée dans un des processus clé de la mort cellulaire programmée, appelée l’apoptose mitochondriale. Elle se divise en membres anti-apoptotiques (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1) et pro-apoptotiques (Bak, Bax et les «BH3»).Ces molécules vont réguler l’apoptose en maintenant ou non l’intégrité de la membrane mitochondriale. En réponse à un signal de stress, les «BH3» neutralisent les antiapoptotiques et activent les pro-morts, leur permettant de former des pores sur la membrane mitochondriale. Ce phénomène aboutit au relargage du cytochrome c dans le cytosol et à l’activation de la cascade des caspases dont la finalité est la destruction de la celluleLa pertinence de l’étude des Bcl-2 s’observe de manière croissante depuis les années 1990. En effet, une surexpression des membres pro-survie de cette famille (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, BFL1 etc...) a été observée dans de nombreux cancers. Suite à ce constat, cibler ces molécules est devenue une piste prometteuse en cancérologie par le développement d’inhibiteurs des protéines pro-survie, l’objectif étant de restaurer l’apoptose dans les cellules tumorales.Dans cette perspective, différentes stratégies thérapeutiques ont été imaginées:(i) la thérapie génique avec l’Oblimersen, un ADN antisens développé par Genta, qui inhibe l’expression de la Bcl-2. Néanmoins, les résultats précliniques sont décevants.(ii) l’utilisation de peptides (ou peptidomimétiques) imitant les sentinelles «BH3» comme antagonistes de l’interaction Bcl-xL/Bak. Il faut souligner le concept des «stappled peptides», permettant la stabilisation des hélices par cyclisation des chaînes latérales. Si certaines de ces molécules synthétisées semblent très actives, aucune n’est encore en étude clinique.(iii) le développement de petites molécules non peptidiques, issues d’un criblage systématique in vitro ou in silico et se caractérisant par une grande variété structurale. Parmi ces molécules, certaines sont synthétiques comme l’ABT-737 et l’ABT-263 élaborés par les laboratoires Abbott, grâce à la méthode d’assemblage des fragments (fragment-based drug design) aidée par des études SAR by NMR (structure activity relationship). D’autres sont issues de produits naturels comme le (R)-Gossypol, le TW-37, la sanguinarine ou l’Obatoclax. En 2008, 11 composés étaient en phase préclinique ou clinique et les résultats pour certains d’entres eux semblaient plus prometteurs que pour l’Oblimersen.Ces stratégies ont permis de mettre au point un certain nombre de composés ciblant les protéines anti-apoptototiques. Si certains de ces composés sont actuellement en phase de tests cliniques, les plus prometteurs (ABT) ont démontré une efficacité uniquement vers certains des protéines anti-apoptotiques laissant place à un phénomène d’échappement des cellules cancéreuses.Un criblage réalisé à l’ICSN par l’équipe de F. Guéritte (Pôle Substances Naturelles Plantes) a permis d’identifier une nouvelle classe de molécules ayant une affinité de l’ordre du μM pour Bcl-xL. Parmi ces composés, deux présentent une attractivité d’un point de vue structural qui rend faisable leur synthèse chimique:(i) la meiogynine A, un sesquiterpène dimère de structure originale isolé des écorces de Meiogyne cylindrocarpa, une plante de Malaisie.(ii) le drimane, un sesquiterpène isolé en grandes quantités du genre zygogynum, une espècede Nouvelle-Calédonie.Ainsi, des collaborations ont été établies au sein de l’ICSN, réunissant diverses expertises (chimie, biologie, physicochimie et modélisation) afin de dégager les synergies souhaitables.Dans la perspective de la conception rationnelle d’analogues aux propriétés améliorées ciblant l’ensemble des membres anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, ma contribution est de choisir les cibles biologiques (Bcl-xL et Mcl-1), de les obtenir pures et marquées en isotopes stables afin de réaliser par RMN et modélisation moléculaire une étude structurale des complexes protéines/ligands et de définir un modèle d’interaction.Le deuxième volet de ma thèse, à dominante fondamentale, a pour objectif de caractériser par RMN les médiateurs enzymatiques d’une voie de biosynthèse d’un métabolite secondaire, la congocidine issue des bactéries Streptomyces Ambofaciens.La congocidine présente des propriétés antivirales et anticancéreuses de par sa capacité à se fixer à l’ADN. Cependant, du fait de sa forte toxicité, cette molécule ne peut pas être utilisée directement à des fins thérapeutiques.L’analyse des groupes de gènes impliqués dans la biosynthèse de la congocidine a mis en évidence 24 gènes. Seuls certains intermédiaires réactionnels ont été identifiés. Cependant, le rôle précis des produits de ces gènes n’est pas encore bien défini.Ainsi, en collaboration avec l’équipe de JL Pernodet à l’Université d’Orsay, nous nous sommes intéressés à deux enzymes en particulier intervenant dans la synthèse de la congocidine, les protéines CGC-10 et CGC-19.L’objectif de cette collaboration est d’utiliser la spectroscopie RMN couplée à la modélisation moléculaire sous contraintes expérimentales afin de déterminer la structure de ces deux protéines. Nous souhaitons apporter des informations sur l’éventuelle présence de motifs structuraux au sein de ces protéines afin de mieux comprendre leur fonction et de définir à quel moment de la voie de biosynthèse elles interviennent.Concernant la protéine CGC-10, nous avons conçu un plasmide optimisé que nous avons fait synthétiser. Le gène obtenu a été cloné dans un vecteur d’expression choisi par nos collaborateurs (pQE30).Concernant la protéine CGC-19, nous allons en décrire les étapes d’expression et de purification qui nous ont permis d’enregistrer l’ensemble des expériences 3D-triple résonnance nécessaires à la détermination de la structure de la protéine. De plus, il a été mis en évidence la présence d’une modification post-traductionnelle de type phosphopanthéténylation au sein de cette protéine. Nous avons produit l’enzyme responsable de cette modification, la sfp, afin de pouvoir effectuer la réaction et suivre l’effet de la modification sur les spectres RMN de la protéine et donc sur la structure.Ce projet, qui s’inscrit dans une perspective de recherche à plus long terme, a pour objectif de caractériser précisément le mécanisme de production de la congocidine. A travers cette démarche, il s’agit de combiner la biologie moléculaire (modification en amont les gènes) à la chimie afin d’obtenir des molécules différentes aux propriétés améliorées et non toxiques. / My PhD thesis contains two parts: development of ligands against anti-apoptotic proteins and structural study of CGC proteins involved in the biosynthesis of congocidine, a Streptomyces Ambofaciens secondary metabolite.The first project concerns the NMR study of the interactions between the anti-apoptotic proteins and two potential ligand candidates, the Meiogynine and the Drimane. These two terpenoïds, identified from ICSN’s chemical library screening against the Bcl-xL protein, have shown a significant inhibiting activity, thus opening promising perspectives for the treatment of cancer cells overexpressing anti-apoptotic proteins. In fact, as these compounds are considerably smaller than the binding site, our objective is to introduce modifications (such as elongation of their structure, functionalization with hydrophilic groups etc.) that may improve their binding properties as well as their delivery and bioavailability.Following to the successful recombinant expression and purification, necessary to obtain labelled targets (15N/13C), our preliminary NMR studies suggested a rather universal action of our candidates, capable to bind not only to Bcl-xL but also to the other major anti-apoptotic protein, Mcl-1. Titration experiments revealed significant perturbations of the HSQC protein NMR spectra with the progressive disappearance of several protein HN and ligand signals, confirming dissociation constants at the µM region for both targets. However, the intermediate chemical exchange NMR regime observed, associated with the weak ligand solubility, poses severe difficulties for the structural elucidation of the complexes by classical NMR methods.In this work alternative approaches for the localisation of the ligands in the hydrophobic cleft of both target proteins will be presented.Oligopyrroles are secondary metabolites synthesized by Streptomyces bacteria. This family of natural products, composed by one or more pyrrole-2-carboxamide groups is characterized by a variety of biological activities such as antiviral, antitumor and antibiotic functions.One of the best-known metabolites is the congocidine, extensively studied due to its capacity to bind into the minor groove of the DNA double helix, with strong sequence specificity. However, because of its strong toxicity, this molecule cannot be directly used for therapeutic purposes.The analysis of the groups of genes involved in congocidine biosynthesis brought to light 24 genes, but their precise role is not yet well defined. We were particularly interested in two enzymes: the proteins called CGC-10 and CGC-19. For the recombinant expression of the first one, we designed an optimized insert which was cloned in an expression vector pQE30.Concerning CGC-19, the stages of expression and purification, which allowed us to obtain doubly-labeled protein, as well as the 3D NMR experiments for spectral assignment and structure elucidation, will be discussed.Furthermore, we were interested in the holo- state of this protein obtained through a post-traductional modification (phosphopanthéténylation). To this, we produced the enzyme responsible for this modification, Sfp, carry out the reaction in vitro and follow the effect of the modification at the NMR spectra.

Saccharothrix algeriensis est une bactérie filamenteuse productrice de plusieurs molécules de la famille des dithiolopyrrolones aux propriétés à la fois antibiotiques et anticancéreuses. Ces composés sont constitués d'un noyau bicyclique commun, la pyrrothine, lié par une liaison amide à différents radicaux acyls (R). Lors de ce projet de thèse, la réaction enzymatique d'acylation du noyau pyrrothine, dite pyrrothine N-acyltransférase, a été étudiée chez Sa. algeriensis pour mieux comprendre la régulation exercée par les acides organiques sur la biosynthèse des dithiolopyrrolones et synthétiser par voie enzymatique de nouveaux composés avec différents radicaux R. Deux activités enzymatiques pyrrothine Nacétyltransférase et N-benzoyltransférase catalysant la formation de deux dithiolopyrrolones, la thiolutine (R= CH3) et la benzoyl-pyrrothine (BEP, R= C6H5) ont d'abord été mise en évidence dans l'extrait cellulaire brut de Sa. algeriensis. Ensuite la régulation exercée par les acides organiques a été étudiée en mesurant ces activités enzymatiques dans des extraits cellulaires de Sa. algeriensis obtenus au cours de cultures sur différents milieux supplémentés en acides organiques. Les résultats obtenus montrent que l'augmentation de la production de BEP en présence d'acide benzoïque à 1,25 mM est en partie due à l'induction de l'activité benzoyltransférase. Par ailleurs, les activités acétyltransférase et benzoyltransférase ont montré des profils d'expression très différents qui laissent supposer que deux enzymes catalysent le transfert de l'acétyl- et du benzoyl-. Leur purification a aussi été entreprise et l'extrait cellulaire de Sa. algeriensis, sous une forme brute ou semi-purifiée, a été utilisé pour catalyser la synthèse enzymatique de 9 dérivés dithiolopyrrolones, susceptibles de posséder des activités biologiques innovantes et/ou accrues. / Saccharothrix algeriensis is a filamentous bacterium that produces many dithiolopyrrolone compounds with antibiotic and anti-tumour properties. These metabolites possess a common bicyclic nucleus, the pyrrothine, amide linked with variable acyl groups R. During this PhD project, the enzymatic reaction of pyrrothine acylation, identified as pyrrothine N-acyltransferase, was studied in Sa. algeriensis to further our understanding of the regulation exerted by organic acids on the dithiolopyrrolone biosynthesis and to produce new dithiolopyrrolone compounds by enzymatic catalysis. Evidence for the presence in the crude cell free extract of Sa. algeriensis of two enzymatic activities, pyrrothine Nacetyltransferase and N-benzoyltransferase is provided. They catalyze respectively the formation of the two dithiolopyrrolones, thiolutin (R= CH3) and benzoyl-pyrrothine (BEP, R = C6H5). To study the regulation exerted by organic acids, these enzymatic activities were then assayed in crude cell free extracts of Sa. algeriensis obtained during cultures on media supplemented with organic acids. The results show that BEP-production is enhanced in the presence of benzoic acid partly because of an induction of pyrrothine N-benzoyltransferase. Differences in the expression time courses of pyrrothine N-acetyltransferase and Nbenzoyltransferase activities were also observed. It supports the idea that the transfer reactions of acetyl-CoA and benzoyl-CoA on pyrrothine are catalyzed by two different enzymes. Their purification was undertaken and the cell free extract, crude or semi-purified was used as catalyst to synthetize nine dithiolopyrrolones with biological activities potentially new and better

L’objectif de ce projet de thèse était de caractériser le métabolisme de terpénoïdes (ou isoprénoïdes) chez les plantes supérieures. L’essentiel du travail a consisté à caractériser des triterpènes synthases (TTPS) d’Arabidopsis thaliana, un modèle végétal, ainsi que celles de l’épurge (Euphorbia lathyris), une euphorbe pour laquelle des applications agronomiques sont envisagées. Au cours de ma thèse, j’ai aussi contribué à l’étude du métabolisme et des fonctions des précurseurs de triterpènes et de stérols, ainsi qu’à leurs fonctions biologiques.Les triterpènes synthases, ou 2,3-oxydosqualène cyclases (OSCs), convertissent le substrat 2,3-oxydosqualene (SqO) en une multitude d'alcools triterpéniques, et ainsi amorcent la biosynthèse de dérivés triterpénoïdes (triterpènes oxydés, conjugués, etc ..). Arabidopsis thaliana contient 13 OSCs produisant divers squelettes triterpéniques, de type stéroïdien ou non-stéroïdien. Les produits de cyclisation du SqO ont été élucidés structuralement (GC-MS, RMN) après expression hétérologue des enzymes en levure erg7. Cette levure est déficiente en lanostérol synthase (ERG7), ce qui permet d'accumuler le SqO, substrat des cyclases. Lorsque le mutant est transformé avec un ADNc codant une triterpène synthase, il est capable de convertir le SqO en un ou plusieurs triterpènes. Cependant, la caractérisation des 13 OSCs d'Arabidopsis réalisée de façon hétérologue en levure n’a pas été établie inplanta. De façon surprenante, certains des composés produits dans les levures erg7 transformées n'ont jamais été détectés chez Arabidopsis. C'est pourquoi il a été nécessaire de reconsidérer les fonctions biochimiques exactes de ces enzymes dans un contexte végétal. / The subject of this PhD thesis is part of a research project entitled "Production of energy-rich triterpenoids in Euphorbia lathyris, a potential crop for third generation biofuels," whose acronym is EULAFUEL. This project is funded by a multipartner program ANR-KBBE and has been extended until December 2013. The aim of this PhD project is to get new insights into the aspects related with the biosynthesis and accumulation of latex triterpenoids. In addition, for comparison, a major objective of the thesis is to characterize functionally the enzymes involved in the synthesis of triterpenes in the model plant Arabidopsis thaliana. Triterpene synthases, also named oxidosqualene cyclases (OSCs), convert 2,3-oxidosqualene (OS) into a multitude of triterpene alcohols and there by initiate triterpene biosynthesis. Arabidopsis thaliana for instance has 13 OSCs producing diverse skeletons of steroidal or non-steroidal triterpenes. Cyclization products of a given enzyme have been characterized biochemically using a yeast heterologous expression system. However, for the majority of Arabidopsis triterpene synthases, inplanta studies are lacking. In fact, most of the compounds produced in yeast expressing such enzymes have never been detected in wild-type Arabidopsis. This is a reason why we should reconsider the exact biochemical function of triterpene synthases in the plant context. Then, in a comparative approach in E. lathyris, we project to study the specific triterpene accumulation in the laticifers, a specialized cell type where high amounts of lanosterol, an unusual OS cyclization product for plants, accumulate.

Botrytis cinerea est un champignon nécrotrophe et polyphage capable de provoquer la pourriture grise sur plusieurs centaines d’espèces végétales. Les pertes engendrées par cette maladie sont importantes à travers le monde notamment sur des espèces économiquement importantes comme la tomate, la fraise ou encore la vigne. Parmi les facteurs de virulence identifiés chez B. cinerea se trouvent deux toxines non-hôte spécifiques. Il s'agit du sesquiterpène botrydial et du polycétide acide botcinique. Même si leur rôle redondant dans la nécrotrophie a été démontré, les mécanismes qui gouvernent l’expression des clusters responsables de leur synthèse (respectivement BOT et BOA) restent inconnus. Dans ce contexte, l’objectif de mon projet de thèse était de caractériser les différents mécanismes qui régulent le métabolisme secondaire chez B. cinerea. Je me suis particulièrement intéressé aux clusters BOT et BOA ainsi qu’à un troisième cluster (PKS7) qui, d’après le phénotype d’un mutant d’insertion (ADN-T), pourrait être impliqué dans la nécrotrophie. Grâce à la disponibilité du nouvel assemblage du génome de la souche modèle B05.10, un gène candidat codant un facteur de transcription (FT) putatif a pu être identifié à proximité du cluster BOT. La caractérisation de ce gène a permis de démontrer le rôle majeur de la protéine (BcBot6) dans l’activation des gènes Bcbot et la production subséquente de botrydial. De même, la caractérisation de Bcboa13, un gène codant un FT putatif présent au sein du cluster BOA, a permis de démontrer le rôle de régulateur positif de BcBoa13 envers les gènes Bcboa. A la différence des clusters BOT et BOA, le cluster PKS7 ne contient pas de gène codant pour un potentiel FT spécifique. Afin de confirmer le rôle du métabolite putatif produit par ce cluster et d’identifier sa structure chimique, l’inactivation du gène clé codant une PKS-NRPS (Bcpks7) a été réalisée et des analyses métaboliques ont été initiées. Finalement, la présence au sein des clusters BOT et BOA de nombreux transposons ayant subi des mutations de type RIP (Repeat-Induced Point mutations) ainsi que la position sub-télomérique des clusters BOA et PKS7 nous a amené à nous intéresser au rôle de la structure chromatinienne dans la régulation de ces clusters. Dans ce cadre, trois mutants délétés dans des gènes codant des modificateurs chromatiniens putatifs (les histones méthyltransférases BcDim-5 et BcKmt6 et la protéine hétérochromatinienne BcHp1) ont été générés. L’expression des gènes clés des clusters BOT, BOA et PKS7 chez les mutants Bcdim-5, Bchp1 et Bckmt6 suggère que différents mécanismes chromatiniens interviennent pour le contrôle des clusters BOT et BOA d’une part et du cluster PKS7 d’autre part. L’ensemble des résultats obtenus pendant cette thèse apporte une contribution majeure à la compréhension des mécanismes de régulation spécifiques mais aussi de ceux en lien avec la structure chromatinienne de la production de métabolites phytotoxiques impliqués dans la nécrotrophie chez B. cinerea. / Botrytis cinerea is a necrotrophic polyphagous fungus able to induce the gray mold disease on hundreds of plant species. The resulting losses are important worldwide notably on economically important crops such as tomato, strawberry or grapevine. Among the virulence factors identified in B. cinerea stand two non-host specific toxins: the sesquiterpene botrydial and the polyketide botcinic acid. Although their redundant role in necrotrophy has been shown, the mechanisms governing the clusters responsible for their synthesis (respectively BOT and BOA) remain unknown. In this context, the aim of my PhD project was to characterize the different mechanisms that regulate secondary metabolism in B. cinerea. I particularly focused on BOT and BOA clusters as well as on a third one (PKS7) which, according to the phenotype of an insertion-based mutant (T-DNA), could be involved in necrotrophy. Thanks to the newly assembled genome of the B05.10 wild type strain, a candidate gene encoding a putative transcription factor (TF) could be identified near the BOT cluster. The characterization of this gene allowed pointing out the major role of the protein (BcBot6) in the activation of Bcbot genes and in the subsequent botrydial production. Similarly, the characterization of Bcboa13, a putative TF-encoding gene present into the BOA cluster, allowed demonstrating the positive regulatory role of BcBoa13 on Bcboa genes. Unlike the BOT and BOA clusters, the PKS7 one does not contain any putative TF-encoding gene. In order to confirm the role of the putative metabolite produced by this cluster and to identify its chemical structure, the inactivation of the PKS-NRPS key enzyme-encoding gene (Bcpks7) was conducted and metabolic analyses were initiated. Finally, the presence of many RIP(Repeat-Induced Point mutations)-inactivated transposons within BOT and BOA clusters as well as the subtelomeric location of BOA and PKS7 clusters raised our interest about the role of chromatin structure on those clusters regulation. In this context, three mutants inactivated into putative chromatin modifiers encoding-genes (the histone methyltransferases BcDim-5 and BcKmt6 and the heterochromatin protein BcHp1) were generated. The expression analysis of the key genes of the BOT, BOA and PKS clusters suggests different chromatin-based mechanisms that intervene for the BOT and BOA cluster on one side and on the PKS7 cluster on another. Altogether, the results generated during this PhD project are a major contribution to the comprehension of pathway-specific as well as chromatin-based mechanisms that regulate the production of necrotrophy-involved phytotoxins by B. cinerea.

Pseudomonas brassicacearum a la particularité de générer une diversité intraclonale aussi bien in vitro qu'en conditions naturelles dans la rhizosphère de plantes. Ce phénomène de variation phénotypique commun chez les bactéries est un processus d'adaptation aux environnements changeants. Des données de transcriptomique issues de puces à ADN, contenant aussi bien des séquences codantes que non codantes, nous ont permis d'identifier les gènes dont l'expression est altérée et surtout de relier ce phénomène à l'expression d'ARN non codants régulateurs (ARNnc) de type Rsm qui sont sous le contrôle du système à deux composants GacS/GacA. Nous avons montré que des mutations ponctuelles dans les gènes gacS ou gacA sont à l'origine de cette variation phénotypique et que l'expression de l'un des trois gènes rsmX, rsmY ou rsmZ permet de restaurer le phénotype de la souche sauvage. L'importance de ces ARNnc dans la survie de la bactérie aux fluctuations de son environnement est dénotée par la duplication de rsmX en un gène que nous avons nommé rsmX-2, dont la fonction a été validée. Nos données suggèrent une activation exclusive des gènes rsmX-1 et rsmX-2 par GacA et l'intervention de régulateurs additionnels dans le cas de rsmY et rsmZ. Au vu de la redondance fonctionnelle de ces quatre ARNnc, nous avons investigué leur niveau d'expression et leur stabilité dans différentes conditions de culture et montré des différences pour les quatre ARNnc. En réponse à une carence en nutriments, l'expression des ARNnc Rsm est fortement activée et atteint son maximum quand le ppGpp est détecté dans le milieu, suggérant un lien entre le système Gac/Rsm et la réponse « stringente ». / The plant-beneficial bacterium Pseudomonas brassicacearum forms phenotypic variants in vitro as well as in planta during root colonisation under natural conditions. Transcriptome analysis of typical phenotypic variants using microarrays containing coding as well as non-coding DNA fragments showed differential expression of several genes relevant to secondary metabolism and of the small non-coding RNA (ncRNA) genes rsmX, rsmY and rsmZ, which was characterized by down-regulation. Naturally occurring mutations in the GacS/GacA two-component system accounted for phenotypic switching. The importance of these ncRNAs in the survival of the bacteria to changing environments is denoted by the duplication of rsmX gene, which we called rsmX-2 and whose function has been validated. Our data suggest an exclusive activation of rsmX-1 and rsmX-2 genes by GacA and the involvement of additional regulators in the case of rsmY and rsmZ. Given the functional redundancy of these ncRNAs, we investigated their expression level and stability in different culture conditions and showed differences for the four ncRNAs. In response to nutrient depletion, the four ncRNAs expression is strongly activated and reaches its maximum when the ppGpp is detected in bacterial cells, suggesting a link between the Gac/Rsm system and the "stringent" response. Determining the level of each Rsm ncRNA, which is defined by a balance between synthesis and degradation of each transcript, shows the maintenance of a very important pool of RsmZ compared to other ncRNAs.

Saccharothrix algeriensis est une bactérie filamenteuse capable de produire différentes molécules de la famille des dithiolopyrrolones présentant des activités antibiotiques et anticancéreuses. Ce travail porte sur l’analyse macroscopique et la modélisation du comportement dynamique de cette bactérie en vue de concevoir et d’optimiser un procédé de bioproduction de thiolutine. Les expériences menées en fermenteur de deux litres ont permis de décrire le comportement macroscopique de Sa. algeriensis. Sur substrat mixte (extrait de levure et glucose), la bactérie présente une croissance diauxique. La production de thiolutine, découplée de la croissance, est provoquée par l’épuisement du substrat préférentiel (extrait de levure). L’analyse des bilans carbone, azote et rédox nous a conduit à considérer deux phénomènes physico-chimiques qui n’étaient pas pris en compte dans le modèle proposé par Strub (2008) : l’entrainement de l’ammonium dans la phase gazeuse et l’adsorption des ions ammonium et des acides aminés sur la biomasse. Les données réconciliées sur la base des bilans élémentaires sont utilisées comme support pour la construction d’un modèle stœchio-cinétique. Différentes approches de modélisation des cinétiques et de représentation des bascules métaboliques ont été testées afin de retenir un schéma stœchio-cinétique apparent cohérent avec les données réconciliées. Cette étape de discrimination a été réalisée à l’aide de la toolbox ExOptim, développée en partenariat avec AgroParisTech. Cet outil, alliant une méthode d’optimisation robuste tout en limitant les temps de calcul, permet de prendre en compte les erreurs de mesure dès la mesure initiale et de reparamétrer indépendamment les paramètres du modèle et les données expérimentales. Les cinétiques réactionnelles sont représentées de manière satisfaisante par l’association du modèle de Monod et la loi logistique. Les seize paramètres du modèle sont identifiés sur sept expériences indépendantes. Le modèle finalement obtenu est ensuite testé sur cinq nouvelles expériences aux conditions initiales différentes. Ce modèle permet de prédire raisonnablement les cinétiques de croissance et de production de thiolutine. Toutefois, son utilisation reste limitée à des conditions initiales proches de celles de cette étude. / Saccharothrix algeriensis is a filamentous bacterium that produces several dithiolopyrrolone compounds with antibiotic and antitumor properties. This study focuses on the macroscopic analysis and modelling of the dynamic behaviour of this bacterium, in order to design and optimize the bioproduction process of thiolutin. Experiments were conducted in a two-litres bioreactor to characterise the macroscopic behaviour of Sa. algeriensis. On a medium containing several substrates (yeast extract and glucose), the bacterium shows a diauxic growth. Thiolutin production, which appears to be dissociated from growth, is triggered by the preferential substrate (yeast extract) depletion. The analysis of the carbon, nitrogen and redox balances led us to consider two physicochemical phenomena, which were not taken into consideration in the model proposed by Strub (2008): ammonium stripping in gaseous phase and adsorption of ammonium ions and amino acids on biomass. The data, reconciled on the basis of elementary balances, were used for the construction of a stoichio-kinetic model. Different modelling of kinetic and metabolic switches were tested in order to select a stoichio-kinetic model consistent with the reconciled data. This discrimination step was carried out using the ExOptim toolbox, developed in partnership with AgroParisTech. This toolbox combines a robust optimisation method and a reduced computation time. The experimental biases are taken into account from the first measurement and model parameters and experimental data reconditioned independently. The reaction kinetics are well represented by association of the Monod model and logistic laws. The sixteen model parameters were estimated from seven experiments. Finally, the model was validated by five additional experiments using different initial conditions. The kinetics of growth and thiolutin production are reasonably well predicted. However, the model is limited to initial conditions close to those of this study.

En condition de stress, les organismes photosynthétiques réorientent leur métabolisme vers la production de métabolites d’intérêt. Cette thèse vise à fournir de nouvelles informations sur ces processus chez les algues et les plantes supérieures. La 1ère partie est consacrée aux effets de 3 éclairements différents sur le métabolisme du carbone de la diatomée Phaeodactylum tricornutum. L'impact d’un éclairement supérieur à 300 µmol photons m-2 s-1 (ML) est tout à fait différent de celui obtenu pour un éclairement de 30 µmol photons m-2 s-1 tant au niveau physiologique que moléculaire. Dans nos conditions, la carence en carbone constitue la cause principale de l'apparition de la phase stationnaire. La synthèse des lipides est plus élevée sous un éclairement inférieur à ML. En revanche, la synthèse des protéines et de chrysolam-inarine augmente respectivement sous fort et faible éclairements. Les changements d’expression génique suggèrent que la conversion réversible du phosphoénol-pyruvate en pyruvate constitue une étape clé de l’orientation des intermédiaires dans les différentes voies de biosynthèse des molécules d’intérêt. L'état physiologique des cellules doit être considéré pour la comparaison d’échantillons. La 2ème partie du mémoire est consacrée aux effets de la quantité et de la qualité de la lumière délivrée par des LED (bleu, rouge, 70% de lumière rouge+30% de bleu et blanc) sur la régulation de la synthèse de métabolites secondaires chez 3 espèces de menthe prélevées dans la nature. La qualité de la lumière influence la stratégie d’utilisation du carbone par les plantes. Par exemple, la lumière rouge stimule le mieux la production de la synthèse de l'huile essentielle chez la menthe alors que le taux de fixation du carbone est similaire à celui trouvé dans les autres conditions d’illumination. Glomus mossae est le seul champignon mycorhizien à arbuscules à induire une augmentation supplémentaire de la production d’huile essentielle. / Under stress, photosynthetic organisms reoriente their metabolism toward the production of high added value molecules. Regarding the importance of this process, it is surprising that the processes on which the reorientation relies are still not better understood. This thesis aims to provide new information regarding these processes. The 1st part of this thesis is dedicated to the effects of 3 different light intensities on the carbon metabolism of the diatom Phaeodactylum tricornutum. The impact of light intensities higher than 300 µmol photons m-2 s-1 (ML) were different from those obtained with 30 µmol photons m-2 s-1 at the physiological and molecular levels. Carbon deficiency was responsible for the occurrence of plateau phase in cultures. Except lag phase, lipid synthesis was higher under ML In contrast, protein and chrysolaminarin syntheses increased under 1000 and 30 µmol photons m-2 s-1, respectively. Gene expression modifications suggest that the reversible conversion between phosphoenolpyruvate and pyruvate constitutes a key step for the orientation of intermediates to either high value molecules biosynthetic pathways. The physiological state of the cells should be taken into consideration when samples comparison is considered.The 2nd part of the report is dedicated to the effects of light quantity and quality (blue, red, 70% red+30% blue and white light delivered by LED) on the regulation of essential oil synthesis in 3 Mentha species collected in nature. The light quality impacts the strategy of carbon utilization by the plant. Typically, red light was the most effective for stimulating the production of essential oil in Mentha sp. while carbon fixation capacity was similar to that found in other ligthing conditions. Regardless the light intensity, Glomus mossae was the only arbuscular mycorrhizal fungus able to enhance additionally essential oil production.

Les espèces du genre Colletotrichum sont majoritairement des agents pathogènes de nombreuses plantes et provoquent des dégâts importants aux cultures partout dans le monde. Colletotrichum higginsianum est un champignon phytopathogène hémibiotrophe capable d’infecter de nombreuses Brassicaceae dont la plante modèle Arabidopsis thaliana. L’intérêt du pathosystème C. higginsianum – A. thaliana réside dans la possibilité de manipuler génétiquement les deux partenaires. Par ailleurs, la disponibilité de très nombreuses lignées transgéniques et d’outils génétiques aide à disséquer les mécanismes de résistance et de sensibilité de la plante. Nous avons re-séquencé (technologie PacBio) le génome de C. higginsianum afin d’obtenir les séquences complètes des 12 chromosomes. L’analyse détaillée de cette seconde version du génome a permis de mettre en évidence l’un des plus grands arsenaux fongiques de gènes du MS et de résoudre les problèmes de fragmentation de la première version du génome. Afin d’identifier les métabolites secondaires que C. higginsianum produit au cours de l’infection de la plante, nous avons supprimé des répresseurs du MS qui modifient l’état de la chromatine (Kmt1, Kmt6, Hep1, CclA) et sur-exprimé des inducteurs du MS (LaeA, Sge1) décrits chez d’autres mycètes. Grâce à des analyses de transcriptomique (RNA-Seq), des gènes du MS différentiellement exprimés dans ces mutants ont pu être identifiés. Ensuite, par des analyses de chimie analytique nous avons pu identifier et caractériser deux familles de métabolites secondaires. Enfin, nous avons mis en évidence des activités inédites pour ces deux familles de composés. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour aborder le déterminisme du pouvoir pathogène de C. higginsianum. / Colletotrichum spp. are major plant pathogens of numerous crops worldwide. Colletotrichum higginsianum uses a hemibiotrophic lifestyle to infect many members of the Brassicaceae including the model plant Arabidopsis thaliana. The C. higginsianum – A. thaliana pathosystem facilitates dissection of the mechanisms of plant resistance and susceptibility and the traits underlying fungal pathogenicity. Both partners can be genetically manipulated and powerful genetic tools and transgenic lines are available on the plant side. With a view to obtain a more complete inventory of C. higginsianum secondary metabolism (SM) genes, we re-sequenced the genome de novo using PacBio technology, providing 12 complete chromosome sequences. The in-depth analysis of this second version of the genome revealed one of the largest SM repertoires described to date for any ascomycete and solved numerous fragmentation problems in the first genome assembly. In order to identify secondary metabolites produced by C. higginsianum during plant infection, we deleted negative SM regulators that modify chromatin status (Kmt1, Kmt6, Hep1, CclA), and over-expressed positive SM regulators (LaeA, Sge1), all of which were well-described in other fungi. Using transcriptomics (RNASeq), we identified SM genes differentially expressed in these mutants. Using metabolite profiling, we also identified and characterised two families of secondary metabolites. Finally we describe novel biological activities for these compound families. These results provide new insights into the molecular basis of pathogenicity in C. higginsianum.

L'induction du métabolisme secondaire fait partie du système de défense des plantes lors d’une attaque par un microorganisme pathogène. Les propriétés antimicrobiennes ou de signalisation des métabolites secondaires (MS) peuvent être régulées par un processus majeur et efficace, la glycosylation. Cette réaction est catalysée par les glycosyltransférases (UGTs) qui assurent le transfert d’une molécule de sucre sur un MS. Mon travail de thèse a porté sur l’étude de trois UGTs d’Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), UGT76E12 d’une part, et UGT73B3 et UGT73B5 d’autre part, et a montré que 1) UGT76E12 est impliquée dans la mise en place de la résistance basale à la souche virulente de la bactérie Pseudomonas syringae pv. tomato, Pst DC3000, et participe au dialogue entre les voies de signalisation hormonale de l’acide jasmonique (JA) et de l’acide salicylique (SA). Des analyses par clustering hiérarchique ont révélé une co-expression forte entre le gène UGT76E12, et deux gènes codant une terpène synthase (TPS4) et un cytochrome P450 (CYP82G1), impliqués dans la biosynthèse d’un diterpène, le TMTT ((E,E)-4,8,12-triméthyletridéca-1,3,7,11-tetraène), suggérant un rôle pour UGT76E12 dans la régulation de la voie de biosynthèse des terpènes ; 2) UGT73B3 et UGT73B5 sont impliquées dans la mise en place de la résistance spécifique d’Arabidopsis à la souche avirulente Pst DC3000-AvrRpm1, notamment par la régulation de MS intervenant dans le maintien de l’état redox cellulaire au cours de la réaction d’hypersensibilité (HR). Ces deux gènes appartiennent à la classe des « SA-early induced-genes » et présentent un profil co-expression avec le gène TOLB-related et deux gènes codant des glutathion S-transférases (GSTU7 et GSTU24) impliqués dans la réponse au stress oxydant et la détoxication des MS. Nos résultats suggèrent un rôle pour UGT73B3 et UGT73B5 dans la glycosylation de métabolites oxydants associés à la mise en place de la HR. / Plant secondary metabolism induction is part of an integrated defense system after pathogen infection. Signalling and antimicrobial properties of secondary metabolites (SM) can be regulated by an efficient process named, glycosylation. This reaction is ensured by glycosyltransferases (UGTs) which catalyze the transfer of a sugar moiety on a SM. My PhD work was divided in two parts, the first on UGT76E12 and the second part on UGT73B3 and UGT73B5, three UGTs of Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) and it demonstrated that 1) UGT76E12 is involved in basal resistance establishment during plant challenge with the virulent strain of Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst DC3000), and participates to the hormonal crosstalk between jasmonic acid (JA) and salicylic acid (SA). Clustering analyses revealed a strong co-expression between UGT76E12 and two genes encoding a terpene synthase (TPS4) and a cytochrome P450 (CYP82G1), both involved in the biosynthesis of a diterpene named TMTT ((E,E)-4,8,12-trimethyltrideca-1,3,7,11-tetraene), which suggests a role for UGT76E12 in terpene biosynthesis pathway regulation. 2) UGT73B5 and UGT73B3 are involved in the establishment of Arabidopsis specific resistance against the avirulent strain of Pst DC3000-AvrRpm1, especially in the regulation of MS playing a role in redox homeostasis status during the hypersensitive response (HR). These two genes are part of SA-early induced-genes and showed co-expression patterns with the TOLB-related gene and two genes encoding glutathione S-transferases (GSTU7 and GSTU24) involved in oxidative stress responses and in MS detoxification. Our results suggest a role for UGT73B3 and UGT73B5 in the glycosylation of oxidant MS associated with HR establishment.