Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-08-29T18:04:13Z No. of bitstreams: 1 franciscocarlosdaguia.pdf: 1708670 bytes, checksum: 0477005c8ad48befeb5fdbdaec28770a (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-30T11:46:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 franciscocarlosdaguia.pdf: 1708670 bytes, checksum: 0477005c8ad48befeb5fdbdaec28770a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-30T11:46:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 franciscocarlosdaguia.pdf: 1708670 bytes, checksum: 0477005c8ad48befeb5fdbdaec28770a (MD5) Previous issue date: 2016-03-07 / Lesões na musculatura esquelética podem ocorrer devido desordens genéticas ou trauma. Em lesões menos extensas nas quais vasos sanguíneos ou tecido conectivo não são atingidos o músculo consegue se regenerar sem intervenção médica. Contudo, lesões envolvendo porções maiores do tecido a regeneração não consegue ser completa sem intervenção. Desse modo, a engenharia tecidual aparece como uma alternativa para a regeneração completa do tecido. Dentre os biomateriais empregados na regeneração muscular, as matrizes extracelulares descelularizadas figuram como as classes de biomateriais mais empregadas. Contudo até o presente momento não foi desenvolvido uma metodologia de descelularização de tecido esquelético que preserve a arquitetura do tecido e sua composição química com uma taxa adequada de remoção de células. Desta forma, o presente trabalho almeja produzir um biomaterial composto da matriz extracelular de músculo esquelético de rato Wistar descelularizada. Para tanto, músculo esquelético de ratos Wistar machos foram extraídos e submetidos a lavagens sucessivas com soro fisiológico estéril. Posteriormente, os músculos foram congelados e fatiados, sendo então novamente lavado com soro fisiológico e submetido a irradiação com luz UV por 20 min em cada face do material. Após a irradiação, O tecido foi então digerido em uma solução de tripsina 0,05% contendo 0,2% de EDTA pH 7,6 por 2h a 37°C. Em seguida o tecido sofreu banhos, sob refrigeração, em solução de SDS 1% (p/v) por 4 a 5 dias com trocas diárias da solução. Finalmente o material foi submetido a um banho em água destilada por dois dias finalizando assim a descelularização. Após o procedimento foi obtido um biomaterial com aparência translucida e com uma concentração de DNA de 0,005 ± 0,002 ng de DNA por mg enquanto o controle não descelularizado apresentou uma concentração de 0,800 ± 0,107 ng de DNA por mg de tecido. Além disso, a análise em microscopia de fluorescência comprovou a inexistência de estruturas nucleares e a preservação da arquitetura do tecido após a descelularização. A presente metodologia representa um avanço nos protocolos de descelularização, pois foi obtido um nível de descelularização 10 vezes menor que o preconizado na literatura como ideal além permitir um patamar bem superior de descelularização mantendo a estrutura tridimensional do tecido em comparação a trabalhos similares. / Injuries in skeletal muscle can occur genetic disorders or trauma. In less extensive injuries in which blood vessels or connective tissue are not affected muscle can regenerate without medical intervention. However, injuries involving major portions of the tissue regeneration can be complete without intervention. Thus, tissue engineering is an alternative to the complete tissue regeneration. Among the biomaterials used in muscle regeneration, the decellularized extracellular matrices appear as the most used biomaterials classes. However until now it has not developed a methodology of skeletal tissue decellularization that preserves the tissue architecture and chemical composition with an appropriate rate of removal of cells. Thus, the present study aims to produce a biomaterial composed of the extracellular matrix decellularized skeletal muscle of Wistar rats. To this end, the skeletal muscle of male Wistar rats were extracted and subjected to repeated washings with sterile saline. Subsequently, the muscles were frozen and sliced, and then washed again with saline and subjected to irradiation with UV light for 20 min on each face of the material. After irradiation, the tissue was then digested in a 0.05% trypsin solution containing 0.2% EDTA pH 7.6 for 2h at 37 ° C. Then the tissue baths experienced under refrigeration, in 1% SDS solution (w / v) for 4 to 5 days with daily exchanges of solution. Finally the material was subjected to a bath in distilled water for two days thus finishing the decellularization. After the procedure was obtained a biomaterial with a translucent appearance and a DNA concentration of 0.005 ± 0.002 ng per mg of DNA while the control had not decellularized a concentration of 0.800 ± 0.107 ng DNA per mg of tissue. Furthermore, fluorescence microscopy analysis confirmed the absence of nuclear facilities and the maintenance of tissue architecture after decellularization. This methodology represents an advance in decellularization protocols because it was obtained a level of decellularization 10 times lower than that recommended in the literature as ideal addition allow much higher level of decellularization keeping the three-dimensional structure of the tissue compared to similar works

A proposta deste estudo foi avaliar o efeito de 8 semanas de treinamento de força ou potência sobre a expressão de genes pertencentes a via de sinalização canônica da WNT, assim como a expressão protéica de b-catenina. Vinte e cinco indivíduos (27,4±4,6 anos) foram distribuídos randomicamente nos grupos: treinamento de força (TF) (n=10), treinamento de potência (TP) (n=10), e controle (C) (n=5). Os grupos TF e TP realizaram o exercício agachamento durante 8 semanas, 3 vezes por semana. Biópsias do músculo vasto lateral foram retiradas antes e após o período de treinamento. Alguns genes foram modulados positivamente no grupo TF (WNT1:6.4 vezesP<0.0001; SFRP1:3.3 vezesP<0.0001 e LEF1:7.3 vezesP<0.0001) e também no grupo TP (WNT1:24.9 vezesP<0.0001; SFRP1:2.7 vezesP<0.0001; LEF1:34.1 vezesP<0.0001 e Cyclina D1:7.7 vezesP<0.001). O conteúdo protéico total de -catenina aumentou somente no grupo TP (p<0,05). Nossos dados indicam que o treinamento de potência desencadeia respostas de maior magnitude sobre a via WNT quando comparado ao treinamento de força máxima. / The purpose of the present study was to evaluate the effects of 8 weeks of strength and power training on the expression of genes related to the canonical WNT pathway and b-catenin protein levels. Twenty five subjects (27.4±4.6 yrs) were randomly assigned to three groups: strength training (ST) (n=10), power training (PT) (n=10), and control (C) (n=5). The ST and the PT groups performed squats, 3 times per week, for 8 weeks. Muscle biopsies from the vastus lateralis muscle were collected before and after the training period. Certain genes were up-regulated in the ST group (WNT1:6.4 foldP<0.0001; SFRP1:3.3 fold-P<0.0001 and LEF1:7.3 foldP<0.0001) and also in the PT group (WNT1:24.9 foldP<0.0001; SFRP1:2.7 foldP<0.0001; LEF1:34.1 foldP<0.0001 and Cyclin D1:7.7 foldP<0.001). Finally, the total protein content of -catenin increased only in the PT group (P<0.05). Our data indicate that PT triggers greater responses on the WNT pathway as compared to ST regimens.

Moçambique é um País da África Austral onde cerca de 55% da população vive abaixo da linha de pobreza absoluta com menos de uma refeição por dia sobrevivendo a muito custo com base em donativos. A insegurança alimentar e a nutrição extremamente precária, principalmente nas crianças, são fatores que induzem a níveis de Desnutrição crônica (DC) infantil em torno de 44%. Esta DC é responsável por um terço de mortes em menores de cinco anos. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos que uma ração preparada com alimentos produzidos e consumidos pela população das zonas rurais de Moçambique exerceu no músculo gastrocnêmio de ratos wistar (Rattus norvegicus) alimentados com esta ração. Foram usados 75 ratos Wistar pesando aproximadamente 300 g divididos em três grupos: Nutrido ou controle (N), Desnutrido (D) e Moçambique ou grupo experimental (M), avaliados ao nascimento e ao desmame. Os animais foram mantidos sob as mesmas condições de alojamento, temperatura umidade e luz, porém com alimentação diferente consoante o grupo; Grupo N com ração normoproteica (20% de caseína), Grupo D com ração desnutrida (5% de caseína) e grupo M com ração de Moçambique. Em todos os grupos foi feita avaliação da massa corporal ao nascimento e desmame e coletado o músculo gastrocnêmio direito dos filhotes machos ao desmame para processamento. Foram realizadas cortes seriados de 10 µm de espessura em criostato e, as secções foram submetidas às técnicas da hematoxilina e eosina, picro-sirius, NADH-tr e análise em microscopio eletrônico de transmissão. A avaliação estatística das diferenças inter-grupos foi determinada pelos testes análise de variância, (ANOVA) e Tukey. Foram encontradas diferenças significativas entre os grupos N, D e M. Observou-se nos animais do grupo M uma grande variação no peso e tamanho que foi similar ao do grupo D; os mesmos apresentaram também alterações no formato das fibras musculares que exibiram contornos arredondados e, ainda, predominância de fibras colágenas tipo III tal como os desnutridos. Ultra estruturalmente os animais de Moçambique apresentaram um desalinhamento das linhas Z dos sarcômeros e rompimento das miofibrilas, diminuição na área de seção transversa e menor proporção de fibras glicolíticas e glicolítico-oxidativas, e maior porcentagem e área de seção transversa igual ao grupo D no respeitante ás fibras oxidativas. / Mozambique is a country of Southern Africa where about 55% of the population lives below the absolute poverty line with less than one meal per day, hardly surviving based on donations. Food insecurity and precarious nutrition, especially in children, are factors that induce to levels of 44% chronic infant malnutrition (DC). DC is responsible for one third of deaths in children under five years. The aim of this study was to evaluate morphoquantitative effects in gastrocnemius muscle of Wistar rats (Rattus norvegicus) fed with a diet utilized by people of rural areas of Mozambique. We used 75 Wistar rats weighing approximately 300 g divided in three groups: Nourished or control (N), Malnourished (D) and Mozambique or experimental group (M), measured at birth and weaning. The animals were kept under the same housing conditions, temperature, humidity and light, but fed with different diet depending on the group; Group N with normal protein diet (20% casein), Group D with hypo-proteic diet (5% casein) and group M with Mozambique diet. Body mass at birth and weaning was evaluated the right gastrocnemius muscle of male pups at weaning was colletcted for processing. Serial sections of 10 µm were performed in a cryostat prior to histology techniques of hematoxylin and eosin, picro-sirius, NADH-tr and analysis in transmission electron microscope. Statistical evaluation was determined by analysis of variance tests (ANOVA) and Tukey. Significant differences were found between groups N, D and M. Group M exhibit a great variation of body mass that was similar to group D; these animals (group M) also showed structural changes in muscle fiber which exhibited round-shaped contours, and a predominance of type III collagen similarly to malnourished group. Ultra structurally animals from Mozambique showed a disorganization of Z lines of sarcomeres and myofibrils disruption, decreased cross-sectional area and a smaller proportion of glycolytic and glycolytic-oxidative fibers, and higher percentage and cross-sectional area identical to group D with respect to oxidative fibers.

Orientador: Maria Alice da Cruz-Hofling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:04:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ito_AngelaCristina_M.pdf: 452057 bytes, checksum: d8202544f8db18e2697b97b370cf85c2 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O óxido nítrico (NO) é uma molécula gasosa, de vida curta, que modula a neurotransmissão, a força de contração, o metabolismo de glicose, o tônus vascular e a função muscular em geral. O músculo esquelético é a maior fonte de NO em mamíferos e expressa todas as três isoformas de NO sintases (NOS). Os inibidores da NOS são ferramentas usadas para estudar a função do NO na fisiologia muscular. Neste trabalho, nós examinamos os efeitos do tratamento crônico de ratos com N?-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), que bloqueia a síntese de NO pelas NOSs, através de parâmetros bioquímicos e morfológicos dos músculos soleus e extensor digitorum longus. A tipagem das fibras musculares, a medida da área de secção transversal das fibras, a expressão das isoformas de miosina, a determinação do número dos núcleos da fibra muscular e, a expressão e imunolocalização da NOS endotelial e neuronal foram parâmetros usados para avaliar os efeitos da falta de NO nos músculos. Os ratos foram tratados com L-NAME (20 mg/rato/dia, na água de beber dos animais) por duas, quatro e oito semanas. Decorridos esses tempos, os animais foram sacrificados e os músculos removidos e processados para análises. O tratamento crônico dos ratos com L-NAME causou um pequeno (13.2%), porém significativo, decréscimo na porcentagem das fibras tipo I, após duas semanas de tratamento, e aumento na área de secção transversal das fibras IID, após oito semanas de tratamento, no músculo soleus. Não houve diferenças significativas na porcentagem dos tipos de fibras, ou em suas áreas de secção transversal no músculo extensor digitorum longus. O número de núcleos da fibra muscular, também usado como um indicador de hipertrofia da fibra, não apresentou diferenças significativas nos ratos tratados com L-NAME. Igualmente, não houve alterações significativas na expressão e distribuição das NOSs endotelial e neuronal, ou na expressão das isoformas de miosina de ambos os músculos.Estes resultados mostram que a inibição crônica da biossíntese de NO pelo LNAME, nos períodos pesquisados, em geral não altera os vários parâmetros estudados nos músculos soleus e extensor digitorum longus, exceto para as fibras tipo I e tipo IID no músculo soleus / Abstract: Nitric oxide (NO) is a short-lived gas molecule that modulates neurotransmission, contractile force, glucose metabolism, vascular tone, and muscle function in general. Skeletal muscle is a major source of NO in mammals and expresses all three isoforms of NO synthases (NOS). Inhibitors of the NOS are useful tools for studying the role of NO in muscle physiology. In this work, we examined the effects of chronic treatment of rats with N?-nitro- L-arginine methyl ester (L-NAME), which blocks the synthesis of NO by NOSs, through selected biochemical and morphological parameters of soleus and extensor digitorum longus muscles. Fiber typing, fiber cross-sectional area, expression of myosin isoforms, number of muscle fiber nuclei, and the expression and immunolocalization of endothelial and neuronal NOS were used to assess the effects of NO deprivation. Rats were treated with L-NAME (20 mg/rat/day, in the drinking water) for two, four and eight weeks, after which the animals were sacrificed and the muscles removed and processed for analysis. The chronic treatment of rats with L-NAME caused a slight (13.2%) but significant decrease in the percentage of type I fibers after two weeks of treatment and in the cross-sectional area of IID fibers after eight weeks of treatment in soleus muscle. There were no significant differences in the percentage of fiber types or in their cross-sectional areas in the EDL. The number of muscle fiber nuclei, also used as an indicator of hypertrophy, did not show significant differences in the treated rats. Likewise, there were no significant changes in the expression and distribution of endothelial and neuronal NOS, or in the expression of myosin isoforms. These results show that the chronic inhibition of NO biosynthesis by L-NAME in the time intervals examined, generally did not alter the various parameters studied in rat soleus and extensor digitorum longus muscles, except for type I and IID fibers in soleus muscle / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

O envelhecimento é caracterizado por diversas alterações no organismo, as quais acarretam em fragilidade, maior susceptibilidade a quedas, perda de autonomia e piora da qualidade de vida. O músculo esquelético também é afetado pelo envelhecimento, levando a alterações na locomoção, adaptação metabólica e em sua plasticidade. Alterações na plasticidade - prejudicam a capacidade regenerativa do músculo esquelético, desencadeando modificações em todos os estágios desse processo. Uma estratégia que tem sido bastante utilizada para minimizar/reverter o impacto do envelhecimento na função e plasticidade muscular é o treinamento físico aeróbico (TFA), o qual promove diversos benefícios à musculatura esquelética. Dessa forma, na presente dissertação investigamos a contribuição do TFA de 4 semanas em esteira rolante na capacidade regenerativa do músculo tibial anterior de camundongos jovens e idosos após lesão mecânica. A capacidade regenerativa foi avaliada por métodos histológicos e de imunofluorescência em tecido aos 2, 4 e 15 dias após a indução da lesão mecânica. Os níveis de RNAm de fatores relacionados à resposta regenerativa muscular foram avaliados por PCR em tempo real. Para confirmar a eficácia do TFA e função muscular, avaliamos a capacidade aeróbica, a deambulação e a produção de força ex vivo. Observou-se que o TFA melhorou a função muscular e a capacidade aeróbica dos animais jovens e idosos. No que diz respeito ao processo de regeneração muscular, os resultados obtidos sugerem, aumento da área necrótica, da inflamação, da deposição de colágeno e redução da área de secção transversa das fibras nos animais idosos sedentários ao longo do curso temporal estudado. Adicionalmente, observou-se redução na expressão de genes envolvidos na ativação de células satélites e atraso no processo de diferenciação dessas células nesses animais. OTFA contribuiu para a redução da área necrótica, da inflamação, levando a menor deposição de colágeno e aumento da distribuição das fibras centro nucleadas nos animais idosos. No entanto, não se observou modificações na expressão dos genes com o TFA nesses animais. Portanto, os dados sugerem que o TFA contribui para melhora do processo de regeneração muscular em camundongos idosos / Aging is a biological process characterized by a progressive impairment in physiological systems, which leads to general frailty and reduced exercise tolerance and performance in daily living activities. Skeletal muscle is directly affected by aging, displaying changes in locomotion, metabolic adaptation, and muscle plasticity. Altered muscle plasticity affects muscle regeneration capacity in elderly. Aerobic exercise training (AET) has been used as a strategy to minimize/reverse the impact of aging on muscle function and regenerative function. Thus, we have investigated the contribution of 4-week AET (running on the treadmill) for tibialis anterior muscle regenerative response from mechanical injury in young and old muscle, which were randomly assigned into untrained and trained groups. The regenerative capacity was evaluated by histology and immunofluorescence at 2, 4 and 15 days after the mechanical injury induction. Muscle mRNA levels of regulatory genes involved in muscle regeneration were evaluated by real time PCR. To verify the effectiveness of AET and muscle function, we assessed the aerobic capacity, step length in ambulation test and ex vivo muscle force production. We observed that AE improved muscle function and aerobic capacity of young and old mice. Regarding the muscle regeneration process, our data suggest an increase in necrotic area, inflammation and collagen deposition paralleled by a reduced fiber cross sectional area in sedentary old mice. These responses were associated with changes in gene expression suggesting reduced satellite cells activation and delayed differentiation. AET contributed to reduction in both necrotic area and inflammation, leading to reduced collagen deposition and increased centronucleated fibers, suggesting improved regeneration process. However no changes were observed in mRNA levels of genes studied after AET. Altogether, our data provide evidence for AET improved regeneration process in muscle of old mice

O hormônio tireoideano (T3) é um potente regulador das funções cardíacas e musculares esqueléticas. Desse modo, o presente trabalho identificou o efeito de tal hormônio nas proteínas da banda M sarcomérica, as quais fazem parte das proteínas estruturais cardíacas e musculares esqueléticas. O T3 diminuiu a expressão da proteína M no coração, uma das proteínas da banda M, e agiu diretamente no gene dessa proteína M. No músculo esquelético, T3 aumentou a expressão de EH-miomesina no músculo sóleo e reduziu a expressão de proteína M no músculo extensor digital longo (EDL). Portanto, pode-se concluir que o T3 possui uma importante função na regulação da expressão de proteínas estruturais musculares e a ausência dessas proteínas pode ocasionar lesões das estruturas musculares cardíacas e esqueléticas. / Thyroid hormone (T3) regulates many functions of the heart and skeletal muscle. In this way, the present work identified the effect of T3 on the sarcomeric M band proteins, which are structural proteins from the heart and skeletal muscle. T3 down regulated M protein expression in the heart, one of the M band proteins, and, moreover, T3 could regulate M protein gene directly. In the skeletal muscle, T3 up regulated EH-myomesin expression in soleus muscle and T3 down regulated M protein expression in the extensor digitorum longus muscle (EDL). Therefore, we could conclude that T3 has an essential function in the regulation of muscle structural protein and the absence of these proteins could cause lesions at cardiac and skeletal muscle structures.

Neste estudo, testamos dois novos moduladores seletivos do receptor de glicocorticóide, nomeados L5 e L7, em comparação com o dexametasona, sobre aspectos estruturais, funcionais e moleculares no músculo sóleo. Ratos Wistar foram tratados com doses progressivas de dexametasona, L5 e L7 em 1 ou 7 dias. A massa corporal e a ingestão alimentar apresentaram queda após o tratamento com dexametasona em todas as doses; os tratamentos com L5/L7 mostraram resposta semelhante aos controles. O peso do músculo foi diminuído pelo dexametasona, efeito não observado nos tratamentos com L5/L7. Apenas o tratamento com dexametasona causou uma diminuição na área de secção transversa dos tipos de fibra muscular analisada. A força tetânica do sóleo foi diminuída pela dexametasona, nos tratamentos com L5/L7 este parâmetro também não foi afetado. A expressão gênica de MAFbx/Atrogin-1 e MuRF-1 foi elevada pela dexametasona; por outro lado, L5/L7 não elevaram a expressão destes genes. Concluímos que o L5/L7, em contraste com o dexametasona, preveniu o músculo esquelético da atrofia. / In this study, we have tested two new selective modulators named L5 and L7 along with dexamethasone in skeletal muscle structural, functional and molecular aspects. Male Wistar rats were treated with progressive doses of dexamethasone, L5 and L7 for 1 and 7 days. While body weight and food intake were decreased by the dexamethasone treatment in all doses, L5/L7 treatments induced gain in body weight similarly to controls. Muscle weight was decreased by dexamethasone, while L5/L7 were ineffective. Only the dexamethasone treatment caused a decrease in the analyzed cross sectional area of the skeletal muscle fiber types. Soleus tetanic force was decreased by the dexamethasone treatment, while L5/L7 treatments did not alter this parameter. MAFbx/Atrogin-1 and MuRF-1 gene expressions were elevated by dexamethasone; on the other hand, L5/L7 did not modulate any expression of those genes. We conclude that L5/L7, in contrast to dexamethasone, spare skeletal muscle from structural and functional loss, and molecular changes, reinforcing their role as a therapeutic device.

As lesões dos nervos periféricos, que inervam os músculos esqueléticos, evoluem para perdas da propriocepção e alterações na morfologia e função das fibras musculares, causando um impacto negativo na qualidade de vidas dos indivíduos. Tais lesões implicam em alteração na expressão de genes específicos do músculo, como por exemplo, na MyoD e Miogenina, atuantes na ativação de células satélites e reguladores da massa muscular A técnica cirúrgica de tubulização é um recurso empregado na prática clínica para tratamento de músculos que sofreram desnervação. O objetivo do presente estudo foi analisar se a técnica de tubulização com o preenchimento de gordura altera a expressão de Myod e Miogenina, a morfometria do músculo sóleo de ratos e localização da Myod e Miogenina. Para isso, 57 ratos Wistar foram separados em grupos: controle inicial (GCI); final 45 (GCF45), final 150 (GCF150), desnervado 45 dias (GD45), desnervado 150 dias (GCD150) e grupos experimentais com veia vazia 45 dias (GESP45) e 150 dias (GESP150) e com veia preenchida de gordura 45 dias (GEG45) e 150 dias (GEG150). Para os procedimentos cirúrgicos de desnervação e reinervação e coleta do músculo os animais foram profundamente anestesiados. Após os devidos tempos experimentais, os animais foram sacrificados, o músculo sóleo foi dissecado, envolvido em meio de criopreservação e estocado a -80°C. A quantificação de mRNA do MyoD e Miogenina foi realizada por amplificação por reação em cadeia de polimerase (PCR) em tempo real (RealTimePCR) e a localização da produção de Myod e Miogenina foi realizada por microscopia confocal a laser e imunofluorescência. A morfometria foi realizada em lâminas coradas com HE, observadas em microscópio ótico e calculadas pelo software Image Pro-Plus 6.2. Os resultados do presente estudo mostraram que houve aumento da expressão do Myod e Miogenina nos grupos experimentais 45 dias quando comparados ao grupo controle inicial e um decréscimo da expressão de Myod e Miogenina para os grupos experimentais com 150 dias. A área da secção transversa nos grupos experimentais com 45 dias (GESP45 e GEG45) não apresentaram diferença estatística, quando comparado com grupo desnervado 45 dias (GCD45), enquanto que o grupo experimental com preenchimento de gordura 150 dias (GEG150) obteve os melhores resultados na medida da área da secção transversal do músculo sóleo. As lâminas observadas no microscópio confocal mostram a MyoD e Miogen localizadas no mionúcleo. Concluiu-se que o uso da gordura na técnica de tubulização do nervo ciático de ratos, interfere na regeneração do músculo sóleo. / Peripheral nerve injuries can result in the loss of propioception, morphological and functional alterations of muscle fibers which causes a negative impact on the quality of life. These injuries elicit an alteration on the expression of muscle specific genes, like MyoD and Myogenin, involved in the satellite cell activation and muscle mass regulation. The vein graft tubulization is a well known technique for treatment of denervated muscle. The aim of this work was to investigate if vein graf tubulization filled with fat tissue changes the expression and localization of MyoD and Myogenin and to study if it can modify the morphometry of soleus muscle. Fifty seven Wistar rats were divided in initial control group (ICG), final control group 45 days and 150 days (FCG45; FCG150), denervated 45 days and 150 days (D45; D150) and experimental groups with vein graft 45 days and 150 days (VG45; VG150). and vein graft filled with fat tissue 45 days and 150 days (VF45; VF150). For denervation and reinervation procedures and muscle biopsy the animals were submitted to anaesthesia and after the experimental time they were euthanized. Soleus muscle was dissected, involved in criopreservation medium and stored at -80oC. It was performed RealTime polymerase chain reaction (RealTimePCR) for MyoD and Myogenin mRNA quantification. The localization of its production was analysed by laser confocal microscopy and immunofluorescence staining. The morphometric analysis were done by Hematoxilin-Eosin staining and examined at optical microscopy using the Image ProPlus 6.2 software. There was an upregulation on the expression of MyoD and Myogenin for the experimental groups at 45 days when compared to the initial control group. On the other hand, we found a downregulation on the MyoD and Myogenin expression in the same groups with 150 days. The area of transversal section in the 45 days experimental groups (VF45, VG45) did not show statistical difference compared with denervated group with 45 days (D45). Moreover, the group filled with fat tissue at 150 days (VF150) presented the best results in the transversal section area of soleus muscle. In addition, the slides analysed under confocal microscopy showed the localization of MyoD and Myogenin in the mionuclei. In conclusion, the application of vein graft filled fat tissue improves the soleus muscle regeneration.

Grado de magíster en fisiología / En el músculo esquelético, la función más estudiada del receptor de dihidropiridina o canal de calcio tipo L (Cav1.1), además de su función como canal de Ca+2 tipo L, ha sido el acoplamiento excitación-contracción (ECC). En los últimos años, se ha descrito una nueva función para el Cav1.1, relacionando su actividad al acoplamiento excitación-transcripción (ETC). En el ETC, el Cav1.1 es clave y participa regulando la activación del canal de Panexina 1 (Panx1), el cual permite la salida de ATP desde el interior hacia el exterior de la célula. En fibras musculares, nuestro grupo ha descrito que este proceso de liberación de ATP por parte de Panx1 puede activarse mediante un estímulo eléctrico. Aún más importante, este es un proceso dependiente de la frecuencia de estimulación eléctrica y que, en conjunto a otros intermediarios, genera señales de Ca+2 intracelulares regulando la expresión génica asociada a la plasticidad muscular. El control que ejerce el Cav1.1 sobre la actividad del Panx1 luego de estímulos eléctricos a frecuencias permisivas, demuestra una influencia unidireccional desde Cav1.1 hacia Panx1. Por otro lado, estas proteínas se encuentran a menos de 40 nm de distancia y co-inmunoprecipitan. A pesar de estos hallazgos, la estrecha regulación funcional entre Cav1.1 y Panx1 permanece poco explorada. Se ha descrito que el Cav1.1 en su rol en el ECC, ejerce una regulación unidireccional o anterógrada, en la cual, frente a la depolarización de la membrana plasmática sufre un cambio conformacional que activa al Receptor de Rianodina tipo 1 (RyR1) permitiendo la salida de Ca+2 desde el retículo sarcoplasmático y la contracción muscular. Sin embargo, en las últimas décadas se ha mostrado que existe también una regulación retrógrada desde RyR1 hacia Cav1.1, en la cual el RyR1 puede influenciar las características biofísicas del Cav1.1, como ocurre en modelos de inhibición o ausencia de RyR1, donde se encuentran alteraciones en la corriente de Ca+2 tipo L y en el “movimiento de carga” del Cav1.1. En relación a estos antecedentes, nuestra hipótesis es que existe una regulación retrógrada de Panx1 hacia Cav1.1. En este trabajo, evaluamos la influencia de Panx1 en la función de Cav1.1. Para esto, desarrollamos un modelo de knockdown para Panx1, con la técnica del RNA interferente, mediante la electroporación de un plasmidio shPanx1 en el músculo Flexor Digitorum Brevis (FDB). Medimos la corriente de Ca+2 tipo L y el movimiento de carga en condiciones de “potencial de membrana controlado, en célula completa” (Whole cell Voltage-Clamp) en fibras musculares aisladas del FDB. Observamos una disminución significativa en la amplitud de la corriente de Ca+2 tipo L durante los pulsos de potencial a 0 mV (p=0,023) y 10 mV (p=0,018) en las células que expresaban el plasmidio shPanx1 versus el control. Para el movimiento de carga, observamos una diferencia significativa en el parámetro V0.5, una de las variables de la distribución de Boltzmann para 2 estados, que representa el potencial de membrana al cual se desplaza la mitad de la carga máxima, mostrando una disminución de este valor en las fibras shPanx1 vs el control (p=0,047). De esta manera, podemos concluir que Panx1 cumple un rol en la regulación de la función de Cav1.1 por lo que la interacción funcional entre estas dos proteínas es bidireccional al igual que en el caso de Cav1.1 y RyR1. Esta interacción debe tenerse en cuenta en el desarrollo de futuros tratamientos farmacológicos que tengan como blanco a Panx1 y para condiciones patológicas donde la función de Cav1.1 se encuentre afectada, como la distrofia muscular, así como en aquellos procesos donde la adaptación muscular juega un rol vital, como son el envejecimiento y la diabetes. / In skeletal muscle, the most studied function of dihydropyridine receptor or L-type calcium channel (Cav1.1), in addition to its function as L-type Ca+2 channel, has been the excitation-contraction coupling (ECC). In recent years it has been described a new role for Cav1.1, linking their activity to the excitation-transcription coupling (ETC). In ETC, Cav1.1 is a key participant regulating the Pannexin 1 (Panx1) activation. This channel allows the outflow of ATP in a process dependent on the frequency of electrical stimulation and differents intermediaries, generates intracellular Ca+2 signals regulating gene expression associated with muscle plasticity. However, the close functional regulation between Cav1.1 and Panx1 remains little explored. In addition to this, for Cav1.1 in ECC, initially a unidirectional or anterograde regulation was described, in which Cav1.1 after cellular membrane depolarization undergoes a conformational change that activates ryanodine receptor type 1 (RyR1) allowing the Ca+2 release and muscle contraction. However, in recent decades a retrograde regulation from RyR1 to Cav1.1 has been described, evidenced as a change in the electrophysiology properties of Cav1.1 during blocking or absence of RyR1, with alterations in the L-type Ca+2 current and "Charge Movement", representatives of Cav1.1 function. Our hypothesis is that there is a retrograde regulation from Panx1 to Cav1.1. We evaluated the influence of Panx1 in Cav1.1 function. For this, we decreased the expression of Panx1 by electroporation of a shPanx1 plasmid, encoding an interference RNA against Panx1 in Flexor Digitorum Brevis (FDB). Then we measured the L-type Ca+2 current and the Charge Movement by the "whole cell control voltage" experiment (Voltage-Clamp) in isolated FDB muscle fibers. We observed a significant decrease in L-type Ca+2 current amplitude during the command pulses at 0 mV (p = 0.02297) and 10 mV (p = 0.01778) in shPanx1 vs control (mCherry). In Charge Movement we showed a significant difference in V0.5, a variable in two-state Boltzmann distribution, which represents the voltage at which there is a half maximum charge (Qmax) displacement, with a decrease in shPanx1 V0.5 vs control (p = 0.047). We can conclude that Panx1 has a role in the function of Cav1.1, so they have a bidirectional-relationship, the same that occurs between Cav1.1 and RyR1.

Orientador: Maeli Dal-Pai / Resumo: O músculo esquelético é capaz de adaptação fenotípica à fatores ambientais, como a disponibilidade de nutrientes, alterando o equilíbrio entre catabolismo e anabolismo muscular que, por sua vez, coordena o crescimento muscular. Os pequenos RNAs não codificados, conhecidos como microRNAs (miRNAs), reprimem a expressão de mRNAs alvo e muitos estudos demonstraram que os miRNAs regulam os mRNAs de genes catabólicos e anabólicos. Nós avaliamos a morfologia muscular, a expressão gênica de componentes envolvidos com o catabolismo, anabolismo e metabolismo energético e expressão de miRNAs no músculo rápido e lento de juvenis de pacus (Piaractus mesopotamicus) durante um período de restrição alimentar e realimentação. Nossa análise revelou que períodos curtos de restrição alimentar seguidos por realimentação afetaram predominantemente o músculo rápido, alterando o diâmetro da fibra muscular e a expressão de RNAs e miRNAs. Houve um aumento nos níveis de mRNA dos componentes catabólicos (FBXO25, ATG12, BCL2) e genes relacionados ao metabolismo energético (PGC1a e SDHA), juntamente com uma diminuição nos níveis de PPARβ / δmRNA. Curiosamente, um aumento nos níveis de mRNA dos genes anabólicos (PI3K e complexo mTORC1: mTOR, mLST8 e RAPTOR) também foi observado durante a restrição alimentar. Após realimentação, a morfologia muscular mostrou padrões similares do grupo controle; a maioria dos genes estavam ligeiramente regulados de forma up e down em mabas as musculaturas, respectivamente; o... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Skeletal muscle is capable of phenotypic adaptation to environmental factors, such as nutrient availability, by altering the balance between muscle catabolism and anabolism that in turn coordinates muscle growth. Small noncoding RNAs, known as microRNAs (miRNAs), repress the expression of target mRNAs, and many studies have demonstrated that miRNAs regulate the mRNAs of catabolic and anabolic genes. We evaluated muscle morphology, gene expression of components involved in catabolism, anabolism and energetic metabolism and miRNAs expression in both the fast and slow muscle of juvenile pacu (Piaractus mesopotamicus) during food restriction and refeeding. Our analysis revealed that short periods of food restriction followed by refeeding predominantly affected fast muscle, with changes in muscle fiber diameter and miRNAs expression. There was an increase in the mRNA levels of catabolic pathways components (FBXO25, ATG12, BCL2) and energetic metabolism-related genes (PGC1αand SDHA), together with a decrease in PPARβ/δmRNA levels. Interestingly, an increase in mRNA levels of anabolic genes (PI3K and mTORC1 complex: mTOR, mLST8 and RAPTOR) was also observed during food restriction. After refeeding, muscle morphology showed similar patterns of the control group; the majority of genes were slightly up- or down-regulated in fast and slow muscle, respectively; the levels of all miRNAs increased in fast muscle and some of them decreased in slow muscle. Our findings demonstrated that a sh... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor