Taxonomia vegetal é a ciência que trata da descrição, identificação, nomenclatura e classificação de plantas. O desenvolvimento de novas técnicas que podem ser aplicadas nesta área de conhecimento é essencial para dar suporte às decisões relacionadas a conservação de hotspots de biodiversidade. Nesta dissertação de mestrado foi desenvolvido um protocolo de metabolic fingerprinting utilizando MALDI-MS (matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry) e subsequente análise multivariada utilizando scripts desenvolvidos para o pacote estatístico R. Foram classificadas, com base nos seus metabólitos detectados, 24 plantas de diferentes famílias vegetais, sendo todas elas coletadas em áreas da Savana Brasileira (Cerrado), que foi considerada um hotspot de biodiversidade. Metabolic fingerprinting compreende uma parte da Metabolômica, i.e., a ciência que objetiva analisar todos os metabólitos de um dado sistema (celula, tecído ou organismo) em uma dada condição. Comparada com outros métodos de estudo do metaboloma MALDI-MS apresenta a vantagem do rápido tempo de análise. A complexidade e importância da correta classificação taxonômica é ilustrada no exemplo do gênero Lychnophora, o qual teve diversas espécies incluídas neste estudo. No Brasil espécies deste gênero são popularmente conhecidas como \"arnica da serra\" ou \"falsa arnica\". Os resultados obtidos apontam similaridades entre a classificação proposta e a classificação taxonômica atual. No entanto ainda existe um longo caminho para que a técnica de metabolic fingerprinting possa ser utilizada como um procedimento padrão em taxonomia. Foram estudados e discutidos diversos fatores que afetaram os resultados como o preparo da amostra, as condições de análise por MALDI-MS e a análise de dados, os quais podem guiar futuros estudos nesta área de pesquisa. / Plant taxonomy is the science of description, identification, nomenclature and classification of plants. The development of new techniques that can be applied in this field of research are essential in order to assist informed and efficient decision-making about conservation of biodiversity hotspots. In this master\'s thesis a protocol for metabolic fingerprinting by matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry (MALDI-MS) with subsequent multivariate data analysis by in-house algorithms in the R environment for the classification of 24 plant species from closely as well as from distantly related families and tribes was developed. Metabolic fingerprinting forms part of metabolomics, a research field, which aims to analyse all metabolites, i.e., the metabolome in a given system (cell, tissue, or organism) under a given set of conditions. Compared to other metabolomics techniques MALDI-MS shows potential advantages, mainly due to its rapid data acquisition. All analysed species were collected in areas of the Brazilian Savanna (Cerrado), which was classified as \"hotspot for conservation priority\". The complexity and importance of correct taxonomic classification is illustrated on the example of the genus Lychnophora, of which several species also have been included into analysis. In Brazil species of this genus are popularly known as \"arnica da serra\" or \"falsa arnica\". Similarities to taxonomic classification could be obtained by the proposed protocol and data analysis. However there is still a long way to go in making metabolic fingerprinting by MALDI-MS a standard procedure in taxonomic research. Several difficulties that are inherent to sample preparation, analysis of plant\'s metabolomes by MALDI-MS as well as data analysis are highlighted in this study and might serve as a basis for further research.

Sepsis är ett allvarligt tillstånd som uppstår när bakterier går från vävnad till blodbanan. Positiva blododlingar odlas på agarplattor och bakterier analyseras med Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Time-of-flight Mass spectrometry (MALDI-TOF MS) där prov blandas med en matrix och sedan bestrålas med laser. Proteinerna i provet joniseras och rör sig mot en detektor, vilket ger ett m/z-spektrum som jämförs med referensspektrum i en databas och ett score-värde erhålls över hur väl analyten liknar referensen. Arbetets syfte var att undersöka möjligheten att direktidentifiera bakterier från blod med en viss preparation innan analys med MALDI-TOF MS och på så vis möjliggöra snabbare preliminära svar samt undersöka möjligheten att särskilja Staphylocoocus aureus och koagulasnegativa stafylokocker. Innan analys med MALDI-TOF MS centrifugerades blod från positiva blododlingar blod i flera steg med 5 % natriumkloridlösning (NaCl-metoden). Dessutom testades ett kommersiellt kit (Sepsityper, Bruker Daltonics). Med NaCl-metoden sågs korrekt identifiering hos 66 % av inokulerade proverna. Av blododlingar innehållande med S. aureus respektive koagulasnegativa stafylokocker identifierades 60 % respektive 43 % av bakterierna korrekt. Med Sepsiptyper erhöll 58 % av proverna godkänt score-värde. Slutsatsen blev att det är möjligt att identifiera bakterier direkt från blod efter viss preparation, men metoden bör utvecklas mer då det fanns en signifikant skillnad i score mellan NaCl-metoden och nuvarande metod. Det är dock möjligt att skilja mellan Staphylococcus aureus och koagulasnegativa stafylokocker. Fler studier är nödvändiga för att avgöra möjligheten att föra in någon av metoderna i rutindiagnostiken.

La lutte anti-vectorielle est l’un des volets le plus important de l’entomologie médicale et nécessite une identification précise des vecteurs. Cette dernière décennie, la technique du MALDI-TOF MS a prouvé son potentiel comme outil rapide et efficace pour l'identification des arthropodes hématophages adultes. Dès lorsNous nous sommes intéressés à la mise au point d’un protocole d’identification des stades aquatiques de moustique par MALDI-TOF MS d’une part. D’autre part la détection d’un pathogène dans un arthropode n’implique pas forcement sa capacité à transmettre. L’incrimination d’un arthropode comme vecteur respecte certaines règles allant de la suspicion à la démonstration de sa compétence vectorielle au laboratoire. Afin de mieux comprendre l’épidémiologie de R. felis nous avons d’abord participé à une investigation conduite à l’Ile de la Réunion, en testant des puces, les seuls vecteurs biologiques connus jusqu’à présent. Ensuite Nous avons démontré le rôle potentiel des moustiques en particulier d’Anopheles gambiae à transmettre Rickettsia felis. Enfin nous avons utilisé le MALDI-TOF MS pour la détermination du statut infectieux d’Anopheles gambiae à R. felis. Nous proposons également un cycle probable de transmission de R. felis à l’homme incluant les psoques et les moustiques. / Vector control is one of the most important aspects of medical entomology and requires accurate identification of vectors. Within the past decade, the MALDI-TOF MS technique has proven its potential as a fast and effective tool for identification of adult blood-sucking arthropods. From then on we were interested in the development of an identification protocol of aquatic stages of mosquitoes by MALDI-TOF MS. On the other hand, the detection of a pathogen in an arthropod does not necessarily mean its ability to transmit. Incrimination of an arthropod as vector follows certain rules ranging from suspicion to demonstrate its vector competence in the laboratory. To better understand the epidemiology of R. felis we first participated in an investigation conducted in Reunion, testing fleas, the only biological vectors known to date. We demonstrated the potential role of the mosquito particularly Anopheles gambiae, in the transmission of R. felis. Finally, we used the MALDI-TOF MS for the determination of the Anopheles gambiae infection status to R. felis. We also offer a probable transmission cycle of R. felis to man including psocids and mosquitoes.

Le répertoire des bactéries est mal connu en Afrique du fait des méthodes d’étude essentiellement basées sur des techniques de culture sur milieux simples associées à des tests biochimiques, ce qui ne permet pas son exploration. Il a néanmoins été récemment bouleversé par l’usage systématique de la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF MS.Au cours de nos travaux de thèse de doctorat, nous avons utilisé deux types de spectromètres de masse: le MALDI-TOF Vitek MS, nouvellement installé à Dakar; le MALDI-TOF Microflex LT, installé à Marseille. Les résultats que nous avons obtenus ont montré, pour la première fois, que la technique du MALDI-TOF est efficace et tout à fait adaptée en Afrique pour le diagnostic spécifique de routine. Cette performance a conduit le laboratoire clinique de l’HPD à opter pour son utilisation à la place des traditionnelles techniques d’identification phénotypique telles que les galeries API. Nous avons également confirmé que le MALDI-TOF est un puissant outil d’identification des espèces bactériennes rarement impliquées dans les maladies infectieuses humaines. De plus, cet outil nous a permis de détecter sept nouvelles espèces de bactéries isolées pour la première fois chez l’homme. En Afrique, il faudrait donc multiplier l’installation de spectromètre de masse MALDI-TOF, ou mettre en place des réseaux autour de plateformes MALDI-TOF sous-régionales partagées entre plusieurs structures sanitaires et/ou de recherche. / The Africa bacteria repertory is unfamiliar because the available tools in this region are not allowed its best knowledge. In fact, bacteria are most often identified using culture techniques on simple media and biochemical tests which enable the identification of some common characters. These methods do not facilitate an exhaustive knowledge of the bacterial repertory; consequently they have recently been revolutionized by the systematic use of MALDI-TOF mass spectrometry (MS).In our thesis we used two mass spectrometers, respectively, MALDI-TOF Vitek MS currently installed at Dakar (Senegal) and MALDI-TOF Microflex LT installed in Marseille (France). In addition we have also confirmed that MALDI-TOF is a powerful tool for identifying bacterial species rarely involved in human infectious diseases. Thus in adopting the MALDI-TOF as a first-line tool in bacterial identification before Gram staining or other techniques of phenotypic identifications based on chemical characteristics, we discovered seven new species of bacteria isolated for first time in humans. Microbial identification using MALDI-TOF MS is currently feasible in Africa. Its performance and effectiveness in routine diagnosis of clinical microbiology laboratories have been proven. It is necessary either to increase the installation of MALDI-TOF, or establishing a network around a shared MALDI-TOF platform between several structures located in the same area, especially in the underdeveloped countries of Africa amortization of investment costs of the device, because it allowed reducing the time of reporting results and indirectly facilitating better care for patients.

L’oxygénation d’un tissu ou d’une cellule résulte d’un équilibre entre la disponibilité en oxygène et sa consommation. Un arrêt de la circulation ou des variations de la pression partielle en oxygène sont responsables d’une réduction de l’apport en oxygène induisant une réponse adaptative.L’objectif de ce travail a été de caractériser l’hypoxie de l’échelle cellulaire à tissulaire par la complémentarité de deux techniques d’imagerie par spectrométrie de masse (ISM) : La spectrométrie de masse à ionisation secondaire (SIMS) et l’ionisation/désorption par laser assistée par matrice (MALDI). L’ISM fournit la détection, l’identification et la distribution d’une variété d’espèces moléculaires endogènes et exogènes directement sur tissu sans marquage. Afin de caractériser l’hypoxie, un modèle in vitro de culture cellulaire en trois dimensions (sphéroïde) et un modèle in vivo d’accident vasculaire cérébral ont été utilisés.L’imagerie TOF-SIMS nous a permis de voir que la disponibilité réduite de l’oxygène au centre des sphéroides induit de profonds changements métaboliques. L’imagerie MALDI-TOF, quant à elle, a permis de visualiser la pharmacocinétique de différents traitements dans des sphéroides traités.Concernant l’étude sur l’accident vasculaire cérébral, l’imagerie SIMS et MALDI nous ont fourni une signature moléculaire de l’hypoxie tissulaire, apportant de nouvelles connaissances sur les changements physiopathologiques induits par la lésion tissulaire.La complémentarité de ces deux techniques d’imagerie permet donc une réelle synergie pour l’étude de l’hypoxie dans différents modèles. / Tissue or cells oxygenation results from a balance between oxygen availability and consumption. This availability is determined by the amount of oxygen carried by the blood irrigating the tissue and its diffusion capacity through the cell membranes. The interruption of blood flow or variations in the oxygen partial pressure are responsible for a reduction of oxygen intake that induces an adaptive response.The aim of my work is to characterize the hypoxia from cellular to tissue-level via the complementarity of two mass spectrometry imaging (MSI) methods: the Secondary Ion Mass Spectrometry (SIMS) and Matrix-Assisted Laser Desorption and Ionization (MALDI). MSI has the potential to provide detection, identification and distribution of a variety of different endogenous and exogenous molecular species directly from the tissue without labelling. Here we combine them to characterize hypoxia in vitro on a 3D cell culture system (spheroid) and in vivo using ischemic rat model.We have shown via TOF-SIMS imaging that reduced availability of oxygen to the center of spheroids induces profound metabolic changes. MALDI-TOF imaging helped to visualize the pharmacokinetics of different treatments in treated spheroids.Concerning the ischemic stroke, MSI provides a molecular signature of hypoxia in tissue, which could bring new insights into the pathological changes induced by the tissue injury.The complementarity of these two imaging techniques allows real synergy for the study of hypoxia in different models.

L’avènement de la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF a révolutionné la microbiologie en permettant l’identification précise des bactéries et des levures en seulement quelques minutes. En 2010, la MALDI-TOF SM n’était pas applicable à l’identification des champignons filamenteux. Un protocole d’identification générant des spectres interprétables de champignons filamenteux fut d’abord mis au point, suivi par le développement d’une architecture de banque originale. Enfin une banque de références solides, intégrant des références pour la majorité des espèces de moisissures impliquées en pathologie humaine, fut créée en collaboration avec le BCCM/IHEM. Les qualités d’identification de cette banque ont été démontrées non seulement à l’échelle localemais également à l’échelle nationale . Dans un second temps, nous sommes intéressés à l’identification des levures. Nous avons déterminé qu’une extraction complète est le meilleur protocole d’identification des levures en utilisant la banque de référence Bruker ™. Afin d’améliorer le diagnostic clinique,nous avons testé un protocole d’identification sur un séries de 6192 levures isolées de prélèvements cliniques reçus au laboratoire pendant un an. Enfin nous avons pu démontrer en utilisant nos « systèmes » d’identification par MALDI-TOF MS la sous-estimation de la diversité des espèces de moisissures et de levures isolées des prélèvements cliniques, lorsqu’on ne disposait que de techniques conventionnelles d’identification. La mise à disposition d’un tel outil ouvre de grandes perspectives dans le domaine de la mycologie, tant d’un point de vue épidémiologique que clinique. / During the last decade, MALDI-TOF MS has revolutionized microbiology by enabling the accurate identification of bacteria and yeast in only few minutes1. At the beginning of this work in 2010, MALDI-TOF MS was not yet optimized for mold identification. To meet this need, we established an identification protocol to generate interpretable mold spectra. The structure of the reference database was developed taking intoaccount the heterogeneity of molds in culture. Finally, a comprehensive reference database,including references for the majority of molds encountered in human pathology, was created in collaboration with the BCCM/IHEM. Identification performance of this database was tested and validated at both a local scale and an international scale . We also determined the best-adapted pre-treatment protocol to identify yeasts in a routine setting. The protocol was tested on a panel of 6192 yeast isolates recovered from clinical samples submitted to our laboratory over the course of one year. Using our fungal identification system, we were able to identify morphologically similar species and highlight the underestimation of fungal pathogen diversity. The development of our MALDI-TOF MS-based fungal identification system presents numerous opportunities in the field of mycological, from both an epidemiological and clinical point of view. In subsequent studies, defining the clinical meaning of emerging species identified via MALDI-TOF MS will profoundly modify our perspective of fungal diseases.

Au regard des nombreux avantages en terme de rapidité, de coût, de sensibilité et de fiabilité de la spectrométrie de masse MALDI-TOF nous avons cru pouvoir l’appliquer à l’étude des cellules eucaryotes intactes, en particulier à l’étude des cellules immunitaires. Nous avons ainsi montré que cette approche était applicable à l'analyse globale des cellules eucaryotes y compris des cellules immunitaire circulantes. En outre, elle a permis de caractériser les multiples facettes d'activation des macrophages humain en analysant les données avec le logiciel R, la librairie « MALDIquant » et des algorithmes spécifiques. Les empreintes peptidiques/protéiques induites par les agonistes M1, IFN-γ, TNF, LPS et LPS + IFN-γ ou les agonistes M2, IL-4, TGF-β1 et IL-10, sont distinctes des macrophages non stimulés et spécifiques de chaque agoniste. La spectrométrie de masse MALDI -TOF peut ainsi être utilisée pour caractériser les sous-types de macrophages M1 et M2. En outre, les empreintes induites par des bactéries extracellulaires (streptocoque du groupe B, Staphylococcus aureus) sont spécifiques et similaires à celles induites par l'IL-4. Les réponses des macrophages à des bactéries intracellulaires (BCG, Orientia tsutsugamushi, Coxiella burnetii) sont également uniques. La spectrométrie de masse MALDI-TOF sur cellules entières a ainsi révélé donc les multiples facettes d'activation des macrophages humains. Enfin, des résultats préliminaires montrent que notre approche pourrait être utilisée en clinique en analysant les cellules circulantes de la réponse immune. / In view of the many advantages in terms of speed, cost , sensitivity and reliability of the MALDI -TOF mass, we thought we could apply it to the study of intact eukaryotic cells, in particular the study of cells immune . We have shown that this approach is applicable to the global analysis of eukaryotic cells including circulating immune cells. In addition, it allowed us to characterize the many faceted of human macrophage activation by analyzing the data with the R software library " MALDIquant " and specific algorithms. The protein/peptide fingerprint induced by the M1 agonists : IFN - γ , TNF , LPS and LPS + IFN - γ or M2 agonists : IL- 4 , TGF - β1 and IL- 10 are distinct to unstimulated macrophages and specific for each agonist. MALDI -TOF Mass spectrometry can then be used to characterize the subtypes M1 and M2 macrophages . In addition, fingerprints induced by extracellular bacteria ( group B streptococcus , Staphylococcus aureus ) are specific and closed to those induced by IL -4 . The responses of macrophages to intracellular bacteria (BCG, Orientia tsutsugamushi , Coxiella burnetii ) are also unique. Mass spectrometry MALDI -TOF of whole cell revealed therefore the multifaceted activation in human macrophages . Finally, preliminary results show that our approach could be used clinically for the analysis of circulating cells in the case of host-pathogen interaction.

Les méthodes pour le diagnostic des infections à mycobactéries sont restées pratiquement inchangées pendant des décennies et n'auraient probablement pas progressé sans la réémergence inattendue de la tuberculose (TB) au cours des vingt dernières années du 20ème siècle. Le diagnostic de laboratoire de la tuberculose pulmonaire repose principalement sur la détection des organismes du complexe Mycobacterium tuberculosis (MTC) dans les prélèvements respiratoires par leur isolement et identification ou par les méthodes moléculaires. Pour les patients qui n’expectorent pas, des échantillons du tractus respiratoire peuvent être obtenus par des procédures invasives. En nous basant sur la survie connue de MTC dans le liquide gastrique, nous avons considéré que les MTC devraient également être détectables dans les selles. Nous avons recherché des MTC en parallèle dans des échantillons de tractus respiratoire et dans les selles récoltés des mêmes patients. Mycobacterium tuberculosis a été détecté après décontamination à la chlorhexidine dans des cultures sur des milieux à base d'œuf et par l'examen direct microscopique après coloration de Ziehl-Neelsen. Après la mise au point d’une technique originale d’extraction de l’ADN total à partir des selles, nous avons utilisé la détection de M. tuberculosis par PCR en temps réel en duplex utilisant le gène IS6110 comme cible moléculaire et un contrôle interne de présence d’inhibiteurs de la PCR. Ces travaux mettent en évidence l’intérêt et la sensibilité de l’analyse des selles pour le diagnostic de la tuberculose pulmonaire. Cette technique est aujourd’hui utilisée dans notre laboratoire en routine et est en cours d’évaluation par d’autres équipes.Actuellement, l'identification des mycobactéries basée sur l’analyse des caractéristiques biochimiques (test à l’uréase, test de la nitrate réductase, test de la résistance à la pyrazinamide (pza), test de la sensibilité, test de la résistance à la thiophen-2-carboxylic acid hydrazide (TCH) etc …) est le plus souvent remplacée par des méthodes de biologie moléculaire dont l’amplification par PCR d'un gène spécifique. Ces méthodes sont laborieuses et peuvent exiger un degré d'expertise élevé. Afin de simplifier l'identification précise des isolats de mycobactéries en laboratoire de routine, après avoir vérifié l’inactivation des MTC par la chaleur et l’éthanol pour pouvoir travailler hors du laboratoire P3, nous avons mis au point les conditions pour l'utilisation de la spectrométrie de masse « matrix-assisted laser desorption and ionisation-time-of-flight» (MALDI-TOF-MS) en association avec un logiciel bioinformatique spécifique, comme outil d’identification et de différenciation entre les membres du complexe MTC, du complexe Mycobacterium avium et les autres mycobactéries non-tuberculeuses. Nous avons ensuite appliqué cette technique afin d’identifier les mycobactéries à partir du milieu liquide Middlebrook 7H10 utilisé dans une étuve automatisée. L’identification des mycobactéries isolées dans notre laboratoire, est maintenant réalisée en routine par MALDI-TOF-MS. L’ensemble de ces travaux contribue à améliorer le diagnostic de routine de la tuberculose pulmonaire et les techniques mises au point sont utilisées en routine dans notre laboratoire, en particulier dans le cadre d’un « kit tuberculose ». / The diagnosis of mycobacterial infections remained practically unchanged during numerous decades and would not probably have progressed of the whole without the unexpected re-emergence of the tuberculosis (TB) during the last twenty years of the 20th century.The diagnosis of laboratory of pulmonary tuberculosis is mainly based on the detection of microorganisms of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) in the respiratory specimens. For the patients who do not expectorate, samples of the respiratory tract can be only obtained according to invasive procedures. Based on the survival known for MTC organisms in the gastric liquid, we considered that MTC organisms would be detectable also in samples of stools. We compared the presence of bodies MTC in samples of respiratory tract and the specimens of stools collected from the same patients. MTC was detected in cultures on egg-based media after appropriate decontamination using the chlorhexidine and by the microscopic examination after Ziehl-Neelsen staining. After the set on of an original protocol of the total DNA extraction from stools, we were able to use by the detection with the real-time PCR of IS6110 using internal controls as PCR inhibitor control. This protocol illustrate the utility of stool analysis for the diagnosis of pulmonary tuberculosis, this technique is actually used in routine in our laboratory, it is also under investigation by other research teams.Phenotypic identification of mycobacteria based on the analysis of biochemical pattern (urase test, nitrate reductase test, resistance to pyrazinamide (pza) test, susceptibility to thiophen-2-carboxylic acid hydrazide (TCH) test, etc …) is more often replaced by molecular methods using DNA, including the development by PCR of a specific gene. These methods are generally laborious and can require a considerable degree of expertise. To simplify the identification specifies isolates of mycobacteria routinely in the laboratory, we estimated the use of the mass spectrometry "matrix-assisted laser desorption and ionization-time-of-flight" (MALDI-TOF MS) in association with a specific bioIT software, was capable of identifying and of distinguishing between the members of Mycobacterium tuberculosis complex, Mycobacterium avium complex and the non- tuberculosis mycobacteria. We verified the MTC inactivation by heating or by ethanol allowing the analysis of the inactivated MTC out of the P3 laboratory; we studied the cost-effectiveness of this method from the blood solid media by extrapolating this approach in the emergent countries. We then applied the same method to identify mycobacteria from Middlebrook 7H10 liquid media used in an automated oven. Identification of cultured Mycobacteria is now done in routine in our laboratory by MALDI-TOF-MS. These data contribute in improving the routine diagnosis of pulmonary tuberculosis and this protocol is then used routinely in our laboratory, particularly with the “kit de tuberculose” we set on.

Cette thèse a été consacrée à l’amélioration de méthodes en imagerie par spectrométrie de masse, et à leur utilisation pour l’analyse in situ de substances naturelles. Une première partie a été consacrée à développer une nouvelle méthode permettant d’acquérir en imagerie TOF-SIMS des images avec une résolution de 400 nm tout en préservant la résolution en masse. Pour cela, une extraction retardée des ions secondaires a été caractérisée et optimisée. Une seconde partie a eu pour objectif d’étudier le phénomène de duraminisation d’un arbre tropical de l’espèce Dicorynia guianensis, qui est l’un des plus exploités en Guyane française et dont le duramen est réputé être imputrescible. Les images par spectrométrie de masse TOF-SIMS enregistrées avec la méthode développée ont montré à l’échelle sub-micrométrique les changements métaboliques s’opérant autour de la zone de transition, où s’opère la duraminisation. Les techniques TOF-SIMS et MALDI-TOF ont ensuite été utilisées pour l’analyse d’une surface sur laquelle ont crû deux souches microbiennes en compétition. Les deux souches ont été extraites d’un if japonais (Cephalotaxus harringtonia), l’une étant un champignon endophyte (Paraconiothyrium variabile) et l’autre une bactérie pathogène à ce conifère (Bacillus subtilis). Les résultats ont montré que le champignon était capable d’hydrolyser les surfactines produites par la bactérie. Enfin, les imageries par spectrométrie de masse MALDI-TOF et TOF-SIMS sont deux méthodes de choix pour l’étude de modèle in vitro de ce qui pourrait se produire in vivo. / This thesis was devoted to the improvement of mass spectrometry imaging methods, and to their use for in situ analysis of natural substances. The first part of this thesis has been dedicated to the development of a new acquisition mode in TOF-SIMS imaging able to acquire images with a high spatial resolution of 400 nm while keeping a good mass resolution. For that, a delayed extraction of the secondary ions has been characterized and optimized. Then, a second part has been dedicated to the study of heartwood production in a tropical species named Dicorynia guianensis. This species is one of the most exploited in French Guiana for its heartwood which exhibits a good durability. Metabolic changes are shown by sub-micrometric resolution ion images recorded in and around the transition zone, where the heartwood formation occurs. Then, TOF-SIMS and MALDI-TOF have both been used to analyse the surface of a bacterial competition. Species have been isolated from a Japanese conifer (Cephalotaxus harringtonia), from which the stains are an endophitic fungi (Paraconiothyrium variabile) and a pathogenic bacteria of the conifer (Bacillus subtilis). The results have shown that the fungus is able to hydrolyze surfactines produced by the bacteria during the competition. Furthermore, both the MALDI-TOF and the TOF-SIMS mass spectrometry imaging are methods of choice to study in vitro models of what could happen in vivo.

La chromoblastomycose (CBM) et la sporotrichose (SPT) sont des infections fongiques chroniques des tissus sous-cutanés. Elles touchent surtout les membres, après blessure végétale ou souillure tellurique. Les principaux agents fongiques responsables de CBM appartiennent aux genres Fonsecaea et Cladophialophora tandis que Sporothrix est à l’origine de la SPT. A Madagascar, les études menées entre 1955 et 1994 ont montré une prévalence de la CMB à 0,5/100 000 habitants faisant considérer ce pays comme le premier foyer mondial. Depuis, aucune donnée n’a permis d’actualiser ces observations. Malgré les nombreux cas de SPT observés par les médecins, son épidémiologie à Madagascar n’a jamais été décrite.L'objectif général était d'évaluer l’incidence actuelle de ces mycoses à Madagascar. Les objectifs spécifiques étaient de caractériser les espèces fongiques responsables et de mettre en place un réseau clinico-biologique pérenne permettant une gestion adaptée des patients et l’utilisation de méthodes moléculaires pour l’identification des souches.Une étude prospective conduite entre mars 2013 et juin 2017 a donné lieu à des consultations dans les régions ou dans le service de dermatologie de l’hôpital universitaire d’Antananarivo et a permis d’inclure des patients présentant des lésions sous-cutanées chroniques. Les méthodes conventionnelles de diagnostic mycologique ont été complétées par des méthodes moléculaires (PCR, séquençage, MALDI-TOF-MS). Les cas ont été classés au cours de réunions de concertation clinico-biologique.Au total, 148 patients d’âge moyen de 41 ans avec une prédominance d’hommes (75,0%) ont été inclus : 63 cas de SPT (42,5%) et 50 cas de CBM (33,8%) ont été confirmés. L’incidence annuelle de le CBM a été estimée à 0,38/100 000 habitants dans la région Sava au Nord où les cas prédominent avec au niveau du district Anosibe An’Ala (à l’Est) une incidence maximale de 1,12/100 000. Alors que la CBM était prédominante dans le Nord-Est, l'Est et le Sud de l'île, étonnamment, la SPT était presque exclusivement localisée sur les hautes terres centrales. L’incidence globale moyenne de SPT était de 0,17/100 000 habitants dans les hauts plateaux et de 0,07/100 000 pour l’ensemble de Madagascar. Pour la SPT, le risque est plus élevé chez les jeunes (< 18 ans) et les formes cutanéo-lymphatiques des membres supérieurs sont les plus fréquentes. Pour la CBM, le risque de contamination est élevé chez les agriculteurs et les professions de services et la majorité des lésions (82,9%) était localisée au niveau des membres inférieurs. Sur le plan mycologique, 63 Sporothrix schenckii, 7 Cladophialophora carrionii, 29 Fonsecaea sp dont 22 F. nubica ont été identifiés. Pour le genre Fonseceae, l’identification de l’espèce nubica remplace l‘espèce pedrosoi initialement proposée pour les isolats malgaches et souligne l’importance de l’identification moléculaire pour une classification précise des espèces.Cette première étude sur la SPT humaine à Madagascar a permis d’actualiser les données épidémiologiques mondiales et de classer Madagascar avec un niveau endémique modéré alors qu’il était considéré comme faible jusque-là. La CBM persiste à une incidence élevée et comparable à celle décrite jusqu’en 1994, illustrant l’absence de contrôle de cette mycose dans le pays. La constitution d’un réseau clinico-biologique local stable et les nouveaux outils diagnostics mis en place dans ce travail (PCR et le MALDI-TOF MS), vont faciliter la conduite de programmes de surveillance et de contrôle alors que l’OMS a récemment classé la CBM en maladie tropicale négligée. Une enquête environnementale est en cours pour détecter les sources de contamination dans l’environnement. Le réseau mis en place permettra dans un futur proche de nouvelles études thérapeutiques (nouveaux schémas thérapeutiques) ou génétique (facteurs d’hôtes) sur la CBM et SPT mais également sur d’autres mycoses endémiques et encore négligées à Madagascar / Chromoblastomycosis (CBM) and sporotrichosis (SPT) are chronic subcutaneous or cutanéo-lymphatic infections found mostly in tropical and subtropical regions. Studies carried out by the Institut Pasteur of Madagascar between 1955 and 1994 provided an inventory of the number of cases of CBM and identified this country as the leading focus of this mycosis worldwide. Mean incidence was estimated at about 0.5/100,000 inhabitants at the time. No new data have been obtained to update the epidemiological situation. About SPT, only sporadic cases have been reported in Madagascar, due to the absence of specific surveillance. CBM is usually caused by dematiaceous fungi, principally Fonsecaea spp. and Cladophialophora spp. The causal agent of SPT is Sporothrix schenckii, a dimorphic hyphomycete.The objectives of this study was to update the data on epidemiology and to evaluate the current burden of these two fungal infections. In addition, we aimed to set up a durable local bio-clinical network and to implement molecular tools to ensure reliable species identification (PCR, sequencing, mass spectrometry).A prospective study, involving the recruitment of patients with suspect lesions was undertaken from March 2013 to June 2017. Patients were included in the dermatology department of the univerity hospital of Antananarivo and through field campaigns in rural areas. Clinical samples were collected and analyzed with conventional mycological methods and molecular tools. Classification of the cases was achieved by the confrontation of mycological and clinical features.Among the 148 patients (mean age 41; male 75.0%): 63 SPT cases (42.5%) and 50 CBM cases (33.8%) were diagnosed. The highest annual incidence of CBM was estimated at 0.38/100,000 inhabitants in the Sava region located to the north. At the district level, the peak incidence was 1.12/100,000 at Anosibe An’Ala, eastern part of the country. Whereas CBM predominated at the periphery of the island, SPT was surprinsgly concentrated in the highlands where the mean incidence was 0.17/100,000 inhabitants. The incidence in the whole country was 0.07/100,000. SPT likelihood of infection was higher in young (<18 years) and the cutaneo-lymphatic forms of the upper limbs were the most frequent. For CBM, farmers and service workers were at high risk and the lesions were mostly (82.9%) located to the lower limbs. The mycological analyses revealed 63 strains of Sporothrix schenckii, 7 of Cladophialophora carrionii, 29 of Fonsecaea sp including 22 F. nubica. F. nubica identification corrected the one of F. pedrosoi previously found in Madagascar, highlighting the need for a molecular analysis of the strains.This is the first study describing human SPT in Madagascar. The SPT burden can now be considered as moderate instead of low as it was described before. It reveals an unexpected concentration of the patients in the central highlands. CBM burden was found at a high level, regrettably similar to the one described 20 years ago, showing the lack of control of this infection. The implementation of a durable bio-clinical network and of the new molecular tools (PCR et le MALDI-TOF MS) developed in this work will easy the development of surveillance programs, especially as the WHO recently added CBM in the neglected tropical diseases list. The network that was built for this work will be used for further therapeutic trials on new schedules of treatment, new drugs or new formulations as well as genetic studies about predisposing factors of CBM and SPT and others deep fungal infections that are still neglected in Madagascar. Yet, an environmental survey is ongoing to describe the sources of contamination.