As espécies do Complexo Acinetobacter calcoaceticus-A. baumannii (ACB) são importantes causadoras de Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde em todo o mundo. Detêm maior relevância os isolados com resistência aos antimicrobianos, os quais impactam negativamente no prognóstico, na mortalidade e custos associados ao cuidado com o paciente. O objetivo deste estudo foi avaliar a diversidade genética e o perfil de susceptibilidade antimicrobiana de 134 isolados multirresistentes de A. baumannii presentes no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, entre 2007 e 2014. A identificação de A. baumannii deu-se pela pesquisa dos genes blaOXA-51-like e gltA, detectados em 85% (n=114) dos isolados Os isolados de Acinetobacter não-baumannii foram identificados por sequenciamento gênico como A. nosocomialis (n=4; 3,1%), A. pittii, A. bereziniae (n=2; 1,7%, cada), A. ursingii, A. variabilis, A. gyllenbergii (n=1; 0,9% cada) e Acinetobacter spp (n=2; 1,7%). Os isolados de A. baumannii foram submetidos às técnicas de PCR multiplex para detecção de outras oxacilinases, pesquisa de ISAba1, teste de susceptibilidade antimicrobiana, tipagem molecular por eletroforese em campo pulsado (PFGE), por sequência trilocus (3LST) e por sequência multilocus (MLST). Detectou-se o gene blaOXA-23-like em 105 isolados (92,1%), estando 100% associados a ISAba1; blaOXA-72 em um isolado (0,9%) e blaOXA-231 em dois isolados (1,7%). A maior parte (n=66; 57,9%) dos isolados foi classificada como extensivamente resistentes (XDR). O PFGE agrupou os isolados em 11 clusters (A-K) e o MLST identificou os isolados pertencentes majoritariamente aos clones CC79 (42,4%), CC1 (16,6%), CC15 (12,1%) e ao ST317 (18,2%). Os resultados do MLST e 3LST concordaram em 95,6%. Foi verificada a ocorrência de diferentes perfis de PFGE em A. baumannii MDR e XDR, predominando cepas carreadoras de ISAba1/OXA-23-like e pertencentes aos CC1, CC15, CC79, ST317. Predominaram o ST317 nos anos iniciais e o CC79 (ST730) de 2011 a 2014. Estes resultados fornecem subsídios que ressaltam a necessidade de monitoramento e controle de patógenos multirresistentes / Species of Acinetobacter calcoaceticus-A. baumannii Complex (ACB) are important causes of Healthcare Associated Infections worldwide. More relevant are isolates with antimicrobial resistance, which have a negative impact on the outcome, mortality and costs associated with patient care. The aim of this study was to evaluate the genetic diversity and the antimicrobial susceptibility profile of 134 multiresistant ACB spcies strains present at Botucatu Medical School Teaching Hospital between 2007 and 2014. Identification of A. baumannii species was by detection of blaOXA-51-like and gltA genes, detected in 85% (n=114) of the isolates. Non-baumannii Acinetobacter species were identified by gene sequencing as A. nosocomialis (n=4, 3.1%), A. ursingii, A. variabilis, A. gyllenbergii (n=1, 0.9% each) and Acinetobacter spp (n=2; 1.7%). A. baumannii isolates were submitted to multiplex PCR for other oxacillinases and ISAba1 detection, antimicrobial susceptibility testing, molecular typing by pulsed field gel electrophoresis (PFGE), trilocus sequence typing (3LST) and multilocus sequence typing (MLST). blaOXA-23-like gene was detected in 105 isolates (92.1%), of which 100% were associated with ISAba1; blaOXA-72 was present in one isolate (0.9%) and blaOXA-231, in two isolates (1.7%). The majority (n=66; 57.9%) of isolates were classified as extensively resistant (XDR). The PFGE grouped the isolates into 11 clusters (A-K) and MLST identified the isolates belonging mainly to CC79 (42.4%), CC1 (16.6%), CC15 (12.1%) and ST317 (18.2%). MLST and 3LST results were 95.6% concordant. We verified the occurrence of different PFGE profiles in multidrug-resistant (MDR) and extensively drug-resistant (XDR) A. baumannii, predominantly presenting ISAba1/OXA-23-like genes and belonging to CC1, CC15, CC79 and ST317. There was a prevalence of ST317 in the early years and CC79 (ST730) from 2011 to 2014. Our results highlight the importance of surveillance and control of multiresistant pathogens

Um total de 107 S. aureus isolados de casos de mastite, glândulas portadoras, pele do úbere, ordenhadores e insufladores, em rebanhos de São Paulo e Pernambuco, foram tipados por técnicas moleculares PCR-RFLP do gene coa e PCR de spa distinguiram seis perfis. Todas as amostras amplificaram genes coa, spa, icaA e 69% produziram biofilme glicose-induzido in vitro. PFGE identificou 31 perfis e 12 linhagens. Uma linhagem foi predominante (P < 0,0001) e amplamente disseminada em ambas as regiões. Um mesmo perfil foi isolado de mastite clínica, subclínica e portadoras. Houve heterogeneidade genética entre isolados de fazenda. Isolados de origem humana e animal constituíram populações distintas. Poucos isolados de leite, insufladores e pele do úbere tiveram igual perfil. Uma amostra extramamária, 77% dos isolados de leite e. 99% de S. aureus de portadoras produziram biofilme. Não foi detectada correlação entre produção de biofilme e CCS. O isolamento sucessivo do mesmo perfil de PFGE de glândulas assintomáticas por mais de 16 dias caracterizou o estágio de portador. / A total of 107 S. aureus isolated from bovine milk, udder skin, milkers and milking machine, from São Paulo and Pernambuco herds was typed by molecular techniques. PCR-RFLP coa gene and PCR spa gene distinguished six amplicons. All strains amplified coa, spa, icaA genes and, 69% produced in vitro glucose-induced biofilm. PFGE identified 31 pulsotypes, 12 lineages. One of the lineages was predominantly isolated (P<0.0001) and widely disseminated. A same pulsotype was isolated from clinical and, subclinical mastitis as well as from carriers. There was genetic heterogeneity among isolates from the herds. Strains from human and animal origin were genetically different. Few isolates from milk, milking machine and udder skin showed similar pulsotype. An extramammary strain, 77% of the milk isolates and, 99% of the S. aureus isolated from carriers produced biofilm. It was not detected any correlation between SCC and biofilm production. The successive isolation during more than 16 days of a same pulsotype from the asymptomatic glands characterized the carrier status.

Les espèces bactériennes exhibent plusieurs états de structure de populations pouvant varier de clonale à panmictique selon l'importance des transferts horizontaux et la nature de leur écosystème. Dans mon travail de thèse, je me suis intéressé à trois espèces bactériennes, Staphylococcus aureus, Legionella pneumophila et Pseudomonas aeruginosa qui reflètent trois situations différentes. Afin de pouvoir décrire de façon rapide de grandes collections de souches, j'ai utilisé comme marqueurs de diversité le polymorphisme de séquences répétées en tandem appelées VNTRs, pour Variable Number Tandem Repeat. La méthode MLVA, ou Multiple Loci VNTR Analysis, est une méthode de typage moléculaire qui s’appuie sur l’étude concomitante du polymorphisme de plusieurs loci VNTRs. Dans un premier temps, j'ai conçu des protocoles de typage automatisés pour les trois espèces considérées, puis j'ai appliqué ces outils pour traiter de questions d'épidémiologie. S. aureus, espèce à structure clonale, est un pathogène majeur responsable notamment de toxi-infections alimentaires collectives (TIAC). Les travaux réalisés ont permis de démontrer la spécificité d’hôte de certains complexes clonaux et l’origine humaine des cas de TIAC. L. pneumophila est un pathogène de l’environnement dont la structure de population est atypique : présumée panmictique dans la nature, la bactérie semble connaitre une évolution clonale lorsque son écosystème est restreint, dans un milieu anthropique par exemple. L’étude épidémiologique menée sur la population de L. pneumophila dans la ville de Rennes a mis en évidence la présence d’un écotype, non impliqué dans les cas cliniques épidémiques, particulièrement adapté aux réseaux d’eau. P. aeruginosa, modèle de bactérie panmictique, colonise les bronches de patients atteints de mucoviscidose. Le suivi longitudinal de patients indique que les souches installées sont persistantes et quasi-exclusive de la niche qu’elles occupent. L’exploration de cette diversité du monde bactérien est un préalable à l’investigation épidémiologique des maladies infectieuses. Avec un même outil moléculaire de première intention, cette thèse retrace l’épidémiologie et la structure de trois espèces bactériennes très différentes. L’adaptation à un nouvel environnement (hôte animal, niche écologique, organe) est l'occasion d'expansions clonales. / Bacterial species exhibit diversity in their population structure varying from clonal to panmictic according to the abundance of horizontal transfer and the nature of their ecosystem. During my PhD, I focused on three bacterial species, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Legionella pneumophila, which reflect three different situations. To perform the characterisation of large strain collections, I studied the polymorphism of molecular markers called VNTRs for Variable Number Tandem Repeat. MLVA (Multiple Loci VNTR Analysis) is a PCR based typing method that relies on the concomitant analysis of several VNTRs loci. Initially, I designed automated typing protocols for the three species, then I applied these tools to address issues of epidemiology. S. aureus, a clonal species, is a major cause of food poisoning. The present work confirmed the existence of host-specific clonal complexes and demonstrated the predominantly human origin of foodborne disease cases. L. pneumophila is an environmental pathogen whose population structure is atypical: it is presumed panmictic in the environment but the bacterium expands clonally when the ecosystem is restricted, in an anthropogenic habitat for instance. A long-term epidemiological monitoring of L. pneumophila populations in the city of Rennes highlighted the presence of an ecotype, not involved in epidemic cases, particularly adapted to hot water supply systems. P. aeruginosa, a well-described panmictic bacterium, colonizes CF patients’ airways. The longitudinal monitoring of patients provided evidence that the settled strains were persistent and exhibited strong exclusivity for the occupied niche. Exploring the bacterial world diversity is a prerequisite for epidemiological investigation of infectious diseases. Using a first-line molecular tool, these works trace the epidemiology and the population structure of three bacterial species. The adaptation to a new environment (animal host, ecological niche, organ) generally results in clonal expansions.

Introdução: As infecções respiratórias causam elevadas morbidade e mortalidade, sendo os vírus os principais agentes destas doenças. O monitoramento e vigilância de vírus respiratórios, desde os mais conhecidos até os emergentes, são importantes para a gestão em saúde, orientando tempo de profilaxia e minimizando o impacto de epidemias nas comunidades. Objetivos: Estudar a epidemiologia molecular do vírus sincicial respiratório (VSR) e descrever a epidemiologia dos seguintes vírus: influenza (IF), influenza A (H1N1), adenovírus (AdV) e parainfluenza (PIV) no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Para isso foram conduzidos três estudos: (1) caracterização das infecções respiratórias causadas por VSR, IF, AdV e PIV em crianças; (2) validação de uma técnica de reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) para detecção de VSR A/B e IF A/B e (3) caracterização de genótipos do VRS em crianças com infecções comunitárias e hospitalares. Métodos: No primeiro estudo foram levantadas as seguintes variáveis: casos de infecções respiratórias por VSR, AdV, PIV ou IF e H1N1; internações em enfermarias hospitalares e internações em unidades de terapia intensiva (UTI); infecções hospitalares e taxas de letalidade. As variáveis foram coletadas durante o atendimento de crianças (idade 0-12 anos) no HCPA entre 2007 e 2010. No segundo estudo, os alvos do ensaio de RT-PCR foram: o gene da proteína da matriz de IFA, o gene da hemaglutinina do IFB e o gene da nucleoproteína de RSVA/B. A especificidade do ensaio e seu limite de detecção foram determinados. Uma comparação entre RT-PCR e imunofluorescência indireta foi realizada. No terceiro estudo, 63 isolados de VSR (21 de origem nosocomial e 42 adquiridos na comunidade) foram sequenciados para estabelecer uma análise filogenética deste vírus. Resultados: Cada um dos vírus estudados apresentou um comportamento diferente. O VSR demonstrou ser o principal agente envolvido em infecções nosocomiais. Já os pacientes com AdV, bem como o VSR, apresentaram altas taxas de admissão em UTI em 2007 e 2010. O AdV e o H1N1 tiveram as maiores taxas de letalidade. O ensaio de RT-PCR mostrou-se específico e foi mais sensível do que a imunofluorescência, sendo capaz de detectar co-infecções. Os seguintes limites de detecção foram obtidos: 1 cópia/mL para a IFA, 10 cópias/mL para IFB, 5 cópias/mL para RSVA e 250 cópias/mL para RSVB. A investigação dos genótipos de VSR revelou que todos os isolados VSRA circulantes eram do mesmo grupo filogenético, o genótipo NA1 de origem japonesa. Por outro lado, os isolados VSRB foram distribuídos em grupos diferentes: BA4, POA1, POA2, POA3 e POA4. Este estudo foi o primeiro que descreveu a circulação do genótipo NA1 no Brasil, bem como quatro novos genótipos (POA1, POA2, POA3 e POA4). Conclusão: Os resultados obtidos no primeiro estudo demonstram o impacto das epidemias sazonais de vírus respiratórios. O segundo estudo corroborou relatos da literatura que técnicas moleculares, como RT-PCR, são adequadas para a detecção de vírus respiratórios. O terceiro estudo relatou genótipos emergentes de VSR. Estudos de vigilância como os descritos acima deveriam ser conduzidos periodicamente para acompanhar o padrão de comportamento dos vírus na população alvo. / Background: Respiratory tract infections of viral origin are a major cause of morbidity and mortality worldwide. Surveillance of well-known viruses and emerging threats is important for management, prophylaxis and to minimize impact on the community. Objective: To study the molecular epidemiology of respiratory syncytial virus (RSV) and describe the epidemiology of viruses: influenza (IF), influenza A (H1N1), adenovirus (AdV) and parainfluenza (PIV) at Hospital de Clinicas de Porto Alegre. Three studies were performed: (1) characterization of respiratory infections caused by RSV, IF, AdV and PIV in children, (2) validation of a technique of polymerase chain reaction in real-time (RT-PCR) to detect RSVA/B and IFA/B and (3) detection of genotypes of RSV in children with communityand hospital-acquired infection. Methods: In the first study, variables such as number of cases of viral (RSV, AdV, PIV or IF and H1N1) infection, hospitalizations in general wards and intensive care units (ICUs), nosocomial infections and lethality rates were collected. These variables obtained from each children (age 0-12 years) between 2007 and 2010. In the second study the assay RT-PCR was used to target the matrix gene of IFA, the hemagglutinin gene of IFB and the nucleoprotein gene of RSVA/B. The specificity of the assay and its limit of detection were determined. A comparison of RT-PCR and indirect immunofluorescence was performed. In the third study, 63 RSV isolates (21 nosocomial and 42 community-acquired) were submitted to sequencing to establish a phylogenetic analysis of this virus. Results: The different viruses presented a diversity of behaviors according to hospitalization, nosocomial outbreaks or lethality in children. RSV accounted for most nosocomial infections. Rates of ICU admission for AdV and RSV infection were highest in 2007 and 2010. During 2008–2009, H1N1 and AdV had the highest ICU admission rates. AdV and H1N1 had the highest lethality rates. The RT-PCR assay was more sensitive than immunofluorescence and it was able to detect viral co-infections. Futhermore, the limits of detection were 1 copy/μL for IFA, 10 copies/μL for IFB, 5 copies/μL for RSVA, and 250 copies/μL for RSVB. The genotyping study showed that hospital- and community-acquired RSVA isolates were from the same phylogenetic group (the same group of the NA1 Japanese isolates). Conversely, RSVB isolates were distributed across different groups: BA4, POA1, POA2, POA3 and POA4. This was the first study to describe circulation of the NA1 genotype in Brazil, as well as four RSVB genotypes: POA1, POA2, POA3 and POA4. Conclusion: The results obtained in the first study demonstrate the impact of seasonal epidemics of respiratory viruses. The second study confirmed that molecular techniques such as RT-PCR, are suitable for the detection of respiratory viruses. The third study reported emerging genotypes of RSV. Surveillance studies such as this should be performed periodically to monitor the behavior pattern of the virus in the target population.

Introdução: As infecções respiratórias causam elevadas morbidade e mortalidade, sendo os vírus os principais agentes destas doenças. O monitoramento e vigilância de vírus respiratórios, desde os mais conhecidos até os emergentes, são importantes para a gestão em saúde, orientando tempo de profilaxia e minimizando o impacto de epidemias nas comunidades. Objetivos: Estudar a epidemiologia molecular do vírus sincicial respiratório (VSR) e descrever a epidemiologia dos seguintes vírus: influenza (IF), influenza A (H1N1), adenovírus (AdV) e parainfluenza (PIV) no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Para isso foram conduzidos três estudos: (1) caracterização das infecções respiratórias causadas por VSR, IF, AdV e PIV em crianças; (2) validação de uma técnica de reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) para detecção de VSR A/B e IF A/B e (3) caracterização de genótipos do VRS em crianças com infecções comunitárias e hospitalares. Métodos: No primeiro estudo foram levantadas as seguintes variáveis: casos de infecções respiratórias por VSR, AdV, PIV ou IF e H1N1; internações em enfermarias hospitalares e internações em unidades de terapia intensiva (UTI); infecções hospitalares e taxas de letalidade. As variáveis foram coletadas durante o atendimento de crianças (idade 0-12 anos) no HCPA entre 2007 e 2010. No segundo estudo, os alvos do ensaio de RT-PCR foram: o gene da proteína da matriz de IFA, o gene da hemaglutinina do IFB e o gene da nucleoproteína de RSVA/B. A especificidade do ensaio e seu limite de detecção foram determinados. Uma comparação entre RT-PCR e imunofluorescência indireta foi realizada. No terceiro estudo, 63 isolados de VSR (21 de origem nosocomial e 42 adquiridos na comunidade) foram sequenciados para estabelecer uma análise filogenética deste vírus. Resultados: Cada um dos vírus estudados apresentou um comportamento diferente. O VSR demonstrou ser o principal agente envolvido em infecções nosocomiais. Já os pacientes com AdV, bem como o VSR, apresentaram altas taxas de admissão em UTI em 2007 e 2010. O AdV e o H1N1 tiveram as maiores taxas de letalidade. O ensaio de RT-PCR mostrou-se específico e foi mais sensível do que a imunofluorescência, sendo capaz de detectar co-infecções. Os seguintes limites de detecção foram obtidos: 1 cópia/mL para a IFA, 10 cópias/mL para IFB, 5 cópias/mL para RSVA e 250 cópias/mL para RSVB. A investigação dos genótipos de VSR revelou que todos os isolados VSRA circulantes eram do mesmo grupo filogenético, o genótipo NA1 de origem japonesa. Por outro lado, os isolados VSRB foram distribuídos em grupos diferentes: BA4, POA1, POA2, POA3 e POA4. Este estudo foi o primeiro que descreveu a circulação do genótipo NA1 no Brasil, bem como quatro novos genótipos (POA1, POA2, POA3 e POA4). Conclusão: Os resultados obtidos no primeiro estudo demonstram o impacto das epidemias sazonais de vírus respiratórios. O segundo estudo corroborou relatos da literatura que técnicas moleculares, como RT-PCR, são adequadas para a detecção de vírus respiratórios. O terceiro estudo relatou genótipos emergentes de VSR. Estudos de vigilância como os descritos acima deveriam ser conduzidos periodicamente para acompanhar o padrão de comportamento dos vírus na população alvo. / Background: Respiratory tract infections of viral origin are a major cause of morbidity and mortality worldwide. Surveillance of well-known viruses and emerging threats is important for management, prophylaxis and to minimize impact on the community. Objective: To study the molecular epidemiology of respiratory syncytial virus (RSV) and describe the epidemiology of viruses: influenza (IF), influenza A (H1N1), adenovirus (AdV) and parainfluenza (PIV) at Hospital de Clinicas de Porto Alegre. Three studies were performed: (1) characterization of respiratory infections caused by RSV, IF, AdV and PIV in children, (2) validation of a technique of polymerase chain reaction in real-time (RT-PCR) to detect RSVA/B and IFA/B and (3) detection of genotypes of RSV in children with communityand hospital-acquired infection. Methods: In the first study, variables such as number of cases of viral (RSV, AdV, PIV or IF and H1N1) infection, hospitalizations in general wards and intensive care units (ICUs), nosocomial infections and lethality rates were collected. These variables obtained from each children (age 0-12 years) between 2007 and 2010. In the second study the assay RT-PCR was used to target the matrix gene of IFA, the hemagglutinin gene of IFB and the nucleoprotein gene of RSVA/B. The specificity of the assay and its limit of detection were determined. A comparison of RT-PCR and indirect immunofluorescence was performed. In the third study, 63 RSV isolates (21 nosocomial and 42 community-acquired) were submitted to sequencing to establish a phylogenetic analysis of this virus. Results: The different viruses presented a diversity of behaviors according to hospitalization, nosocomial outbreaks or lethality in children. RSV accounted for most nosocomial infections. Rates of ICU admission for AdV and RSV infection were highest in 2007 and 2010. During 2008–2009, H1N1 and AdV had the highest ICU admission rates. AdV and H1N1 had the highest lethality rates. The RT-PCR assay was more sensitive than immunofluorescence and it was able to detect viral co-infections. Futhermore, the limits of detection were 1 copy/μL for IFA, 10 copies/μL for IFB, 5 copies/μL for RSVA, and 250 copies/μL for RSVB. The genotyping study showed that hospital- and community-acquired RSVA isolates were from the same phylogenetic group (the same group of the NA1 Japanese isolates). Conversely, RSVB isolates were distributed across different groups: BA4, POA1, POA2, POA3 and POA4. This was the first study to describe circulation of the NA1 genotype in Brazil, as well as four RSVB genotypes: POA1, POA2, POA3 and POA4. Conclusion: The results obtained in the first study demonstrate the impact of seasonal epidemics of respiratory viruses. The second study confirmed that molecular techniques such as RT-PCR, are suitable for the detection of respiratory viruses. The third study reported emerging genotypes of RSV. Surveillance studies such as this should be performed periodically to monitor the behavior pattern of the virus in the target population.

O Vírus Sincicial Respiratório (RSV) é reconhecido como agente causador de infecção nosocomial entre receptores de pacientes de células-tronco hematopoéticas causando morbidade e mortalidade consideráveis nesses pacientes. O objetivo desse estudo foi caracterizar as cepas do RSV isoladas de receptores de transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo durante sua estação. As cepas do RSV foram tipadas (em grupo A ou B) e genotipadas. Das sete cepas analisadas dos receptores de TCTH durante o ano de 2001, somente duas pertenciam ao grupo B, as outras cinco eram pertencentes ao grupo A. Dessas sete cepas, três eram altamente relacionadas e haviam infectados pacientes que freqüentavam o ambulatório. Em 2002, das doze cepas analisadas, três pertenciam ao grupo A e as outras nove pertenciam ao grupo B. Sete cepas eram altamente relacionadas entre elas e eram também de pacientes de ambulatório sugerindo que a transmissão em hospital-dia era mais provável. Enfim, múltiplços genótipos do RSV co-circularam nas unidades de TCTH (ambulatório e enfermaria) do Hospital das Clínicas entre 2001 e 2002. A transmissão nosocomial foi mais provável ocorrer no ambulatório da unidade de TCTH quando comparada à enfermaria. Políticas de controle de infecção devem ser também implementadas em ambulatórios para evitar transmissão nosocomial do RSV e outros vírus respiratórios em pacientes de ambulatório. / Respiratory Syncytial Virus is recognized as the leading cause of nosocomial respiratory infection among recipients of hematopoietic stem cell transplant (HSCT) causing considerable morbity and mortality among theses patients. The aim this study was characterize the strains of Respiratory Syncytial Virus in recipients Hematopoietic Stem Cell Transplant Unit (HSCT) at Hospital das Clínicas, University of São Paulo Medical School during RSV season in symptomatic HSCT recipients at Hospital das Clínicas. The strains of RSV was typed (in group A or B) and genotyped. Of the seven strains analyzed from HSCT recipients during 2001, only two belonged to group B, the other five belonged to group A. Of these seven strains, three were closely related and were from outpatients. In 2002 , of the twelve strains analyzed, three belonged to group A and the other nine belonged to group B. Seven strains were closely related and were also from outpatients suggesting that nosocomial transmission in hospital-day was more likely. In conclusion, multiples genotypes of RSV co-circulated in the Hematopoietic Stem Cell Transplant units (ward and dayhospital) of Hospital das Clínicas between 2001 and 2002. Nosocomial transmission was more likely to occur at the HSCT Day-hospital as compared to the HSCT ward. Infection control practices should be also implemented at Day-hospital Units to avoid nosocomial transmission of RSV and other respiratory viruses in outpatient units.

Objetivo: i) Estudar os casos de tuberculose (TB) por transmissão recente em brasileiros e migrantes sul-americanos, quantificar a transmissão cruzada recente entre ambas as populações e estudar seus fatores associados; ii) Avaliar, isoladamente, os fatores associados à transmissão recente da TB e o impacto da migração e de outras vulnerabilidades nos casos da doença no município. Métodos: Estudo transversal em indivíduos brasileiros e migrantes de origem sul-americana, residentes de distritos centrais do município de São Paulo (MSP) com grande proporção de populações vulneráveis e elevada presença recente de migrantes. Estudaram-se os casos de TB pulmonar por M. tuberculosis (Mtb) notificados entre 2013 e 2014, confirmados por meio de cultura de escarro. Foram utilizados os dados do Sistema Estadual de Notificação (SINAN-TB), de unidades de saúde e do laboratório central do Instituto Adolfo Lutz. Analizaram-se as variáveis sociodemográficas, clínicas e a presença de clusters simples e mistos, obtidos pelo agrupamento dos isolados de Mtb por RFLP-IS6110. i) Descreveu-se a distribuição dos clusters mistos e outras variáveis em brasileiros e migrantes sul-americanos e, investigou-se os fatores independentemente associados à presença de clusters mistos na amostra por meio de regressão logística simples e múltipla; ii) Investigaram-se os fatores independentemente associados à ocorrência de clusters mediante regressão logística simples e múltipla e estimou-se o impacto da transmissão recente da TB por meio da Fração Atribuível Populacional (PAF). Resultados: Foram amostrados 347 indivíduos, 19 por cento dos casos na área estudada. Desses, 76 por cento eram brasileiros e 24 por cento migrantes sul-americanos. O primeiro estudo mostrou que a proporção de clusters foi de 40,5 por cento , sendo 28 por cento desses compartilhados por brasileiros e migrantes sul-americanos (clusters mistos). Clusters mistos foram mais frequentemente encontrados em migrantes sul-americanos do que em brasileiros (OR=6,05), porém sugeriu-se transmissão cruzada em ambas as direções. A análise de sensibilidade, removendo usuários de drogas, HIV positivos e alcóolicos, teve pouco efeito no número de clusters mistos porém reduziu o de clusters simples em vi brasileiros, sugerindo maior transmissão recente do Mtb entre indivíduos brasileiros e migrantes não pertencentes a esses grupos de risco. O segundo estudo sugeriu que o uso de drogas está independentemente e diretamente associados a clusters sugestivos de transmissão recente (ORaj=3,18) e o alcoolismo (ORaj=0,30) está inversamente associado à transmissão recente. Foi encontrada baixa prevalência de comorbidades e outros fatores de risco entre migrantes sul-americanos, tanto em clusters quanto em perfis únicos. A transmissão recente entre usuários de drogas foi atribuída a cerca de 15 por cento dos casos de TB em brasileiros. Conclusões: Verificou-se que a transmissão recente, tanto entre brasileiros quanto entre migrantes sul-americanos, desempenha um papel importante nas regiões centrais do MSP. No entanto, sugere-se que a migração possa desempenhar um papel menos importante na transmissão/reativação da TB do que o uso de drogas e outras condições de vulnerabilidade. Dessa forma, no contexto dos crescentes movimentos migratórios para grandes cidades de países de média e baixa renda, a migração se soma à vulnerabilidade social, reforçando a necessidade de políticas intersetoriais para controle da TB. / Objective: i) to study recent tuberculosis (TB) transmission in Brazilians and South-American migrants, to estimate the proportion of recent cross-transmission occurring between both populations and to study potential associated factors to cross-transmission; ii) to study associated factors to cross-transmission and to estimate the impact of South-American migration and other vulnerabilities on TB cases. Methods: we conducted a cross-sectional study with TB patients in a central area of São Paulo (MSP) with a strong presence of South-American migrants and vulnerable populations. We selected notified pulmonary TB (PTB) cases confirmed by sputum culture between 2013 and 2014 among Brazilians and South-American migrants. We used the Tuberculosis State Notification System (SINAN-TBWEB), health facilities and the State Reference Laboratory (Instituto Adolfo Lutz) as data sources. We typed M. tuberculosis isolates by IS6110-RFLP, which were clustered by similarity. Clusters were considered mixed when isolates from at least one Brazilian and one South-American migrant were similar; and were considered simple when the cluster contained isolates from patients of only one nationality. We study demographic and clinical variables from TB patients and the presence of clusters within the sample. i) We described the distribution of simple and mixed clusters and other variables amongst Brazilians and South-American migrants and study associated factors to cross-transmission using logistic regression; ii) we estimated the proportion of recent transmission in the sample and investigated the factors associated with the presence of clusters by multiple logistic regression. Results: We sampled 347 individuals, 19 per cent of cases that occurred in the study area. Nearly 76 per cent were Brazilians and 24 per cent South-Americans. The first study demonstrated that 40.5 per cent of cases were clustered, of which approximately 30 per cent were mixed. South-American migrants were more likely to have mixed clusters than Brazilians (OR=6.05) and the results suggest that TB transmission occurred in both directions. We conducted a sensitivity analysis removing drug users, HIV positive and alcoholics, which suggested higher transmission amongst Brazilian and migrants outside these groups. In the second study we demonstrated that drug users were more likely to viii belong to clusters (ORadj=3.18) while individuals who abuse alcohol were more likely to belong to unique profiles (ORadj=0.30). South American migrants had lower prevalence of comorbidities and other risk factors. Nearly 15 per cent of PTB cases among Brazilians were attributed to recent transmission among drug users. Conclusions: We conclude that general recent transmission of TB and cross-transmission between Brazilian and South American migrants play an important role in the central regions of MSP. Nevertheless, we suggest that social vulnerability and drug use in TB transmission may be more important than migration status itself. In the context of increasing migration to large cities of low- and middle-income countries, our findings add migration to other social vulnerabilities, reaffirming the need for inter-sectoral policies on TB control.

Introdução: As infecções respiratórias causam elevadas morbidade e mortalidade, sendo os vírus os principais agentes destas doenças. O monitoramento e vigilância de vírus respiratórios, desde os mais conhecidos até os emergentes, são importantes para a gestão em saúde, orientando tempo de profilaxia e minimizando o impacto de epidemias nas comunidades. Objetivos: Estudar a epidemiologia molecular do vírus sincicial respiratório (VSR) e descrever a epidemiologia dos seguintes vírus: influenza (IF), influenza A (H1N1), adenovírus (AdV) e parainfluenza (PIV) no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Para isso foram conduzidos três estudos: (1) caracterização das infecções respiratórias causadas por VSR, IF, AdV e PIV em crianças; (2) validação de uma técnica de reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) para detecção de VSR A/B e IF A/B e (3) caracterização de genótipos do VRS em crianças com infecções comunitárias e hospitalares. Métodos: No primeiro estudo foram levantadas as seguintes variáveis: casos de infecções respiratórias por VSR, AdV, PIV ou IF e H1N1; internações em enfermarias hospitalares e internações em unidades de terapia intensiva (UTI); infecções hospitalares e taxas de letalidade. As variáveis foram coletadas durante o atendimento de crianças (idade 0-12 anos) no HCPA entre 2007 e 2010. No segundo estudo, os alvos do ensaio de RT-PCR foram: o gene da proteína da matriz de IFA, o gene da hemaglutinina do IFB e o gene da nucleoproteína de RSVA/B. A especificidade do ensaio e seu limite de detecção foram determinados. Uma comparação entre RT-PCR e imunofluorescência indireta foi realizada. No terceiro estudo, 63 isolados de VSR (21 de origem nosocomial e 42 adquiridos na comunidade) foram sequenciados para estabelecer uma análise filogenética deste vírus. Resultados: Cada um dos vírus estudados apresentou um comportamento diferente. O VSR demonstrou ser o principal agente envolvido em infecções nosocomiais. Já os pacientes com AdV, bem como o VSR, apresentaram altas taxas de admissão em UTI em 2007 e 2010. O AdV e o H1N1 tiveram as maiores taxas de letalidade. O ensaio de RT-PCR mostrou-se específico e foi mais sensível do que a imunofluorescência, sendo capaz de detectar co-infecções. Os seguintes limites de detecção foram obtidos: 1 cópia/mL para a IFA, 10 cópias/mL para IFB, 5 cópias/mL para RSVA e 250 cópias/mL para RSVB. A investigação dos genótipos de VSR revelou que todos os isolados VSRA circulantes eram do mesmo grupo filogenético, o genótipo NA1 de origem japonesa. Por outro lado, os isolados VSRB foram distribuídos em grupos diferentes: BA4, POA1, POA2, POA3 e POA4. Este estudo foi o primeiro que descreveu a circulação do genótipo NA1 no Brasil, bem como quatro novos genótipos (POA1, POA2, POA3 e POA4). Conclusão: Os resultados obtidos no primeiro estudo demonstram o impacto das epidemias sazonais de vírus respiratórios. O segundo estudo corroborou relatos da literatura que técnicas moleculares, como RT-PCR, são adequadas para a detecção de vírus respiratórios. O terceiro estudo relatou genótipos emergentes de VSR. Estudos de vigilância como os descritos acima deveriam ser conduzidos periodicamente para acompanhar o padrão de comportamento dos vírus na população alvo. / Background: Respiratory tract infections of viral origin are a major cause of morbidity and mortality worldwide. Surveillance of well-known viruses and emerging threats is important for management, prophylaxis and to minimize impact on the community. Objective: To study the molecular epidemiology of respiratory syncytial virus (RSV) and describe the epidemiology of viruses: influenza (IF), influenza A (H1N1), adenovirus (AdV) and parainfluenza (PIV) at Hospital de Clinicas de Porto Alegre. Three studies were performed: (1) characterization of respiratory infections caused by RSV, IF, AdV and PIV in children, (2) validation of a technique of polymerase chain reaction in real-time (RT-PCR) to detect RSVA/B and IFA/B and (3) detection of genotypes of RSV in children with communityand hospital-acquired infection. Methods: In the first study, variables such as number of cases of viral (RSV, AdV, PIV or IF and H1N1) infection, hospitalizations in general wards and intensive care units (ICUs), nosocomial infections and lethality rates were collected. These variables obtained from each children (age 0-12 years) between 2007 and 2010. In the second study the assay RT-PCR was used to target the matrix gene of IFA, the hemagglutinin gene of IFB and the nucleoprotein gene of RSVA/B. The specificity of the assay and its limit of detection were determined. A comparison of RT-PCR and indirect immunofluorescence was performed. In the third study, 63 RSV isolates (21 nosocomial and 42 community-acquired) were submitted to sequencing to establish a phylogenetic analysis of this virus. Results: The different viruses presented a diversity of behaviors according to hospitalization, nosocomial outbreaks or lethality in children. RSV accounted for most nosocomial infections. Rates of ICU admission for AdV and RSV infection were highest in 2007 and 2010. During 2008–2009, H1N1 and AdV had the highest ICU admission rates. AdV and H1N1 had the highest lethality rates. The RT-PCR assay was more sensitive than immunofluorescence and it was able to detect viral co-infections. Futhermore, the limits of detection were 1 copy/μL for IFA, 10 copies/μL for IFB, 5 copies/μL for RSVA, and 250 copies/μL for RSVB. The genotyping study showed that hospital- and community-acquired RSVA isolates were from the same phylogenetic group (the same group of the NA1 Japanese isolates). Conversely, RSVB isolates were distributed across different groups: BA4, POA1, POA2, POA3 and POA4. This was the first study to describe circulation of the NA1 genotype in Brazil, as well as four RSVB genotypes: POA1, POA2, POA3 and POA4. Conclusion: The results obtained in the first study demonstrate the impact of seasonal epidemics of respiratory viruses. The second study confirmed that molecular techniques such as RT-PCR, are suitable for the detection of respiratory viruses. The third study reported emerging genotypes of RSV. Surveillance studies such as this should be performed periodically to monitor the behavior pattern of the virus in the target population.

Orientador: Maria Luiza Moretti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T02:52:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kuboyama_RogerioHakio_D.pdf: 1899697 bytes, checksum: 863826cd141f1e5f89eb90d272c0c330 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Os objetivos do presente estudo, conduzido retrospectivamente, utilizando cepas isoladas de espécimens clínicos obtidos de pacientes internados em dois hospitais brasileiros entre fevereiro de 2001 e junho de 2004 foram descrever: a presença de cepas de Klebsiella pneumoniae produtoras de beta-lactamases de espectro estendido (ESBLs), o melhor método e o substrato preferido para os testes de triagem e de confirmação da produção de ESBLs, a relação epidemiológica das cepas obtidas e analisar os fatores de risco para infecção por cepa produtora de ESBLs. A fim de investigar a relação genética das cepas, foram utilizadas as análises do DNA plasmidial e do DNA cromossômico por eletroforese em campo pulsátil (PFGE). Um total de 89 cepas de K. pneumoniae foram coletadas de diversos sítios anatômicos. Os espécimens clínicos mais comuns dos quais foram isoladas cepas produtoras foram urina (12,4%) e sangue (10,1%). Utilizando os critérios estabelecidos pelo CLSI (testes de triagem), 35 (39,3%) cepas de K. pneumoniae foram consideradas possivelmente produtoras de ESBLs, enquanto que o teste de aproximação de discos (DDAT) revelou distorções características nas zonas de inibição produzidas pela molécula do clavulanato em 96, 62,5, 50, 18,8 e 12,5% das cepas ao redor dos discos contendo aztreonam, cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona e cefpodoxima, respectivamente. Das 89 cepas, 32 (36%) foram consideradas produtoras de ESBLs baseadas no teste confirmatório pelo método Oxoid de discos-combinados. O disco contendo cefotaxima foi capaz de confirmar 100 % dos produtores de ESBLs enquanto que o disco contendo ceftazidima deixou de confirmar 2 cepas produtoras. Dez e 32 diferentes perfis plasmidiais foram observados dentre as cepas de K. pneumoniae produtoras e não produtoras, respectivamente. A PFGE demonstrou melhor poder discriminatório fornecendo 15 e 55 perfis de DNA cromossômico dentre as cepas ESBLs-positivas e ESBLs-negativas, respectivamente. Da análise univariada, as variáveis significativamente associadas com infecção por cepas de K. pneumoniae produtoras de ESBLs foram: uso de cefalosporinas de quarta geração, de lincosamida, de carbapenêmicos, de glicopeptídeos, cirurgia recente, traqueostomia, idade, dias em uso de lincosamida, dias em uso de glicopeptídeos, número total de antibióticos e duração da terapia antimicrobiana. Ao realizar a análise multivariada, utilizando um modelo de regressão logística que incluía as variáveis estatisticamente significantes da análise univariada (P < 0,05), número total de antibióticos permaneceu como única variável independente para infecção por cepa de K. pneumoniae produtora de ESBLs (OR, 1,60; IC95%, 1,194-2,145.; P = 0,0017). Os dados obtidos revelam: uma taxa relativamente alta da produção de ESBLs em cepas de K. pneumoniae obtidas de pacientes das instituições estudadas; a insuficiência da análise plasmidial na elucidação da relação genética dentre as cepas produtoras de ESBLs; aztreonam como melhor substrato indicador da produção presuntiva de ESBLs e cefotaxima como o melhor substrato no teste confirmatório pelo método Oxoid de discoscombinados / Abstract: The objectives of this study conducted restrospectively using strains isolated from clinical specimens obtained from patients hospitalized in two Brazilian hospitals between February 2001 to June 2004 were to describe the presence of extended-spectrum b-lactamase (ESBL)-producing Klebsiella pneumoniae strains, the best method and the preferred substrate for screening and confirming ESBL production and the epidemiological relatedness of ESBL-producing strains and analyse the risk factors for infection due to ESBL-producing K. pneumoniae. To investigate the genetic relatedness of the strains, plasmid analysis and chromosomal DNA analysis by pulsed-field gel electrophoresis were used. A total of 89 K. pneumoniae were collected from diverse body sites. The most commom specimens yielding ESBL-producing strains were urine (12.4%) and blood (10.1%). Using CLSI criteria (ESBL screening breakpoints), 35 K. pneumoniae (39.3%) had presumptive ESBL phenotype, while using the double-disk approximation test (DDAT) characteristic clavulanate-induced distortions of inhibition zones were found in 96, 62.5, 50, 18.8 and 12.5% of the strains around the disks containing aztreonam, cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxone and cefpodoxime, respectively. Of 89 isolates, 32 (36%) produced ESBL based on the confirmatory Oxoid combination disk method. The disk containing cefotaxime was able to confirm 100% of the ESBL producers while the disk containing ceftazidime was not able to confirm 2 ESBL-positive strains. Ten and 32 different plasmid profiles were observed among the ESBL-producing K. pneumoniae and non ESBL producers, respectively. Pulsed-field gel electrophoresis showed the best discriminatory power giving 15 and 55 different chromosomal DNA profiles among the ESBL-positive and ESBL-negative K. pneumoniae, respectively. From univariate analysis, variables significantly associated with infection by an ESBL-producing strain of K. pneumoniae included the following: use of 4st-generation cephalosporins, lincosamide, carbapenems, glycopeptides, recent surgery, tracheostomy, age, days in using of lincosamide, days in using of glycopeptides, total number of antibiotics and duration of the antimicrobial therapy. The only variable that remained independent risk factor for acquiring infection due to ESBL-producing K. pneumoniae after multivariable analysis using a logistic regression model, which included the variables associated with acquiring infection by ESBL-producing K. pneumoniae by univariate analysis (P < 0.05), was total number of antibiotics (OR, 1.60; 95%CI, 1.194-2.145; P = 0.0017). In summary, these data indicate that ESBL-producing K. pneumoniae occur at a relatively high incidence at our institutions and the plasmid analysis is not sufficient to identify relationships between ESBL-producing strains of K. pneumoniae. The ESBL screening breakpoints and DDAT with aztreonam appear to be good indicators in presumptive detection of ESBL-producing strains and the cefotaxime used in the Oxoid combination disk method constituted the best substrate in the confirmatory test / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Staphylococcus aureus est une bactérie commensale et pathogène qui s’est rapidement adaptée à la pression sélective des antibiotiques entraînant la diffusion de souches résistantes à la méticilline (MRSA). En Belgique, des souches appelées Healthcareassociated (HA)-MRSA sont devenues endémiques dans les hôpitaux, causant de nombreuses épidémies durant les années 90.<p>Parallèlement, des cas d’infections communautaires par des souches appelées Community-associated (CA)-MRSA produisant la leucocidine de Panton-Valentine (PVL) ont été rapportées en Europe, en Australie et aux USA, chez des patients jeunes sans contact avec les institutions de soins. Depuis 2005, une prévalence élevée de portage de MRSA a été observée chez les porcs, les éleveurs et les vétérinaires aux Pays-Bas et dans les pays voisins. Ces souches dites Livestock-associated (LA)-MRSA montrent une origine génétique distincte des souches humaines précédemment décrites.<p>Nos travaux de recherche ont porté sur l’épidémiologie et la caractérisation moléculaire de la colonisation et l’infection par S. aureus dans diverses populations humaines en Belgique afin d’élucider :1) l’évolution de la distribution spatio-temporelle des clones épidémiques de MRSA parmi les patients hospitalisés au cours de la période de 1995 à 2003 ;2) les mécanismes moléculaires de résistance aux antibiotiques associés à ces clones ;3) les relations phylogénétiques entre souches de S. aureus sensibles et résistantes à la méticilline parmi les patients hospitalisés afin d’identifier l’origine probable des clones épidémiques ;4) la prévalence et les facteurs de risque de portage de MRSA parmi les résidents des maisons de repos et l’origine de ces souches ;5) l’origine des souches de CA-MRSA et les profils cliniques des infections associées ;6) la prévalence et les facteurs de risque associés au portage de MRSA et la diffusion des souches de MRSA dans les fermes d’élevage porcin.<p>Des enquêtes multicentriques nous ont permis de caractériser les souches de S. aureus résistantes et sensibles à la méticilline affectant les patients hospitalisés (4 enquêtes, 1995 -2003), les patients ambulants (1 enquête, 2002-2004), les résidents dans des maisons de repos et de soins (1 enquête en 2005) et les habitants des fermes d’élevage porcin (1 enquête en 2007). Ces souches ont été caractérisées par détermination du type de cassette mec (SCCmec typing), séquençage d’un gène hypervariable (spa typing) et de 7 gènes de ménage (multi-locus sequence typing, MLST), combinées à l’analyse par électrophorèse en champs pulsé (PFGE) du profil de acrorestriction génomique. Les gènes codant pour trois classes d’antibiotiques et les toxines, PVL, TSST-1 et exfoliatines, ont été recherchés par PCR.<p>L’étude des souches de MRSA a montré une diversification importante des clones dans les hôpitaux, avec le remplacement d’un clone multi-résistant par des clones plus sensibles aux antibiotiques. La distribution des gènes de résistance ainsi que du gène TSST-1 était fortement liée au génotype. Les S. aureus sensibles à la méticilline (MSSA) montraient une plus grande diversité génotypique que les MRSA. La majorité des MRSA épidémiques appartient à des génotypes endémiques de MSSA, suggérant la possibilité d’émergence locale de MRSA par acquisition récente de l’élément mobile SCCmec.<p>D’autres souches de génotypes pandémiques pourraient avoir été importées en Belgique. L’enquête dans les maisons de repos et de soins a montré une prévalence élevée de résidents porteurs de MRSA. L’exposition aux antibiotiques, les lésions cutanées, la perte de mobilité, l’absence de formulaire thérapeutique et de procédures d’hygiène pour le contrôle du MRSA, associée à un nombre élevé de médecins, augmentaient significativement le risque de portage. La présence des mêmes génotypes dans les hôpitaux et les maisons de repos d’une même province suggère des transferts locaux de MRSA entre patients résidant dans et circulant entre ces secteurs de soins.<p>Les souches de CA-MRSA productrices de toxine PVL importées ou acquises en Belgique appartiennent à divers génotypes. La présence de MRSA de même lignée clonale mais présentant des profils de virulence différents clonale dans les institutions de soins et dans la population générale suggère que ces souches ont évolué de manière divergente dans des environnements différents.<p>Nous avons documenté une prévalence très élevée de porteurs de MRSA de génotype ST398 chez les éleveurs de porcs. Le réservoir de ce clone est très probablement d’origine animale, la transmission à l’homme ayant lieu par contact avec des animaux d’élevage ou de compagnie et potentiellement, par voie alimentaire.<p>En conclusion, S. aureus est un pathogène capable de s’adapter dans des environnements très différents. Les souches épidémiques résistantes aux antibiotiques, qu’elles soient d’origine hospitalière, communautaire ou animale, appartiennent à un nombre limité de génotypes bien établis dans chaque écosystème au niveau local ou régional. L’étude approfondie de la dynamique de transmission des MRSA, et de leur profil de résistance dans la communauté, les secteurs des soins aigus et chroniques et l’élevage, est indispensable pour définir les stratégies cliniques et de santé publique pour adapter les schémas thérapeutiques et endiguer l’endémie d’infections à MRSA.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished