“Plasmodium vivax” és el paràsit causant de malària humana amb més àmplia distribució i és responsable cada any de 100-300 milions de casos clinics, incloent algunes manifestacions severes i mort. P. vivax envaeix principalment reticulòcits I és àmpliament acceptat que els reticulòcits infectats no citoadhereixen en els capil•lars d'òrgans interns, tenint un pas obligat per la melsa. Es desconeix com P. vivax escapa del pas per la melsa, el nostre major òrgan limfoide, i evita així ser fagocitat. La nostra hipòtesi postula que aquest paràsit indueix la formació de cèl•lules de barrera a la melsa, on reticulòcits infectats citoadhereixen de manera específica per protegir-se de l’atac dels macròfags. Per avançar en aquesta hipòtesi, hem utilitzat el model murí de malària en ratolins Balb/c infectats amb una soca noletal que infecta principalment reticulòcits, P. yoelii 17X, semblant a P. vivax, i una soca letal amb tropisme per normòcits, P. yoelii 17XL, semblant a P. falciparum. Per investigar la funció i l’estructura de la melsa en la malària, així com les característiques dinàmiques dels processos impulsats pel paràsit, hem implementat la microscòpia intravital i la ressonància magnètica de la melsa del ratolí en infeccions experimentals. Notablement, hem observat major acumulació de paràsits, motilitat reduïda, pèrdua de direccionalitat, augment en el temps de residència i ressonància magnètica alterada només a la melsa dels ratolins infectats amb 17X. D'altra banda, aquestes diferències s’han associat amb la formació d'una barrera d'origen fibroblàstic induïda en la polpa vermella de les melses de ratolins infectats amb la soca no-letal, acompanyada d'evasió dels macròfags de la polpa vermella i adherència dels glòbuls vermells infectats a la barrera. A més, hem confirmat l'adhesió de reticulòcits infectats per P. vivax de pacients humans a crioseccions de melsa humana i explorat el paper de les proteïnes Vir en aquesta adhesió. Les nostres dades suggereixen que en la malària no-letal el pas per la melsa és diferent del que es coneix en altres espècies de Plasmodium i obren noves vies per a estudis funcionals i estructurals d'aquest òrgan limfoide en la malària. / Plasmodium vivax is the most widely distributed human malaria parasite and responsible each year for 100-300 million clinical cases including severe disease and death. P. vivax invades predominantly, if not exclusively, reticulocytes and it is amply accepted that it does not sequester in the deep capillaries of inner organs having an obligate passage through the spleen. Questions thus remain as how P. vivax escapes spleen-clearance and establishes chronic infections. We have advanced a hypothesis postulating that this parasite induces the formation of spleen barrier cells where infected reticulocytes specifically cytoadhere protecting themselves from spleen macrophage-clearance. To advance this hypothesis, we have used the rodent malaria model of Balb/c mice infected with the reticulocyteprone non-lethal P. yoelii 17X strain, resembling P. vivax, and the normocyte-prone lethal P. yoelii 17XL strain, resembling P. falciparum. To investigate the function and structure of the spleen in malaria, as well as the dynamic characteristics of parasitedriven processes, we implemented the intravital microscopy and magnetic resonance imaging of the mouse spleen in experimental infections. Noticeably, there was higher parasite accumulation, reduced motility, loss of directionality, increased residence time and altered magnetic resonance only in the spleens of mice infected with 17X. Moreover, these differences were associated with the formation of a strain-specific induced spleen tissue barrier of fibroblastic origin, with red pulp macrophage-clearance evasion and adherence of infected red blood cells to this barrier. We further reported adhesion of P. vivax-infected reticulocytes from human patients to cryosections of human spleens and explored the role of Vir proteins in such an adhesion. Our data suggest that in reticulocyte-prone non-lethal malaria, passage through the spleen is different from what is known in other Plasmodium species and open new avenues for functional/structural studies of this lymphoid organ in malaria.

Malaria, caused by Plasmodium falciparum parasites remains a huge public health problem and a major cause of morbidity and mortality in sub-Saharan Africa, especially among children and infants. The parasite and its vector – the Anopheles spp mosquito - have tremendous adaptability capacities, including the acquisition of resistance to anti-malarial drugs and insecticides, making the development of new preventive tools, such as a safe and effective vaccine, a key element to counter balance this tendency. The most advanced malaria vaccine candidate, RTS,S/AS has progressed to a Phase III trial through a research and development plan as a result of an unforeseen partnership between African, European and American research institutions together with GSK Biologicals and the PATH Malaria Vaccine Initiative (MVI). This thesis describes some critical stages of the clinical development plan of this vaccine, reporting clinical trials of the RTS/AS candidate malaria vaccine conducted in Mozambican children and infants. Here we illustrates the assessment of the RTS,S/AS02D safety, humoral and cellular mediated immune responses and the duration of protection over a one year period in infants. We also provide a detailed immunogenicity data of 4 years of follow-up of children aged 1 to 4 years by the time of immunization with RTS,S/AS02A. These studies principally show that the vaccine is safe, well tolerated and highly immunogenic, eliciting both humoral and cell-mediated antibodies. The vaccine also protects children and infants against clinical malaria. Importantly, they also describe for the first time an association between the risk of clinical malaria and Plasmodium falciparum anticircumsporozoite antibody titters. The presented results support the hypothesis that developing a safe, immunogenic and efficacious malaria vaccine is feasible and, together with other studies, they should be the basis for the registry process of what should be the first generation of vaccines against malaria. / La malaria, causada por el parásito Plasmodium falciparum sigue siendo un gran problema de salud pública y una causa importante de mortalidad y morbilidad en el África Sub-Sahariana, especialmente entre los niños y lactantes. El parásito y su vector mosquito Anofeles spp. tienen una tremenda capacidad de adaptación, incluyendo la capacidad de adquirir resistencia a los fármacos antipalúdicos e insecticidas. Es por tanto prioritario desarrollar nuevas herramientas preventivas, entre las cuales una vacuna segura y eficaz, un elemento clave para contrarrestar esta tendencia. La vacuna candidata contra la malaria más avanzada, denominada RTS,S/AS, ha progresado hasta un ensayo de Fase III siguiendo un plan de investigación y desarrollo clínico resultado de una colaboración sin precedentes entre centros de investigación Africanos, Europeos y Americanos junto con la GSK Biologicals y PATH Malaria Vaccine Initiative (MVI). Esta tesis describe algunas de las fases críticas de estos logros, reportando los ensayos clínicos de la vacuna candidata contra la malaria RTS,S/AS llevados a cabo en niños y lactantes de Mozambique. Esta tesis analiza en detalle la evaluación de la seguridad de esta estrategia, la respuesta inmunológica (tanto humoral como celular) que esta vacuna confiere, y la duración de la protección durante un período de seguimiento de un año en los lactantes. Presentamos también los datos completos de 4 años de seguimiento de la inmunogenicidad de la RTS,S/AS02A administrada a niños de 1 a 4 años de edad en el momento de su primera vacunación. Estos estudios demuestran que la vacuna es segura, bien tolerada y altamente inmunogénica, produciendo respuestas tanto humorales como celulares. La vacuna también protege a los niños y lactantes contra la malaria clínica. Además se describe por primera vez una asociación entre el riesgo de malaria clínica y los niveles de anticuerpos contra la proteína de circumsporozoito del Plasmodium falciparum. Los resultados aquí presentados apoyan la tesis de que el desarrollo de una vacuna eficaz, inmunogénica y segura contra la malaria es posible, y deberá ser la base, junto con otros estudios, del proceso de registro de la que podrá ser la primera generación de vacunas contra la malaria.

El risc d’infecció per Plasmodium falciparum, el paràsit causant de la malària, augmenta durant l’embaràs. La disminució del risc d’infecció en embarassos successius s’atribueix a l’adquisició d’anticossos contra eritròcits infectats a la placenta, els quals expressen en la seva superfície la proteïna VAR2CSA. Aquesta proteïna pertany a la família de lligands polimòrfics PfEMP1, i permet l’adhesió dels paràsits a la placenta mitjançant la seva interacció amb el receptor humà sulfat de condroitina A. Per aquest motiu, VAR2CSA és actualment un candidat a vacuna per a la prevenció de la malària en dones embarassades. No obstant, altres mecanismes com la modulació general de la immunitat durant l’embaràs podrien contribuir a augmentar la susceptibilitat a la infecció. A més, la contribució de paràsits que expressin membres de la família PfEMP1 diferents de VAR2CSA no s’ha estudiat en detall en les infeccions maternes. Per tant, és necessària una millor comprensió dels mecanismes moleculars implicats en la fisiopatologia de la malària en dones embarassades, a fi de desenvolupar intervencions específiques i efectives. Els treballs inclosos en aquesta tesi doctoral demostren que: i) una baixa resposta d’anticossos contra VAR2CSA però també una disminució general dels nivells de IgG poden contribuir a augmentar el risc de malària en el primer embaràs; ii) la infecció de la placenta per P. falciparum estimula la producció d’anticossos amb especificitats múltiples, suggerint que els anticossos en el moment del part són un indicador d’exposició més que de protecció; iii) tot i que la població de paràsits que expressen VAR2CSA és majoritària, paràsits que expressen altres PfEMP1 són freqüents en les infeccions maternes; iv) la presència de determinades variants de seqüència en les regions polimòrfiques de VAR2CSA s’associen a un increment de la densitat de paràsits a la placenta. A nivell immunològic, aquests resultats impliquen que els nivells d’anticossos en fases inicials de l’embaràs o bé altres mecanismes com les respostes cel•lulars podrien ser més rellevants en el control de la infecció, comparat amb els nivells d’anticossos al final de l’embaràs. A nivell molecular, vacunes específiques per a prevenir la malària en dones embarassades podrien ser més efectives si incorporessin aquelles variants VAR2CSA potencialment més patogèniques, així com epítops rellevants d’altres PfEMP1 o altres antígens conservats de P. falciparum. / The thesis project entitled Malaria during pregnancy: maternal immunity and expression of Plasmodium falciparum citoadhesion-related genes focuses on var gene expression patterns in maternal P.falciparum isolates as well as host immune responses against PfEMP1 and merozoite antigens in pregnant women from Mozambique.

Les molècules ramificades poden jugar un paper clau en la síntesi en fase sòlida de compostos amb una elevada complexitat estructural. En aquest sentit i concretament en la síntesi de pèptids i peptidomimètics, els aminoàcids trifuncionals hi juguen un paper fonamental. En aquesta tesi s'han utilitzat aquest tipus de molècules per tal d'obtenir estructures complexes com són els pèptids cíclics, els foldàmers i noves quimioteques. Com a plataformes ramificadores s'han utilitzat derivats trifuncionals de prolina, com la cis-gamma-amino-L-prolina i la trans-4-hidroxi-L-prolina. Així, la present tesi doctoral descriu tres projectes diferents els quals comparteixen l'ús de la síntesi en fase sòlida com a metodologia sintètica, així com la utilització d'aminoàcids trifuncionals. Els diferents projectes es basen en: (i) estudi de grups protectors ortogonals en la síntesi de pèptids cíclics en fase sòlida; (ii) síntesi, estudis estructurals i aplicacions de fòldamers gamma-peptídics derivats de la gamma-amino-L-prolina; i (iii) síntesi en fase sòlida d'una llibreria d'inhibidors de la lisil-tRNA sintetasa (LysRS) de Plasmodium falciparum, paràsit causant de la malària. CAPÍTOL 1: En la síntesi en fase sòlida és del tot imprescindible disposar de grups protectors ortogonals per tal d'obtenir uns resultats satisfactoris al final d'una síntesi complexa. Tot i això, no sempre s'arriba als resultats esperats. El primer capítol d'aquesta tesi descriu els problemes derivats de treballar amb els grups protectors d'amines Fmoc i Alloc quan estan continguts en el mateix aminoàcid trifuncional. El problema que es descriu és l'eliminació prematura del grup Fmoc en les condicions d'eliminació dels grup Alloc. Així, s'estableix l'origen del problema i s'estableixen metodologies alternatives d'acoblament per tal d'evitar subproductes no desitjats. Aquest mateix capítol descriu la síntesi en fase sòlida de tetra-beta-pèptids cíclics utilitzant un sistema de protecció tetraortogonal. CAPÍTOL 2: Els gamma-pèptids són els foldàmers més estudiats fins al moment, ja que se n'ha descrit propietats força interessants com ara l'antimicrobiana o la seva capacitat per travessar la membrana de cèl·lules eucariotes, fet que els converteix en bons candidats a transportadors de fàrmacs. La rellevància que estan adoptant aquests peptidomimètics es deu bàsicament al fet que aquestes molècules no naturals poden millorar alguns inconvenients dels pèptids naturals, com pot ser la baixa estabilitat en front a proteasses. El segon capítol d'aquesta tesi doctoral descriu la síntesi en fase sòlida de gamma-pèptids derivats de la cis-gamma-amino-L-prolina. A més a més, estudis estructurals mitjançant l'ús de tècniques de dicroïsme circular i ressonància magnètica nuclear estableixen que aquest tipus de compostos formen llaços C9, donant com a resultat en una estructura regular una sèrie de girs concatenats d'aquest tipus, estructura que també es pot descriure com a hèlix 9. Aquest mateix capítol descriu algunes propietats d'aquest compostos, com ara la seva capacitat de travessar membranes cel·lulars, la baixa toxicitat, l'elevada estabilitat en front a proteasses o l'activitat antimicrobiana. L'entrada cel·lular de cada pèptid es quantifica mitjançant tècniques de fluorimetria de plaques i de citometria de flux i es visualitza al microscopi confocal. CAPÍTOL 3: El tercer capítol descriu la síntesi d'una llibreria de compostos potencials inhibidors de la lisil-tRNA sintetassa (LysRS) del Plasmodium falciparum, paràsit causant de la malària. S'ha vist que les aminoacil-tRNA sintetasses poden ser dianes terapèutiques força vàlides, ja que tot i ser enzims essencials en totes les espècies, aquestes es poden inhibir d'una forma espècie-específica. En la ruta biològica de la traducció en la que participen les tRNA sintetasses es forma un complex intermedi, l'aminoacil adenilat, en el qual es va basar el disseny dels inhibidors. Així, aquest capítol descriu la síntesi de sulfamats en fase sòlida i la seva posterior utilització en la síntesi d'una llibreria de 90 inhibidors. / Branched molecules, such as trifunctional amino acids, can play important roles in the creation of complex structures using solid-phase synthesis. This thesis describes the use of proline derived trifunctional amino acids such as cis-gamma-aminoproline and trans-4-hidroxyproline for the synthesis of cyclic peptides, foldamers and libraries. Thus, this thesis has been divided into three different chapters, which share both the use of these trifunctional molecules and the use of solid-phase peptide synthesis as a common methodology. The first chapter describes several problems derived from the use of orthogonal protecting groups in the same molecule. For instance, it describes that, in certain cases, the Fmoc protecting group can be removed when eliminating the Alloc one, not for its removing conditions but for the free amine that are kept free once the Alloc group has been removed. The use of several protecting groups at the same time was also tested in the synthesis of cyclic tetra-beta-peptides using a tetra-orthogonal protecting scheme. The second chapter describes the solid-phase synthesis of abiotic foldamers derived from proline derivatives. This chapter also describes that these compounds can fold forming a series of C9 turns, which, in an idealised structure, can form an helix 9. The labelling of these gamma-peptides with a fluorescent probe followed by their confocal microscopy study reveal that these gamma-peptides are able to cross the cell membrane of eukaryotic cells, a property that makes them good candidates as drug carriers for drug delivery. Actually, the conjugation of one of them with a PNA reveals that this gamma-peptide can transport this big non-membrane permeable molecule inside the cell, demonstrating its value for such application. In the third chapter, the solid phase synthesis of sulfamates is described, as well as their application in the synthesis of inhibitors of the lysil-tRNA synthetase (LysRS) of "Plasmodium falciparum"

Malaria is caused by protozoan parasites of the genus Plasmodium, Plasmodiidae family, transmitted to humans through the bite of infected female Anopheles.spp mosquitoes. It is one of the major global public health problems and an important cause of death in young children in Subsaharian Africa.Malaria is both a cause and a consequence of poverty. It best represents the paradigm of the vicious circle of disease and poverty. Recent estimates suggest that malaria alone costs about 12 billion US dollars to the endemic countries of Africa, and therefore represents a major constraint to economic progress. Today, Africa continues to carry the brunt of the global malaria burden with around 350-550 million clinical episodes and between 700.000 and 1.6 million deaths annually, representing 80-90% of the all malaria deaths in the world, mostly in children younger than five years and pregnant women. Estimates of malaria mortality are rather imprecise. However, describing the contribution of malaria to under five mortality is a very important and relevant objective. It improves the precision of our burden estimate, and helps prioritize and guide control efforts, as well as evaluate its impact. However in rural areas of Africa such as Mozambique, many children are born and die without ever being registered, and a significant proportion of all deaths take place outside health facilities. In this scenario, the only way of estimating the likely cause of death is through an interview of a witness of the final illness. This is called a verbal autopsy (VA).The last decades have witnessed the establishment of a network of centres throughout the continent that include continuous demographic surveillance of defined populations, the so called Demographic Surveillance Sites (DSS). The DSS have been established to record prospectively demographic information, including births and deaths, to investigate epidemiological and social determinants, and to provide a platform on which to undertake large-scale community interventions trials.The first article of this thesis describes 10 year data from the Manhiça DSS on the most frequent causes of mortality in children under 15 years of age, between 1997 and 2006. During this period, 10037 deaths were recorded, of which 3730 were recorded in children under 15 years old. Verbal autopsy interviews were conducted for 3002 (80.4%) of these deaths. According to respondents, 54% of deaths occurred outside a health facility. Overall, malaria accounted for 22% of all deaths, but the relative frequency was highest in children 1 to 4 years of age, accounting for 34% of all deaths corresponding to a mortality rate of 6.1 deaths/1000 pyrs.The last decade has witnessed a renewed effort in the study and control of this disease. New tools are becoming available, and the development of a vaccine is considered a potentially key component for improved control.GlaxoSmithKline (GSK) Biological's RTS,S,AS02A is a currently the world's most clinically-advanced malaria vaccine candidate. RTS,S/AS02A specifically targets the pre-erythrocytic stage of P. falciparum, and has been shown to confer protection against P. falciparum infection, delivered via laboratory-reared infected mosquitoes, in immunised malaria naive volunteers and against natural infection in semi-immune adult and immune children.As part of the clinical development plan, we conducted a Proof of Concept randomised, controlled, phase IIb trial of RTS,S/AS02A in 2022 Mozambican children aged 1-4 years living in a rural endemic area of Mozambique. The initial double blind phase included study months 0 to 8.5 and the single blind phase from study months 8.5 to 21. The open phase included study months 21 to 45. Children were randomised in a 1:1 ratio to receive RTS,S/AS02A or the control vaccines. The RTS,S/AS02A was administered intramuscularly in the deltoid region according to a 0, 1, and 2 month schedule. Children aged 24 months and older in the control group received three paediatric doses (0.5 ml) of Engerix-B . Children under 24 months received two paediatric doses of Prevenar , administered at the first and third vaccinations and one dose of Hiberix , at the second vaccination. Good safety profile and immunogenicity has been confirmed. Considering the entire follow up period of 45 months, Vaccine Efficacy (VE)(2.5-45) against first or only episode of clinical malaria disease was 30.5% (95% CI 18.9-40.4; p=<0.001), and VE against severe malaria was 38.3% (95% CI 3.4 to 61.3; p=0.045).These results highlight the feasibility of developing a malaria vaccine that may protect children against malaria, and may therefore be a useful component of the strategies to improve malaria control. / EN CASTELLANO: La malaria es causada por un parásito protozoario del género "Plasmodium", de la familia "Plasmodium Plasmodiiade", transmitido a los humanos a través de la picadura de un mosquito Anófeles.spp hembra infectado. Es uno de los mayores problemas de salud pública en el África Subsahariana y una de las causas más importantes de muerte en niños pequeños en la región.La malaria es tanto una causa como una consecuencia de la pobreza. Recientes estimaciones sugieren que la malaria cuesta aproximadamente 12.000 millones de dólares americanos a los países endémicos de África, y por consiguiente, representa un constreñimiento mayor al progreso económico de dichos países. Actualmente, África continúa soportando la mayor carga de malaria del mundo, con aproximadamente 350-550 millones de episodios clínicos y entre 700.000 y 1.6 millones de muertes anuales. Así, representa el 80-90% de la malaria en el mundo, la mayoría en niños menores de 5 años y mujeres embarazadas. Las últimas décadas han sido testimonio del establecimiento de una red de centros a lo largo del continente, que incluye a vigilancia demográfica continuada de poblaciones definidas, los llamados Sistemas de Vigilancia Demográficos (DSS). Los DSS han sido creados para registrar prospectivamente informaciones demográficas, incluyendo los nacimientos y las muertes, para investigar los determinantes epidemiológicos y sociales, y para proveer con una plataforma en la cual se puedan llevar a cabo ensayos de intervención comunitaria a gran escala.Durante los últimos diez años se ha asistido a un esfuerzo renovado en el estudio y el control de esta enfermedad. Se dispone de nuevas herramientas y en concreto se está avanzando en el desarrollo de una vacuna como componente potencialmente importante para un mejor control. Actualmente, la RTS,S/AS02A GlaxoSmithKline (GSK) Biological es la vacuna candidata contra la malaria más avanzada del mundo. Su objetivo específico es la actuación en el estado pre-eritrocítrico del "P.falciparum" y ha demostrado su validez a la hora de conferir protección contra la infección experimental por P.falciparum, administrada via mosquitos infectados criados en el laboratorio, en voluntarios nunca expuestos previamente y contra la infección natural en adultos semi inmunes y niños inmunes.Como parte del plan de desarrollo clínico, realizamos un estudio prueba de concepto, aleatorizado, controlado, de fase IIb de RTS,S/AS02A en 2022 niños mozambiqueños de 1 a 4 años de edad viviendo en una área rural endémica. Los resultados demostraron un buen perfil de seguridad y una buena respuesta inmunitaria. Durante el periodo de vigilancia, la eficacia de la vacuna (VE) (2.5-45) contra un primer o único episodio de malaria clínica fue del 30.5% (95% CI 18.9-40.4; p=<0.001) y contra malaria severa fue del 38.3% (95% CI 3.4 - 61.3;p=0.045).Estos resultados resaltan la viabilidad del desarrollo de una vacuna contra la malaria y puede ser, por consiguiente, un componente útil entre las estrategias para mejorar su control.

Despite a renewed impetus on bringing together efforts to wipe malaria from the globe, the truth is that this ancient disease remains one of the principal threats to child survival in vast areas of the world. The existing control measures are largely insufficient to reduce globally the malaria burden, and as of today, malaria remains endemic in more than 100 countries, where at least half of the world's population live exposed to the risk of being infected. Indeed, the burden of malaria morbidity and mortality continues to be unacceptably high, with more than 250 million clinical episodes and at least one million deaths per year. While morbidity due to malaria affects all age groups and is scattered throughout the world, Sub-Saharan Africa concentrates the brunt of the malaria deaths, which overwhelmingly occur in children under five years of age infected with P. falciparum. The exciting and almost palpable perspective of an effective malaria vaccine, added to the promotion of innovative control strategies such as intermittent preventive treatment for infants or pregnant women, have in the recent years centred the scientific discussions regarding the approach to malaria control. However, in contrast to these innovative perspectives, malaria control has remained in the last two decades essentially dependent on the early identification and prompt treatment of clinical malaria cases and the reduction of man-vector contact. Unless there is a major renewal, optimisation and scale-up of the antimalarial arsenal and strategies, malaria will continue to dictate the health status of the world, and eradication will not be achievable in a realistic timeframe. As malaria is a life-threatening infection, a fundamental requirement for its adequate control is the availability of effective antimalarial drugs. The first paper in this thesis describes a large randomised clinical trial (around 1500 children) performed in five different African countries to assess the non-inferiority of a novel combination, dihydroartemisinin-piperaquine, produced under strict good manufacturing practices, when compared to the standard combination therapy AL, for the treatment of uncomplicated malaria in African children under the age of five years. In the second paper, we describe the results of another large (around 900 patients) randomised clinical trial in which we assessed in 5 different African countries the non-inferiority of a new, paediatric-suited cherry-flavoured, dispersible formulation of AL, when compared to standard crushed AL tablets, for the treatment of uncomplicated malaria in children younger than 12 years of age. The results of these two trials, reflected in paper 1 and paper 2 of this thesis, bring to the malaria community public-health relevant data on alternatives to the currently limited antimalarial drug arsenal. The third paper in this thesis describes the clinical presentation of severe malaria in a rural Mozambican Hospital, and the associated risk factors for a negative outcome. It also presents minimum community based incidence rates, a useful indicator of the malaria burden in the area. Finally, the fourth paper addresses the relationship between severe malaria and bacterial invasive disease in children younger than 5 years admitted to a Manhiça's rural hospital, Mozambique. Malaria is an ancient disease of terrible consequences for mankind. All efforts devised to diminish the burden that malaria imposes in endemic areas need to be embraced and brought together on a coordinated manner to fight this infection from all possible fronts. Understanding the clinical determinants of the infection and its relation with other coexistent infectious diseases will give an insight to the basic pathophysiology of malaria, and thus guide appropriate management strategies. New highly effective drugs, and their paediatric-orientated formulations, need to be developed and made available to those most at need. / A pesar del renovado afán por eliminar la malaria de la faz de la tierra, esta histórica enfermedad se mantiene como uno de los principales peligros para la salud infantil en amplias zonas del mundo. Las medidas de control existentes son claramente insuficientes a la hora de reducir globalmente el impacto de esta enfermedad, y a día de hoy la malaria es endémica en más de 100 países en dónde más de la mitad de la población mundial está expuesta al riesgo de infectarse. De hecho, la carga de esta enfermedad en términos de morbilidad y mortalidad persiste inaceptablemente alta con, anualmente, más de 250 millones de episodios clínicos y cerca de un millón de muertes. Mientras que la enfermedad clínica puede afectar a cualquier grupo de edad, la mortalidad por malaria se ve esencialmente circunscrita a los niños menores de cinco años infectados por P. falciparum.La apasionante y casi palpable perspectiva de una vacuna efectiva contra la malaria, sumada a la promoción de innovadoras estrategias de control como el tratamiento intermitente en lactantes o mujeres embarazadas han centrado, en los últimos años, el debate científico relacionado con las estrategias de control. En contraste con estas innovadoras estrategias, el control de la malaria se ha visto sin embargo limitado en las últimas décadas a la identificación y tratamiento precoz de los episodios clínicos y a la reducción del contacto entre el reservorio humano y el vector. A menos que se produzca una importante renovación y optimización del arsenal terapéutico y de las estrategias frente a esta infección, acompañado por un despliegue masivo de las intervenciones en aquellas áreas dónde son más necesarias, la malaria continuará dictando el estado de salud global, y su erradicación no dejará de ser una utopía irrealizable a corto plazo.La malaria es una enfermedad potencialmente mortal, y por lo tanto, un requerimiento fundamental para su control es la disponibilidad de fármacos antimaláricos efectivos para su tratamiento. El desarrollo de la farmacopea antimalárica, estrechamente relacionada a los diferentes conflictos bélicos del último siglo, ha representado un constante desafío y debido a los repetidos problemas de financiación ha resultado claramente inadecuado, especialmente en comparación con el desarrollo de fármacos para otras enfermedades. Como ejemplo cabe destacar que, entre los años 1975-1999, apenas 4 de los cerca de 1400 fármacos registrados en el mundo, eran antimaláricos. Además, la aparición de resistencias por parte del parásito a los fármacos, un problema creciente y global, resulta un grave peligro para el control de esta infección, y representa una presión añadida para los pocos fármacos efectivos todavía disponibles. Con todo, en los últimos años, la malaria se está desprendiendo del status de enfermedad olvidada que arrastraba, e importantes esfuerzos han surgido para el desarrollo e investigación de nuevos fármacos con actividad antimalárica. Basado en el conocimiento adquirido con otras enfermedades infecciosas como la tuberculosis, la organización mundial de la salud promulga actualmente que el tratamiento frente a P. falciparum, la especie responsable de la mayoría de casos graves y la práctica totalidad de las muertes, debe basarse en la terapia combinada, incluyendo a ser posible un derivado de las artemisininas. La elección de los fármacos a combinar debe basarse en la potencial sinergia entre los perfiles farmacocinéticos y terapéuticos de los diferentes componentes, con el objetivo de conseguir una eliminación de la parasitemia rápida, protegiendo al mismo tiempo a los diferentes componentes frente al desarrollo de resistencias.

Malaria occurs mostly in the tropical regions of the world. Sub-Saharan Africa is the area most affected. The occurrence of a very efficient mosquito vectors Anopheles gambiae complex and Anopheles funestus group sustain high transmission of the Plasmodium falciparum, the most predominant and deadly malaria parasite species. Local weather conditions are appropriate and often transmission occurs throughout the year. Limited resources and socio-economic instability constitute the major factors impeding efficient malaria control activities. The worldwide malaria eradication programme carried out during the 1950's focused mainly on insecticide residual spraying with DDT, anti-malarial drug treatment, and surveillance.Regional eradication of the disease was achieved, nevertheless, in many endemic regions of sub-Saharan Africa excluded from the eradication campaign, the disease is still afflicting their inhabitants. The malaria disease burden estimation in tropical Africa relies on mortality and morbidity data collected by the health system information. Conservative estimates of the burden of disease claim for more than 300 million clinical episodes and 1 - 3 million deaths every year and young children harbour the largest and most important portion of this bulk.Currently, the situation is deteriorating, increasing malaria-related morbidity and mortality have been reported. The rapid development and widespread of parasites strains resistant to almost all anti-malarial drugs, and vector resistance are the major contributing factors.In addition, global climate change is affecting the health of human populations, including changes in the transmission and seasonality of vector-borne diseases. The range of factors affecting transmission and distribution of vector-borne diseases, particularly malaria, include those related to temperature, humidity and precipitation. In Mozambique, malaria is endemic throughout the country, due to a multitude of factors such as climatic/environmental (favourable temperatures and rain patterns, abundant breeding sites) and socio-economical (poverty related improper housing/shelter, unaffordable preventive means). Transmission is perennial, with peaks during and after rainy seasons. The intensities of transmission may vary depending on the amount of rain and air temperature. However, at present there is a lack of good quality and updated information on the endemicity levels in the country.The country-wide malaria survey carried out between 2002 and 2003 aimed to determine the prevalence and intensity of Plasmodium infections, the prevalence and the severity of anaemia in children under 10 years of age and in pregnant women across different ecological settings, in order to characterize the malaria transmission intensities and to estimate the disease burden in Mozambique. The last comprehensive malaria survey in the country was carried out in 1952. For that reason, this survey was an unique opportunity to perform a sound methodological assessment of the current epidemiological malaria situation in the country. Based on altitude and on geographical region differences samples were collected from stratified areas distinguished as coastal, plateau and highland strata, in the northern, centre-northern, central and southern regions. For sampling at community level, in each of those stratified areas, a modified cluster sampling method with 30 clusters, used by WHO for evaluation of coverage of the Expanded Programme of Immunization was adopted. The study consisted of house-to-house survey, in 24 districts randomly selected. A total of 12,002 subjects including children less than ten years of age and pregnant women were enrolled. The malariometric survey consisted of finger pricking and blood collection to prepare thick and thin film for malaria parasite species identification, and respective density and determination of haemoglobin concentration. Measurement of axillary temperature and in those with fever a rapid enzyme test for malaria diagnosis was performed. The entomologic survey consisted of pyrethrum spray knock down mosquito collections. In total 6,557 female anopheline mosquitoes caught in 1,440 dwellings, were analysed for sporozoite infection using PCR techniques and the entomological inoculation rates were determined for each strata across regions. / La malaria se encuentra preferentemente en las regiones tropicales del mundo, siendo África sub-sahariana el área con más afectación. La gran eficiencia de los mosquitos vectores Anopheles gambiae complex y Anopheles funestus favorece una gran transmisión del Plasmodium falciparum, el parásito más predominante y más maligno de las especies causante de malaria. Las condiciones ambientales locales son apropiadas y a menudo la transmisión se da a lo largo todo el año.Los recursos limitados y la inestabilidad socio-económica constituyen los principales factores que impiden la total eficacia de las estrategias de control de la malaria. El programa de erradicación mundial de la malaria se se llevó a cabo durante los años 50 focalizándose básicamente en la fumigación con DDT, el tratamiento con fármacos anti-maláricos y la vigilancia.La erradicación regional de la enfermedad se conseguió en muchas regiones endémicas del África sub-sahariana, no obstante en zonas excluidas de la campaña de erradicación, la enfermedad continua afectando a sus habitantes.La estimación de la carga de enfermedad por malaria en el África tropical se obtiene de los datos de mortalidad y morbilidad recogidos por el sistema de informació de la salud.Los datos conservadores estiman que la carga de esta enfermedad causa más de 300 millones de episodios clínicos y entre 1 - 3 millones de muertes cada año, siendo los niños los más afectados.En la actualidad, la situación se esta deteriorando, observándose un incremento de la morbilidad y mortalidad por malaria. El rápido desarrollo, la propagación de cepas del parásito resistentes ante todos los fármacos anti-maláricos y la presencia de vectores resistentes son los factores que más han contribuido a este incremento.A demás, el cambio climático global está afectando la salud de las poblaciones, incluyendo cambios en la transmision y estacionalidad de las enfermedades mediadas por vectores. Los factores que afectan la transmisión y la distribución de este tipo de enfermedades, particularmente la malaria, incluyen los relacionados con la temperatura, la humedad y las precipitaciones. En Mozambique, la malaria es una enfermedad endémica en todo el país, debido a la multitud de factores, como los climáticos/medioambientales (temperaturas favorables y patrones de precipitación, abundantes espacios para la reproducción) y socio-económicos (pobreza relacionada con vivienda inadecuada, medios preventivos inasequibles). La transmisión es perenne, con picos durante y después de la estación de lluvias. Las intensidades de transmisión pueden variar dependiento de la cantidad de precipitación y la temperatura en el ambiente. Sin embargo, actualmente, hay una falta de información actualizada y de calidad sobre los niveles de endemicidad del país. El estudio llevado acabo por todo el país entre los años 2002 y 2003 tenía como objetivo determinar la prevalencia y la intensidad de las infecciones por Plasmodium, la prevalencia y la severidad de la malaria en niños menores de 10 años de edad y en mujeres embarazadas a través de diferentes nichos ecológicos, para poder caracterizar la intensidad de transmisión por malaria y estimar la carga de esta enfermedad en Mozambique. El último estudio exahustivo de estas características en el país fue realizado en 1952. Por esta razón, este estudio era una oportunidad única para realizar un asesoramiento metodológico profundo de la situación epidemiológica actual de la malaria el país. Las muestras fueron recogidas basándose en la altitud y diferencias geográfica de cada región. Las areas estratificadas se clasificaron en: estrato costero, plateau y de montaña, y según la región en: norte, centro-norte, central y sur. Para el muestreo a nivel de comunidad, en cada una de esas áreas estratificadas, se utilizó un método por muestreo modificado por grupos con 30 grupos, ya usado por la OMS para la evalución de la cobertura del Programa Ampliado de Vacunación.El estudio consisitió en visitar casa por casa en 24 distritos seleccionados aleatóriamente. Se incluyeron un total de 12,002 individuos, tanto niños menores de 10 años de edad como mujeres embarazadas. El estudio malariométrico consistió en recoger sangre por punción en el dedo para preparar una lámina delgada y otra gruesa para la identificación de la especie del parásito de la malaria y una estimación de la densidad, y para la determinación de la concentración de hemoglobina. Se tomó la tempreatura axilar y en presencia de fiebre se realizaba un test enzimático rápido para el diagnóstico de malaria.El estudio entomológico consistió en la recogida de mosquitos rociados con piretrum. En total 6,557 mosquitos anófeles hembra de 1,440 viviendas fueron analizados para infeción de esporozoito usando técnicas de PCR, y la tasa de inoculación entomológica fue determinada para cada estrato a través de las diferentes regiones.

Past and present uses of DDT and pyrethroids have led to their incorporation into humans, mainly through the food chain and sometimes by direct exposure. The present work focuses on establishing the levels of DDT, its analogous compounds (DDE and DDD), and pyrethroids in humans and the human environment in Manhiça, a rural area where they have been used as insecticides for indoor residual spraying (IRS) and insecticide treated nets (ITN) in malaria control programs. Thatch samples from human dwellings, breast milk from pregnant women and cord blood from newborns were analyzed for assessment of the concentration levels of these compounds. The results showed that DDT and its analogues were already present in humans and dwellings before reintroduction of this insecticide for IRS. As consequence of these applications DDT concentrations increased significantly. The higher proportion of 4,4’-DDT than 4,4’-DDE evidenced that the observed amounts were due to recent applications of this insecticide. Concerning pyrethroids, their presence has been identified in both breast milk and human dwellings showing that both agricultural applications and use for ITN may be responsible for their occurrence in humans and human environments of Manhiça. / L’ús en el passat i en temps actuals del DDT i piretroides ha donat lloc a la seva incorporació en els humans, principalment mitjançant la cadena tròfica i a vegades per exposició directa. Aquest treball té com objectiu establir els nivells de DDT i els seus compostos anàlegs (DDE i DDD), i piretroides en humans i l’ambient humà a Manhiça, una àrea rural on aquests s’han utilitzat com insecticides per aplicació interna (indoor residual spraying, IRS) i tractament de xarxes de protección (insecticide treated nets, ITN) en programes de control de la malària. Per a esbrinar els nivells de concentració d’aquests compostos s’analitzaren mostres de palla de cabanes, de llet materna i de sang de cordó de nou nats. Els resultats mostraren que el DDT i els seus compostos anàlegs ja eren presents en humans i cabanes abans de la reintroducció d’aquest insecticida per IRS. L’ús del DDT en aquest programa féu augmentar considerablement les concentracions d’aquest insecticida. La major proporció de 4,4’-DDT que 4,4’-DDE posà de manifest que les quantitats observades corresponien a aplicacions recents d’aquest insecticida. Respecte als piretroides, s’han trobat en mostres de llet materna i cabanes tot mostrant que tant les aplicacions agrícoles com el seu ús en ITN poder esser la causa de la seva presència en els humans i els ambients humans de Manhiça.

Clonally variant gene expression (CVGE) is a common survival strategy used by many pathogens, including the malaria parasite Plasmodium falciparum. Among the genes that show CVGE are several members of the clag and eba families. The active or repressed state of clag3.1, clag3.2 and eba‐140 is transmitted epigenetically and is controlled by the euchromatic or heterochromatic state of bistable chromatin domains, characterised by H3K9ac and H3K9me respectively. Both of these modifications are maintained throughout the asexual cycle to transmit epigenetic memory. We have characterised CVGE on a genome‐wide level and found that it is widespread. Using clag3.2 in proof‐of‐principle experiments, we demonstrate that CVGE for genes other than var can be reproduced in an episomal system and provide preliminary evidence that CVGE is regulated by the spontaneous formation of facultative heterochromatin. The mutually exclusive expression of clag3.1 and clag3.2 is also addressed, including the characterisation of a neighbouring noncoding RNA. / La variació clonal en l'expressió gènica (CVGE) és una estratègia de supervivència comú utilitzada per molts patògens, incloent el paràsit de la malària Plasmodium falciparum. Entre els gens que mostren CVGE hi ha diversos membres de les famílies clag i eba. L'estat actiu o inactiu de clag3.1, clag3.2 i eba‐140 es transmet epigenèticament i és controlat per l'estat eucromatínic o heterocromatínic de dominis de cromatina biestables, caracteritzats respectivament per H3K9ac i H3K9me. Ambdues modificacions es mantenen durant tot el cicle asexual per transmetre la informació epigenètica. També hem caracteritzat la CVGE a nivell de tot el genoma, i hem vist que afecta un gran nombre de gens. Experiments preliminars amb clag3.2 ens demostren que la CVGE de gens diferents que var es pot reproduir en un sistema episomal I proporcionen evidència preliminar de què la CVGE està regulada per la formació espontània d’heterocromatina facultativa. També s’ha estudiat l'expressió mútuament exclusiva de clag3.1 i clag3.2, incloent la caracterització d’un ARN no‐codificant veí.

Una de les forces selectives més fortes que han afectat a les poblacions humanes en la història més recent és el paràsit de la malària: Plasmodium falciparum, que és la causa de varis exemples d'adaptació induïda per patògens en els éssers humans. Una forma especial de malària és l'associada a l'embaràs, que es caracteritza per l'acumulació d'eritròcits infectats en la placenta, i que pot arribar a causar fins a 200.000 morts maternoinfantils cada any. L'objectiu d'aquest treball és descriure com aquesta forma peculiar de malària ha afectat la variació genètica humana. Amb aquesta finalitat, hem utilitzat mètodes tant de la genètica evolutiva com de l'epidemiologia molecular, resultant en la primera investigació a gran escala de la base genètica de la malària placentària. Els resultats ofereixen una nova visió sobre els gens que modulen el risc d'infecció, ,així com de la selecció natural actuant sobre les vies cel·lulars implicades en la patogènesi de la malaltia. Finalment, també aportem noves dades sobre l'estructura genètica de les poblacions sub-saharianes analitzades. / One of the strongest selective forces affecting human populations in recent history is the malaria parasite Plasmodium falciparum, which is the cause of a variety of well-established examples of pathogen-induced adaptation in humans. A special form of malaria is pregnancy-associated malaria, which is characterised by the accumulation of infected erythrocytes in the placenta, and causes up to 200,000 maternal and infant deaths every year. The aim of this work is to characterise how this particular form of malaria has shaped human genetic variation. To that end we use methods of both evolutionary genetics and molecular epidemiology, reporting the first large-scale investigation of the genetic basis of placental infection. Our results provide new insights into genes modulating the risk of infection, as well as natural selection acting on cellular pathways involved in the pathogenesis of the disease. Finally, we also provide new data on the genetic structure of affected populations in Sub-Saharan Africa.