Orientadora : Drª Giseli Klassen / Coorientador : Prof. Dr. Emanuel M. de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 14/10/2016 / Inclui referências : f. 68-88 / Área de concentração: Patologia / Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer que mais acomete as mulheres em todo o mundo, tanto em países desenvolvidos como em países em desenvolvimento. É uma doença heterogênea, com diferenças em suas características clínicas, moleculares e biológicas. Tradicionalmente, os marcadores de imunohistoquímica em conjunto com os parâmetros clínico-patológicos são usados para classificar esse tipo de câncer e prever a evolução da doença. Dentre os subtipos moleculares de câncer de mama, os carcinomas triplo negativo (TNG) são definidos pela ausência de expressão de receptores hormonais e do gene HER2. Cerca de e 80% dos TNG apresentam o fenótipo basal, por expressar proteínas que caracterizam células mesenquimais e são denominados como o subtipo basalóide (BLBC) de câncer de mama. Os TNG são os subtipos mais agressivos de câncer de mama, com pior prognóstico, e ausência de terapia específica. Estudos anteriores do grupo de pesquisa, evidenciaram que o gene ADAM33, pode ser silenciado por hipermetilação do DNA no câncer de mama. Diversas proteínas da família ADAM já foram relacionadas ao desenvolvimento e progressão de tumores. Diante dessas observações, a expressão diferencial do gene ADAM33 motivou ao nosso grupo de pesquisa investigar se a proteína ADAM33 poderia ser utilizada como um biomarcador no câncer de mama. No presente estudo, foram produzidos anticorpos monoclonais contra a proteína ADAM33 para que esse pudesse ser utilizado em ensaios de imunohistoquímica em amostras parafinadas de câncer de mama. Para isso, após a obtenção de um hibridoma secretor e ensaios de caracterização de anticorpo monoclonal, esse foi utilizado, juntamente com um painel de marcadores moleculares (RE, PR, HER2, EGFR, CK 5/6, CK14, CK17, c-Kit e Ki- 67) em 212 amostras de tumores de mama. E pode-se comparar os escores da proteína ADAM33 com os dados clínico-patológicos das pacientes, para determinar sua importância como um marcador de prognóstico ou preditivo para o câncer de mama. A baixa expressão da proteína ADAM33 foi relacionada com TNG e BLBC, e com uma menor sobrevida global e sobrevida livre de metástases. O achado mais importante deste trabalho é que a baixa expressão de ADAM33 no câncer de mama tem um valor prognóstico independente. A diminuição da expressão dessa proteína está associada ao risco de desenvolvimento de metástases e morte. Assim, a avaliação de ADAM33 por IHQ poderia ser utilizado como um marcador de prognóstico para os subtipos TNG e BLBC. / Abstract: Breast cancer is the most common cancer in women around the world. It is a heterogeneous disease with differences in its clinical, molecular and biological features. Traditionally, immunohistochemical markers together with clinicopathologic parameters are used to classify breast cancer and to predict disease outcome. Triplenegative breast cancer (TNBC) is a particular type of breast cancer that is defined by a lack of expression of hormonal receptors and HER2 gene. About 80% of TNBC also have a basal-like phenotype (BLBC) with expression of cytokeratin 5/6 and/or EGFR, characterized by protein expression of mesenchymal cells. TNG are the most aggressive subtypes of breast cancer with worse prognosis and lack of specific therapy. In that regard, the ADAM33 gene is silenced by DNA hypermethylation in breast cancer, which suggests that ADAM33 might be useful as a molecular marker. In the present study, we have produced monoclonal antibodies against the ADAM33 protein and have investigated role of ADAM33 protein in 212 breast tumor samples breast cancer. We compare clinicopathological information and the expression of a panel of IHC markers (ER, PR, HER2, EGFR, CK 5/6, CK14, CK17, c-Kit and Ki67) with the ADAM33 protein scores to determine whether ADAM33 protein is clinically efficient as a prognostic or predictive marker for breast cancer. We compare the ADAM33 protein scores with clinicopathological data from 212 patients to determine their importance as a predictor and prognostic marker for breast cancer. The low expression of ADAM33 protein was related to TNBC and BLBC, and with a lower overall survival and metastasis-free survival. The most important finding of this study is that low ADAM33 expression in breast cancer has an independent prognostic value. Decreasing the expression of this protein is associated with risk of development of metastases and death. Thus, the evaluation of ADAM33 protein by IHC could be used as a prognostic marker for TNBC and BLBC subtypes.

Resumo: O câncer de mama é o tipo mais comum e a principal causa de morte por câncer entre as mulheres no mundo todo. As metástases contribuem com 90% das causas de morte por câncer. O estudo de novos marcadores moleculares de câncer estão em amplo e atual desenvolvimento, tanto para diagnóstico como prognóstico da doença. Diversos estudos tem mostrado o papel de eventos epigenéticos entre eles a metilação do DNA, em regiões promotoras de genes como um evento importante no processo de tumorigênese em diversos tipos de câncer. No câncer de mama já foram descritos um grande número de genes envolvidos com controle da proliferação, adesão e migração celular que podem ser silenciados por mecanismos epigenéticos. O gene CXCL12 codifica para uma quimiocina ou citocina quimiotática, que é comprovadamente silenciado por metilação de sua região promotora em câncer gástrico, de cólon intestinal e de mama. O produto deste gene esta envolvido no processo migratório como molécula ligante de células tumorais que superexpressam o receptor CXCR4 e que migram e colonizam secundariamente pulmões ossos, fígado ou linfonodos que tem altos níveis de CXCL12. Nesse trabalho estudamos detalhadamente a região promotora do gene CXCL12 que contém 5 regiões ricas em dinucleotídeos CpGs (ilhas de CpG). As ilhas de CpG 1 ,2, 3 e 5 foram amplificadas, clonadas e sequenciadas a partir de DNA de sete linhagens tumorais de mama. A ausência ou presença de metilação do DNA de cada região foi correlacionado com a presença ou ausência de expressão do gene CXCL12. A ilha de CpG 1 apresentou-se hipermetilada em linhagens que expressam CXCL12, sendo assim essa região parece não participar do processo de silenciamento desse gene nessas linhagens. A ilha de CpG 2 que contém 1346 pb foi analisada em 2 partes sendo que a parte inicial que contém o nucleotídeo +1 apresentou-se fortemente correlacionada com a expressão do gene. Somente uma linhagem imortalizada, a HB4a apresentou 53,25% de metilação global, o que poderia interferir na expressão do gene. A segunda parte da ilha 2, assim como a ilha de CpG 3 e 5 apresentaram-se hipermetiladas nas linhagens que expressam o gene, e portanto essas regiões provavelmente não interferem na expressão do gene CXCL12 nessas linhagens tumorais. Por outro lado a ilha de CpG 4 localizada a cerca de 1500 pb de distância do início de transcrição e fora da provável região promotora, apresentou-se pouco metilada nas linhagens que expressam o gene e hipermetilada nas linhagens que não expressam CXCL12. Concluímos que as regiões denominadas ilhas de CpG 1 o terço final da Ilha de CpG 2, ilha de CpG 3 e 5 estão metiladas em linhagens que expressam o gene CXCL12 e assim sendo, não são importantes no processo de regulação da expressão desse gene. A Ilha de CpG 4 é a única região diferencialmente metilada e que parece atuar de modo a sinalizar o silenciamento do gene CXCL12.

Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 22/03/2011 / Inclui referências : f. 54-57 / Área de concentração / Resumo: O câncer de mama é um mal que acomete mais de 49.000 mulheres anualmente no Brasil. Na decisão terapêutica para esse tipo de tumor, é importante a definição de alguns parâmetros ligados a proteínas presentes ou não no carcinoma. Dentre essas proteínas, destaca-se o receptor ? de estrógeno (hER?). A detecção do receptor de estrógeno é feita através de imunohistoquímica e para essa técnica são usados anticorpos monoclonais anti hER?. Uma vez que o Brasil ainda é totalmente dependente da importação desse insumo, a obtenção de linhagens de hibridomas secretores desses anticorpos torna-se uma questão de soberania. No presente trabalho, foi elaborado todo o processo e ferramentas necessários para a obtenção dos hibridomas. Partindo-se do RNA total de células produtoras desse receptor, foi produzido cDNA a partir do qual o fragmento codificante para hER? foi clonado em plasmídeo para produção de proteína recombinante em sistema heterólogo em E. coli. Essa proteína foi fusionada a uma cauda de histidina que foi utilizada na sua purificação por cromatografia de afinidade a metal imobilizado. O peptídeo purificado foi utilizado como antígeno na imunização de camundongos Balb/C. Animais que apresentaram uma boa resposta imunológica frente ao antígeno de interesse foram eutanasiados e tiveram o seu baço removido para a realização dos ensaios de fusão. Os esplenócitos dissociados foram fusionados a células de linhagens de mieloma através da utilização de polietilenoglicol com o objetivo de se obter hibridomas secretores de anticorpos monoclonais de interesse. Durante o período do trabalho nenhum hibridoma estável foi obtido, no entanto foram desenvolvidas todas as ferramentas necessárias para a obtenção do insumo. Palavras-chave: hER?, receptor de estrógeno, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, proteinas recombinantes. / Abstract: Breast cancer is a disease that affects more than 49,000 women annually in Brazil. To achieve a therapeutic decision for this type of tumor, it is important to define some parameters linked to proteins present or absent in the carcinoma. Among those proteins, the estrogen receptor ? (hER?) is highlighted. The detection of estrogen receptor ? is made by immunohistochemistry and, for this technique, monoclonal antibodies against hER? are used. Since Brazil is still completely dependent on imports of this material, obtaining hibridoma lines that produce those antibodies becomes an issue of sovereignty. In this study, the hole process and tools necessary to obtain those hybridomas was developed. Starting from the total RNA of cells that produce the receptor, cDNA was produced. The encoding sequence for hER? was cloned into a plasmid from which the recombinant protein was produced in heterologous system in E. coli. This protein was fused to a histidine tag that was used for its purification by Immobilized Metal Affinity Chromatography. The purified peptide was used as antigen to immunize Balb/C mice. Animals that showed a good immune response against the antigen of interest were euthanized and had their spleen removed for fusion assay. The dissociated splenocytes were fused to myeloma cell lines by using polyethyleneglycol in order to obtain hybridomas secreting monoclonal antibodies of interest. During the study, no stable hybridoma was obtained, however have been developed all the tools necessary to obtain the desired material. Key words: hER?, estrogen receptor, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, recombinant proteins.

Orientadora : Profª Drª Giseli Klassen / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica. Defesa: Curitiba, 18/11/2014 / Inclui referências / Resumo: As metástases são um grande problema para pacientes com câncer de mama, chegando a ser a causa de 90% dos casos de morte desta neoplasia. A proteína matriz metaloprotease 14 (MMP-14) tem uma importante contribuição no desencadeamento da migração celular nos carcinomas mamários, pela sua atividade proteolítica, e também pela ativação de outras metaloproteases solúveis capazes de degradar componentes da matriz extracelular. Sabe-se que a regulação do gene MMP14 está intimamente relacionada com aspectos epigenéticos, através da metilação de uma ilha de CpG localizada na região promotora. Estudos têm demonstrado que o padrão de metilação ao longo do corpo do gene também pode apresentar um importante papel na regulação da transcrição gênica e, para tanto, o objetivo deste estudo foi verificar o papel da metilação do corpo do gene MMP14 na regulação da expressão em diferentes linhagens tumorais de mama. As linhagens HB4aC3.6, HB4aC5.2, PMC42 e MCF-7 foram avaliadas quanto a expressão do gene estudado por RT-PCR e RT-qPCR. Duas regiões que continham ilhas de CpG, uma localizada na região promotora (-161 a +186) e outra no primeiro íntron do corpo do gene (+242 a +869), foram amplificadas e sequenciadas após o tratamento com bissulfito de sódio. Os resultados obtidos mostraram que as linhagens HB4aC3.6, HB4aC5.2 e PMC42 expressam o gene MMP14 e que suas taxas de metilação global, de ambas as ilhas de CpG avaliadas, não passam de 15%. Por outro lado, a linhagem MCF7 foi a única que não expressou o gene MMP14, e apresentou taxas de metilação global que ultrapassam 75%, em ambas as ilhas de CpG. Assim, mostrou-se uma correlação entre a ausência de expressão e alta metilação da ilha de CpG não só da região promotora, mas também da localizada no primeiro íntron. Estes resultados também permitiram a identificação de regiões diferencialmente metiladas nas linhagens de mama para padronização da técnica de MSP-PCR. A linhagem MCF7, quando submetida ao tratamento com os compostos desmetilantes (DAC) e inibidores desacetilantes de histona (TSA), passou a expressar o gene MMP14 e reduziu suas taxas de metilação global, indicando uma estreita relação entre epigenética e regulação deste gene incluindo a região intrônica. Nas regiões desmetiladas pelos tratamentos, foi possível identificar um sítio de ligação do fator de transcrição GLI3, que pode estar auxiliando na expressão de MMP14. Concluímos que a metilação da ilha de CpG localizada no íntron do gene MMP14 parece estar atuando cooperativamente com a região promotora para promover ou silenciar a transcrição do gene. Estudos de metilação no corpo do gene são recentes e, portanto, novos dados podem contribuir para entender a importância da metilação dessas regiões de DNA nos mecanismos de tumorigênese. Palavras-chave: Câncer de mama. MMP-14. Ilha de CpG intrônica. Metilação. / Abstract: Metastasis is a major problem for patients with breast cancer, being the cause of 90% of deaths from this neoplasia. The protein matrix metalloprotease 14 (MMP-14) has a major contribution in the initiation of cell migration in breast carcinomas, due to its proteolytic activity, and also by the activation of other soluble metalloproteases capable of degrading components of the extracellular matrix. It is known that the regulation of the MMP14 gene is closely related to epigenetic events by methylation of a CpG island located in the promoter region. Studies have shown that the methylation pattern along the body of the gene may also have a role in regulating gene transcription and, therefore, the aim of this study was to investigate the role of methylation in the body of MMP14 in regulating the expression of this gene in different breast tumor cell lines. The expression of the gene was evaluated by RT-PCR and RT-qPCR in the HB4aC3.6, HB4aC5.2, PMC42 and MCF-7 cell lines. Two regions containing CpG islands, one located in the promoter (-161 to +186), and another region in the first intron of the gene body (+242 to +869), were amplified and sequenced after treatment with sodium bisulfite. The results showed that the HB4aC3.6, HB4aC5.2 and PMC42 lines expressed MMP14 and their rates of global methylation of both CpG islands was no more than 15%. On the other hand, the MCF7 line was the only one that did not express the MMP14 gene and presented global methylation rates exceeding 75% in both CpG islands. This showed a correlation between the absence of high expression and methylation of the CpG island not only of the promoter region but also of the first intron. These results also allowed the identification of different methylated regions in breast cancer cell lines for the standardization of MSP-PCR. The MCF7 line, when subjected to treatment with the demethylating compound (DAC) and the inhbitors of histone deacethylating compund (TSA), expressed MMP14 and reduced its rates of global methylation, indicating a close relationship between epigenetics and regulation of this gene including the intronic region. In regions demethylated by the treatment it was possible to identify a binding site of the transcription factor GLI3, which may be promoting the expression of MMP14. We conclude that methylation of the CpG island located in the intron of the MMP14 gene seems to be working cooperatively with the promoter region to permit or silence the transcription of the gene. Studies of methylation in the body of the gene are new, and, therefore, new data can contribute to understand the importance of DNA methylation of these regions in the mechanisms of tumorigenesis. Keywords: Breast cancer. MMP-14. Intronic CpG island. Methylation.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-11-28Bitstream added on 2014-06-13T19:44:11Z : No. of bitstreams: 1 paiva_ce_dr_botfm.pdf: 1567376 bytes, checksum: a85fd07082b19096a7181e31cd1b5247 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O câncer de mama (CM) representa um importante problema de saúde pública no mundo, com aproximadamente 1.400.000 casos diagnosticados e 460.000 mortes por ano. É considerada uma doença heterogênea, com alterações em diversas vias de sinalização molecular. Tanto os marcadores prognósticos quanto os preditivos são de grande importância para a tomada de decisões terapêuticas. No caso do CM operado, os marcadores prognósticos ajudam a determinar se a paciente necessita de tratamento adicional e os marcadores preditivos auxiliam o clínico a decidir qual tratamento a ser utilizado. Desta forma, o melhor conhecimento dos marcadores prognósticos e preditivos conhecidos e a identificação de novos marcadores, poderão auxiliar o tratamento de pacientes com CM de forma mais adequada. Dois marcadores tumorais com possíveis implicações clínicas são o TGF-β1 e o seu receptor TGF-βRII. Em relação ao impacto preditor de resposta a quimioterapia, os referidos marcadores ainda não foram devidamente estudados. Quanto ao papel prognóstico, os estudos em literatura são contraditórios. Acredita-se que o TGF-β atue de forma diferente em função do tipo celular e do contexto biológico envolvido. Assim, é supressor tumoral nos estágios iniciais da carcinogenese e promotor tumoral nos estágios tardios. O momento da troca de papéis não está estabelecido, porém, sabe-se que, em um mesmo tumor, o TGF-β pode atuar tanto como supressor quanto como promotor tumoral simultaneamente. Em face da complexidade biológica do TGF-β, optou-se por estudar um grupo homogêneo de mulheres com CM em estádio TNM III, com longo período de seguimento clínico, submetidas à quimioterapia neoadjuvante (QtNeo) baseada em doxorrubicina e também à quimioterapia adjuvante. Desta forma, o objetivo deste... / Breast cancer (BC) represents an important public heatlh problem worldwide, with approximately 1.4 million new cases and 460,000 deaths per year. It is considered a heterogeneous disease with changes in several molecular signalling pathways. Both the predictive and prognostic markers are important for making therapeutic decisions. In the case of operated BC, prognostic markers help to determine if the patient needs additional treatment and predictive markers help the clinician to decide which treatment to use. Thus, a better knowledge of known predictive and prognostic markers and the identification of new markers, may improve the treatment of BC patients. Two tumor markers with potential clinical implications are TGF-β1 and its receptor TGF-βRII. Regarding the prediction of response to cancer chemotherapy, these markers have not been adequately studied. Considering its prognostic value, published studies are contradictory. It is believed that the TGF-β acts differently depending on the cell type and the biological context involved. Thus, it acts as a tumor suppressor in the early stages of carcinogenesis and as a tumor promoter in later stages. The moment of role switch is not established, however, it is known that in the same tumor, TGF-β can act as both tumor suppressor and promoter simultaneously. Given the biological complexity of TGF-β, we chose to study a homogeneous group of women with TNM stage III BCs comprising tumors with long follow-up period, submitted to doxorubicinbased neoadjuvant chemotherapy (NAC) and adjuvant chemotherapy as well. Thus, the aim of this study was to evaluate the protein expression of TGF-β1 and TGF-βRII in a sample of BCs and to correlate it with clinical and pathological response rates, occurrence of distant metastasis, and survival analysis. To this end... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-22Bitstream added on 2014-06-13T18:46:58Z : No. of bitstreams: 1 neuber_lmb_dr_botfm.pdf: 821698 bytes, checksum: 47159f4648e7ac0bea0da74608ffdc95 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O câncer de mama acomete inúmeras mulheres e preocupa profissionais de diferentes áreas da saúde, em busca de alternativas para a prevenção e o tratamento dessa doença. Dentre os fatores de risco para o câncer, encontram-se variáveis genéticas, alimentares, sócio-ambientais e comportamentais que participam da gênese da doença. O estresse é um dos fatores pesquisados, sendo reconhecido por seus efeitos imunodepressores e potencialmente relevantes para a gênese das neoplasias malignas. A inter-relação de variáveis orgânicas e psicossociais na gênese do câncer e na de muitas outras doenças tem sido objeto de estudos da psicoimunologia, que se solidifica como novo campo científico, fundamentado em resultados de pesquisas psicofisiológicas e nas contribuições das pesquisas na área do estresse. Dada a importância das relações conjugais e familiares na trajetória de vida da maioria dos indivíduos e os resultados de pesquisa indicando tais relações como fontes significativas de estresse, considera-se relevante a realização de estudos visando compreender e tratar os fatores afetivoemocionais de estresse ligados às relações conjugais e à saúde dos indivíduos. Esta pesquisa visou contribuir para os avanços teóricos em psico-oncologia, tendo como objetivo geral realizar intervenção terapêutica sociodramática com a finalidade de trabalhar os conflitos conjugais e familiares como prevenção primária, para as mulheres sem câncer de mama, e secundária, para as mulheres com câncer de mama. E específicos, identificar os conteúdos psicossociais envolvidos nos conflitos familiares e conjugais; possibilitar a co-construção dos conteúdos emergidos no grupo, na busca de conscientizar, ampliar, compreender e redefini-los; averiguar o significado atribuído a esses conflitos e favorecer a ressignificação para a abertura de novas possibilidades na resolução... / Breast cancer affects several women and raises concern among health professionals of different specialties, in the search for options for the prevention and treatment of this disease. The risk factors for cancer include genetic, dietary, socioenvironmental and behavioral factors that, in combination, participate in the occurrence of this disease. Stress is one of the factors analyzed, because of its known immune suppressing effects that may be potentially relevant in the initiation of malignant neoplasias. The inter-relation of organic and psychosocial variables in the initiation of cancer and many other diseases has been investigated in psychoimmunology research, which has been established as a new field of science, based on the results of psychophysiologic studies and contributions of investigations in the field of stress.Considering the importance of marital and family relationships in the life of most individuals and that previous investigations indicated such relationships as significant sources of stress, studies should be conducted to understand and treat the affectiveemotional factors of stress related to the marital relationships and health of individuals. This study aimed to contribute to theoretical advances in the field of psycho-oncology, with the overall objective to perform a sociodramatic therapeutic intervention in order to address the marital and family stresses as primary prevention for women without breast cancer and secondary prevention for women with breast cancer. The specific objectives were to identify the psychosocial aspects involved in the family and marital stresses; allow the co-construction of contents appearing in the group, in order to promote the awareness, widen, understand and redefine them; check the signification assigned to these stresses; and favor their resignification to open new possibilities... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-11-28Bitstream added on 2015-04-09T12:48:03Z : No. of bitstreams: 1 000815527_20160106.pdf: 214090 bytes, checksum: 0512964e0204c89e90a14197aaf55957 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-01-06T15:52:21Z: 000815527_20160106.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-06T15:52:58Z : No. of bitstreams: 1 000815527.pdf: 1509912 bytes, checksum: 7899785076e0cdf76d639b7e4242c9b6 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O câncer, manifestação originada pelo crescimento descontrolado de células, afeta milhões de indivíduos e é uma das principais causas de morte em todo mundo. Tendo em vista que os fármacos atualmente disponíveis para o tratamento apresentam eficácia limitada (como a cisplatina) comumente atrelada à alta toxicidade, a busca por novos compostos capazes de combater células cancerígenas é uma necessidade premente. Com isso, cresce o interesse de se investigar novas substâncias que não sejam tóxicas, mas sim seletivas. Os compostos de paládio(II) têm sido estudados como uma alternativa aos fármacos disponíveis, mostrando-se promissores por sua menor toxicidade e capacidade de estimular a resposta imune antitumoral. Os macrófagos são as primeiras células a serem ativadas para participar de uma resposta imunológica propriamente dita e são células capazes de secretar mais de cem produtos biologicamente ativos, entre esses, espécies reativas de nitrogênio e citocinas atuantes na resposta imunológica e na formação tecidual. Neste trabalho foram testados sete compostos de paládio(II) quanto ao potencial imunológico e antitumoral, sendo eles: [Pd(dmba)(μ-Cl)]2 (1), [Pd(dmba)(μ-N3)]2•H2O (2), [Pd(dmba)(μ-NCO)]2 (3), [Pd(dmba)Cl(isn)] (4), [Pd(dmba)(N3)(isn)] (5), [Pd(dmba)(NCO)(isn)] (6) {DMBA= N,Ndimetilbenzilamina; ISN= isonicotinamida; Cl= cloro; N3= azida; e NCO= cianato}; e [Pd(Cdmba)( NCS)(dppp)] (7) {DMBA = N,N-dimetilbenzilamina; NCS = tiocianato e DPPP = difenilfosfinapropano}. Os compostos foram testados quanto pelo teste colorimétrico de MTT, brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólio. Os compostos que apresentaram melhores resultados (3,4 e 7, em comparação com a cisplatina), foram submetidos ao teste do MTT a fim de traçar seu perfil citotóxico e citostático frente a linhagem celular LM3 (carcinoma mamário murino), além de quantificar citocinas e analisar a apoptose por Citometria ... / The cancer manifestation caused by uncontrolled growth of cells, affects millions of individuals and is a major cause of death worldwide. Considering that the drugs currently available for the treatment of limited efficacy (such as cisplatin) commonly linked to high toxicity, the search for new compounds capable of fighting cancer cells is urgently needed. With this growing interest in investigating new substances that are not toxic, but selective. Compounds of palladium(II) have been studied as an alternative to available drugs showing be promising for its low toxicity and ability to stimulate antitumor immune response. Macrophages are the first cells to be activated to participate in an immune response itself and cells are able to secrete more than hundred biologically active products, among these, reactive nitrogen species and active cytokines in the immune response and tissue formation. In this work seven compounds of palladium(II) were tested for potential antitumor and immune being: [Pd(dmba) (μ-Cl)]2 (1), [Pd(dma)(μ-N3)]2•H2O (2), [Pd (dmba)(μ-NCO)]2 (3), [Pd(dmba)Cl(isn)] (4), [Pd(dmba)(N3)(isn)] (5), [Pd(dmba)(NCO)(isn)] (6) {DMBA = N, Ndimethylbenzylamine; ISN = -isonicotinamide; Cl = chloro; N3 = azide; and NCO = cyanate}; and [Pd(C-dmba)(NCS)(dppp)] (7) = {DMBA = N,N‟ – dimethylbenzylamine; NCS= thiocyanate and DPPP = difenilfosfinapropano}. The compounds were tested by colorimetric assay of MTT, 3 [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl-tetrazolium. Compounds that showed better results (3.4 and 7, compared with cisplatin) were subjected to the MTT assay in order to trace their cytostatic and cytotoxic profile against LM3 cell line (murine mammary carcinoma), and analysis of apoptosis Flow Cytometry results involving cytotoxicity on these two cell types showed that each compound acts differently. Featured, against LM3 lineage compound 3 showed efficacy at a concentration of 25 mg / mL, as compound 4 showed the best ...

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-26Bitstream added on 2015-05-14T16:59:08Z : No. of bitstreams: 1 000822183.pdf: 282765 bytes, checksum: db910f4ab312864b17680fd86c4fc745 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A importância do estrógeno (E2) no desenvolvimento do câncer de mama é bem estabelecido na literatura. O uso de antagonistas de E2 para o tratamento de tumores positivos para o receptor de estrógeno mostra-se importante para a sobrevida de pacientes acometidas pela doença. Amphiregulin (Areg), um fator de crescimento regulador multifuncional que pode ser induzido por estrógeno, possui papel central no desenvolvimento da glândula mamária e na morfogênese de órgãos e é expresso tanto em tecidos normais como cancerosos. Estudos clínicos sugerem que amphiregulin também desempenha papel importante na progressão do câncer da mama humano e a sua expressão aumentada tem sido associada com doença agressiva. Para investigar o mecanismo pelo qual o E2 induz a expressão de AREG, células MCF-7 e MDA-MB-231 foram tratadas durante 10 minutos, 30 minutos, 1 hora e 4 horas com veículo (controle) ou E2 isoladamente ou em associação com Fulvestrant (ICI, inibidor do receptor de estrógeno), Actinomicina D (ACTD, inibidor da transcrição gênica), Ciclohexamida (CHX, inibidor da síntese proteica) ou LY (inibidor da via PI3K). Os inibidores também foram utilizados isoladamente. O RNAm foi extraído das células pelo método de trizol e a expressão de AREG foi analisada por qRT-PCR. O tratamento de ambas as células com E2 induziu aumento do RNAm de AREG em todos os tempos analisados. Esse aumento foi parcialmente dependente de ER nas células MCF-7 nos tempos de 10 minutos, 1 e 4 horas. Em 30 minutos não foi observado a ligação do E2 com o ER para que houvesse o aumento da expressão do gene alvo. Nas células MDA-MB-231 o estrógeno aumentou o RNAm de AREG por pelo menos duas vias distintas em todos tempos analisados. Uma das vias ativa a via PI3K para que este efeito ocorra. Nossos resultados demonstram que o E2 é capaz de induzir a expressão de AREG em linhagens de células de câncer de ... / The relevance of estrogen in breast cancer development is well established in the literature. The use of E2 antagonists for ER-positive breast cancer treatment is shown to be important to patients´ survival. Amphiregulin, a multifunctional growth regulator factor that may be induced by estrogen plays a central role in development of mammary glands and organ morphogenesis, is expressed in both normal and cancerous tissues. Clinical studies suggest that amphiregulin also is important in human breast cancer progression and its expression has been associated with aggressive disease. To investigate the mechanism whereby E2 induces AREG expression, MCF-7 and MDA-MB-231 cells were treated for 10 minutes, 30 minutes, 1 hour or 4 hours with vehicle (control) or estrogen (E2) isolated or in association with Fulvestrant (ICI, estrogen receptor inhibitor), Actinomycin D (ACTD, gene transcription inhibitor), Cycloheximide (CHX, protein synthesis inhibitor ) or LY (PI3K inhibitor). The inhibitors were also used alone. mRNA was extracted from the cells by the Trizol method and AREG expression analyzed by qRT-PCR. Treatment of both cell types with E2 increased AREG mRNA expression at all moments. This increase was partially ER-dependent in MCF- 7 cells at 10 minutes, 1 and 4 hours. At 30 min, no binding of E2 to ER was obseved. In MDA-MB-231 cells, the estrogen-induced AREG mRNA was enhanced by two distinct pathways at the moments analyzed and PI3K pathways participated in one of them. Our results showed that E2 was able to induce the AREG expression in breast cancer cell lines in an ER-dependent and -independent manner

Orientador: Noeme Sousa Rocha / Banca: Claudia Valeria Seullner Brandão / Banca: Cristina Kurachi / Resumo: Neoplasia é um processo anormal que compromete a proliferação e diferenciação celular de início localizado, podendo disseminar pelo organismo do hospedeiro levando a sua morte. As características desse processo devem ser investigadas para se estabelecer um protocolo terapêutico, para isso, uma importante ferramenta é o Teste do Cometa que detecta a lesão do DNA. Quanto ao protocolo terapêutico a Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma nova modalidade utilizada para o tratamento de neoplasia. Consiste na indução da citotoxicidade, através da interação da luz de comprimento de onda adequado, de um fotossensibilizador e do oxigênio molecular presente nas células. Com o objetivo de quantificar a lesão no DNA das neoplasias mamárias pelo Teste do Cometa; avaliar a resposta desse tumor à Terapia Fotodinâmica como tratamento único e adjuvante a cirurgia utilizamos 20 ratas Sprague-Dawley divididas em quatro grupos durante 12 semanas: os grupos G1 a G4 receberam dose única de DMBA 50 mg/kg por gavagem para indução do tumor de mama. Quando da manifestação da neoplasia aplicou-se nos animais de todos os grupos citados o TNM clínico, exame citológico e Teste do Cometa. O G1 foi acompanhado clinicamente, o G2 submetido à TFD, o G3 à cirurgia associada a TFD, G4 à cirurgia. Os animais do grupo 2 foram submetidos a uma única sessão da TFD, após 8 semanas, tiveram o estadiamento clínico e lesão no DNA menores quando comparado ao grupo controle. Os animais do grupo 3 não apresentaram recidivas até o final de 12 semanas quando foram comparados com os animais do grupo 4 o qual apresentou 60% de taxa de recidiva após 11 semanas, embora os animais do grupo 3 tenham apresentado menor lesão no DNA. A TFD pode ser usada no modelo experimental de tumor de mama como terapia única e adjuvante a cirurgia para redução da evolução do tumor e evitar recidivas respectivamente. / Abstract: Neoplasm is a process that results from an the abnormal proliferation and cell differentiation initially localized, but can metastize leading to death. The characteristics of this process should be investigated to establish a therapeutic protocol Comet assay is an important tool that detects the DNA damage. Photodynamic Therapy (PDT) is a therapeutic modality that can be used to treat cancer, where the cytotoxic effect is induced by the interaction of light at adequate wavelength, a photosensitizer and molecular oxygen present in cells. Aiming to quantify the DNA damage by Comet assay in mammary tumor assess the tumor response after Photodynamic Therapy as a single treatment or adjunvant modality to surgery, 20 Sprague-Dawley rats were used. The animals were divided into four groups all animals received a single dose of DMBA, 50 mg / kg by gavage to induce the mammary tumors the TNM clinical, cytological and Comet assay classifications were performed. The animals of were clinically monitored, the animals were treated by PDT, the animals were treated with surgery and PDT, and the animals of only surgery. The animals in group 2 were subjected to a single session of PDT, and after 8 weeks, clinical staging and DNA damage were less when compared to the control group. The animals in group 3 showed no tumor recidive until the end of the 12 th week. The animals of group 4 showed 60% rate of tumor recurrence after 11 weeks. The animals in group 3 showed less DNA damage when compared to group 4. PDT can be used in an experimental model of mammary tumor as single and as adjuvant therapy to reduce the development of tumors and to prevent recurrences, respectively. / Mestre

Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer mais frequente no mundo, depois do câncer de pele não melanoma, e a principal causa de morte por câncer entre as mulheres. Os carcinomas do tipo ductal e o lobular são os tipos histológicos de câncer de mama que ocorrem com maior frequência na população. Os carcinomas lobulares invasivos (CLIs) representam em torno de 10-15 % dos casos de câncer de mama, são de difícil identificação e podem ocasionar metástases para alvos pouco comuns como, por exemplo, o sistema gastrointestinal. A perda da expressão de E-caderina reflete a morfologia histológica dos CLIs, entretanto, há uma variação da expressão dessa proteína nos carcinomas lobulares (0-45%). Em um estudo recente foi determinado que o gene ADAM33 apresenta sua expressão diminuída em CLIs devido ao silenciamento por hipermetilação do seu promotor e portanto, a proteína ADAM33 poderia ser um marcador molecular de CLIs. Com o objetivo de avaliar a utilização em imunohistoquímica da proteína ADAM33 como um biomarcador de CLIs, uma parte do gene ADAM33 contendo o domínio rico em cisteínas foi clonado em vetor pGEM T e em seguida subclonado em vetor pET28a. A proteína recombinante foi expressa em sistema procarionte em E. coli BL21 Ai e purificada por cromatografia de afinidade por níquel. A proteina purificada foi utilizada para imunização de camundongos Balb-c e foi produzido soro policlonal com título de 1:25.600. Além disso, o soro policlonal apresentou especificidade para a proteina ADAM33 expressa por linhagens tumorais de mama que expressam o gene ADAM33. O soro policlonal apresentou também especificidade para carcinoma lobular de mama invasivo por ensaio de imunohistoquímica demonstrando, assim, a possibilidade da utilização do anticorpo anti-ADAM33 como biomarcador molecular de carcinoma de mama, mais especificamente do tipo lobular.