Orientador: Antonio Nader Filho / Banca: Luiz Augusto do Amaral / Banca: Carlos Augusto Fernandes de Oliveira / Banca: Nilson Roberti Benites / Banca: Helio Langoni / Resumo: o presente estudo teve como objetivo verificar a prevalência da mastite caprina causada por Staphylococcus spp. em três rebanhos do Estado de São Paulo, bem como conhecer as características fenotípicas e genotípicas das cepas isoladas. Por outro lado, através dos testes de susceptibilidade a antimicrobianos e da PCR-ribotipagem, pretendeu-se, também, verificar a relação epidemiológica existente entre as cepas de Staphylococcus spp. isoladas em amostras de leite, óstio do teto, lesão em pele do teto e ordenhadeira, assim como de mãos, tonsilas e fossas nasais de ordenhadores. A prevalência da mastite subclínica foi de 12,0%, 10,7% e 26,6% nos rebanhos pertencentes às três propriedades estudadas, nos quais Staphylococcus coagulase negativa foi o principal agente envolvido na etiologia dos casos. O teste de susceptibilidade a antimicrobianos revelou que 100% das cepas foram sensíveis à gentamicina, a neomicina e ao cefoperazone e, ainda, que a resistência frente a ampicilina e penicilina foi observada em 25,2% das cepas. A análise molecular revelou estreita relação entre as cepas isoladas de amostras de leite e óstio de teto. Cepas isoladas dos insufladores da ordenhadeira, assim como as de fossas nasais dos ordenhadores, têm participação na epidemiologia das mastites em cabras. A PCR-ribotipagem permitiu avaliar a relação epidemiológica existente entre as cepas isoladas de forma mais eficiente que o teste de susceptibilidade a antimicrobianos. A compreensão dessas relações epidemiológicas é necessária para a implementação de medidas eficazes no controle e prevenção das mastites em cabras. / Abstract: The present study aimed to investigate the prevalence of goat mastitis due to Staphylococcus spp. in three flocks from São Paulo State, as well as understand the phenotypic and genotypic characteristics of the strains isolated. Otherwise, epidemiological relationship between the strains isolated from milk, teat ends, skin lesions, milking units and milking personnel was investigated by the antimicrobial susceptibility and PCR-ribotyping. The prevalence of subclinical mastitis was 12,0%, 10,7% and 26,6% for the three flocks studied and coagulase negative Staphylococcus was the most prevalent agent isolated. Antimicrobial susceptibility test revealed 100% of sensibility to gentamicin, neomycin and cephoperazon and, in addition, the resistance to ampicillin and penicillin in 25,2% of the strains isolated. Molecular analysis showed close relationship between strains isolated from milk and teat ends. Strains isolated from milking units, as well as strains isolated from nasal swabs of the milking personnel, play an important role on goat mastitis epidemiology. PCR-ribotyping was more efficient than antimicrobial susceptibility test to evaluate the epidemiological relationship between the strains isolated. An understanding of these epidemiological relationships is necessary for the design of more effective mastitis control programs. / Doutor

O elevado custo dos tratamentos tradicionais da mastite bovina, associado à redução de produção e inviabilidade de tratamento das mastites subclínicas durante a lactação, bem como a exigência cada vez mais rigorosa da ausência de resíduos de antimicrobianos por parte de instituições nacionais e internacionais, impulsiona o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas que visem minimizar o impacto das medidas tradicionais de tratamento. A homeopatia surge como importante alternativa, sendo aceita nacional e internacionalmente. O objetivo do trabalho foi avaliar o tratamento homeopático com Phytolacca decandra 30CH durante a lactação de vacas com mastite subclínica, utilizando parâmetros de qualidade do leite como Califórnia Mastitis Test (CMT), contagem de células somáticas (CCS) totais, porcentagens de polimorfonucleares (PMN) e de mononucleares (MN), teores de proteína, lactose, gordura, sólidos totais (ST) e extrato seco desengordurado (ESD), além da mensuração da produção leiteira. Foram selecionadas 26 vacas, CMT 2+ e 3+ sem sinais de mastite clínica, entre o terceiro e sexto mês de lactação, pluríparas e divididas em dois grupos, um com tratamentos medicamentosos mensais e outro com tratamentos quinzenais. Mensalmente foram colhidas duas amostras de leite de cada glândula mamária (teto) que apresentava mastite subclínica. Uma das amostras foi utilizada para CCS e análise dos componentes do leite, e a outra para identificação microbiológica. Nos grupos tratados, foi administrado o medicamento homeopático Phytolaca decandra 30CH diluído em água e aspergido nas mucosas oro-nasais e vaginais, enquanto que nos grupos denominados controle foi administrado placebo da mesma maneira. A pesagem da produção láctea de ambos os grupos foi realizada quinzenalmente até o final do experimento. Verificou-se então que não houve diferença significativa entre a produção láctea, CCS e a presença de microrganismos na secreção láctea das glândulas quando comparadas antes e depois do tratamento homeopático, dentro de cada grupo, bem como quando comparados os grupos entre si. As medianas de CMT e porcentagens de PMN foram compatíveis com infecções mamárias agudas, embora os animais tenham sido diagnosticados como portadores de mastites crônicas e em nenhum momento desenvolveram sinais clínicos. / The high cost of traditional treatments of bovine mastitis, with the reduction of production and impracticable treatment of subclinical mastitis during lactation, as well as the requirement of an increased demand for absence of antimicrobial agents residues by national and international institutions, drives the development of new therapeutic alternatives in order to minimizing the impact of traditional treatment measures. The homeopathy appears as an important alternative, accepted domestically and internationally. The objective of this work was to evaluate homeopathic treatment with Phytolacca decandra 30CH during the lactation of cows with subclinical mastitis, using some milk quality parameters as California Mastitis Test (CMT), total somatic cell count (SCC), percentages of polymorphonuclear (PMN) and mononuclear (MN) cells, levels of protein, lactose, fat, total solids and dry defatted matter, in addition to the measurement of milk production. Twenty-six cows were selected with CMT 2 + and 3 + without any signs of clinical mastitis, between the third and sixth month of lactation, pluriparous and they were divided into two groups, with monthly or biweekly drug treatments. Monthly were collected two milk samples from each mammary gland (teat) that presented subclinical mastitis. One of the samples was used for analysis of SCC and milk components, and the other one for microbiological identification. In the treated groups, was given the homeopathic medicine Phytolaca decandra 30CH diluted in water and sprayed in the oral-nasal and vaginal mucosa, while to the control group was given placebo following the same method. The weighing of the milk production for both groups was performed fortnightly until the end of the experiment. There was no significant difference between milk production, SCC and the presence of microorganisms in milk gland secretion compared before and after homeopathic treatment, within each group as well as comparing the groups together. The medians of CMT and percentages of PMN were compatible with acute mammary infection, in spite of they have been diagnosed as carriers of chronic mastitis, and at any time no clinical signs have been developed.

Temos presenciado um crescimento expressivo da ovinocultura de corte nos últimos anos. Algumas doenças de grande importância econômica tem sido motivo de estudos, não apenas pelo impacto econômico que representam, mas também para a saúde do animal e do homem. Com a crescente preocupação com resíduos de medicamentos pesticidas nos produtos de origem animal, perda da qualidade do leite e conseqüente baixo ganho de peso dos borregos de corte, os sistemas orgânicos de produção vem ganhando espaço. Sabe-se que a mastite subclínica é uma das responsáveis pelo baixo rendimento de carcaça na ovinocultura de corte. Neste experimento, optou-se por realizar tratamento com medicamento homeopático (Phytolaca decandra) das ovelhas com tetos diagnosticados com CMT 2+ e 3+, sem sinais de mastite clínica. Dois lotes de ovelhas com mastite subclínica foram usados. Um lote controle que recebeu placebo e o lote tratado que recebeu remédio homeopático duas vezes ao dia junto ao concentrado a partir da quarta semana do parto (de lactação). Foram colhidas duas amostras de cada tetos com mastite subclínica no início do experimento (30 dias do parto) e a cada 15 dias até o desmame quando os borregos tinham aproximadamente 60 - 65 dias de vida. Das amostras colhidas, uma seguiu para identificação do agente microbiológico e outra para a contagem de células somáticas (CCS). Ao final do estudo não houve diferença estatisticamente significativa entre as CCSs da secreção láctea quando comparadas antes e depois do tratamento homeopático no mesmo grupo, bem como quando comparou-se ambos os grupos (tratados e placebo). Porém observou- se que o grupo tratados apresentou redução significativa (P<0,05) nos isolados das amostras com Staphylococcus spp. e aumento significativo de amostras sem crescimento bacterianos (negativas) e ganho de peso estatisticamente significante (P<0,05) quando comparado ao grupo placebo. / We have seen an expressive growth of lamb production in the last years. Some diseases of economic importance have been studied not just by its economic impact but also for the animal and human health. With worry about pesticides and drugs\' remaining (left over) in animal origin products, the loss of milk quality and consequent lamb\'s low gain weight, the organic production systems are growing up. It\'s known that subclinical mastitis is one of the most dangerous and one of those held responsible for the decrease of weight-gain in lamb breeders. In this experiment, it was chosen to use homeopathic medication for ewes whose half udder was diagnosed 2+ and 3+ on CMT (California Mastite Test) without signs of clínical mastitis. Two groups of subclinical mastitis ewes were used. The first one received placebo BID (no treated group) and the second one received homeopathic medication (Phytolaca decandra) BID (treated group) in concentrated food since the 4Th week of lambing. Two milk samples were taken from each injured gland 30 days after lambing and each 15 days until 60-65 days after lambing, when the lambs were weaning. One of the milk samples went to microbiological identification and the other one to SCC (somatic cell count). By the end of the research, neither was it found statistical difference between samples of milk before and after homeopathic treatment from the three milk sampling in the same group nor did it happens when the groups treated and placebo were compared. However, it was observed that the treated group showed significant decrease (P<0,05) samples with Staphylococcus spp. and significant increase of samples without bacteriological growth as well as gain of weight statistically significant (P<0,05) when compared with the placebo groups.

No universo da pecuária leiteira, a mastite representa um importante desafio, sendo responsável por perdas econômicas consideráveis relacionadas principalmente com redução na produção de leite. O gênero Staphylococcus assume elevada importância como agente etiológico das mastites devido à sua ampla distribuição e freqüência de ocorrência. Foram coletadas amostras de leite de fêmeas bovinas com mastite subclínica para exames microbiológicos e contagem de células somáticas (CCS). Após o isolamento e identificação dos micro-organismos, as amostras positivas foram submetidas a análises das medianas das CCS, testes de susceptibilidade \"in vitro\" frente a diferentes antimicrobianos, assim como pesquisa de genes codificadores das adesinas - genes que codificam para proteína ligadora de colágeno (cna), proteína ligadora de laminina (eno), proteína ligadora de elastina (ebp), proteína ligadora de fibrinogênio (fib), proteína A ligadora de fibronectina (fnbA), proteína B ligadora de fibronectina (fnbB) e proteína associada à formação de biofilme (bap), por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). De acordo com os achados do presente estudo, dentre as bactérias do gênero Staphylococcus isoladas, os S. aureus foram verificados com maior freqüência, seguido por Staphylococcus coagulase-negativos - S. intermedius, S. chromogens e S. warneri. Com respeito às medianas das CCS, o gênero Streptococcus spp. apresentou o maior valor. O perfil de sensibilidade e resistência aos antimicrobianos testados foi semelhante entre as espécies de Staphylococcus coagulase-positivos e negativos, sendo os antimicrobianos cefalexina, cefalotina e ceftiofur os que apresentaram maior frequência de sensibilidade, e penicilina, amoxicilina e ampicilina os que apresentaram maior resistência. Com exceção do (fnbA), todos os outros fatores de virulência estudados foram detectados, sendo os genes eno, fib e a associação dos genes \"eno/fib/bap\" os mais freqüentemente detectados. Nas amostras coletadas dos tanques de refrigeração não foram detectadas todas as espécies de Staphylococcus spp. isoladas dos quartos mamários. Tais informações acerca do assunto permitem o desenvolvimento de estratégias mais eficientes de tratamento e controle desta enfermidade, possibilitando o aumento da produtividade leiteira. / In the world of dairy cattle, mastitis is a major challenge, accounting for economic losses related mainly to reduction in milk production. The genus Staphylococcus assumes greater importance as a etiologic agent of mastitis due to its wide distribution and frequency of occurrence. Milk samples were collected from cows with subclinical mastitis to microbiological examinations and somatic cell count (SCC). After isolation and identification of microorganisms, positive samples were analyzed for the medians of SCC, tested for susceptibility \"in vitro\" against different antimicrobials and polymerase chain reaction will be used to search for genes encoding adhesins - genes that code for collagen-binding protein (cna), lamininbinding protein (eno), elastin-binding protein (ebp), fibrinogen-binding protein (fib), fibronectin-binding protein A (fnbA), fibronectin-binding protein B (fnbB) and protein associated with biofilm formation (bap). According to the findings of this study, among the bacteria of the genus Staphylococcus isolated, S. aureus were found most frequently, followed by coagulase-negative Staphylococcus - S. intermedius, S. chromogens and S. warneri. With respect to the medians of CCS, the genus Streptococcus spp. showed the highest. The profile of sensitivity and resistance to antimicrobials was similar among species of coagulase-positive and negative Staphylococcus, and antimicrobial cephalexin, cephalothin, and ceftiofur showed higher frequency sensitivity. Penicillin, amoxicillin and ampicillin showed the highest resistance. With the exception of (fnbA), all other virulence factors were detected, with genes eno, fib and the association of genes \"eno/fib/bap\" the most frequently detected. The samples collected from the cooling tanks were not detected all species of Staphylococcus spp. that were isolated from the mammary glands. Such information on the subject allow the development of more efficient strategies for treatment and control of this disease, allowing for increased milk production.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:16:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008 - Shana de Mattos de Oliveira Coelho.pdf: 1309260 bytes, checksum: d56e11e43855d92c6e9b5e2b5f5f4ab0 (MD5) Previous issue date: 2008-12-18 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / The present study was done to characterize phenotypic and genotypically the virulence factors and resistance profile to antibiotics, specifically to the oxacillin, of species of Staphylococcus spp. coagulase-positives isolated from milk samples of cows with mastitis. Of 150 isolated, the species S.aureus, S.intermedius and S.hyicus were identified. The antimicrobial susceptibility test yielded high resistance to penicillin and ampicillin and distinct antibiotyps had been identified, being of sensitivity to all the antibiotics prevalent. A total of 94,6% and 70,7% was positive for the production of betalactamases and presence of the mecA gene, respectively. The femA gene was detected in 80,9% of isolated mecA positive. The isolated presented distinct standards of growth in the tests of susceptibility to oxacillin. The tests of agar screen and the evaluation of the microdilution in plate, presented considerable values of sensitivity and specificity when the isolated ones were considered as an only group (Staphylococcus spp coagulase-positives) or when the species had been discriminated, respectively. The addition of 4% of NaCl in the agar plate can have effect in the increase of the sensitivity of the test of diffusion using the oxacillin and the test of diffusion presented the better capacity in the detention of the resistance isolates with cefoxitin disk. A total of 80% of the S.aureus was classified as MRSA and had presented resistance higher than 15% to the ampicillin and sulbactam association, vancomicin and gentamicin. About the virulence factors, the technique of the microplate disclosed 82.8% of isolated producers of slime and the intensity of the production was not associated with the presence of the icaA and icaD genes. In addition, the agar with the congo red presented effectiveness in the detention of isolated the not producing ones of slime . In all hemolitics isolates were detected the beta-hemolisin and 11.3% of the non-hemolitics had produced hemolisins in the presence of beta-hemolitic strain, indicating the presence of the delta hemolisin. spaA, coa and agr genes had been carried through the amplifications of the genes the S.aureus. The spaA gene, that it codifies protein A region X, was positive in all isolated ones, disclosed only amplicon for each isolated one and presented polimorfism being the prevalent size of 315pb. The amplification of the coa gene presented three distinct polimorfics types, with only amplicon for each isolated and the prevalent profile was of 900pb. The amplification of the agr gene resulted in amplicons with 350 and 550 pb in 74% of the isolated. The test of biotyping disclosed the bovine ecovar as the prevalent in the S.aureus. Seven S.aureus that had presented the same profiles of the coa, spaA, agr genes, antibiotyps and ecovars was detected being 4 pertaining the same properties and 3 isolated from distinct properties. / O presente estudo foi conduzido para caracterizar feno-genotipicamente os fatores de virul?ncia e perfil de resist?ncia aos antibi?ticos, especificamente ? oxacilina, de esp?cies de Staphylococcus spp. coagulase-positivos isolados de amostras de leite de vacas com mastite. Do total de 150 isolados, foram identificadas as esp?cies S.aureus, S.intermedius e S.hyicus. O teste de suscetibilidade antimicrobiana revelou elevada resist?ncia ? penicilina e ampicilina e distintos antibiotipos foram identificados, sendo o de sensibilidade a todos os antibi?ticos o prevalente. Um total de 94,6% e 70,7% foi positivo para a produ??o de betalactamases e presen?a do gene mecA, respectivamente. O gene femA foi detectado em 80,9% dos isolados mecA positivos. Os isolados apresentaram distintos padr?es de crescimento nos testes de suscetibilidade ? oxacilina. Os testes de ?gar screen e a avalia??o da microdilui??o em placa, apresentaram valores consider?veis de sensibilidade e especificidade quando os isolados foram considerados como um ?nico grupo (Staphylococcus spp coagulase-positivos) ou quando as esp?cies foram discriminadas, respectivamente. A adi??o de 4% de NaCl no meio de cultura pode ter efeito no aumento da sensibilidade do teste de difus?o em disco utilizando o disco de oxacilina e o teste de difus?o em disco apresentou melhor capacidade na detec??o dos isolados resistentes ? oxacilina com discos de cefoxitina. Um total de 80% dos S.aureus foi classificados como MRSA e apresentaram resist?ncia superior a 15% ? associa??o de ampicilina e sulbactam, vancomicina e gentamicina. Quanto aos fatores de virul?ncia, a t?cnica da microplaca revelou 82,8% de isolados produtores de slime e a intensidade da produ??o n?o foi associada ? presen?a dos genes icaA e icaD. Em adi??o, o ?gar contendo vermelho congo apresentou efic?cia na detec??o do isolados n?o produtores de slime . Em todos os isolados hemol?ticos foi detectada a beta hemolisina e 11,3% dos n?o-hemol?ticos produziram hemolisinas na presen?a da cepa beta-hemol?tica, indicando a presen?a da delta hemolisina. Foram realizadas as amplifica??es dos genes spaA, coa e agr em todos os S.aureus. O gene spaA, que codifica a regi?o X, foi positivo em todos isolados, revelou um ?nico amplicon para cada isolado e apresentou polimorfismo sendo o tamanho prevalente o de 315pb. A amplifica??o do gene coa apresentou tr?s tipos polim?rficos distintos, com ?nico amplicon para cada isolado e o perfil prevalente foi o de 900 bp. A amplifica??o do gene agr resultou em amplicons com 350 e 550 pb em 74% dos isolados. A prova de biotipifica??o revelou o ecovar bovino como o prevalente nos S.aureus. Foram identificados 7 S.aureus que apresentaram os mesmos perfis dos genes coa, spaA, agr, antibiotipos e ecovares, sendo 4 pertencentes mesma propriedades e 3 provenientes de propriedades distintas.

Submitted by Leticia Schettini (leticia@ufrrj.br) on 2016-09-20T14:14:37Z No. of bitstreams: 1 2016 - NAIARA DE MIRANDA BENTO RODRIGUES.pdf: 1508318 bytes, checksum: bbf2aebb5d43033339bf559d73461919 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-20T14:14:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016 - NAIARA DE MIRANDA BENTO RODRIGUES.pdf: 1508318 bytes, checksum: bbf2aebb5d43033339bf559d73461919 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPQ / Mastitis adversely affects milk production and in general cows do not regain their full production levels post recovery, leading to considerable economic losses. Moreover the percentage decrease in milk production depends on the specific pathogen that caused the infection and enterobacteria are responsible for this greater reduction. These microorganisms are preferentially found in the habitat of animals in places contaminated with feces, urine, clay and also organic beds. Phenotypic tests are among the currently available methods used worldwide to identify enterobacteria; however they tend to misdiagnose the species despite the multiple tests carried out and they can delay the antibiotic therapy by clinic veterinary. On the other hand the MALDI-TOF MS technique has been attracting attention for its precise identification of several microorganisms at species level. In the current study, 183 enterobacteria were detected in milk (n=47) and fecal samples (n=94) collected from cows; also water (n=23) and milk line samples (n=19) collected from a farm in Rio de Janeiro with the purpose to present the MALDI-TOF MS technique as efficient methodology and also as a ?gold standard? to better understand the possible current biochemical errors in enterobacteria identification considering isolates from bovine environments. This proteomic technique confirmed 92.9% (170/183) of the enterobacteria species identified by biochemical tests that showed high sensitivity (> 81%) and specificity (> 89%). The gyrB sequencing was made in eigth from thirteen misidentified enterobacteria and confirmed 100% the MALDI-TOF results, so the proteomic technique was used as a ?gold standard? for this study. The amino acid decarboxylation test made the most misidentifications and Enterobacter spp was the largest misidentified genus (76.9%, 10/13). E.coli was prevalent (83%, 152/183) in all samples and the bovine milk presented the most enterobacteria diversity. The Salmonella sp wasn?t detected in feces bovine samples and all water samples from different points in the farm presented unacceptable microbiological standards. Was identified enterobacteria in milkers hands and nasal cavity also in the milking machines used on the property. These results aim to contribute significantly to the characterization of the Enterobacteriaceae as well in understanding of its spread in dairy production environment , assisting in need diagnostic of possible agents involved in bovine mastitis as well as to implement properly targeted prophylactic measures. / A mastite bovina afeta negativamente a produ??o de leite dificultando a recupera??o dos n?veis de produ??o total das propriedades leiteiras, levando a perdas econ?micas consider?veis. Esta redu??o no percentual da produ??o de leite pode estar associada ao agente patog?nico espec?fico que causou a infec??o, sendo as enterobact?rias frequentemente respons?veis pela mastite ambiental. Estes microrganismos s?o preferencialmente encontrados no habitat normal dos animais como locais que apresentam esterco, urina, barro e camas org?nicas. Os testes fenot?picos est?o entre os m?todos dispon?veis atualmente utilizados para identificar as enterobact?rias; no entanto, eles podem ocasionalmente identitificar erroneamente algumas esp?cies apesar dos m?ltiplos ensaios realizados. Al?m disso, a demora na sua execu??o pode tardar a antibioticoterapia realizada em campo. Por outro lado, a t?cnica de MALDI-TOF MS tem atra?do a aten??o pela sua identifica??o precisa dos v?rios microorganismos em n?vel de esp?cie. No presente estudo, um total de 183 enterobact?rias foram isoladas a partir de amostras de leite (n=47) e fezes colhidas de vacas em lacta??o (n=94); amostras de ?gua (n=23) e na linha de ordenha (n=19) em uma propriedade situada no Rio de Janeiro. A proposta foi utilizar a t?cnica de MALDI-TOF MS como um m?todo eficaz de identifica??o bacteriana de enterobact?rias e descrever a permanencia destes microrganismos no ambiente de produ??o leiteira. A t?cnica prote?mica confirmou 92,9% (170/183) das esp?cies de enterobact?rias identificadas pelos testes bioqu?micos convencionais. O sequenciamento do gene gyrB, realizado em oito das 13 enterobact?rias que apresentaram identifica??o discordante, confirmou em 100% o resultado da t?cnica prote?mica, que foi utilizada como metodologia de refer?ncia no presente estudo. O g?nero Enterobacter foi o mais discordante pelo m?todo bioqu?mico (76,9%, 9/13). A E.coli foi a esp?cie predominante (83%, 152/183) em todas as amostras avaliadas, sendo que o leite bovino apresentou maior diversidade de enterobact?rias. N?o foi detectada a presen?a de Salmonella spp. nas amostras de fezes bovinas e todas as amostras de ?gua dos diferentes pontos de coleta da propriedade apresentaram padr?es microbiol?gicos inaceit?veis. Foram isoladas enterobact?rias das m?os e cavidades nasal dos ordenhadores, bem como nas ordenhadeiras mec?nicas utilizadas na propriedade. Estes dados visam contribuir de forma significativa para a caracteriza??o das enterobacterias bem como para a compreens?o e sua descri??o no ambiente de produ??o leiteira, auxiliando no diagn?stico preciso dos poss?veis agentes envolvidos na mastite bovina bem como na implementa??o de medidas profil?ticas devidamente direcionadas.

O leite é considerado um bom substrato para o desenvolvimento de diversos microrganismos, dentre os quais, uma variada gama de leveduras com distintas características biológicas. Em geral, as leveduras são consideradas saprotróficas, fazendo parte da microbiota residente, entretanto, em alguns casos, elas podem provocar infecções na glândula mamária. A contaminação do leite por microrganismos patogênicos, pode representar um risco para o consumidor, quando o produto é ingerido na forma in natura ou até mesmo beneficiada. Deve-se considerar, também, os reflexos negativos na produção de subprodutos, pois alterações nas características físicas e organolépticas podem afetar a qualidade e a vida-de-prateleira dos derivados lácteos. O objetivo desse estudo foi avaliar a ocorrência de fungos e bactérias presentes no leite de ovelhas normais e daquelas com mastite clínica. Foram obtidas 588 amostras de leite de ovelha sendo 106 oriundas de animais com mastite clínica e 482 de animais normais. Alíquotas de 0,1 mL de leite foram semeadas pela técnica de espelhamento em superfície em ágar acidificado Yeast Medium. A identificação das leveduras foi realizada através de testes rotineiramente utilizados na metodologia padrão, além da utilização do meio Hicrome Candida Differential Agar Base (HIMEDIA®) e do sistema API 20 C (Biomérieux®). Foram realizados exames bacteriológicos, a fim de obter uma correta avaliação do possível agente etiológico envolvido. Do total das amostras analisadas, 53 (27,04%) foram positivas no exame micológico, 134 (68,36%) positivas no exame bacteriológico e 9 (4,59%) apresentaram crescimento de Candida spp. e Staphylococcus coagulase-negativa. No cultivo micológico foram obtidos 60 isolados pertencentes aos seguintes gêneros: Candida spp. (70,00%), Rhodotorula spp (11,70%), Trichosporon spp. (6,70%), Geotrichum spp. (5,00%), Pichia spp. (5,00%) e Cryptococcus sp. (1,70%). Dentre o total de bactérias, foram isoladas: 110 (82,00%) Staphylococci coagulase-negativa, 14 (10,44%) bactérias Gram-negativas, 6 (4,48%) Staphylococcus aureus e 4 (3,00%) Streptococcus spp. Algumas bactérias Gram-negativas foram identificadas como Pasteurella spp., Rhodococcus spp. e Acinetobacter spp. O resultado microbiológico ressalta a importância da realização concomitante de exames micológicos e bacteriológicos para o correto diagnóstico e monitoramento dos casos de mastite em ovinos. Em relação à saúde pública, o consumo de leite de ovelhas e derivados lácteos contaminados com microrganismos potencialmente patogênicos, constitui um risco para indivíduos imunossuprimidos. No que concerne à produção de derivados lácteos feitos com leite de ovelha, principalmente queijos, a contaminação microbiológica pode afetar a qualidade e a vida-de-prateleira do produto final, causando considerável prejuízo econômico. / The milk is considered a good substrate for the development of various microorganisms, among them, a wide range of yeast strains with different biological characteristics. In general, yeasts are considered to be saprotrophic, part of the normal microflora, however, in some cases, they can cause infections in the mammary gland. Milk contamination by yeasts and yeast-like fungi may represent a risk to the consumer when the product is either consumed in natura or its derivatives. The negative impact on the production of milk derivatives should also be considered as the changes in physical and organoleptic characteristics can affect the quality and shelf-life of dairy products. The aim of this study was to evaluate the diversity of yeasts and bacteria in milk from healthy sheep and those with clinical mastitis. A total of 588 samples were obtained: 106 from animals with clinical mastitis and 482 from healthy animals. Aliquots of 0,1 mL from milk samples were spread in triplicate on acidified Yeast Medium agar. The identification of yeasts was carried out through tests routinely used in the standard methodology along with means Hicrome Candida Differential Agar Base (HIMEDIA®) and API 20 system (Biomerieux ®). Bacteriological studies were performed in order to obtain a correct evaluation of the possible etiological agent. Out of the samples analyzed, 53 (27,04%) showed a positive result in the mycological examination, 134 (68,36%) were positive in the bacteriological examination and 9 (4,59%) presented Candida spp. and coagulase-negative Staphylococcus growing. The mycological analysis showed the presence of 60 isolates belonging to the following genera were cultivated: Candida spp. (70%), Rhodotorula spp. (11.7%), Trichosporon spp. (6.7%), Geotrichum spp. (5%), Pichia spp. (5%) and Cryptococcus spp. (1.7%). The bacteriological analysis showed the presence of 110 (82.00%) coagulase-negative Staphylococci, 14 (10.44%) Gram-negative bacteria, 6 (4.48%) Staphylococcus aureus and 4 (3.00%) Streptococcus spp. Some Gram-negative bacteria were identified as Pasteurella spp., Rhodococcus spp. and Acinetobacter spp. The microbiological results emphasize the importance of the concomitant use of bacteriological and mycological examination for the diagnosis and monitoring of cases of mastitis in sheep. In relation to public health, the consumption of sheep milk and dairy products contaminated with potentially pathogenic microorganisms, constitutes a risk to immunosuppressed individuals. Regarding the production of dairy products made from ewe’s milk, especially cheese, microbiological contamination can affect the life quality and shelf-life of product, causing considerable economic loss.

No início da lactação as vacas podem apresentar várias doenças metabólicas e infecciosas, como a mastite, devido às abruptas mudanças fisiológicas, entre elas a supressão da reposta imune, concomitante com a queda da ingestão de matéria seca e da concentração sérica de vitamina E. Com o objetivo de estudar a influência da suplementação de vitamina E nas atividades funcionais dos neutrófilos do leite de bovinos, catorze novilhas da raça holandesa foram divididas aletoriamente em dois grupos, sendo um com sete animais não suplementados (controle) e outro com sete animais suplementados com 1000 UI/dia de vitamina E durante 30 dias antes do parto previsto e 10 dias após o mesmo. Na primeira semana após o parto foi colhido o leite dos quartos mamários CMT negativo, após estimulação da leucocitose com a infusão intramamária de solução de glicogênio de ostra a 0,1% e 0,5%, 36 e 12 horas respectivamente, antes da colheita do leite. As células foram isoladas, contadas e estimou-se a viabilidade das mesmas. Em seguida foram realizados os testes de fagocitose incubando-se zimosan opsonizado (2x108/ml) com neutrófilos (2x107/ml), contados no microscópio óptico. Suspensões na concentração de 2x108/ml de cepas de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium bovis, Escherichia coli e Prototheca zopfii procedendes de casos de mastite clínica bovina foram incubados com neutrófilos (2x107/ml). A solução foi plaqueada antes da incubação para fagocitose, após a fagocitose, após o tratamento com antibióticos e após a lise dos neutrófilos para a determinação dos patógenos destruídos. As análises estatíscas foram feitas através da ANOVA. A porcentagem de células que englobaram três ou mais partículas de zimosan opsonizado foi de 52% no grupo não suplementado e 66% no grupo suplementado (P<0,05). Não foram detectadas diferenças estatísticas para a porcentagem de fagocitose de microrganismos opsonizados, sendo 30,2% e 28,8% para o grupo controle e suplementado, respectivamente. A destruição intracelular de patógenos foi de 99%, não diferindo entre os grupos. Em seguida, determinou-se a produção de O2- e H2O2, sendo 1,6 e 3,0 nmol de O2- e 0,83 e 0,67 &micro;M de H2O2 para o grupo controle e suplementado, respectivamente. A atividade enzimática no grupo controle e suplementado foi de 4,3 e 3,6 &micro;mol/min/mg proteína para a catalase, 43 e 49 nmol/min/mg de proteína para a glutationa redutase, 16,2 e 30 nmol/min/mg proteína para a glutaiona peroxidase, 3,85 e 6,32 U/mg proteína para a superóxido dismutase e 0,67 e 0,29 U/mg proteína para a mieloperoxidase, sendo que não foram encontradas diferenças estatísticas entre os grupos. A suplementação com vitamina E aumentou a habilidade fagocitária dos neutrófilos somente no ensaio com zimosan e não alterou a atividade enzimática assim como a produção de espécies reativas de oxigênio. O equilíbrio entre as espécies reativas de oxigênio, importante para a destruição intracelular de patógenos, e os antioxidantes é extremamente complexo, não sendo afetado pela suplementação de um único agente antioxidante / At the early lactation, lactating cows are more exposed to metabolic and infectious diseases as mastitis, due to the physiological modifications accomplished with diminishing of dry matter ingestion, immune response depressed and the vitamin E plasmatic concentration level reduction. Therefore, to study the influence of vitamin E supplementation on the function of milk neutrophils, fourteen primigravid holstein heifers were casually allocated in two groups: one was oral supplemented with vitamin E (1000UI/day) 30 days pre parturition and 10 days post parturition, the other group did not receive vitamin E supplementation (control group). During the first week post-parturition, milk was collected from negative CMT quarter after induction of leucocytosis with a intramammary infusion of oyster glycogen infusion (0,1% e 0,5%, 36 e 12 hours respectively). The cells were isolated from milk, counted and the viability was estimated. After these trials the assays: phagocytosis with opsonized zymosan and phagocytosis with microorganisms that cause mastitis were performed. zymosan opzonized particles (2x108/mL) were incubated with neutrophils (2x107/mL) and counted on the optic microscope. The microorganisms (2x108/mL) Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium bovis, Escherichia coli and Prototheca zopfii were incubated with neutrophils (2.107/mL) from milk. Solution were spread plated pre phagocytosis assay, after phagocytosis, post treatment with antibiotics and after break of neutrophils. The results were analysed from the statistical ANOVA. For the phagocytosis assays, 52% of neutrophils from control group phagocyted three or more zymosan particles, and in the supplemented group, 66% of the cells (P< 0,05). For the microorganisms, did not have statistical difference and the results were 30.7% and 28.2% for the control and supplemented groups. The average of the pathogens intracellular kill was 99% in the both groups. In sequence the tests for production O2- and H2O2, enzimatic activity of catalase, superoxide dismutase, glutathione redutase, glutathione peroxidase and myeloperoxidase were made. It were no detected any statiscal differences in respect to the production of O2- and H2O2. The production of O2- was 1,6 nmol and 3,0 nmol and the H2O2 production was 0,83 &micro;M and 0,67 &micro;M for the groups control and supplemented. The control and supplemented group enzymatic activity results obtained were: catalase 4.3 and 3.6 &micro;mol/min/mg protein, glutathione redutase 43 and 49 nmol/min/mg protein, glutathione peroxidase 16.2 and 30 nmol/min/mg protein, superoxide dismuthase 3.85 and 6.32 U/mg protein and myeloperoxidase 0,67 and 0,29 U/mg protein. In relation to these results it was not detected any statistical difference. Vitamin E supplementation increased zymosan phagocytosis and did not affect enzyme activities involved in the mechanisms of protection against oxigen reactive species and microorganism phagocytosis in the neutrophils. The vitamin E supplementation didn´t change the complex balance among the reactions of antioxidants and oxigen reactive species. It can be concluded that due to the complexity of the mechanisms involved the supplementation with just one isolate antioxidant did not interfered with the defence neutrophil activities

A mastite bovina ocasiona grave impacto no setor leiteiro, causando sérios prejuízos, tanto pelo comprometimento funcional da glândula mamária, como na redução da produção de leite. Além disso, causa sérios riscos à saúde pública, uma vez que as principais espécies de patógenos bacterianos causadores de mastite são produtoras de toxinas. Neste contexto, a nanotecnologia é uma alternativa bastante interessante para contornar as limitações dos tratamentos convencionais de mastite, através da criação de dispositivos nanoestruturados que sejam capazes de direcionar o antimicrobiano para a superfície do epitélio glandular e para o interior do tecido afetado, de forma a potencializar o efeito do antibiótico sob as bactérias. O uso da quitosana e do Ácido Polilático (PLA) para este tipo de aplicação se deve às suas inúmeras propriedades, em especial a biocompatibilidade e a biodegradabilidade. Desta forma, este trabalho teve como objetivo a obtenção e caracterização de diferentes formulações de nanopartículas de quitosana/PLA para liberação controlada de gentamicina (GEN), através da metodologia de emulsificação - evaporação de solvente. As nanopartículas foram caracterizadas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) acoplada a um Detector de Energia Dispersiva (EDS), Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), Distribuição do Tamanho de Partículas (DLS) e Carga Superficial (Potencial Zeta). Ainda, foram avaliadas a eficiência de encapsulamento da gentamicina, a liberação de gentamicina in vitro pelo método de diálise e a atividade antimicrobiana através do teste de Difusão em Disco e da determinação da Concentração Mínima de Inibição (CMI) pelo método de microdiluição sucessiva, utilizando Staphylococcus aureus. As análises de DLS mostraram um tamanho médio de nanopartículas entre 150 e 400 nm, variando com a composição da formulação. As análises de MEV mostraram partículas esféricas de tamanho correspondente às medidas de DLS, por essa análise também foi possível observar a formação de aglomerados em determinadas condições de síntese. Pelas análises de FTIR, através das bandas características e do alargamento e/ou aumento da intensificação das bandas, foi possível confirmar a interação entre os componentes da formulação, sugerindo a formação de uma nanopartícula do tipo “core-shell”, onde o PLA estaria no núcleo e a quitosana na casca. Ainda, o estudo do potencial zeta em função do pH mostrou que as partículas possuem cargas de superfície positivas, provavelmente devido à presença de quitosana na casca, o que é atrativo para adesão celular. A eficiência de encapsulamento variou de 66 a 75%. A formulação 1:0,25 (w/w, PLA/quitosana) foi a que apresentou maior eficiência de encapsulamento, sugerindo que o PLA, apesar de hidrofóbico, influenciou na retenção da gentamicina (hidrofílica) na nanopartícula. A análise por EDS confirmou a presença de enxofre em todas as formulações contendo sulfato de gentamicina, o que também comprovou o encapsulamento do antibiótico. Os ensaios de liberação mostraram que a maior concentração de gentamicina foi liberada nas 6 primeiras horas de ensaio. Além disso, após 96 horas de ensaio, cerca de 90% da concentração inicial da gentamicina foi liberada. Por fim, o ensaio antimicrobiano realizado com as suspensões utilizadas o ensaio de liberação in vitro indicou a inibição do crescimento da Staphylococcus aureus, principal causadora da mastite bovina, bem como a CMI obtida para todas as amostras foi condizente com a literatura. / Bovine mastitis causes a serious impact on the dairy sector, causing serious damage, both due to the functional impairment of the mammary gland, with reduced milk production. In addition, it causes serious risks to public health, as the major species of bacterial pathogens that cause mastitis are produce toxin. In this context, nanotechnology is a very interesting alternative to overcome the limitations of conventional mastitis treatments, through the creation of nanostructured devices that are able to direct the antimicrobial to the surface of the glandular epithelium and into the affected tissue in order to potentiate the effect of the antibiotic under bacteria. The use of chitosan and Polylactic Acid (PLA) for this type of application is due to its numerous properties, especially biocompatibility and biodegradability. Thus this work was aimed at obtaining and characterization of nanoparticles for controlled release of gentamicin (GEN) through the emulsification - solvent evaporation. The nanoparticles were characterized by Scanning Electron Microscopy (SEM) coupled to a Dispersive Energy Detector (EDS), Infrared Spectroscopy with Fourier Transform (FTIR), Dynamic Light Scattering (DLS) and Zeta Potential measurements. In addition, the efficiency of encapsulation of gentamicin, the in vitro release of gentamicin using the dialysis method and the antimicrobial activity through the disc diffusion test and the determination of the Minimum Inhibition Concentration (MIC) by the successive microdilution method, using Staphylococcus aureus, were evaluated. DLS analyses showed an average nanoparticle size between 150 and 400 nm, varying with the composition of the formulation. The SEM analyzes correlated well with the DLS measurements, by this analysis it was also possible to observe the formation of agglomerates under certain conditions of synthesis. By FTIR analysis through the characteristic bands and the enlargement and/or increase of the bands intensification, confirmed the interaction between the components of the formulation, suggesting the formation of a core-shell nanoparticle, where the PLA would be in the nucleus and the chitosan in the shell. The study of zeta potential as a function of pH showed that the particles have positive surface charges, which is attractive for cell adhesion. The encapsulation efficiency varied from 66 to 75%, the 1:0.25 sample was the most successful in the encapsulation, suggesting that gentamicin, although hydrophilic, was also bound to PLA (hydrophobic). ESD analysis confirmed the presence of sulfur in all formulations containing gentamicin sulfate, which also confirmed the encapsulation of the antibiotic. The release assays showed that the highest concentration of gentamicin was released in the first 6 hours and that in the period from 24 to 96 hours that concentration remained in equilibrium. Finally, the antimicrobial assay is performed with the suspensions used in vitro release test showed the growth inhibition of Staphylococcus aureus main cause of bovine mastitis, and the MIC obtained for all samples was consistent with the literature. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2018-05-18T18:09:32Z No. of bitstreams: 1 2015 - Bruno Oliveira de Carvalho.pdf: 1725115 bytes, checksum: 78e6b6f127705b066a8a0f75bbb08e88 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-18T18:09:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015 - Bruno Oliveira de Carvalho.pdf: 1725115 bytes, checksum: 78e6b6f127705b066a8a0f75bbb08e88 (MD5) Previous issue date: 2015-03-17 / CAPES / The knowledge of bacterial genetic information has enable advances in many areas allowing detecting microorganisms and evaluating the production of virulence factors and resistance in certain populations. This knowledge allows the detection of microorganisms, as well as the evaluation of virulence and resistance factors production in certain populations. More recently, molecular diagnosis based on the detection of specific fragments from these agents has been implemented in no viable bacterial cultivation environments or hampered by biotic or abiotic conditions. Besides specific agent detection, bacterial diversity analysis might be an important criterion, such as assessing soil quality. Cultivation has been the most common way for evaluating bacterial diversity. However, most of soil bacteria are not cultivable; therefore, the employment of molecular tools has been increasingly used on this sort of analysis. This survey aimed standardizing the use of cultivation independent techniques for granting three agriculture sectors demands. The first chapter standardized the employment of DGGE technique for analyzing milk bacterial diversity from mastitis and healthy teats belonging to the same animal. Results pointed to differences on bacterial profile from both groups. The second chapter evaluated the impact of the employment of drill cuttings with castor beans and cramble pies association as agricultural fertilizers by DGGE analysis. The application of this technique was efficient for evaluating treatments, as well as, confirming the treatments contribution for increasing bacterial diversity in soil samples. The third chapter compared the cultivation technique sensitivity for American Foul Brood (AFB) diagnosis, a bee disease caused by Paenibacillus larvae, to cultivation independent technique by PCR. This survey demonstrated that sensitivity of the technique was greater than that one by P. larvae cultivation technique. Thus, the present survey concluded that cultivation independent techniques were useful for granting agriculture sectors demands. / O conhecimento das informa??es gen?ticas bacterianas tem permitido avan?os em diversas ?reas do conhecimento. Esse conhecimento permite detectar microrganismos, bem como avaliar a produ??o de fatores de virul?ncia e resist?ncia em determinadas popula??es. Mais recentemente, o diagn?stico molecular pela detec??o de fragmentos de DNA espec?ficos desses agentes vem sendo implementado em situa??es onde o cultivo bacteriano n?o ? vi?vel ou ? dificultado por condi??es bi?ticas ou abi?ticas. Al?m da detec??o de agentes espec?ficos, o conhecimento da diversidade bacteriana presente em alguns ambientes pode ser um importante crit?rio, como, por exemplo, para avaliar a qualidade do solo. A forma mais comum de avaliar a diversidade bacteriana se d? atrav?s do cultivo. Por?m, a maior parte das popula??es bacterianas presentes no solo n?o s?o cultiv?veis, com isso, a utiliza??o de ferramentas moleculares s?o cada vez mais utilizadas nesse tipo de an?lise. O presente estudo teve como objetivo padronizar a utiliza??o de t?cnicas independentes de cultivo para atender demandas de tr?s setores da agricultura. O primeiro cap?tulo padronizou a utiliza??o da t?cnica de DGGE (Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante) para an?lise da diversidade bacteriana do leite de tetos mast?ticos e sadios de um mesmo animal. Os resultados apontaram para diferen?as no perfil bacteriano dos dois grupos analisados. O segundo cap?tulo avaliou o impacto sobre a microbiota bacteriana em solos tratados com associa??es de cascalho de perfura??o e tortas de mamona e crambe como adubos agr?colas atrav?s da an?lise de DGGE. A aplica??o da t?cnica de DGGE foi eficiente na avalia??o e confirmou que os tratamentos contribu?ram para o aumento da diversidade bacteriana nas amostras de solos estudadas. O terceiro experimento comparou a sensibilidade da t?cnica de cultivo, oficial para diagn?stico da Cria P?trida Americana (CPA), uma doen?a ap?cola causada por Paenibacillus larvae, com t?cnica de independente de cultivo por PCR do material extra?do direto do mel. Este estudo constatou que a sensibilidade da t?cnica proposta foi superior ? obtida pela t?cnica de cultivo de P. larvae. Com isso, conclui-se que as t?cnicas independentes de cultivo foram ?teis no atendimento das demandas das quest?es dos setores agr?colas contemplados no estudo.