Reproduction de : Thèse de doctorat : Biomolécules et dynamique cellulaire : Reims : 2005. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. f. 225-239.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les carcinomes évoluent dans un microenvironnement inflammatoire composé de cellules stromales (fibroblastes, cellules endothéliales et immunitaires) immergées dans une matrice extracellulaire (MEC). Les fibroblastes associés aux carcinomes (FACs) déposent et remodèlent la MEC dans le but de la rendre permissive à la croissance et l’invasion tumorale. Parmi les facteurs pro-inflammatoires responsables de l’activation des fibroblastes résidents, la cytokine Leukemia Inhibitory Factor (LIF) détient un rôle capital. En régulant l’activité de la chaîne légère de la myosine II (MLC-II), LIF induit la contractilité du cytosquelette d’actomyosine, générant des forces de tension et le remodelage de la MEC par les FACs. En revanche, les gènes régulés par LIF impliqués dans le phénotype pro-invasif des FACs ne sont pas connus. A l’aide d’un criblage phénotypique en trois dimensions, nous avons identifiés ICAM-1 comme régulateur majeur du remodelage de la MEC par les FACs. Nous démontrons qu’ICAM-1 est nécessaire et suffisant pour induire la réorganisation de la MEC indispensable à l’invasion collective des cellules de carcinome squameux. En effet, ICAM-1 est un régulateur de la contractilité cellulaire dépendante de la voie de signalisation RhoA-ROCK et de la kinase Src. De plus, la contractilité cellulaire régule l’expression d’ICAM-1, menant ainsi à une boucle de régulation positive. Nous proposons alors qu’ICAM-1 représente une cible thérapeutique afin de lutter contre l’invasion tumorale et la dissémination métastatique. / Acto-myosin contractility in carcinoma-associated fibroblasts leads to the assembly of the tumor extracellular matrix. The pro-inflammatory cytokine LIF governs fibroblast activation in cancer by regulating the myosin light chain 2 activity. So far, however, how LIF mediates cytoskeleton contractility remains unknown. Using phenotypic screening assays based on knock down of LIF-dependent genes in fibroblasts, we identified ICAM1 as a crucial regulator of stroma fibroblast proinvasive matrix remodeling. We demonstrate that ICAM1 is necessary and sufficient to promote inflammation-dependent extracellular matrix organization, which leads to cancer cell invasion. Indeed, ICAM1 mediates generation of acto-myosin contractility downstream of the Src kinases in stromal fibroblasts. Moreover, acto-myosin contractility regulates ICAM1 expression, establishing a positive feedback signaling. Thus, targeting stromal ICAM1 might constitute a possible therapeutic mean to counteract tumor cell invasion and dissemination.

Les héparane sulfate protéoglycanes (HSPG) sont, comme l’ensemble des protéoglycanes (PG), constitués d’une partie protéique et d’un glycosaminoglycane (GAG), en l’occurrence l’héparane sulfate (HS) pour les HSPG. Ils font partie intégrante de la matrice extracellulaire (MEC). Les PG sont capables, par leurs GAG, de lier un certain nombre de partenaires tels que les facteurs de croissance, chemokines, cytokines ou enzymes. Ils régissent donc la biodisponibilité de nombreux médiateurs solubles et par conséquent leur activité biologique. Ils sont ainsi impliqués dans la régulation de nombreux processus tels que la prolifération, la différenciation, le remodelage tissulaire, l’angiogenèse... De plus, il a été démontré que la liaison de protéines possédant un site heparan binding (HB) avec l’HS des HSPG les protégent de la dégradation enzymatique. Cependant, les HSPG sont parmi les premiers composants de la MEC à être digérés par les héparanases cellulaires lors d’agressions tissulaires. Cette digestion rend les sites HB disponibles et les protéines sensibles à la dégradation protéolytique. C’est donc dans le but de protéger les HSBP (heparan sulfate binding protein) qu’a été développée la technologie des héparanes mimétiques (HM) qui vont se substituer aux HS dégradés sur les sites HB disponibles et protéger les protéines du milieu lésé. Ces HM, déjà utilisés comme agent thérapeutique de la MEC, sont désignés, dans cette utilisation, sous le sigle RGTA pour regenerating agent puisqu’ils augmentent la vitesse et la qualité de la réparation tissulaire, pouvant conduire à une véritable régénération des tissus. Lors du développement tumoral et métastatique, il a été démontré que l’activité enzymatique des héparanases est démultipliée, responsable d’une dégradation accrue des HS. Dans ce contexte, les HM vont pouvoir se fixer sur cette matrice lésée d’où l’idée de leur utilisation diagnostique en cancérologie. L’utilisation d’HM marqué (HM*) par un radioisotope tel que le fluor 18 (18F) et suivi par imagerie moléculaire TEP-Scan (tomographie par émission de positons associée au scanner) devrait permettre un marquage particulièrement efficace des matrices environnant les cellules tumorales et métastasées. Les HM* pourraient, en effet, cibler la MEC impliquée, par sa dégradation précoce, dans les processus de croissance et de dissémination tumorale et devenir un nouveau marqueur oncologique en imagerie moléculaire. A ce jour, parmi les différents marqueurs oncologiques étudiés, aucun ne s’adresse au compartiment matriciel. L’usage des HM* devrait ainsi permettre la détection des zones péri-tumorales et trouver une place dans le diagnostic précoce du cancer et son suivi thérapeutique. / Heparan sulfate proteoglycans (HSPG), like all proteoglycans (PG), consisting of a protein portion and a glycosaminoglycan (GAG), heparan sulphate (HS) for HSPG. They are part of the extracellular matrix (ECM). PG are able, through their GAG, to bind a number of partners such as growth factors, chemokines, cytokines or enzymes. They regulate the bioavailability of many soluble mediators and thus their biological activity. They are thus involved in the regulation of many processes such as proliferation, differentiation, tissue remodeling, angiogenesis... In addition, it was shown that the binding of proteins having a heparan binding site (HB) with HS of HSPG protect them from enzymatic degradation. However, HSPG are among the first components of the ECM to be digested by heparanase during cellular tissue damage. This digestion makes HB sites available and proteins are sensitive to proteolytic degradation. It is in order to protect the HSBP (heparan sulfate binding protein) that was developed technology heparan mimetics (HM) that will replace the degraded HS on available HB sites and protect proteins of middle injured. These HM, already used as a therapeutic agent of the ECM, are identified in this use under the symbol RGTA for regenerating agent because they increase the speed and quality of the tissue repair, potentially leading to a true tissue regeneration. During tumor development and metastasis, it has been shown that the enzymatic activity of heparanase is multiplied, leading to an increased degradation of HS. In this context, the HM will be able to fix this matrix injured hence the idea of their diagnostic use in oncology. Using labeled HM (HM*) with a radioisotope such as fluorine-18 (18F) and followed by molecular imaging PETScan (positon emission tomography with scanner associated) should allow a particularly efficient marking of the matrix surrounding metastatic and tumor cells. HM* could indeed target ECM involved, through its early degradation in the processes of tumor growth and tumor spread and become a new marker oncology in molecular imaging. To date, among the various studied cancer markers, none address the matrix compartment. The use of HM* should allow the detection of peri-tumor and find a place in the early diagnosis of cancer and the therapeutic monitoring.

In vivo, les cellules osseuses évoluent dans un microenvironnement complexe, tridimensionnel et interagissent avec celui-ci à de nombreuses échelles, depuis le nanomètre (tropocollagène) jusqu’à des structures de plusieurs centaines de micromètres (trabécules). Paradoxalement, la majeure partie de nos connaissances sur la physiologie cellulaire est issue d’expériences réalisées sur des cellules cultivées sur du plastique et en deux dimensions. Ces différences ne peuvent qu’avoir une influence sur le comportement des cellules, qui n’entretiennent plus les mêmes relations spatiales entre elles, ainsi qu’avec leur environnement. De plus, si ces dernières années, nombre d’études ont été réalisées sur l’influence de la topographie à des échelles nano et micrométriques, peu d’études ont montré le rôle de la géométrie du substrat à une échelle tissulaire, soit au sein de structures supérieures à 100 µm. Afin d’étudier l’influence de la macroarchitecture du substrat sur le comportement cellulaire, des céramiques en hydroxyapatite à architecture contrôlée ont été ensemencées avec des cellules primaires de calvaria de souris. Une première étude a été entreprise sur des substrats macroarchitecturés, présentant des sillons de différentes géométries : sillons semi-circulaires (Wave), sillons triangulaires à angle de 90° ou à angle de 45°. Plus la géométrie du substrat était refermée (45°>90°>Wave), plus la différenciation ostéoblastique était rapide. Cela s’est traduit par une augmentation des niveaux d’expression génique et protéique d’ostéocalcine et de sclérostine, indiquant la présence d’ostéocytes au sein de l’important tissu déposé par les cellules. De plus, au sein de la géométrie à l’angle le plus fermé (i.e. « 45° »), des structures fibreuses minéralisées, orientées parallèlement au fond du substrat ont été observées. Cette orientation s’est confirmée au niveau cellulaire, avec une orientation similaire des fibres de stress et un étirement des noyaux cellulaires. La géométrie du substrat influence donc le comportement des cellules en modifiant très probablement leur signalisation intracellulaire. Ces investigations ont été poursuivi par le développement d’un modèle d’ostéogénèse 3D sous perfusion au sein du bioréacteur BOSE ElectroForce® 5270 BioDynamic®de la plateforme Equipex IVTV, afin d’explorer les interactions cellulaires-substrat en réponse à des contraintes mécaniques (forces de cisaillement). Le dépôt tissulaire était particulièrement abondant au sein des pores triangulaires à angle de 45°, confirmant les données obtenues sur les substrats macroarchitecturés et laissant penser que ce type de pores est le plus à même de permettre une différenciation ostéoblastique optimale. Les résultats de ces travaux pourront permettre des avancées dans la compréhension de la biologie de l’os, mais également dans la conception d’implants innovants destinés à la réparation de défaux osseux, avec une ostéointégration stimulée via la présence de structures à géométrie fermée, tel que des sillons triangulaires à angles de 45°. / In vivo, cells reside in a complex and three-dimensional microenvironment, with which they interact at multiple scales, from the nanometer (tropocollagen) to structures of several hundred of micrometers (trabeculae). However, most of our knowledge on cell physiology has been obtained from cells grown in Petri dishes, on plastic and in two dimensions. In those conditions, the spatial relationships between cells and their environment can only be deeply modified. Moreover, if the impact of substrate closure at a cellular level is particularly well documented, very few studies have shown its role at a tissue level (i.e. greater than 100 µm), and thus focused mostly on the matrix deposition rather than on the osteoblastic differentiation. In order to study the effects of substrate macroarchitecture on cells, primary mouse calvarial cells were seeded on hydroxyapatite-based bioceramics, made from wax molds by 3D printing. A first study was conducted on macroarchitectured substrates. These bioceramics have three patterns of different degrees of closure: semi-circular grooves (Wave), triangular grooves with 90° angle and triangular grooves with 45° angle. The tighter was the substrate geometry (45°> 90°> Wave), the faster was osteoblastic differentiation. This resulted in increased levels of gene and protein expression of osteocalcin and sclerostin, indicating the presence of osteocytes inside the tissue layed by cells. Moreover, in the tightest geometry (i.e. 45°), mineralized fibrous structures, oriented parallel to the bottom substrate were observed. This orientation was confirmed at the cellular level, with a similar orientation of stress fibers and a stretch of cell nuclei. Thus, the substrate macroarchitecture influences the cellular behavior by, most likely, modifying the intracellular signaling. These investigations were pursued with the development of a 3D model of osteogenesis under perfusion, in the BOSE 5270 ElectroForce® BioDynamic® bioreactor of the IVTV Equipex platform, to explore cell-substrate interactions in response to mechanical stress (shear forces). Tissue deposition was particularly abundant in the triangular pores with 45° angles, confirming our previous observations and suggesting that this geometry was able to promote osteoblast differentiation.Our results could lead to breakthroughs in the understanding of the bone biology but also in the design of innovative implants for the repair of bone defects, with a stimulated osseointegration throught the presence of structures with closed geometries, such as triangular grooves with 45° angles.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

A côté de leur rôle structural au sein des tissus, les protéines de la matrice extracellulaire sont impliquées dans un grand nombre de processus cellulaires au cours de divers évènements biologiques. En revanche, leur rôle au cours de la régénération reste étonnamment peu étudié à ce jour. Pourtant, mieux comprendre le rôle de la MEC dans la régénération a de nombreuses applications en médecine régénérative et reconstructrice. Mon projet de thèse vise précisément à répondre à cette question. Pour cela, nous avons utilisé le modèle bien établi de la régénération de la nageoire caudale du poisson zèbre qui présente de nombreux avantages tels qu’une structure simple, facile d’accès et un régénération rapide, en seulement quelques jours. Une approche globale de transcriptomique sans a priori a permis d’établir l’importance de la matrice extracellulaire au cours de la régénération. Une première étape a consisté à établir la liste des gènes de la matrice extracellulaire du poisson zèbre par orthologie, appelé matrisome. Notre étude a fait émerger le rôle inattendu d’un collagène dans la reconstruction de la membrane basale de l’épiderme, une structure importante pour l’attachement de l’épiderme au derme dans la peau. Cette protéine, exprimée uniquement chez l’embryon, est ré-exprimée dans l’épiderme en régénération et déposée au niveau de la membrane basale. Par stratégie anti-sens in vivo, j’ai montré par microscopie à force atomique et microscopie électronique que l’absence de ce collagène impacte la structure et les propriétés biomécaniques de cette membrane basale en reconstruction. Ces résultats ont été confirmés sur une lignée de poisson, invalidée pour ce gène que nous avons créée par la technologie CRISPR/Cas9. Cette lignée a permis d’établir que ce collagène agit transitoirement comme un « spacer » moléculaire nécessaire à l’organisation tridimensionnelle des autres composants de la membrane basale pendant la régénération. / In addition to their role within tissues, extracellular matrix proteins are implicated in a large number of cellular processes. However, their role in regeneration is not well studied at the moment. A better understanding of the extracellular matrix proteins involvement in regeneration can have several future applications for regenerative and reconstructive medicine. The aim of my PhD project is to answer this question.To do this, we used the well-established zebrafish caudal fin model which have many advantages such as a simple structure, easily accessible and a quick regeneration in only few days. A global transcriptomic approach without a priori showed us that extracellular matrix proteins are playing a key role in regeneration. A first step of my work was to use an orthology-based approach to create the first list of extracellular matrix genes in zebrafish, called the matrisome. Our study revealed the unexpected role of a collagen during epidermal basement membrane reconstruction, an importance structure for the dermo-epidermal cohesion in skin. This protein which is expressed only during embryogenesis, is re-expressed in the regenerating epidermis and deposited in the basement membrane. Using an anti-sense strategy in vivo, I have demonstrated by atomic force microscopy and electron microscopy that the absence of this collagen impacts the biomechanics of this reconstructing basement membrane. These results were confirmed on a zebrafish line invalidated for this collagen that I have generated using the genome editing CRISPR/Cas9 technic. We showed that this collagen acts as a molecular spacer needed for the correct tridimensional organization of the other basement membrane components during regeneration.

L’angiogenèse est un processus majeur intervenant au cours du remodelage du microenvironnement tumoral, induit par l’hypoxie et le VEGF. La lysyl oxydase like-2 (LOXL2) appartient à la famille des lysyl oxydases, impliquée dans le pontage de constituants matriciels. Notre équipe a montré que l’induction de LOXL2 par l’hypoxie conduit à sa sécrétion par les cellules endothéliales et son accumulation dans la matrice extracellulaire endothéliale. Nous avons montré que LOXL2 joue un rôle dans l’angiogenèse au cours du développement. Des études ont montré que LOXL2 est surexprimée dans de nombreux cancers et que l’inhibition de LOXL2 extracellulaire empêche la formation d’un microenvironnement tumoral. Mon travail de thèse a porté sur l’étude du rôle de LOXL2, exprimée par les cellules endothéliales et tumorales, au cours de l’angiogenèse dans le carcinome du rein à cellules claires (ccRCC) humain. Nous avons montré que LOXL2 est exprimée à la fois par les cellules stromales et tumorales dans le ccRCC humain, mais aussi que LOXL2 pourrait jouer un rôle spécifique en fonction de son origine cellulaire dans ces tumeurs. L’étude de la contribution de LOXL2 endothéliale nous a permis de démontrer que LOXL2 promeut l’angiogenèse in vitro et in vivo dans le ccRCC, avec une implication partielle de son activité catalytique dans ce processus. Nous avons montré que LOXL2 sécrétée par les cellules tumorales stimule l’angiogenèse in vitro et in vivo, avec la participation de son activité catalytique, notamment en modulant la prolifération des cellules endothéliales. LOXL2 endothéliale et tumorale promeuvent l’angiogenèse dans le ccRCC, dépendamment ou non de son activité catalytique. / Angiogenesis is a major process in microenvironment remodeling which is mainly induced by hypoxia and VEGF. Lysyl oxidase like-2 (LOXL2) belongs to lysyl oxidase family involved in extracellular matrix crosslinking. Our team previously described that LOXL2 is a hypoxia-target, which is secreted by endothelial cells and accumulated into endothelial extracellular matrix. We also demonstrated that LOXL2 stimulates developmental angiogenesis. Moreover, several studies showed that LOXL2 is overexpressed in many cancers and inhibition of extracellular LOXL2 impedes the formation of a tumor microenvironment. My PhD work focused on the contribution of LOXL2 secreted by stromal cells (endothelial cells and cancer associated fibroblasts) and tumor cells in clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) angiogenesis. ccRCC is a highly vascularized and metastatic tumor. We showed that LOXL2 is expressed both by stromal and tumor cells in ccRCC and might play a specific role depending on its cellular origin in these tumors. Then we demonstrated that LOXL2 secreted by endothelial cells promotes angiogenesis in vitro and in vivo with a partial contribution of its catalytic activity. We also demonstrated that LOXL2 secreted by tumor cells stimulates angiogenesis in vitro and in vivo and that LOXL2 catalytic activity is involved in this process, notably modulating endothelial cells proliferation. Moreover, we showed that endothelial and tumor LOXL2 regulate several signaling pathways implicated in different steps of the angiogenic process.Both tumor and endothelial LOXL2 are involved in angiogenesis of ccRCC, in a dependent or independent catalytic activity manner.

La dissémination du VIH-1 par contacts cellulaires est plus efficace que sa transmission par particules virales libres. Cependant, la nature du matériel infectieux transféré à la jonction reste très mal connue. Nos travaux révèlent que l'infectivité du VIH-1 associée aux lymphocytes T est majoritairement portée à la surface cellulaire dans un biofilm viral. Initialement décrit pour le rétrovirus lymphotrope HTLV-1 (Human T-cell Leukemia Virus type-1), le biofilm viral est une colonie extracellulaire de particules virales infectieuses enchâssées dans un cocon de matrice extracellulaire (MEC). Par un panel de techniques de microscopie, nous décrivons la présence de biofilms viraux à la surface de lymphocytes T infectés par le VIH-1 (lignées chroniquement infectées, lymphocytes CD4+ primaires infectés in vitro par des souches de laboratoire et des isolats primaires, lymphocytes de patients). Nous identifions certains éléments de la MEC enrichis dans le biofilm du VIH-1 et démontrons que certains de ces composants, modulés par l'infection, favorisent la transmission du VIH-1. En effet, le biofilm viral joue un rôle clé dans la transmission directe (entre lymphocytes T) et indirecte (trans-infection) du VIH-1. De plus, le biofilm du VIH-1 confère une infectivité accrue aux particules virales, avantage préservé en présence d'antirétroviraux et d'anticorps neutralisants.L'ensemble de notre travail identifie une nouvelle entité infectieuse cruciale pour la dissémination du VIH-1 par contacts cellulaires. Ce nouveau mécanisme de transmission, potentiellement généralisable à d'autres virus, sera désormais à prendre en compte dans l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques. / HIV-1 cell-to-cell spread is thousands fold more efficient than cell-free infection; yet the nature of the infectious material transferred at the junction remains poorly documented. We found that HIV-1 T cell-associated infectivity mostly resides at the cell surface in a viral biofilm. Initially described for HTLV-1, a viral biofilm is defined as extracellular viral particles aggregated within a scaffold of extracellular matrix (ECM) components exposed at the surface of infected cells. Using a combination of microscopy techniques, we report the presence of HIV-1 biofilms at the surface of HIV-1 infected T cells (chronically infected T cells lines as well as primary CD4+ T cells infected in vitro with HIV-1 laboratory strains as well as primary isolates). Importantly, we show that CD4+ T cells isolated from HIV-1 patients produce a viral biofilm as well. We partially characterize the composition of HIV-1 biofilm in ECM components and unravel their contribution to HIV-1 transmission. We show that HIV-1 biofilm is transferred both between T cells and during dendritic-cell (DC)-mediated trans-infection and confers viral particles with an increased infectivity as compared to their cell-free counterparts. This increased infectivity is preserved in the presence of antiretroviral treatment and neutralizing antibodies. Our findings hence identify HIV-1 biofilm as a new infectious entity central for the efficiency of HIV-1 cell-to-cell transmission. This new mechanism of intercellular transmission might be shared by other viruses and will require appraisal in the design of future therapeutical strategies.