Orientador: Sergio Luis Felisbino / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T04:10:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JustulinJunior_LuisAntonio_M.pdf: 10236686 bytes, checksum: 4ad6350b1b5ac9de674a75c18e876eef (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A próstata (Pvl e a vesícu1a seminal (VS) são glândulas andrógeno-dependentes que sofrem atrofia e recuperação após privação e reposição androgênica, respectivamente. Em ambos eventos são observadas alterações tanto no compartimento epitelial quanto no estromal. Os aspectos relacionados às alterações epitelias provocadas pela reposição hormonal na próstata de ratos castrados estão bem descritos na literatura. Entretanto as alterações estromais e a atividade de metaloproteinases de matriz (MMPs) não estão descritas, tão pouco um estudo comparativo da resposta proliferativa entre a PV e a VS. Desta forma, este trabalho teve por objetivos: a) comparar a resposta da PV e da VS de ratos castrados submetidos ao processo de recuperação glandular por reposição hormonal; b) caracterizar o processo de reorganização estromal da próstata ventral de ratos castrados submetidos à reposição hormonal; c) avaliar a atividade das MMPs-2 e 9 durante a castração e reposição hormonal. Para tanto, ratos Wistar adultos machos (3 meses de idade) foram divididos em 3 grupos experimentais: controle, castrado (remoção dos testículos), e castrado tratado com testosterona. Os animais do grupo castrado foram sacrificados após 3, 5, 7, 21, 24, 26, 28, e 31 dias após a castração, enquanto os do grupo castrado tratado receberam, após 21 dias de castração, doses diárias de propionato de testosterona (4mg/kg/dia) e foram sacrificados após 3, 5, 7 e 10 dias de reposição. Finalmente, os animais do grupo controle foram sacrificados ao 3°., 7°., 21°. e 31° dias após o início do experimento. Os animais foram pesados e mortos. As próstatas ventrais (PV) e as vesículas seminais (VS) foram pesadas e processadas para análises histoquímicas, imunohistoquímicas, morfométricas, estereológicas, ultra-estruturais e análises bioquímicas por zimografia. Os resultados foram avaliados estatisticamente. Com a castração tanto a PV quanto a VS sotteram o característico processo de involução, com perda de peso, redução de área epitelial e luminal, e aumento da área estromal. Esses eventos foram revertidos progressivamente com a reposição hormonal. Entretanto, ao final do tratamento, a VS respondeu mais intensamente à reposição com testosterona do que a PV, superando significativamente o peso das glândulas dos grupos controle, enquanto o peso da PV não atingiu o peso das glândulas dos grupos controle. Esta diferença entre as duas glândulas também foi observada no índice de proliferação (IP) celular obtido pela marcação imunohistoquímica para PCNA. As células epitelias da VS apresentaram um IP aproximadamente três vezes superior às da VP. Embora a castração promova um aparente aumento da área estromal, nossos resultados de peso absoluto do estroma revelaram que ocorre na verdade uma diminuição no conteúdo estromal, com uma possível degradação da matriz extracelular. Embora, as fibras colágenas, reticulares e elásticas, condensadas durante a castração, tenham sido progressivamente distendidas e dispersadas ao redor dos duetos durante a reposição hormonal, ocorreu um aumento progressivo no volume absoluto do estroma, sugerindo a síntese destes componentes durante o tratamento. Este resultado confirma as observações ultra-estruturais de fibroblastos e células musculares lisas com citoplasmas repletos de organelas envolvidas na síntese protéica (Cisternas dilatadas de reticulo endoplasmático rugoso e Complexo de Golgi). Na degradação dos componentes da matriz extracelular do estroma durante a castração certamente ocorre com a participação das metaloproteinases de matriz (MMPs) 2 e 9, as quais exibiram aumento de atividade gelatinolítica de suas forma latentes e principalmente de suas formas ativas. A MMP-9 apresentou maior atividade durante a fase fmal da involução glandular, enquanto a MMP-2 apresentou aumento de atividade tanto na involução, quanto na recuperação glandular. Esses resultados demonstram que hormônios androgênicos modulam a fisiologia da próstata, influenciando o conteúdo e a organização da matriz extracelular do estroma através das células musculares lisas e, principalmente, dos fibroblastos / Abstract:The ventral prostate (VP) and the seminal vesic1e (SV) are both androgen dependents, in which undergoe atrophy and regrowth processes afier androgen deprivation and reposition. In both events, it was observed alterations in the epithelium as well as in the stromal compartiments. The aspects related to the prostate epithelium induced by testosterone replacement in castrated rats are very well discribed, however the estromal modifications and matrix metalloproteinases (MMPs) activity are not, even not a comparative study of proliferative responsiveness between VP and SV to testosterone replacement. In this sense, the aim of this work was: a) to compare the responsiveness to androgen reposition of the VP and SV involuted; b) to describe the process of stromal reorganization of castrated ventral prostate submited to testosterone replacemnt; c) to analyse the gelatinolitic activity of MMP-2 and MMP-9 in the ventral prostate during castration and androngen reposition; For this, male adult Wistar rats (3 months-old) were divided into 3 experimental groups: control, castrated (testis excision), and castrated plus testosterone replacement. The animals from castrated group were sacrificed at 3,5, 7, 21, 24, 26, 28 and 31 days after castration, while those from testosterone replacement, afier 21 days of castration, started to receive daily doses of testosterone propionate (4mg/kg/day) and were sacrificed at 3, 5, 7 and 10 days afier testosterone replacement. Finally, the animals from control group were sacrificed at 3, 7, 21 and 31 days afier beginning the experimento The animals were killed and weighted. The VPs and SVs were weighted and processed for histochemistry, immunohistochemistry, morphometric-stereological, ultra-structural and zymography analyses. The results were analysed statistically. Castration induced the characteristic process of involution. This process was progressively reverted by the testosterone replacement. However, at the end of the treatment, the more responsiveness of SV was demonstrated. The SV from TESTO group overcome the control value, while the VP did not reach the control value. This difference between two glands was also observed in the proliferation index (PI) obtained by the immunoreaction for PCNA. The epithelial cells from involuted SV presented a PI value about 3 times higher than that from VP. In despite castration promote an increase in the stromal area, our results from stromal absolute volume showed a reduction in the estromal compartiment, with a probably degradation of extracellular matrix. Moreover, the condensed colagen, reticular and elastic fibers have been distended and dispersed during testosterone replacement. In fact occured a progressive increase in the stromal absolute volume, suggesting synthesis of this components. These results confnm the ultrastructural observations of fibroblasts and smooth musc1e cell with enlarged rough endoplamatic reticulum cistems and Golgi complex evident. In the degradation of extracellular matrix components from stroma during castration, certainly the participation of MMPs is present. MMP-2 and -9 exhibited increased gelatinolytic activity of latent and mainly of active forms. The MMP-9 presented higher activity during the late phase of glandular involution, while the MMP-2 presented increased activity in both castration and testosterone replacement processes. These results shown that androgen modulate the prostate physiology and influence the composition and organization of stromal extracellular matrix through smooth muscle cells and mainly fibroblasts / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T19:46:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vilamaior_PatriciaSimoneLeite_M.pdf: 6633365 bytes, checksum: ebacaef83c22bcea00b2580b04e24c8e (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: A próstata é a glândula de maior volume e expressividade funcional anexa ao aparelho reprodutor masculino de mamíferos. Histologicamente é constituída de porções glandulares túbulo-alveolares. Em roedores, a glândula prostática está representada por pares de lobos ventrais, dorsais e laterais. O desenvolvimento embrionário e pós-natal, bem como a manutenção da estrutura e do funcionamento da próstata, são eventos dependentes de níveis constantes de andrógenos circulantes. A remoção destes andrógenos em animais adultos leva a próstata a um processo de involução que inclui uma redução de tamanho e diminuição ou perda da função secretora. O fato de a próstata humana ser o sítio de um grande número de doenças, nas quais os hormônios exercem um papel importante na etiologia, levou à necessidade de se conhecer as respostas deste órgão frente à ação hormonal em diferentes condições fisio-patológicas. O presente estudo teve como objetivo estudar os efeitos da remoção de andrógenos, por orquiectomia, sobre alguns componentes do estroma da próstata ventral de ratos adultos (Rattus rattus norvegicus), uma vez que as alterações decorrentes da castração no compartimento epitelial já são bem conhecidas e ainda pouco se sabe sobre as modificações no compartimento estromal. A identificação de alguns dos componentes da matriz extracelular foi efetuada utilizando-se métodos de rotina: hematoxilina-eosina e azul de toluidina, métodos histoquímicos, resorcina-fucsina de Weigert, para o sistema elástico; tricrômico de Masson e picrossíriushematoxilina, para fibras colágenas; impregnação pela prata para fibras reticulares; métodos imuno-histoquímicos, para detecção de glicosaminoglicanos(queratam sulfato e condroitim sulfato), e métodos ultra-estruturais. A análise dos efeitos da castração sobre o estroma foi efetuada em próstatas removidas aos 7, 14 e 21 dias após a castração. Os resultados demonstraram que após a castração ocorrem modificações no compartimento estromal, como o aumento da densidade dos componentes celulares e fibrilares tais como células musculares lisas e fibras do sistema elástico e colágenas, respectivamente. Observaram-se ainda um aumento da imunorreatividade do queratam sulfato e perda da imunorreatividade do condroitim sulfato na membrana apical das células epiteliais. Da análise dos componentes fibrilares foi possível observar um aumento na quantidade e espessura das fibras do sistema elástico e um aumento e uma maior agregação das fibras colágenas após a castração. Além da hiperplasia, observou-se que as células musculares lisas apresentaram fenótipos diferenciados, assumindo características ultra-estruturais de células sinteticamente ativas, nas condições de privação hormonal. Este fato indica que este tipo celular pode estar diretamente envolvido na síntese de alguns componentes macromoleculares do estroma prostático. As interações entre mesênquima e epitélio que ocorrem durante a morfogênese têm sua importância reconhecida, entretanto não se pode negligenciar a importância destas i nterações nos processos de manutenção e remodelação do estroma no órgão maduro. Neste sentido, o aprofundamento do conhecimento sobre a matriz extracelular, com base nos resultados obtidos neste trabalho, parece ser de grande importância / Abstract: The prostate is an acessory gland of the mammalían reproductive system with great volume and high functional importance. Histologically, it is a tubuloalveolar gland. In rodents, the prostatic gland is composed of paired ventral, dorsal and lateral lobes. The embryonic and post.natal development, and the maintenance of the prostatic structure and phísiology are dependent on stable levels of circulanting androgens. The remova I of these androgens in adult animais leads to an involution process, characterized bya reduction in size and a decrease or loss of the secretory function. The fact that the human prostate is the site of a number of díseases, which are in many cases also dependent of hormonal regulation, stimulates the investigation on the response of this organ to different hormonal therapies. This study was developed to verify the effects of androgen withdrawal, by orchiectomy, on some components of the rat ventral prostate. The identification of some extracellular matrix components was performed using routine procedures such as haematoxylin_eosin and toluídine blue staining; hístochemical methods as Weigert's resorcin.fuchsin for elastic system fibers; Masson's trichrome and picrosirius.haematoxylin, for collagen fibers; silver impregnation for reticular fibers; immunohistochemical methods for keratan sulfate and chondroitin sulfate detection and ultrastructural methods. The castration effects on some of the stromal components were examined on prostates removed at the 7, 14 and 21 days after castration. The results showed that castration promotes modifications in the stromal compartment, such as an increased density of cellular (smoth muscle cells) and fibrilar (collagen and elastin) components. It was possible to identify an increase in the amount and thickness of elastic system fibers and an increase in the number and compactness of collagen fiber. The smooth muscle cells presented differentiated phenotypes, attaining ultrastructural features of synthetically active cells. This fact indicates that these cells may be directly involved in the synthesis of some macromolecular components of the prostatic stroma. There is also an increase in keratan sulfate immunoreactivity and loss of reactivity for chondroitin sulfate at the apical membrane of epithelial cells. The mesenchymal.epithelial interactions are important during morphogenesis and they cannot be neglected in the maintenance and remodelling processes of the adult organ. Thus, continuing studies on the extracellular matrix, based on our studies, seems to be of great importance / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Edson Rosa Pimentel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T12:49:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Covizi_DanielaZanin_M.pdf: 5501060 bytes, checksum: d867f84ccf659267d9d346abfc1db3d9 (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: o tendão é um tipo de tecido conjuntivo denso onde há um predomínio de matriz extracelular (MEC) em relação a quantidade de células. Sua principal função é transmitir as forças de tensão geradas pela contração do músculo onde ele se origina ao osso no qual ele se insere. Os principais componentes da MEC de tendões são o colágeno do tipo I, os pequenos proteoglicanos (PGs) e as proteínas não colagênicas (PNC). Existem tendões que passam próximo a um osso em uma articulação antes da inserção, que ocorre numa direção diferente do músculo, e neste caso são denominados "wrap around", e no local em que estão sob a articulação recebem forças de compressão e fricção adicionais às forças de tensão. Neste local geralmente ocorre o desenvolvimento de uma estrutura fibrocartilaginosa com feixes de colágeno espessos, quantidade elevada de PG e células semelhantes a condrócitos. O objetivo deste trabalho foi analisar a composição de PNC e pequenos PGs da MEC de diferentes regiões do tendão do músculo flexor digital profundo (TFDP), do tendão do músculo flexor digital superficial (TFDS) e do tendão calcanear (TC), que por apresentarem trajeto não linear provavelmente estão sob a ação de forças de compressão e fricção além das forças de tensão. O TFDP e o TFDS foram divididos em regiões denominadas proximal, intennediária e distal, enquanto o TC foi dividido nas regiões proximal e distal. Todas as regiões dos três tendões foram extraídas com 25 volumes de c1oridrato de guanidina (GuRCI) 4M com inibi dores de proteases. As dosagens de proteínas realizadas em cada extrato mostraram que no TFDP havia uma maior presença de proteínas não colagênicas/mg de tecido, sendo que nas regiões intennediária e distal esta proporção foi maior. Com relação às dosagens de glicosaminoglicanos (GAGs) sulfatados, após digestão com papaína, foi verificado que a região distal do TC apresentou uma maior quantidade de GAG/mg de tecido, comparando com as regiões dos TFDP e TFDS. De um modo geral, a quantidade de GAG/mg de tecido, nos três tendões, foi sempre maior nas regiões em que os tendões contornam a articulação. O GAG dermatam sulfato foi encontrado em todas as regiões nos três tendões na eletroforese em gel de agarose, enquanto condroitim sulfato foi encontrado apenas nas regiões que estão sob forças de compressão do TFDP e do TC. Amostras de todos os extratos foram fracionadas em coluna de DEAE-celulose. O material ligado à resina foi eluído da coluna em gradiente linear de NaO de O a 1 M, e as frações analisadas em SDS-PAGE 4 a 16 % com e sem 2-mercaptoetanol (2-Me). Em todas as regiões dos três tendões observou-se a presença de componentes com Mr entre 94 kDa e 232 kDa. O pequeno PG fibromodulim foi encontrado em todas as regiões dos TFDP, TFDS e TC, e pelo resultado do teste imunoquímico podemos deduzir que possui duas isoformas do PG. Uma característica interessante deste fibromodulim foi seu comportamento em SDS-PAGE migrando mais lentamente quando não era previamente incubado com 2-Me. O componente poli disperso com Mr na faixa de 67 a 115 kda, provavelmente decorim, também foi encontrado em todas as regiões dos tendões TFDP, TFDS e Te. A presença desses pequenos PGs em tecidos tipicamente fibrosos deve-se à sua provável função de regular a fibrilogênese das moléculas de colágeno. As propriedades de intumescimento apresentadas pelos três tendões foram típicas de uma matriz colagênica fibrosa / Abstract: Tendon is a typical example of done connective tissue, with a predominance of extracellular matrix (ECM). Its main function is transmitting tension from the musc1e to the bone. The main ECM component of tendons are type I collagen, small proteoglycans and non collagenous proteins. Tendons which pass under bones are called a wrap around tendon, and way receive compression and frictional forces in adhesion to tensile forces. Normally, this region has a structure similar to a fibrocartilage with collagen fibers and elevated levels of g1ycosaminoglycans, with cells resembling chondrocytes. The purpose of this work was to analyse the composition of non collagenous proteins and small proteoglycans present in the ECM of different regions of the deep digital flexor tendon (DDFT), superficial digital flexor tendon (SDFr) and calcanear tendon (CT). These tendons probably experience compressive and frictional forces in addition to tensile forces. The DDFr and SDFr were divided in proximal, intermediate and distal regions, while the CT was divided in proximal and distal regions. Every region was treated with 25 volumes of 4M guanidine hydrochIoride (GuHCI) with proteases inhibitors. Quantitation of proteins in each extract showed that in DDFr there was a larger presence of non collagenous protein/ .g of tissue than in the other two tendons. In the intermediate and distal region of the DDFr, the proposition of this protein was higher. In relation to the presence of sulfated glycosaminog1ycans (GAGs), after papain digestion, more GAG/mg of tissue was found in the distal region of CT, compared to the regions of the DDFr and SDFr. In general, the amount of GAG/mg of tissue, was always higher in regions where the tendon passed under the joint. Eletrophoresis in agarose gel showed the presence of sulfate dermatan, in alI regions of the three tendons, whi1e chondroitin sulfate was found only in regions passing under bone, in DDFf and CT. Samples of every extract were fractioned on a DEAE-celulose column. The bound material was eluted with a linear gradient of O-1M NaCI, and fractions analysed in SDS-PAGE in presence and absence of 2-mercaptoethanol. In alI regions of the three tendons components with Mr between 94 and 232 kDa were delected. The small proteoglycan fibromodulin was present in every region of the DDFf, SDFf and CT. The immunochemical test inc1inated tqat fibromodulin may be present in two isoforms of the proteog1ycan. A interesting characteristic of this fibromodulin was its behaviour in SDS- P AGE, migrant more slowly when electrophoresis was in non reducing conditions. The polydisperse component with Mr in the range of 67 to 115 kDa, probably corresponding to decorin, was found in every region of the three tendons. The presence of these two small proteoglycans in fibrous tissues it is probable due to the function of regulating collagen fibrilogenesis. The swelling properties demonstrated for the three tendons were tipical of a collagenous fibrous matrix / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Magister en Ciencias Odontológicas con Mención en Periodontologia / las especies reactivas de oxígeno (ERO), entre ellas H202, son liberadas durante la inflamación crónica inducen la destrucción tisular por medio de la sobreexpresión de citoquinas proinflamatorias y la activación de metaloproteinasas de matriz (MMP), en ocasiones involucrando la activación de la vía de señalización NFκB. Si bien, los fibroblastos del ligamento periodontal (FLP) regulan la homeostasis del periodonto, no se conoce el efecto de las ERO sobre la síntesis y actividad de las MMPs y las vías de señalización involucradas. Objetivo: Evaluar la actividad de MMPs -2 y -9 en conjunto con la participación de la vía NFκB en cultivos primarios de FLP humano tratados o no con dosis subletales de H2O2. Metodología: FLP fueron aislados y cultivados a partir de 14 terceros molares sanos de 14 sujetos con indicación de extracción y expuestos a dosis subletales de peróxido. La activación de NFκB se determinó mediante la translocación nuclear de la subunidad p65 en presencia de H2O2 y/o SN50, un péptido inhibidor de la subunidad p50 de la vía NFκB y controles respectivos mediante inmunofluorescencia. Los FLP fueron estimulados con dosis subletales de H2O2 (2,5-10 µM) por 24 h y/o SN50 como control negativo. Los sobrenadantes fueron recolectados y procesados. La actividad de las proformas y formas activas de MMP-2 y MMP-9 fueron determinadas mediante zimografías en gelatina y evaluadas por densitometría. Los resultados fueron expresados como unidades arbitrarias densitométricas (ua) por mg de proteínas totales. Los resultados fueron analizados por medio del test estadístico ANOVA con el software StataV11.1. Resultados: La viabilidad celular se mantuvo en los grupos estimulados con H2O2 en dosis de 2,5-10 µM por 24 h. El H2O2 Indujo la translocación nuclear de NFκB. El porcentaje de activación (% A) de MMP-9 fue mayor en el grupo H2O2 5 μM que en el grupo 5 μM/ SN50 (p=0,051); mientras que el % A de MMP-2, aumentó significativamente en el grupo H2O2 5 μM comparado con el control. La actividad de MMP-9 fue significativamente mayor en el grupo H2o2 2,5 μM comparado con el de 5 μM/ SN50 y el de 10 μM; mientras que la actividad de MMP-2 aumentó significativamente en el grupo de 5 μM en comparación con el grupo control, 10 μM y el grupo de 5 μM + SN50. Conclusiones: La actividad gelatinolítica de MMP-2 aumenta con dosis subletales de H2O2 (<10 µM), en parte vía NFκB en FLP humano. La actividad de MMP-9 en FLP humano, está regulada parcialmente por la vía NFκB. El aumento en la actividad de MMP-2 inducido por H2O2, podría estar relacionado con la destrucción de tejido en las enfermedades periodontales. / FINANCIAMIENTO FONDECYT 1090461

Propósito: Os avanços obtidos pela engenharia de tecidos propiciaram o desenvolvimento de substitutos biológicos para tecidos urinários permanentemente danificados. O objetivo deste estudo é gerar um modelo para investigar as etapas fundamentais da formação de uma mucosa urotelial in vitro. Materiais e Métodos: Quatro tipos de matrizes foram produzidos com uma mistura de gelatina e diferentes combinações de ácido hialurônico e gelatina. Elas foram caracterizadas com o objetivo de verificar o efeito da modificação na composição sobre propriedades físico- -químicas relacionadas com a interação celular. As células utilizadas no estudo foram extraídas de segmentos do sistema urinário descartados após cirurgias. Após o período de cultura, tanto as células uroteliais quanto células-tronco derivadas de tecido adiposo foram semeadas nas matrizes manufaturadas. Cotes histológicos avaliaram a integração das células às matrizes. O multipotencial de diferenciação das células-tronco e a expressão de citoqueratina 7 pelo urotélio também foram investigados. Resultados: A maior interação da heparina com as moléculas da gelatina provocou uma redução na densidade de cargas eletrostáticas das matrizes. Este efeito também se refletiu na hidrofilicidade da superfície e na capacidade de absorção das matrizes em que a heparina estava presente. As células-tronco e o urotélio expandidos em culturas primárias demonstraram capacidade de proliferar em todas as matrizes. As células-tronco confirmaram seu multipotencial de diferenciação in vitro. As células uroteliais mantiveram a expressão de citoqueratina 7 ao serem cultivadas nas matrizes. Conclusão: Todas as matrizes produzidas suportaram a adesão e proliferação celulares. / Purpose: Advances in culture techniques and production of temporary matrices have allowed the development of biological substitutes to injured urinary tissues. The aim of this work is to generate a model to study the fundamental steps required to produce a urothelial mucosa in vitro. Materials and Methods: Four types of matrices were manufactured based on a mixture of gelatin and different combinations of heparin and hyaluronic acid. They were characterized in order to evaluate the effect of composition on physicochemical properties related to cellular integration. Adipocyte-derived stem cells and urothelium were isolated from urinary tissues and expanded in culture. Mesenchymal stem cells were investigated so as to verify their multilineage potential. Each cellular type was seeded in matrices and after two weeks of culture the specimens were histologically analyzed. Additionally, urothelial cells expression of cytokeratin 7 was tested. Results: The addition of heparin to scaffolds decreased their electrostatic charges density, surface hydrophilicity and absorption capacity. Both cellular types were expanded in primary cultures and grew in all matrix types. Adipocyte-derived stem cells confirmed their multilineage potential. Urothelial cells maintained the cytokeratin 7 expression when cultured in matrices. Conclusion: Despite differences in composition and physicochemical properties, all matrices were able to support cellular attachment and proliferation.

Tesis Magíster en Bioquímica área de Especialización en Toxicología y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al Título de Bioquímico / En la actualidad existen mayores posibilidades de desarrollo académico y profesional para las mujeres. Esto, sumado al fácil acceso a métodos para el control de la natalidad, ha llevado a que se postergue la maternidad a edades más tardías. Esta situación se ha convertido en un gran problema para los países por sus consecuencias a nivel económico, social y de salud pública. Por ello, es de suma importancia estudiar los mecanismos involucrados en el proceso de envejecimiento reproductivo. La regulación de la función ovárica se conoce ampliamente desde el punto de vista neuroendocrino, sin embargo, poco se sabe de los mecanismos que la controlan a nivel local. Se cree que un grupo de péptidos, conocidos como kisspeptinas (KISS), cuyos niveles en el ovario varían conforme al progreso del ciclo estral, podrían estar regulando al sistema proteolítico de las metalloproteinasas de matriz extracelular (MMPs) a nivel local, de manera similar a como se ha descrito en otros tejidos. De ser así, KISS podría regular cíclicamente el remodelamiento de la matriz extracelular ovárica controlando los niveles de expresión y/o actividad de las MMPs. Esto cobraría especial importancia en el periodo de subfertilidad, puesto que se ha descrito que los cambios morfológicos asociados al envejecimiento ovárico en la rata van acompañados de un aumento significativo en los niveles de KISS en el ovario. En base a esto, se postuló que “el aumento de kisspeptina endógeno produce la disminución de la expresión del transcrito y/o actividad de las metaloproteinasas de matrizextracelular-2 y -9 en el ovario en el periodo de subfertilidad en ratas”. El objetivo general del trabajo consisitió en caracterizar el patrón de expresión de los mRNAs de Kiss-1, MMP-2 y MMP-9 y los niveles de actividad proteolítica en ovarios de ratas fértiles y subfértiles en diferentes etapas del ciclo estral, y estudiar el efecto de la adición del péptido KP-10 y del bloqueo de su receptor con el antagonista p234 sobre la expresión y actividad de estas MMPs. Para llevar a cabo este objetivo, se obtuvieron ovarios en distintas fases del ciclo estral y, a partir de ellos, se estudiaron los niveles de mRNA de Kiss-1, MMP-2 y MMP-9 mediante RT-qPCR, y los niveles de actividad gelatinásica mediante zimografía. Además, se realizaron incubaciones in vitro de ovarios de ratas de 6, 8 y 10 meses de edad en presencia del péptido KP-10 y de KP-10 + p234 y, a partir de éstos, se estudiaron los niveles de mRNA de MMP-2 y MMP-9 y los niveles de actividad gelatinásica. Los resultados obtenidos en este trabajo mostraron que los niveles de mRNA de las gelatinasas varían de forma opuesta en el ciclo estral, lo que coincide con el rol fisiológico que se ha descrito para cada una de ellas en procesos como ovulación y formación del cuerpo lúteo. Además, se encontró que los niveles del mRNA de MMP-2 disminuyen de forma significativa en el ovario en el periodo de subfertilidad, probablemente como resultado de la disminución en el número de folículos antrales y cuerpos lúteos que se ha descrito a los 10 meses de edad en la rata. Por último, se encontró que los resultados no avalan la hipótesis planteada puesto que el tratamiento de los ovarios con el péptido KP-10 o con KP-10 + p234 no tuvo efecto sobre la expresión de los mRNAs de MMP-2 y MMP-9 en el periodo fértil ni en el subfértil. En el caso de MMP-2, tampoco se observó efecto a nivel de actividad. / There are currently greater possibilities of academic and professional development for women. This, coupled with ease of access to birth control methods, has led women to postpone motherhood to later ages. This situation has become a major problem for countries due to its economic, social, and public health consequences. Therefore, it is important to study the mechanisms involved in the process of reproductive aging. While the regulation of the ovarian function is widely known from the neuroendocrine point of view, little is known about the mechanisms that control it locally. It is believed that a group of peptides, known as kisspeptins (KISS), whose levels vary according to the progress of the estrous cycle, could be regulating the extracellular matrix metalloproteinases (MMPs) proteolytic system locally, similarly to what has been described in other tissues. If so, KISS could be cyclically regulating the ovarian extracellular matrix remodeling by controlling the MMP expression levels and/or activity. This would be especially important in the subfertility period, since it has been described that the morphological changes associated with the ovarian aging in the rat are accompanied with a significative increase in the ovarian KISS levels. Based on this, it was postulated that “the endogenous kisspeptin increase causes a decrease in the transcript expression and/or extracellular matrix metalloproteinases -2 and -9 activity in the ovary on the subfertility period in rats”. The main objective was to characterize the Kiss-1, MMP-2 and MMP-9 expression pattern and the gelatinolitic activity levels in ovaries of fertile and subfertile rats at different stages of the estrous cycle, and to study the effect of an addition of KP-10 peptide and the blocking of its receptor with p234 antagonist over the expression and activity of these MMPs. To carry out this objective, ovaries were obtained in different stages of the estrous cycle and, from them, the Kiss-1, MMP-2 and MMP-9 mRNA`s levels were studied by RT-qPCR, and the gelatinolytic activity levels by zymography. In addition, in vitro incubations of rat ovaries were performed with KP-10 peptide or with KP-10 peptide + p234 and, from these, the mRNA`s levels of MMP-2 and MMP-9 and the gelatinolytic activity levels were studied. The results obtained in this work showed that the gelatinases mRNA levels vary in an opposite way in the estrous cycle, which coincides with the physiological role that has been described for each of them in processes such as ovulation and formation of the corpus luteum. In addition, MMP-2 mRNA levels were found to decrease significantly in the ovary in the subfertile period, probably as a result of the decrease in the number of antral follicles and corpus luteum that has been described at 10 months old in the rat. Finally, it was found that the results do not support the postulated hypothesis since the treatment of the ovaries with the KP-10 peptide or with KP-10 + p234 had no effect on the MMP-2 and MMP-9 mRNA`s expression levels in the fertile or subfertile period. In the case of MMP-2 there was no effect in the activity levels

Propósito: Os avanços obtidos pela engenharia de tecidos propiciaram o desenvolvimento de substitutos biológicos para tecidos urinários permanentemente danificados. O objetivo deste estudo é gerar um modelo para investigar as etapas fundamentais da formação de uma mucosa urotelial in vitro. Materiais e Métodos: Quatro tipos de matrizes foram produzidos com uma mistura de gelatina e diferentes combinações de ácido hialurônico e gelatina. Elas foram caracterizadas com o objetivo de verificar o efeito da modificação na composição sobre propriedades físico- -químicas relacionadas com a interação celular. As células utilizadas no estudo foram extraídas de segmentos do sistema urinário descartados após cirurgias. Após o período de cultura, tanto as células uroteliais quanto células-tronco derivadas de tecido adiposo foram semeadas nas matrizes manufaturadas. Cotes histológicos avaliaram a integração das células às matrizes. O multipotencial de diferenciação das células-tronco e a expressão de citoqueratina 7 pelo urotélio também foram investigados. Resultados: A maior interação da heparina com as moléculas da gelatina provocou uma redução na densidade de cargas eletrostáticas das matrizes. Este efeito também se refletiu na hidrofilicidade da superfície e na capacidade de absorção das matrizes em que a heparina estava presente. As células-tronco e o urotélio expandidos em culturas primárias demonstraram capacidade de proliferar em todas as matrizes. As células-tronco confirmaram seu multipotencial de diferenciação in vitro. As células uroteliais mantiveram a expressão de citoqueratina 7 ao serem cultivadas nas matrizes. Conclusão: Todas as matrizes produzidas suportaram a adesão e proliferação celulares. / Purpose: Advances in culture techniques and production of temporary matrices have allowed the development of biological substitutes to injured urinary tissues. The aim of this work is to generate a model to study the fundamental steps required to produce a urothelial mucosa in vitro. Materials and Methods: Four types of matrices were manufactured based on a mixture of gelatin and different combinations of heparin and hyaluronic acid. They were characterized in order to evaluate the effect of composition on physicochemical properties related to cellular integration. Adipocyte-derived stem cells and urothelium were isolated from urinary tissues and expanded in culture. Mesenchymal stem cells were investigated so as to verify their multilineage potential. Each cellular type was seeded in matrices and after two weeks of culture the specimens were histologically analyzed. Additionally, urothelial cells expression of cytokeratin 7 was tested. Results: The addition of heparin to scaffolds decreased their electrostatic charges density, surface hydrophilicity and absorption capacity. Both cellular types were expanded in primary cultures and grew in all matrix types. Adipocyte-derived stem cells confirmed their multilineage potential. Urothelial cells maintained the cytokeratin 7 expression when cultured in matrices. Conclusion: Despite differences in composition and physicochemical properties, all matrices were able to support cellular attachment and proliferation.

Propósito: Os avanços obtidos pela engenharia de tecidos propiciaram o desenvolvimento de substitutos biológicos para tecidos urinários permanentemente danificados. O objetivo deste estudo é gerar um modelo para investigar as etapas fundamentais da formação de uma mucosa urotelial in vitro. Materiais e Métodos: Quatro tipos de matrizes foram produzidos com uma mistura de gelatina e diferentes combinações de ácido hialurônico e gelatina. Elas foram caracterizadas com o objetivo de verificar o efeito da modificação na composição sobre propriedades físico- -químicas relacionadas com a interação celular. As células utilizadas no estudo foram extraídas de segmentos do sistema urinário descartados após cirurgias. Após o período de cultura, tanto as células uroteliais quanto células-tronco derivadas de tecido adiposo foram semeadas nas matrizes manufaturadas. Cotes histológicos avaliaram a integração das células às matrizes. O multipotencial de diferenciação das células-tronco e a expressão de citoqueratina 7 pelo urotélio também foram investigados. Resultados: A maior interação da heparina com as moléculas da gelatina provocou uma redução na densidade de cargas eletrostáticas das matrizes. Este efeito também se refletiu na hidrofilicidade da superfície e na capacidade de absorção das matrizes em que a heparina estava presente. As células-tronco e o urotélio expandidos em culturas primárias demonstraram capacidade de proliferar em todas as matrizes. As células-tronco confirmaram seu multipotencial de diferenciação in vitro. As células uroteliais mantiveram a expressão de citoqueratina 7 ao serem cultivadas nas matrizes. Conclusão: Todas as matrizes produzidas suportaram a adesão e proliferação celulares. / Purpose: Advances in culture techniques and production of temporary matrices have allowed the development of biological substitutes to injured urinary tissues. The aim of this work is to generate a model to study the fundamental steps required to produce a urothelial mucosa in vitro. Materials and Methods: Four types of matrices were manufactured based on a mixture of gelatin and different combinations of heparin and hyaluronic acid. They were characterized in order to evaluate the effect of composition on physicochemical properties related to cellular integration. Adipocyte-derived stem cells and urothelium were isolated from urinary tissues and expanded in culture. Mesenchymal stem cells were investigated so as to verify their multilineage potential. Each cellular type was seeded in matrices and after two weeks of culture the specimens were histologically analyzed. Additionally, urothelial cells expression of cytokeratin 7 was tested. Results: The addition of heparin to scaffolds decreased their electrostatic charges density, surface hydrophilicity and absorption capacity. Both cellular types were expanded in primary cultures and grew in all matrix types. Adipocyte-derived stem cells confirmed their multilineage potential. Urothelial cells maintained the cytokeratin 7 expression when cultured in matrices. Conclusion: Despite differences in composition and physicochemical properties, all matrices were able to support cellular attachment and proliferation.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:34:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_10064_Dissertação_Flávia Medina da Silva.pdf: 788299 bytes, checksum: 07d6e8dd8df2ccf77b7aa3426d87206a (MD5) Previous issue date: 2016-05-12 / A doença cardíaca é considerada maior causa de morte no mundo e muitos pacientes tem como única forma de tratamento o transplantes do órgão. A bioengenharia tecidual veio como forma de auxiliar no problema de escassez de órgãos para doação, utilizando de técnicas que consistem em retirar as células do órgão mantendo os componentes da Matriz Extracelular (MEC) e recelularizar com células do próprio paciente, portanto reduzindo a concentração de moléculas imunologicamente ativas. Todos os agentes usados em descelularização alteram a composição e causam algum dano a ultraestrutura. O objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de arcabouço cardíaco derivado de matriz extracelular (MEC) descelularizada com uso de dois agentes e com tempo de exposição reduzidos. Como modelo experimental foram utilizados 14 ratos Wistar, machos, com idade de dois meses pesando em média 330g. Após anestesia (Ketamina/Xilazina 90mg/Kg/10 mg/Kg), os animais tiverem seu tórax aberto e retirado o coração. O órgão foi canulado e perfundido através da aorta ascendente inicialmente com PBS, seguidos por perfusão com detergentes SDS 1% e Triton X-100 1%. Foram utilizadas técnicas de microscopia óptica onde as mostras após processadas foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E), Picrosírius e marcadas com anticorpos para laminina e fibronectina. Para microscopia eletrônica de transmissão e microscopia eletrônica de varredura as amostras após processadas foram obtidas imagens em seus respectivos microscópios. A quantificação de DNA foi feita através de kit DNeasy e as amostras entre os grupos foram consideradas significativas quando p<0,05, utilizando teste t de Student. Foi encontrada ausência de células nos arcabouços descelularizados, observada por microscopia óptica e a manutenção da estrutura do arcabouço da MEC foi visualizada macroscopicamente e microscopicamente onde foi revelada alteração na microestrutura. Os principais componentes da MEC se mantiveram no arcabouço descelularizado e a concentração de DNA teve uma redução de 87,04% comparando os grupos controle e descelularizado. Com uso de apenas dois agentes e a redução do tempo de exposição o processo se manteve eficaz na retirada de células, melhor preservação dos componentes da MEC, podendo utilizar os arcabouços para recelularização.

Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T04:53:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Felisbino_SergioLuis_M.pdf: 16539510 bytes, checksum: 4752f432df02f2aa0188c991542a16cc (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: A cartilagem pode ser descrita como um tecido avascular contendo células arredondadas separadas por uma matriz predominantemente basófila. As células da cartilagem, os condrócitos, produzem uma matriz extracelular constituída principalmente de fibrilas de colágeno tipo II e de grandes proteoglicanos agregantes. Em menores quantidades são encontrados outros tipos de colágeno e proteínas não colagênicas. Existem difererltes tipos de cartilagens distintas principalmente, na composição e organização dos componentes da sua matriz extracelular. Durante o desenvolvimento, os ossos longos são precedidos por um modelo cartilaginoso. Deste modelo cartilaginoso inicial, persiste nas extremidades dos ossos um tipo de cartilagem hialina denominada de cartilagem epifisária, que compreende a cartilagem articular e a cartilagem de crescimento. Dos diferentes tipos de cartilagens, a cartilagem de crescimento é talvez a mais dinâmica. Nesta cartilagem ocorrem processos de proliferação, maturação e hipertrofia celular. Estes processos são essenciais para o crescimento longitudinal do osso e formação de osso endocondral. Estas descrições são baseadas principalmente nos aspectos encontrados em aves e mamíferos, que já foram exaustivamente estudados. Pouco se sabe destes processos em anfíbios anuros, sendo que os trabalhos anteriores muitas vezes mostram-se contraditórios no que diz respeito à ossificação endocondral e à calcificação da cartilagem epifisária. Este trabalho teve por objetivos acompanhar o desenvolvimento e o envelhecimento da cartilagem epifisária de Rana catesbeiana, descrevendo os aspectos celulares e da matriz extracelular, com especial referência ao crescimento ósseo e a calcificação da cartilagem. Cartilagens epifisárias da epífise distal do fêmur e proximal da tíbio-fíbula de animais em diferentes fases de desenvolvimento e envelhecimento foram utilizadas e submetidas a testes histoquímicos, citoquímica enzimática e análises ultraestruturais. Os resultados demonstram que o fêmur e a tíbio-fíbula são formados por ossificacão periosteal de um modelo cartilaginoso. Este osso periosteal forma uma estrutura tubular cujas extremidades se encaixam na cartilagem epifisária. Esta cartilagem epifisária possui uma cartilagem articular bem desenvolvida e apresenta projeções laterais que recobrem a face externa do osso periosteal. Entre a cartilagem lateral e o osso periosteal encontra-se o ligamento osteo-condral. Este ligamento osteo-condral contem muita fibras de colágeno do tipo I e é muito vascularizado. Internamente à extremidade do osso periosteal encontra-se a cartilagem de crescimento com as zonas de reserva, proliferação, maturação e hipertrófica. As células da zona de proliferação são achatadas e separam-se no sentido perpendicular ao longo eixo do osso, ao contrário do que acontece nos mamíferos. Os condrócitos hipertróficos mais distais apresentam aspectos de degeneração. Existem trêm sítios distintos de calcificação da cartilagem epifisária. A calcificacão da cartilagem lateral é a mais freqüente e aumenta com o envelhecimento, os outros dois sítios são encontrados na cartilagem de crescimento. Os testes de atividade de fostatase alcalina revelaram intensa atividade desta enzima nos condrócitos próximos às áreas de calcificação e nos osteoblastos dos periósteo. Ossificação endocondral só é encontrada na epífise distal do fêmur de animais velhos, sendo muito reduzida e, aparentemente, associada à presença de canais da cartilagem. É nos animais velhos que aparece também a ossificação endosteal, com a formação de canais de Havers. Células mononucleadas são aparentemente responsáveis pela erosão da matriz da cartilagem hipertrófica não mineralizada e células semelhantes a osteoclastos ou condroclastos erodem a matriz calcificada. Em conjunto, os resultados revelam um tipo especializado de cartilagem epifisária capaz de permitir um crescimento ósseo rápido e de resistir aos impactos impostos às articulações durante os saltos / Abstract: Cartilage is described as an avascular tissue with round cells embedded in a rather basophilic matrix. Cartilage cells, the chondrocytes, produce an extracellular matrix containing mainly type II collagen fibrils and proteoglycans. Minor collagens and noncollagens proteins are also present in the cartilage matrix. There are different types of cartilage, differing by the composition and organization of the matrix components. Developmentally, long bones are precceded by a cartilaginous scaffold. Cartilage tissue remains at the bone extremities where it is called epiphyseal cartilage. This cartilage can be divided in articular cartilage and in growth cartilage. Growth cartilage is probably the most dynamic cartilage because it bears processes such as cell proliferation, maturation and hypertrophy. These processes are essential for the growth of long bones and f9r endochondral bone formation. These processes are described following studies developed with birds and mammals, that were already exhaustivelly studied. Little knowledge exists on the growth of long bone in amphibians and previous publications are contradictory with regard to the endochondral ossification and the calcification of the epiphyseal cartilage. The objective of this work was to study the development and aging of the epiphyseal cartilage of Rana catesbeiana, describing the cells and extracellular matrix, with especial attention to their role in bone growth and cartilage calcification. Epiphyseal cartilage from the distal femoral epiphysis and from the proximal tibio-fibula epiphysis of animaIs with different ages were used and subjected to histochemistry, enzyme cytochemistry and ultrastructural analyses. The results showed that the femur and tibio-fibula are constructed by periosteal ossification of a cartilaginous scaffold. This periosteal bone beco me a tubular structure which inserts into the epiphyseal cartilage. Epiphyseal cartilage contains a well developed articular cartilage and presents lateral projections that cover the external face of the periosteal bone. In between the lateral cartilage and the periosteal bone there is a osteochondral ligament. This ligament contains many collagen fibers and blood vessels. The growth cartilage is found within the periosteal bone with its reserve, proliferation, maturation and hypertrophic zones. Cells of the proliferation zone are flat and divide in the longitudinal direction with to respect to the length of the bone, as opposed to what happens in mammals. Hypertrophic chondrocytes present degeneration aspects. There are three distinct calcification sites in the epiphyseal cartilage. Lateral cartilage calcification is more frequent and increase with age, while the other sites are found in the growth cartilage. Alkaline phosphatase activity was found in chondrocytes close to the calcification sites and also in the osteoblasts of the periosteum. Endochondral ossification is only found in the distal femoral epiphysis of old animaIs. However, it was very reduced and apparently associated with cartilage canaIs. Old animaIs also has endosteal bone containing haversian systems. Mononucleated cells are responsible for the erosion of the uncalcified cartilage matrix and osteoclast-like or chondroclast-like cells erode the calcified matrix. Together, the results show that the bullfrog epiphyseal cartilage is very especialized tissue able of allow a fast bone growth and to support impacts on the joint during jumps / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas