Orientador: José Luiz Laus / Coorientador: Marcela Aldrovani Rodrigues / Banca: João Antonio Tadeu Pigatto / Banca: Aline Adriana Bolzan / Resumo: Por objetivos, estudaram-se procedimentos em cultivo celular e se eles alteram a supraorganização da matriz extracelular (MEC) amniótica e da límbica, considerando-se propriedades anisotrópicas dos biopolímeros em comum, isto é, colágenos fibrilares e proteoglicanos. Explantes límbicos de coelhos foram cultivados sobre fragmentos de membrana amniótica (MA) desepitelizada humana, por dois, sete e 15 dias. Fragmentos não cultivados de MA e de limbo foram usados como controles. Avaliaram-se parâmetros de birrefringência em fibras colágenas e de absorção e de dicroísmo linear (LD) em proteoglicanos, da MEC amniótica e da límbica. Todas as análises foram conduzidas em microscópio óptico munido de luz polarizada, filtros monocromadores com diferentes comprimentos de onda e vídeo-câmera. Empregaram-se procedimentos em análise digital de imagens (software Image J®, NIH, USA). Parâmetros de birrefringência revelaram que os graus de paralelismo das fibras colágenas amnióticas foram de 1,02 nos controles, 1,17 nas amostras cultivadas por dois dias, 1,26 nas amostras cultivadas por sete dias e de 1,17 nas amostras cultivadas por 15 dias. Relativamente às fibras límbicas, foram de 1,33, 1,17, 1,25 e 1,44. Os contrastes dos brilhos das birrefringências das fibras amnióticas foram de 2,0 nos controles, 13,25 nas amostras cultivadas por dois dias, 19,26 nas amostras cultivadas por sete dias e de 13,23 nas amostras cultivadas por 15 dias. Relativamente às fibras límbicas, foram de 23,01, 13,39, 19,90 e 30,31. Cores de interferência causadas por dispersão anômala de birrefringência foram detectadas. Procedimentos em cultivo celular alteraram parâmetros absorciométricos relacionados à supraorganização dos proteoglicanos da MEC amniótica e da límbica. As MAs de todas as amostras, exceto as cultivadas por 15 dias, apresentaram-se com valores negativos de DL. Os valores de DL dos limbos de todas as amostras, exceto... / Abstract: The goal of this study was to evaluate whether procedures on cell culture alter the supraorganization of amniotic and limbal extracellular matrix (ECM). Anisotropic properties of fibrillar collagen and proteoglycans were studied, since they correspond to major extracellular biopolymers. Rabbit limbal explants were cultured on denuded human amniotic membrane (AM) for two, seven, and 15 days. Uncultured AM and limbus were used as controls. Birefringence parameters related to the supraorganization of collagen fibers, and spectral absorption and linear dichroism (LD) related to the supraorganization of proteoglycans were evaluated. All samples were evaluated on microscope equipped with polarized light, monochromatic filters with varying wavelengths, and digital video camera. Birefringence, absorbances and LD were quantified by using image analyses software (Image J®, NIH, USA). Studies on birefringence showed that parallelism degrees of amniotic collagen fibers were of 1.02 for the control group, 1.17 for the two days culture, 1.26 for the seven days culture, and 1.17 for the 15 days culture. In relation to limbal collagen fibers, parallelism degrees were of 1.33, 1.17, 1.25, and 1.44. Birefringence brightness contrasts of amniotic collagen fibers were of 2.0 for the control group, 13.25 for the two days culture, 19.26 for the seven days culture, and 13.23 for the 15 days culture. In relation to limbal collagen fibers, birefringence brightnesses were of 23.01, 13.39, 19.90, and 30.31. Interference colors due to anomalous birefringence dispersion were observed. Procedures on cell culture induced alterations in absorbance values related to proteoglycans from amniotic and limbal ECM. In all samples, except on those cultured for 15 days, the amniotic ECM showed negative DL values. The DL of limbal ECM varied between negative and positive values for all, except on two days culture / Mestre

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Made available in DSpace on 2015-11-11T12:13:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 flavia_cardoso_ioc_dout_2012.pdf: 4710105 bytes, checksum: dc3501a4d3afbbe60d475111f040507c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-05-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / No presente trabalho a imunopatologia da infecção por Leishmania amazonensisfoi estudada em quatro linhagens de camundongos singênicos. Diferentes parâmetros como análise da expressão/produção de citocinas em diferentes órgãos e no soro, quantificação da carga parasitária, caracterização das populações celulares presentes no infiltrado inflamatório, assim como alterações histopatológicas e na matriz extracelular foram avaliados a fim de verificar as diferenças existentes na resposta imunopatológica entre as linhagens de camundongos utilizadas. A partir destas análises observamos que na fase inicial da infecção, tanto na lesão primária como no linfonodo, as células predominantemente encontradas foram eosinófilos e mastócitos em todas as linhagens de camundongos. A maior presença de células como linfócitos T\03B3\03B4, células B, plasmócitos, assim como altos níveis de anticorpos foi verificada nos camundongos sensíveis a infecção por L. amazonensissugerindo o papel destes na suscetibilidade a doença. Quanto à carga parasitária, as linhagens mais sensíveis (C57BL/10 e CBA) apresentaram maior densidade de amastigotas e maior destruição tecidual com lesões grandes, além de metástase e visceralização do parasito, enquanto os camundongos resistentes (C3H.He) apresentaram poucos parasitos, sem formação de úlceras ou visceralização De acordo com nossas observações, a resposta imunológica à L. amazonensisdemonstra uma compartimentalização e consequente diferença na produção/expressão de citocinas nos diferentes órgãos estudados. As linhagens mais sensíveis apresentaram, na lesão primária, níveis mais elevados de expressão de citocinas próinflamatórias como IL-12, TNF-\03B1e IFN-\03B3, assim como a indução de iNOS, estando tais níveis associados a maior destruição tecidual observada, enquanto níveis elevados de TGF-\03B2 estariam associados a desativação do macrófago e consequente estabelecimento do parasito no início da infecção. A expressão de IL-4 foi mais evidente nos linfonodos dos camundongos sensíveis. Já no baço de camundongos C57BL/10 uma expressão concomitante de TNF-\03B1e IL-10, assim como IL-12, IFN-\03B3e iNOS estavam associadas a presença de parasitos.A expressão de citocinas proinflamatórias (INF-\03B3, TNF-\03B1e IL-12) no fígado de camundongos C57BL/10 foi observada na fase inicial da infecção,enquanto citocinas regulatórias (TGF-\03B2e IL-10) na fase tardia. Os camundongos resistentes àinfecção por L. amazonensis apresentaram baixos níveis de expressão de citocinas em todos os órgãos analisados Apesar de não haver uma correlação direta na produção/expressão destas citocinas nestes órgãos, a infecção induz uma produção mista de citocinas que é independente da constituição genética do hospedeiro. Na análise da expressão de proteínasda matriz observamos uma associação entre o aumento na expressão fibronectina, colágenoI e III com a expressão de TGF-\03B2no fígado e linfonodo de C57BL/10 e C3H.He. Tal associação não foi observada na pata e no baço destes animais. A expressão de colágeno III napata, na fase tardia da infecção, estava relacionada à presença maciça de histiócitos parasitados. Altos níveis de expressão de laminina foram observados na pata de camundongos C57BL/10, 30 dias após a infecção, assim como o aumento de colágeno IV e fibronectina / In the present work L. amazonensis infection immunopathology was studied in four inbred mouse strains. With the aim of evaluate the differences in immunopathologic response between all strains, different parameters such as: cytokines analysis expression/production, in different organs and serum, parasite quantification , inflammatory infiltrate description, as well as histopathological and extracellular matrix alter ations were evaluated. The association of these analyzes showed that in the early phase of in fection, in both primary lesion and lymph nodes, the cells predominantly found in all mouse s trains were eosinophils and mast cells. A highest presence of T γδ lymphocytes, B cells, plasma cells, as well as hig h levels of antibodies were observed in L. amazonensis susceptible mice, suggesting a role of this parameters in disease susceptibility. In regard the parasite load, the more susceptible strains (C57BL/10 and CBA) showed a heavy parasite load, ma ssive tissue destruction with large lesions and metastasis, and parasite visceralizatio n. The resistant mice (C3H.He) showed few parasites and no scars or visceralization were obse rved. According to our observations, L. amazonensis immune response showed cytokines production/expres sion compartmentalization in different studied organs. T he more susceptible strains showed an increase of proinflammatory (IL-12, TNF- α and IFN- γ ) cytokines expression, as well as the iNOS induction, in the primary lesion. This enhance ment of expression was associated with tissue destruction, while high levels of TGF- β were associated with macrophages deactivation and subsequent parasite establishment in the early infection. The expression of IL-4 was more evident in susceptible mice lymph nodes. In C57BL/1 0 mice spleen a concomitant expression of TNF- α and IL-10, as well as IL-12, IFN- γ and iNOS, were associated with parasites presence. Proinflammatory cytokines (IFN- γ , TNF- α and IL-12) expression in C57BL/10 mice liver was observed in the initial phase of inf ection, whereas regulatory (TGF- β and IL- 10) cytokines were seen in the late phase. The resi stant to L. amazonensis mice showed low levels of cytokine expression in all examined organ s. Although there is not a direct association between cytokines production/expression in these organs, the L. amazonensis infection induces a mixed cytokines production that is independent of the host genetic background. The analysis of extracellular matrix pr oteins expression showed an association between FN, collagen I and III expression increase with the expression of TGF- β in the liver and lymph nodes of C57BL/10 and C3H.He mice. This a ssociation was not observed in the footpad and spleen of these animals. The footpad ex pression of collagen III in the late phase of infection was associated with the massive presen ce of parasitized histiocytes. A highest level of laminin, as well as the increase of collag en IV and fibronectin expression was observed in C57BL/10 mice footpad, 30 days after in fection.

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:20:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 desio_oliveira_ioc_dout_2011.pdf: 1175865 bytes, checksum: f838717ed871f60759465b1b71ebee3c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A infecção pelo Trypanosoma cruzi promove alterações em órgãos linfóides. O timo apresenta-se atrofiado com depleção de células CD4+CD8+ (DP) na fase aguda. Em órgãos linfóides periféricos, os linfonodos subcutâneos (LSC) e o baço apresentam-se hipertrofiados com aumento de células T e B, enquanto os linfonodos mesentéricos (LM) apresentam-se atrofiados devido à morte dessas células. Nesse trabalho estudamos os efeitos da infecção pelo T. cruzi sobre células epiteliais tímicas (TEC) e timócitos, bem como o papel do timo no comportamento de órgãos linfóides periféricos. Em experimentos de infecção in vitro, avaliamos TEC, abordando a expressão de ligantes e receptores da matriz extracelular (ECM), e ainda, as possíveis conseqüências desse aumento de ECM sobre a interação de TEC/timócitos ou TEC/parasita. Nossos resultados demonstram que a infecção promove diminuição do número de TEC, alterações morfológicas e aumento de ECM em culturas infectadas. Observamos também que componentes da ECM são requeridos na interação entre TEC/parasita. Curiosamente, o menor crescimento de TEC em culturas infectadas está associada com a inibição do ciclo celular e não com apoptose No que se refere à interação TEC/timócitos, observamos que a adesão foi maior nas culturas infectadas, especialmente sobre TEC parasitadas. Esse aumento de adesão entre TEC/timócitos corrobora a hipótese descrita anteriormente pelo nosso grupo que a infecção favorece a migração de timócitos para periferia. Estendendo nossa análise ao compartimento linfóide do timo, investigamos a apoptose de timócitos na infecção. Observamos que a celularidade do timo diminui viii durante a infecção, juntamente com aumento de apoptose de timócitos CD4-CD8- (DN), DP, CD4 e CD8. Procurando entender a via envolvida na apoptose desses timócitos, demonstramos que a atividade de caspases total, caspase 8, caspase 9 e caspase 3 estão aumentadas na infecção. Observamos que ambas caspases iniciadoras caspase 8 (via extrínseca, Fas, TNF, TRAIL) e caspase 9 (via intrínseca, privação de fatores) parecem estar envolvidas na depleção desses timócitos Esse dado foi confirmado nos experimentos de bloqueio de morte com inibidores de caspases, onde observamos que o tratamento in vivo (injeção intratímica) e in vitro com zVAD (inibidor geral de caspases) em timócitos de animais infectados foi mais eficaz no bloqueio da morte do que os inibidores de caspase-8 (zIETD) ou caspase-9 (zLEHD). Além disso, animais infectados e tratados com zVAD apresentaram a celularidade do timo parcialmente recuperada, mais especificamente em timócitos DN e DP. Finalmente, procurando entender o papel do timo na resposta imune regional de órgãos linfóides periféricos na infecção, camundongos foram timectomizados antes da infecção para avaliação da celularidade dos LSC, LM e baço. Nossos dados demonstram que, mesmo com a ausência do timo, a hipertrofia dos LSC e a atrofia dos LM permaneciam inalterados, entretanto, encontramos significativo acúmulo de linfócitos T e B no baço de animais infectados. Em conjunto, nossos resultados demonstram que as alterações observadas no componente epitelial do microambiente tímico, assim como em timócitos de animais infectados favorecem a migração e morte destes timócitos e a atrofia desse tecido. Além disso, demonstramos que células do timo possuem papel imunoregulatório no baço durante a infecção / Trypanosoma cruzi infection promotes lymphoid organ alterations. The thymus is atroph ied with CD4 + CD8 + (DP) thymocyte depletion in the acute phase of infection. In p eripheral lymphoid organs, subcuta neous lymph nodes (LSC) and spleen present hypertrophy, with increase of T and B cells, whereas mesenteric lymph nodes (LM) are atrophied due to the death of these cells . In this work, we studied the effects of T. cruzi infec tion in thymic epithelial cells (TEC) and thymocytes , as well as the role of thymus in the behavior of peripheral lymphoid organs . In experiments of in vitro infection, we evaluated TEC, concerning the expression of extracellular matrix (ECM) ligands and receptor s , and also the possible conseq uences of ECM increase in TEC /thymocyte or TEC/parasit e intera ctions . Our data demonstrate that T. cruzi infection promotes a decrease of TEC number , morphological alterations and ECM increase in infected cultures . We observed that ECM components ar e required in the interaction between TEC and parasit es . Curiously, the decrease in TE C number in infected cultures is associated to cell cycle inhibition but not to apoptos is . Concerning TEC/thymocyte interactions, we observed that adhesion was greater in infected cultures, especially on parasitized TEC . This increase in TEC/thymocyte adhesion corroborates the hypothesis previously described by our group that the infection favors migration of thymocyte s to the periphery . Extending our analysis to th ymic ly mphoid compartment, we investigated thymocyte apoptosis following infection . We observed that thymus cellulari ty decreases during infection, together with the increase of apopt osis in CD4 - CD8 - (DN), DP, CD4 and CD8 thymocyte s. Searching to understand what death pathway is involved in thymocyte apoptosis, we demonstrated that the activity of total cas pases, caspase - 8, caspase - 9 and caspase-3 (ef f e c tor caspase ) are increased in infection . We observ ed that both initiator ca spase - 8 (extrinsic pathway, Fas, TNF , TRAIL) and caspase - 9 (intrinsic pathway, factor deprivation) seem to be involved in thymocyte deple tion. These data were confirmed in death blocking experiments with caspase inhibitors , in which w e showed that in vivo (intrat hy mic inje ction ) and in vitro treatment s with zVAD ( general caspase in hibitor ) were more effective in blocking thymocyte death than the in hibitors of caspase - 8 (zIETD) or caspase - 9 (zLEHD) separately . Moreover , infected animals treated with zVAD showed a partial recovery of thymus cellularity , more specifica lly in DN and DP thymocytes . Finally, searching to understand the role of the thymus in the regional immune response of peripheral lymphoid organs in infection , mice were t hy mectomiz e d prior to infection to evaluation of LSC, LM and spleen cellularity. Our data demonstrate d that, even in the absence of the thymus, LSC hypertrophy and LM atrophy were not altered ; however , we found a significant accumulation of T and B lymphocytes in the spleen of infected animals. Conjointl y , our results show that the alterations observed in the epithelial component of the thymus microenvironment, as well as in thymocyte s of infected animals favor the migration and death of thymocyte s and the atrophy of this tissue . Besides that , we demonstr at ed that thymic cells have an immunoregulatory role in the spleen during infection .

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-24. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:18:12Z : No. of bitstreams: 1 000848379.pdf: 743130 bytes, checksum: d77bb064fd18e5841495951287d9ff0f (MD5) / Por objetivos, estudaram-se procedimentos em cultivo celular e se eles alteram a supraorganização da matriz extracelular (MEC) amniótica e da límbica, considerando-se propriedades anisotrópicas dos biopolímeros em comum, isto é, colágenos fibrilares e proteoglicanos. Explantes límbicos de coelhos foram cultivados sobre fragmentos de membrana amniótica (MA) desepitelizada humana, por dois, sete e 15 dias. Fragmentos não cultivados de MA e de limbo foram usados como controles. Avaliaram-se parâmetros de birrefringência em fibras colágenas e de absorção e de dicroísmo linear (LD) em proteoglicanos, da MEC amniótica e da límbica. Todas as análises foram conduzidas em microscópio óptico munido de luz polarizada, filtros monocromadores com diferentes comprimentos de onda e vídeo-câmera. Empregaram-se procedimentos em análise digital de imagens (software Image J®, NIH, USA). Parâmetros de birrefringência revelaram que os graus de paralelismo das fibras colágenas amnióticas foram de 1,02 nos controles, 1,17 nas amostras cultivadas por dois dias, 1,26 nas amostras cultivadas por sete dias e de 1,17 nas amostras cultivadas por 15 dias. Relativamente às fibras límbicas, foram de 1,33, 1,17, 1,25 e 1,44. Os contrastes dos brilhos das birrefringências das fibras amnióticas foram de 2,0 nos controles, 13,25 nas amostras cultivadas por dois dias, 19,26 nas amostras cultivadas por sete dias e de 13,23 nas amostras cultivadas por 15 dias. Relativamente às fibras límbicas, foram de 23,01, 13,39, 19,90 e 30,31. Cores de interferência causadas por dispersão anômala de birrefringência foram detectadas. Procedimentos em cultivo celular alteraram parâmetros absorciométricos relacionados à supraorganização dos proteoglicanos da MEC amniótica e da límbica. As MAs de todas as amostras, exceto as cultivadas por 15 dias, apresentaram-se com valores negativos de DL. Os valores de DL dos limbos de todas as amostras, exceto... / The goal of this study was to evaluate whether procedures on cell culture alter the supraorganization of amniotic and limbal extracellular matrix (ECM). Anisotropic properties of fibrillar collagen and proteoglycans were studied, since they correspond to major extracellular biopolymers. Rabbit limbal explants were cultured on denuded human amniotic membrane (AM) for two, seven, and 15 days. Uncultured AM and limbus were used as controls. Birefringence parameters related to the supraorganization of collagen fibers, and spectral absorption and linear dichroism (LD) related to the supraorganization of proteoglycans were evaluated. All samples were evaluated on microscope equipped with polarized light, monochromatic filters with varying wavelengths, and digital video camera. Birefringence, absorbances and LD were quantified by using image analyses software (Image J®, NIH, USA). Studies on birefringence showed that parallelism degrees of amniotic collagen fibers were of 1.02 for the control group, 1.17 for the two days culture, 1.26 for the seven days culture, and 1.17 for the 15 days culture. In relation to limbal collagen fibers, parallelism degrees were of 1.33, 1.17, 1.25, and 1.44. Birefringence brightness contrasts of amniotic collagen fibers were of 2.0 for the control group, 13.25 for the two days culture, 19.26 for the seven days culture, and 13.23 for the 15 days culture. In relation to limbal collagen fibers, birefringence brightnesses were of 23.01, 13.39, 19.90, and 30.31. Interference colors due to anomalous birefringence dispersion were observed. Procedures on cell culture induced alterations in absorbance values related to proteoglycans from amniotic and limbal ECM. In all samples, except on those cultured for 15 days, the amniotic ECM showed negative DL values. The DL of limbal ECM varied between negative and positive values for all, except on two days culture

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Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-06Bitstream added on 2014-06-13T19:14:39Z : No. of bitstreams: 1 donofrio_fc_me_arafcf.pdf: 611507 bytes, checksum: 2ca5a08dde5671c30f12d9904897bfcb (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A capacidade de Paracoccidioides brasiliensis, agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), de causar doença com manifestações clínicas variadas, depende de seus fatores de virulência, em particular daqueles envolvidos na interação celular. Neste estudo pretendeu-se isolar e caracterizar adesina(s) de P. brasiliensis ligante(s) de fibronectina relacionadas à interação do fungo com células epiteliais de origem pulmonar, comparando amostras de P. brasiliensis, antes (18a) e depois (18b) da passagem em animal, posteriormente cultivadas em meio de Fava Netto e em meio sólido (ágar base) e líquido (BHI) contendo 5% de sangue de carneiro. Os extratos 18a e 18b obtidos dos diferentes meios apresentaram proteínas variando de 106 a 12 kDa. Os extratos da amostra 18a e 18b cultivados em meios sólido e líquido acrescidos de sangue demonstraram maior expressão de algumas proteínas, quando comparado às amostras 18a e 18b cultivadas apenas em meio de Fava Netto. Aparentemente, o uso de meios de cultura acrescidos de sangue é semelhante ao verificado após a passagem em animal. As proteínas com massas moleculares de 54 kDa e pI de 5,6; 58 kDa e pI de 5,9 e 60 kDa com pI de 6,3 foram caracterizadas como adesinas ligantes de fibronectina. Uma delas, a proteína de 54 kDa foi purificada por cromatografia de afinidade e eluída por eletroeluição. O sobrenadante contendo a proteína purificada foi avaliado por eletroforese bidimensional, confirmando a presença da proteína de 54 kDa e pI de 5,6 e seu papel como adesina. Os extratos cell-free dos isolados 113, 339, 2663-R3, 2681, PB01, 1934 de P. brasiliensis... / The capacity of Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), to provoke illnesses with great variety of clinical manifestations depends on its virulence factors, particularly on those involved in the cellular interaction. The present study was designed to isolate and characterize the adhesin fibronectin-binding related to the capacity of this fungus to adhere to the host by comparing P. brasiliensis samples, taken before (18a) and after (18b) animal inoculation and cultured on Fava Netto s medium and on blood base agar solid medium and liquid (BHI) medium with 5% sheep blood. The 18a and 18b extracts, independent of the medium, presented proteins with the molecular weights of 106 and 12 kDa. Extracts from Pb18a and 18b cultured in blood agar solid and liquid (BHI) medium showed higher levels of protein expression than that from samples cultured on Fava Netto. Apparently, the use of the sheep blood in the medium is similar to the animal passage. Ligand affinity binding assays showed that proteins of 54 kDa, pI 5.6; 58 kDa and pI of 5.9 and 60 kDa and pI de 6.3 were evident in all P. brasiliensis cell-free extracts, and all had properties of adhesin fibronectin-binding. A fibronectin-binding protein of 54 kDa was purified by affinity chromatography and by electro elution. The protein purified was evaluated by isoelectric focusing, confirming the presence of protein of 54 kDa and pI of 5.6 and its role as an adhesin. The cell-free extracts from 113, 339, 2663-R3, 2681, PB01, 1934 P. brasiliensis isolates, also showed the expression of 54 kDa protein, and it was more evident in 113 and 339 isolates. Our experiments... (Complete abstract click electronic access below)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In the present study, chick embryos, non treated and treated with busulfan during the period from 1 to 6 days of incubation (stages 5 to 30) were used. These embryos were transversally sectioned in different levels, according to migratory pathway of primordial germ cells. The sections were then stained: 1. by Haematoxilin and Eosin for morphological observation; 2. by Periodic Acid Schiff, for the study of interactive glycoproteins and identification of primordial germ cells; sulfated and non sulfated glycosaminoglycans were observed by Alcian Blue (pH 2,5 and pH 1,0, respectively)and collagen was observed by Sirius Red Technique. Migration of primordial germ cells has a continuous flux. The route begins in germinal crescent, passes into the blood vessels and then reaches the interstitium destined to the developing gonads, where primordial germ cells colonize. Along the route, it was noted that interactive glycoproteins reduce right after the beginning of the intersticial migration phase. The same happens with sulfated glycosaminoglycans, that it could be related to a mechanism of compensation on the cell migration. On the other hand, in busulfan treated embryos, the amount of sulfated glycosaminoglycans (supposed to be hialuronic acid) increases, and, also, compensates the migration. Atrophic gonads were seen in busulfan treated embryos. The quantity of collagen was not modified along the route. These results suggest that extracellular matrix compounds participate actively by modulating the migration of primordial germ cells. / O presente estudo constitui a realização de cortes histológicos em embriões de Gallus gallus domesticus L. não tratados e tratados com busulfan, durante o período de 1 a 6 dias (estádios 5 a 30 de HAMBURGER & HAMILTON, 1951) de incubação. Nestes embriões, foram realizados cortes transversais, em diferentes níveis, dependendo da rota migratória das células germinativas primordiais. Tais cortes foram corados pela Hematoxilina e Eosina-floxina para estudos morfológicos; pelo método do ácido periódico-reativo de Schiff para a marcação das células germinativas primordiais e o estudo das glicoproteínas interativas; pelo método do Alcian Blue para observar glicosaminoglicanas sulfatadas e não sulfatadas e pelo Picrosirius para observar o colágeno em embriões tratados e não tratados com busulfan. Observou-se que as células germinativas primordiais seguem um fluxo contínuo na sua rota migratória do estádio 5 a 30 de HAMBURGER & HAMILTON, 1951. A rota inicia-se no crescente germinativo, passa pelos vasos sanguíneos e posteriormente pelo interstício para, por fim, colonizar o esboço gonadal. Ao longo da rota migratória notou-se que as glicoproteínas interativas diminuem logo após o início da fase intersticial de migração, o mesmo acontecendo com as glicosaminoglicanas sulfatadas, o que pôde ser interpretado como um mecanismo compensatório na velocidade de migração das células. Já nos embriões tratados com busulfan, embora as glicoproteínas interativas tenham diminuído em tal etapa, a quantidade suposta de ácido hialurônico aumentada, também compensa a velocidade de migração. As gônadas, frente ao busulfan, mostraram-se atrofiadas. A quantidade de colágeno permaneceu inalterada em toda a rota migratória com ou sem o tratamento com o busulfan. Estes resultados sugerem uma participação ativa de componentes da matriz extracelular como moduladores da migração das células germinativas primordiais ao longo do seu trajeto migratório.

Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Gil Benardi / Banca: Cleni Mara Marzocchi Machado / Resumo: A capacidade de Paracoccidioides brasiliensis, agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), de causar doença com manifestações clínicas variadas, depende de seus fatores de virulência, em particular daqueles envolvidos na interação celular. Neste estudo pretendeu-se isolar e caracterizar adesina(s) de P. brasiliensis ligante(s) de fibronectina relacionadas à interação do fungo com células epiteliais de origem pulmonar, comparando amostras de P. brasiliensis, antes (18a) e depois (18b) da passagem em animal, posteriormente cultivadas em meio de Fava Netto e em meio sólido (ágar base) e líquido (BHI) contendo 5% de sangue de carneiro. Os extratos 18a e 18b obtidos dos diferentes meios apresentaram proteínas variando de 106 a 12 kDa. Os extratos da amostra 18a e 18b cultivados em meios sólido e líquido acrescidos de sangue demonstraram maior expressão de algumas proteínas, quando comparado às amostras 18a e 18b cultivadas apenas em meio de Fava Netto. Aparentemente, o uso de meios de cultura acrescidos de sangue é semelhante ao verificado após a passagem em animal. As proteínas com massas moleculares de 54 kDa e pI de 5,6; 58 kDa e pI de 5,9 e 60 kDa com pI de 6,3 foram caracterizadas como adesinas ligantes de fibronectina. Uma delas, a proteína de 54 kDa foi purificada por cromatografia de afinidade e eluída por eletroeluição. O sobrenadante contendo a proteína purificada foi avaliado por eletroforese bidimensional, confirmando a presença da proteína de 54 kDa e pI de 5,6 e seu papel como adesina. Os extratos cell-free dos isolados 113, 339, 2663-R3, 2681, PB01, 1934 de P. brasiliensis... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The capacity of Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), to provoke illnesses with great variety of clinical manifestations depends on its virulence factors, particularly on those involved in the cellular interaction. The present study was designed to isolate and characterize the adhesin fibronectin-binding related to the capacity of this fungus to adhere to the host by comparing P. brasiliensis samples, taken before (18a) and after (18b) animal inoculation and cultured on Fava Netto’s medium and on blood base agar solid medium and liquid (BHI) medium with 5% sheep blood. The 18a and 18b extracts, independent of the medium, presented proteins with the molecular weights of 106 and 12 kDa. Extracts from Pb18a and 18b cultured in blood agar solid and liquid (BHI) medium showed higher levels of protein expression than that from samples cultured on Fava Netto. Apparently, the use of the sheep blood in the medium is similar to the animal passage. Ligand affinity binding assays showed that proteins of 54 kDa, pI 5.6; 58 kDa and pI of 5.9 and 60 kDa and pI de 6.3 were evident in all P. brasiliensis cell-free extracts, and all had properties of adhesin fibronectin-binding. A fibronectin-binding protein of 54 kDa was purified by affinity chromatography and by electro elution. The protein purified was evaluated by isoelectric focusing, confirming the presence of protein of 54 kDa and pI of 5.6 and its role as an adhesin. The cell-free extracts from 113, 339, 2663-R3, 2681, PB01, 1934 P. brasiliensis isolates, also showed the expression of 54 kDa protein, and it was more evident in 113 and 339 isolates. Our experiments... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

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