Wolbachia pipientis é uma alfa-protobactéria intracelular obrigatória, endossimbionte de artrópodes e nematódeos que é herdada por via materna ao longo das gerações. A presença desta bactéria nos tecidos germinativos pode provocar nos hospedeiros alterações fenotípicas reprodutivas, como partenogênese, feminização genética de machos, morte de machos, incompatibilidade citoplasmática (IC) e alterações de fitness. Alguns mecanismos moleculares dessas alterações baseiam-se na modulação da expressão gênica do hospedeiro, ou seja, a bactéria pode suprimir ou estimular genes de forma a produzir ambiência favorável à manutenção da endossimbiose. Devido a esse potencial manipulador, Wolbachia tem sido testada como \"ferramenta\" para controle populacional de insetos vetores de patógenos. O mosquito Culex quinquefasciatus, naturalmente infectado por Wolbachia na região Neotropical, é um importante vetor de diversos patógenos que atingem humanos e animais. A presença da bactéria causa IC e altera o fitness no mosquito, mediante alterações temporais na ovogênese, fecundidade e fertilidade reprodutivas. Sabe-se que a presença da Wolbachia altera a expressão do gene grauzone e há fortes indícios de que esta expressão diferencial induza à IC em Cx. quinquefasciatus. Sabe-se também que este gene possui duas cópias parálogas em Cx. quinquefasciatus, porém estudos observaram a relevância de apenas um parálogo como importante regulador dos ciclos celulares da ovogênese e espermatogênese. No entanto, as bases genéticas dos fenótipos IC e \"fitness alterado\" do modelo Wolbachia-Cx. quinquefasciatus Neotropical ainda permanecem desconhecidas. Objetivamos inicialmente neste modelo quantificar e silenciar a expressão do gene grauzone (ambos parálogos) para suportar a hipótese pré-existente de que a superexpressão deste gene em mosquitos infectados por Wolbachia causa as alterações fenotípicas reprodutivas. Durante o desenvolvimento do projeto houve intercorrências que alteraram o rumo do trabalho: a necessidade de substituição da colônia experimental de mosquitos devido a baixas demográficas e à alta variabilidade intraespecífica do gene grauzone. Frente às intercorrências, formulamos como neo-objetivo a comparação filogenética entre as variantes do gene grauzone. Detectamos também variabilidade em um dos parálogos e concluímos que as cópias parálogas do gene encerram proteínas estruturalmente distintas e talvez funcionalmente distintas no tocante à alteração reprodutiva (IC) causada pela presença da Wolbachia. Foi possível observar que fêmeas infectadas apresentam amplificações de grauzone mais intensas quando comparadas com fêmeas não-infectadas no 4° dia de emergência, corroborando dados da literatura. Em conjunto, esses achados indicam que é promissora a continuidade do estudo do papel de grauzone na IC, mas demonstra também que este gene é mais complexo do que se imaginava, o que demandará maior esforço investigativo. A expectativa de uso futuro de Wolbachia como controlador biológico de mosquitos-vetores poderá se beneficiar de estudos como aqui proposto. / Wolbachia pipientis is an obligate intracellular alpha-protobacterium, endosymbiont of arthropods and nematodes, which is inherited through maternal route over generations. The presence of this bacterium in germinative tissues can cause reproductive phenotypic alterations in the hosts, such as parthenogenesis, genetic feminization of males, death of males, cytoplasmic incompatibility (CI) and fitness changes. Some molecular mechanisms of these alterations are based on the modulation of gene expression of the host, that is, the bacterium can suppress or stimulate genes in order to produce favorable environment for the maintenance of the endosymbiosis. Due to this potential manipulator, Wolbachia has been tested as a \"tool\" for population control of pathogen vector insects. The mosquito Culex quinquefasciatus, naturally infected by Wolbachia in the Neotropical region, is an important vector of several pathogens that affect humans and animals. The presence of the bacteria causes CI and changes the fitness in the mosquito, through temporal changes in ovogenesis, reproductive fertility and fertility. The presence of Wolbachia is known to alter the expression of the grauzone gene and there are strong indications that this differential expression induces the CI in Cx. quinquefasciatus. It is known that this gene occurs with two paralogs copies in Cx. quinquefasciatus, but studies have observed the relevance of only one paralog as important regulator of oogenesis and spermatogenesis cell cycles. However, the genetic basis of the phenotypes \"changed fitness\" and CI of Wolbachia-Cx quinquefasciatus Neotropical model remain unknown. We initially aimed at quantifying and knockdown of grauzone gene (both paralogs) to support the preexisting hypothesis that overexpression of this gene in Wolbachia-infected mosquitoes causes reproductive phenotypic changes. During the development of the project there were intercurrences that altered the course of work: the need to replace mosquito populations due to demographic lows and the high intraspecific variability of grauzone gene. In view of the intercurrences we formulated the neo-objective phylogenetic comparison between the variants of the grauzone gene. We also detected variability in one of the paralogs and concluded that the paralogs copies of the gene contain structurally distinct and perhaps functionally distinct proteins with respect to the reproductive alteration (CI) caused by the presence of Wolbachia. It was possible to observe that infected females show more intense grauzone amplifications when compared to uninfected females on the 4th day of emergence, corroborating data from the literature. Taken together, these findings indicate that the continuity of the study of the role of grauzone in CI is promising, but also demonstrates that this gene is more complex than previously thought, which will require more investigative effort. The expectation of future use of Wolbachia as a biological control of mosquito-vectors may benefit from studies as proposed here.

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico gerado pela atividade da enzima óxido nítrico sintase (NOS) a qual foi detectada em vários órgãos incluído o sistema reprodutor. O sistema NOS/NO parece desempenhar papel importante na maturação oocitária entre outras funções. No entanto, apesar das evidências, há poucos estudos sobre o papel desse sistema em oócitos da espécie bovina. Sabe-se que o NO atua pela via da guanilato ciclase (GC) estimulando a produção do nucleotídeo GMPc, que por sua vez é capaz de influenciar os níveis de outro nucleotídeo, o AMPc, que é um importante elemento da via de sinalização das gonadotrofinas nos oócitos e no controle da maturação oocitária. O objetivo do presente estudo foi de investigar o envolvimento da via do GMPc na ação do sistema NOS/NO na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos e seu efeito sobre a via do AMPc. Com a maior concentração estudada do doador de NO (10-7M de SNAP), apenas 36% dos oócitos conseguiram alcançar o estágio de RVG (P< 0,05), após 9 horas de maturação. Esse atraso também foi observado com diferentes concentrações do estimulador de GC (5, 10 ou 50&mu;M de Proptoporfirina IX) e pelo análogo de GMPc (1, 2 e 4mM de 8-Br-GMPc ), que apresentaram uma taxa média de RVG de 50% para os tratamentos e 70% para os grupos controles sem as drogas (P<0,05). No início da maturação (0h), os níveis de GMPc foram de 5,29 pmol/oócito sofrendo uma queda logo na primeira hora de cultivo para 2,97 pmol nos oócitos do grupo controle e 1,54 pmol nos cultivados com associação de 10-7M de SNAP (doador de NO) e 100&mu;M de OQD (inibidor de GC (P<0,05). No grupo de oócitos cultivados apenas com SNAP, os níveis de GMPc se mantiveram em 4,51 pmol/oócito, semelhante ao grupo imaturo (0h de cultivo, P>0,05). O doador de NO manteve estável o nível de GMPc somente na primeira hora de maturação. Após 3 e 6 h de MIV, os níveis de GMPc permaneceram baixos e similares (0,07 a 2,46 pmol/oócito, P>0,05) nos grupos controle (sem drogas), tratado com doador de NO (10-7M de SNAP) associado ou não ao inibidor de guanilato ciclase (100&mu;M de OQD). Também foi observada uma queda nos níveis de AMPc em relação ao grupo imaturo (32,42 fmol de AMPc/oócito) para os demais grupos (P<0,05), que apresentaram aproximadamente, 12,0 a 16,0 fmol de AMPc/oócito durante a primeira hora, 3,3 a 8,0 fmol/oócito durante a terceira hora e 7,4 a 18,3 durante a sexta hora de maturação (P>0,05). O NO afetou os níveis de GMPc no início da maturação, mas não os níveis de AMPc. O NO e o GMPc podem atuar no controle da expressão gênica de uma série de proteínas envolvidas no controles dos níveis de AMPc e GMPc ou suas funções. Esse controle pode ser efeito direto do NO (PKG2, PDE3A, PDE4D e PDE8A), do GMPc (ADCY6) ou do NO via GMPc (PKA1) e varia com o compartimento considerado (oócito ou células do cumulus). Esses resultados demonstraram a inter-relação das vias NO/GMPc/AMPc e toda a sua complexidade dependendo do tipo celular e da fase da maturação de oócitos bovinos. / The NOS/NO system seems to play an important role in oocyte maturation besides other functions. However, despite the evidence, there are few studies on the possible role of this system in bovine oocytes. It is known that NO acts via guanylate cyclase (GC) by stimulating the production of the nucleotide cGMP, which in turn can influence the levels of another nucleotide, cAMP, which is an important element of the signaling pathway of gonadotropins in oocytes and in the control of oocyte maturation. The aim of the present study was to investigate the involvement of the cGMP pathway in the action of the NOS/NO system on the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes and its effect on the cAMP pathway. The highest studied concentration of the NO donor (10-7M SNAP), only 36% of oocytes were able to undergo GVBD (P<0.05) after 9 hours of maturation. This delay was also observed with different concentrations of the GC stimulator (5, 10 or 50&mu;M Proptoporfirin IX) and the cGMP analogue (1, 2 and 4 mM 8-Br-cGMP), which had an average of 50% GVBD for treatment groups and 70% for control groups without drugs (P<0.05). At the beginning of maturation (0 h) cGMP levels were 5.29 pmol/oocyte and decreased within the first hour of culture to 2.97 pmol and 1.54 pmol in the control group and in oocytes cultured in 10-7M SNAP (NO donor) associated with 100&mu;M OQD (GC inhibitor; P<0.05). In the group of oocytes cultured only with SNAP, cGMP levels remained at 4.51 pmol/oocyte similar to the immature group (0 h culture, P> 0.05). The increase of NO maintained cGMP levels stable only during the first hours of maturation. After 3 and 6 h IVM, cGMP levels remained low and similar (0.01 to 2.5 pmol/ ocyte, P>0.05) in control (without drugs), treated with NO donor (SNAP 10-7M) with or without the guanylate cyclase inhibitor (100&mu;M OQD). A decrease in cAMP levels was also observed when compared with the immature group (32.42 fmol cAMP/oocyte) for the other groups (P <0.05), which showed 12.0 to 16.0 fmol cAMP/oocyte after the first hour, 3.3 to 8.0 fmol/oocyte after the third hour and 7.4 to 18.3 after the sixth hour of IVM (P>0.05). NO and cGMP may act to control gene expression in a series of proteins involved in control of the levels of cAMP and cGMP or their functions. The control may be a direct effect of NO (PKG2, PDE3, PDE4D and PDE8A), cGMP (ADCY6) or NO via cGMP (PKA1) and varies with the compartment considered (oocyte or cumulus cells). The results showed the interrelationship of the NO/cGMP/cAMP pathway and all its complexity depending on the cell type and the stage of maturation in bovine oocytes.

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maelin da Silva.pdf: 4148919 bytes, checksum: c40d33739dbca2809bfaa5126daa2f6d (MD5) Previous issue date: 2010-03-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The order Gymnotiformes ranges the electrical fish. It’s distributed by South and Central America. Family Gymnotidae show two genus; Gymnotus and Eletrophurus, the last one was recently included in this family. Genus Gymnotus is the most widespread and show 33 species and present great number of cytogenetics studies. Our objectives in the present study were analyse the meiotic behaviour of multiple sexual chromosomes system X1X1X2X2/X1X2Y of G. pantanal, isolate sequences of repetitive DNA from three species of Gymnotus; G. sylvius, G. paraguensis and G. pantanal, inhabiting in simpatry at Piquiri River - PR – BR, verify the association of these sequences with sexual chromosomes and mapping the rDNA 5S gene at G. paraguensis and G. pantanal. Meiotic analysis of G. pantanal presented one trivalent in pachytene of profase I formed by X1, X2 and Y chromosomes, totally paired characterizing a recent sexual chromosomes system. In the metaphase II was visualized cells 18+Y and 18+X1X2 chromosomes with normal disjunction of sexual chromosomes and balanced gametes. The mapping of repetitive DNA sequences, isolated by Cot1, presented location in centromeric and Nucleor Organization Regions (NORs) of all analyzed species, included the sexual chromosomes of G. pantanal, standard similar of heterocromatin obtained by C banding. Hybridization with rDNA 5S probes presented a standard unique for all species analyzed. Our data suggest a recent origin for sex chromosomes of G. pantanal and a differentiate evolutionary dynamic for the distribution of rDNA 5S in the karyotype of species analyzed, suggesting that character can be broadly utilized among the Gyminotidae as cytotaxonomic marker. / A ordem Gymnotiformes compreende os peixes elétricos, que estão amplamente distribuídos pelas Américas Central e do Sul. A família Gymnotidae possui apenas dois gêneros Gymnotus e Eletrophurus, sendo que este último foi recentemente incluído à família. O gênero Gymnotus é o mais especioso da ordem com 33 espécies, e é também o que comporta maior número de estudos citogenéticos. O presente trabalho teve por objetivos analisar o comportamento meiótico do sistema de cromossomos sexuais múltiplo X1X1X2X2/X1X2Y em G. pantanal. Isolar sequências de DNA repetitivo das três espécies que habitam em simpatria o rio Piquiri – Paraná – Brasil: G. sylvius, G. paraguensis e G. pantanal, e neste último a possível associação dessas sequências aos cromossomos sexuais. E mapear o DNAr 5S em G. paraguensis e G. pantanal. A Análise meiótica revelou a formação de um trivalente no estágio de paquíteno da Prófase I em G. pantanal formado pelos cromossomos X1, X2 e Y, pareados complementarmente caracterizando um sistema de determinação sexual recente. A metáfase II apresentou células com 18+Y e 18+X1X2 cromossomos, caracterizando uma disjunção típica dos cromossomos sexuais, dando origem a gametas balanceados. O mapeamento de sequências de DNA repetitivos isolados por C0t – 1 apresentou localização em região centromérica e na região das regiões organizadoras de nucléolos de todas as espécies analisadas, inclusive nos cromossomos sexuais de G. pantanal, padrão coincidente com blocos heterocromáticos. A hibridização com sondas de DNAr 5S revelou padrão de marcação próprio em todas as espécies analisadas. Nossos dados sugerem uma origem recente para os cromossomos sexuais de G. pantanal e uma dinâmica evolutiva diferenciada para distribuição do DNAr 5S no cariótipo das espécies analisadas. Sugerindo que este caráter possa ser mais amplamente utilizado entre os Gymnotidae como marcador citotaxonômico.

Orientador: Eliana Morielle-Versute / Banca: Shirlei Maria Recco-Pimentel / Banca: Cleida Aparecida de Oliveira / Banca: Carlos Alberto Vicentini / Banca: Isabel Cristina Cherici Camargo / Resumo: Embora o processo de reprodução tenha sido objeto de estudo em muitos mamíferos, relativamente pouca atenção tem sido dada a esse estudo em morcegos, apesar dessa ser uma grande e diversa classe de organismos, que apresenta diferentes estratégias reprodutivas para ajustar esses animais às várias condições ecológicas e comportamentais as quais estão submetidos. Da mesma forma, em geral todas as observações sobre o ciclo nucleolar foram feitas a partir da análise de células mitóticas. Assim, o intuito do presente estudo foi analisar características reprodutivas e do ciclo nucleolar meiótico de espécies de morcegos Neotropicais. No epitélio seminífero, três tipos de espermatogônias foram reconhecidos: Ad, Ap e B. Essas após entrarem em meiose, passam por duas divisões celulares e formam espermátides haplóides, que sofrem diferenciação, compactando seu DNA, alongando seu núcleo e formando o flagelo e acrossomo, num processo que, em microscopia eletrônica de transmissão, pode ser dividido em doze fases. Observamos que o processo de espermiogênese ocorre de forma semelhante em Platyrrhinus lineatus, Molossus molossus e Myotis nigricans e que os espermatozóides de P. lineatus e M. molossus apresentam semelhanças, como o formato mais alongado da cabeça, a presença do perforatorium e espessamentos nas fibras densas externas 1, 5 e 6. Por outro lado, M. nigricans apresenta a ausência de perforatorium e espessamentos nas fibras axilares 1, 5, 6 e 9. Comparando os padrões reprodutivos de Artibeus planirostris e M. nigricans, observamos que, apesar de ambos serem espécies Neotropicais, eles diferem acentuadamente em sua reprodução. Artibeus planirostris apresenta um perfil de espermatogênese ativo durante todo o ano, possivelmente apresentando um padrão poliéstrico... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Although the process of reproduction has been studied in many mammals, relatively little attention has been given to this study in bats, this large and diverse order of organisms, which presents different reproductive strategies to adjust the animals to various environmental conditions and behaviors that they are inserted. Likewise, in general all studies on the nucleolar cycle were made based on the analysis of mitotic cells. Thus, the purpose of this study was to analyze the reproductive characteristics and the nucleolar meiotic cycle of Neotropical bat species. In the seminiferous epithelium, three types of spermatogonia were recognized: Ad, Ap and B. These, after enter in meiosis, undergo two cell divisions to form haploid spermatids, which undergo differentiation, compressing their DNA, stretching its nucleus and forming the acrosome and flagellum, a process that, in transmission electron microscopy, can be divided into twelve stages. We note that the process of spermiogenesis occured similarly in Platyrrhinus lineatus, Molossus molossus and Myotis nigricans and that the spermatozoon of P. lineatus and M. molossus have similarities, as the more elongated shape of the head, the presence of perforatorium and thickening in the outer dense fibers 1, 5 and 6. On the other hand, M. nigricans did not present the perforatorium and the thickening was presented in the fibers 1, 5, 6 and 9. Comparing the reproductive patterns of Artibeus planirostris and M. nigricans, we observed that, although both are Neotropical species, they differ markedly in their reproduction. Artibeus planirostris presents an active pattern of spermatogenesis throughout the year, possibly exhibiting a polyestral bimodal pattern, with two pronounced peaks of spermatogenic production, one in September and another in February. On the other... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by (ana.araujo@ufrpe.br) on 2017-02-17T16:39:46Z No. of bitstreams: 1 Kaliny Veiga Pessoa da Silva.pdf: 1359915 bytes, checksum: de61e5532d3cfedb773fa796979687fb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-17T16:39:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kaliny Veiga Pessoa da Silva.pdf: 1359915 bytes, checksum: de61e5532d3cfedb773fa796979687fb (MD5) Previous issue date: 2011-02-17 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The Manihot genus belongs to Euphorbiaceae family, has about 98 species and native to tropical regions of the Americas, with greatest diversity center in Brazil, with 80% of Manihot species, showing a large vegetative polymorphism and a potential source for cassava breeding programs. Cassava (Manihot esculenta Crantz) is the only commercially cultivated species, with the shoots and the tuber roots used for both human food and animal feed. Cassava roots are also used in the manufacture of flour or in the composition of other products. Karyotypic analysis in mitotic or meiotic cells concerning to chromosomal homology, numerical and structural variations, polyploidy and evolution mechanisms of the karyotypes can provide useful information for breeding programs aimed at achieving improved cultivars. In addition, a karyotype study in many cases contributes to the increase cytogenetic markers that while certain aspects related to horticultural assist in the cultivars characterization. Manihot species are considered allotetraploid, with 2n=36 chromosome and x=9 as basic number. Natural interspecific crosses can be found frequently, making in some cases infertile hybrids. Infertility is not easily detected using phenotypic analysis. However, it is believed that these species undergone diploidization process along the evolution, now showing a meiotic behavior of a diploid. This work aimed the mitotic and meiotic analysis in nine species of the genus Manihot in order to confirm the karyotypic stability described at literature data. Three varieties of cassava and eight wild species were analised. The analysis revealed strong mitotic stability among species regarding the number and chromosome morphology, average size of chromosomes of 1.75 and maximum of two pairs of satellites. The meiosis was regular in wild species and irregular in varieties of M. esculenta 'manipeba', showing univalent, bivalent and trivalent at metaphase-anaphase I, showing typical behavior of a triploid and partly irregular meiosis in 'pornunça', producing polyads in microsporogenesis. An additional study was performed with molecular marker ISSR (Inter simple sequence repeat). Polymorphism was observed in 89.7% among the locus of the species, but as expected, there was a great genetic similarity between varieties of M. esculenta cultivated for the wild species. / O gênero Manihot pertence a família Euphorbiaceae, possui cerca de 98 espécies e é nativo das regiões tropicais das Américas, apresentando um grande centro de diversidade genética no Brasil. Cerca de 80% das espécies de Manihot ocorrem no país, exibindo amplo polimorfismo vegetativo e reunindo potencial para utilização em programas de melhoramento genético do gênero. A mandioca (M. esculenta Crantz) é a única espécie comercialmente cultivada, e dela se aproveita tanto a parte aérea como suas raízes reserva para consumo humano e animal, sendo utilizada na fabricação de farinha ou como parte da composição de diversos outros produtos e subprodutos. Análise cariotípica em células mitóticas ou meióticas em relação a homologia cromossômica, variações numéricas e estruturais, poliploidia e mecanismos evolutivos dos cariótipos podem fornecer informações úteis aos programas de melhoramento que visam a obtenção de cultivares melhoradas. Além disso, um estudo cariotípico em muitos casos contribui para o aumento no número de marcadores citológicos que quando relacionados a determinados aspectos horticulturais auxiliam na caracterização de cultivares. As espécies de Manihot são consideradas alotetraplóides, com 2n=36 e um número básico x=9. Cruzamentos interespecíficos naturais podem ocorrer com certa freqüência produzindo híbridos férteis ou não e, que, nos casos de infertilidade, essa característica pode não ser facilmente detectada por análise fenotípica. No entanto, acredita-se que estas espécies sofreram processo de diploidização ao longo da evolução, apresentando hoje um comportamento meiótico típico de diplóide. Este trabalho realizou a análise mitótica e meiótica em nove espécies do gênero Manihot, a fim de confirmar a estabilidade cariotípica descrita na literatura. Para isso, três variedades de mandioca e oito espécies silvestres foram analisadas. O estudo revelou uma forte estabilidade do cariótipo mitótico entre as espécies quanto ao número e morfologia cromossômica, o tamanho médio dos cromossomos de 1,75 e máximo de dois pares de satélites. A meiose foi regular em espécies selvagens e irregular em variedades de 'manipeba‟ M. esculenta, mostrando univalentes, bivalentes e trivalentes na metáfase, anáfase I, mostrando o comportamento típico de uma meiose triplóides e parcialmente irregular em ' pornunça", produzindo políades na microsporogênese. Adicionalmente foi realizado um estudo molecular com marcador ISSR (Simples sequência interna). Foram observados polimorfismos da ordem de 89,7% entre os lócus das espécies estudadas mostrando uma ampla variabilidade genética entre as espécies do gênero que podem ser fontes importantes de genes a serem empregados em programas de melhoramento da espécie cultivada. Entretanto, como esperado, houve uma grande similaridade genética entre as variedades da espécie M. esculenta em relação as espécies silvestres.

Orientador: Doralice Maria Cella / Banca: Kátia Cristina Machado Pellegrino / Banca: Douglas de Araujo / Resumo: Das subfamílias de Chrysomelidae, Cassidinae sensu lato (s.l.), formada por 6.000 espécies e 43 tribos, possui aproximadamente 100 espécies analisadas citogeneticamente e a maioria delas apresentou 2n=18=16+Xyp, o qual é menor que aquele considerado basal para os Polyphaga, 2n=20=18+Xyp. No entanto, alguns grupos de espécies demonstraram manutenção do número diplóide basal e outros, aumento desse número; algumas espécies do último grupo também exibiram variação em relação ao tipo de sistema cromossômico sexual (SCS). Considerando a revisão taxonômica recentemente realizada para as espécies de Cassidinae s.l., a existência de relação filogenética para algumas espécies dessa subfamília, a alta diversidade de espécies desse grupo registrada para a região Neotropical e o baixo número de espécies que tiveram seus cromossomos estudados, o presente trabalho teve como objetivo verificar os mecanismos envolvidos na evolução cariotípica dessa subfamília através do estudo de sete espécies da fauna brasileira e da revisão dos dados citogenéticos. Os espécimes foram coletados em Avaré e Rio Claro, SP, Nonoai, RS, e Ponta Grossa, PR. As preparações cromossômicas obtidas de embrião e testículos de machos adultos foram coradas com solução de Giemsa. As espécies Agroiconota inedita (2n=42=40+Xyp), Charidotella (sensu stricto) immaculata (2n=22=20+Xyp), Charidotella (sensu stricto) sexpunctata (2n=22=20+Xyp), e Stolas chalybaea (2n=24=22+Xyp) revelaram número diplóide maior do que aquele estabelecido como basal para os Polyphaga e cromossomos com dois braços. Os cariótipos de Cteisella confusa, Deloyala cruciata, e Metriona elatior mostraram a fórmula cromossômica 2n=18=16+Xyp, considerada modal para os Cassidinae s.l., e cromossomos com dois braços. As sete espécies apresentaram cromossomos sexuais facilmente identificáveis por serem... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Among the subfamilies of Chrysomelidae, Cassidinae sensu lato (s.l.) , formed by 6 000 species and 43 tribes, possesses approximately 100 species cytogenetically analyzed and most of them presented 2n=18=16+Xyp, which was smaller than 2n=20=18+Xyp considered basal for Polyphaga. However, some groups of species presented maintenance of the basal diploid number and others showed increase of this number; certain species of the latter group also exhibited variation in the sex chromosome system (SCS). Considering the recent taxonomic revision accomplished for the Cassidinae s.l. species, the existence of phylogenetic relationship for some species of this subfamily, the high diversity of species of this group in the Neotropical region, and the low number of Cassidinae s.l. species karyotyped so far, the aim of the present work was to verify the main mechanisms involved in the karyotype evolution of this subfamily through the study of seven species of the Brazilian fauna and the overview of the cytogenetic data. The individuals were collected in Avare and Rio Claro, SP, Nonoai, RS, and Ponta Grossa, PRo The chromosomal preparations obtained from embryo and testes of adult males were stained with Giemsa solution. The species Agroiconota inedita (2n=42=40+Xyp), Charidotella (sensu stricto) immaculata (2n=22=20+Xyp), Charidotella (sensu stricto) sexpunctata (2n=22=20+Xyp), and Stolas chalybaea (2n=24=22+Xyp) revealed diploid number higher than that established as basal for Polyphaga and biarmed chromosomes. The karyotype of Gteisella confusa, Deloyala cruciata, and Metriona elatior showed the chromosomal formulae 2n=18=16+Xyp considered modal for Cassidinae s.l. and biarmed chromosome. The seven species exhibited easily identified sex chromosomes due to their smallest size in the complement. The analysis of meiotic cells of all the species showed pachytenes with a positively heteropycnotic block... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Introdução: O fuso meiótico dos oócitos de mamíferos pode se despolimerizar quando exposto a pequenas variações de temperatura. Este fato já está bem estabelecido e estudado em oócitos maduros em metáfase II (MII). No entanto, pouco se sabe a respeito da influência da diminuição da temperatura sobre o fuso meiótico dos oócitos imaturos. Desse modo, este estudo tem como objetivos: 1) avaliar a influência da diminuição da temperatura sobre o fuso meiótico de oócitos de camundongas maturados in vitro e 2) avaliar o fuso meiótico em oócitos humanos maturados in vitro submetidos à criopreservação pela técnica de congelação lenta ou por vitrificação quando em estágio de vesícula germinativa. Métodos: Realizaram-se dois experimentos, denominados 1 e 2, sendo o primeiro em oócitos de camundongas e o segundo em oócitos humanos. No experimento 1 oócitos imaturos de camundongas nos estágios de metáfase I (MI), telófase I(TI) e MII foram cultivados nas seguintes temperaturas: 37º C (controle), temperatura ambiente (22oC) e 4º C por 0, 10, 30 e 60 minutos. Após este período de tempo o fuso meiótico oocitário foi avaliado por meio de microscopia de luz polarizada (MLP) (LC-Polscope-Oosight image software) e imunocitoquímica (IC). No experimento 2 oócitos em estágio de vesícula germinativa (GV) coletados de pacientes submetidas à indução da ovulação e fertilização in vitro, foram divididos de forma randômica em três grupos: oócitos a fresco (A), oócitos congelados pela técnica de congelação lenta (B) e oócitos congelados pela técnica de vitrificação (C). Os oócitos a fresco, os descongelados e os aquecidos foram maturados in vitro até estágio de (MII). A análise do fuso meiótico foi realizada por microscópio invertido equipado com uma câmera de vídeo analógica e um sistema de imagens que combina luz polarizada em cristal líquido (ICSI Guard Octax). Resultados: Experimento 1: No tempo 0 e à 37º C, todos os oócitos apresentavam o fuso meiótico visível tanto pela MLP quanto pela IC. À 4º C, o número de oócitos em MI com fuso meiótico visível por meio da MLP foi menor do que com a IC, e descresceu com o tempo, fato que também ocorreu, em menor proporção, com os oócitos em TI. No entanto, a 4º C, o reconhecimento do fuso meiótico dos oócitos em TI foi semelhante tanto para MLP como para IC. Quando os oócitos MII foram expostos à 4º C, a detecção do fuso meiótico teve descréscimo diretamente proporcional ao tempo de cultura quando foi utilizada a MLP, sendo que o mesmo ocorreu para a IC, porém de forma menos pronunciada. À temperatura ambiente houve um pequeno descéscimo na visualização do fuso meiótico tanto por MLP quanto por IC, porém este não foi estatisticamente significativo para os oócitos em TI. Experimento 2: A taxa de sobrevivência imediatamente após o descongelamento/ aquecimento foi de 44,6% para o grupo B e de 79% para o grupo C. Após 24 horas em cultura , estas taxas passaram para 29,2% e 69%, respectivamente. A mediana de tempo para maturação foi de 26 horas para os grupos A e C, e de 27 horas para o grupo B. Ao final da maturação in vitro a porcentagem de oócitos em MII foi menor no grupo B e semelhante nos grupos A e C. Assim como para a detecção do fuso meiótico que foi menor no grupo B e similar nos grupos A e C. Conclusões: Houve diferença na porcentagem de despolimerização do fuso meiótico em resposta à baixa temperatura entre os oócitos de camundongas nos diferentes estágios da divisão meiótica, sendo menor nos oócitos em TI. A porcentagem de despolimerização do fuso meiótico foi diretamente proporcional ao tempo de cultivo, à exceção dos oócitos em TI à temperatura ambiente. Os oócitos hmanos em GV vitrificados apresentaram melhores taxas de sobrevivência quando comparados com oócitos humanos em GV criopreservados pelo congelamento lento. Os oócitos humanos em GV vitrificados apresentaram taxas semelhantes de maturação in vitro e detecção do fuso meiótico polimerizado quando comparados a oócitos a fresco / Introduction: The meiotic spindle of most mammals is sensitive to cooling and depolymerizes even after a slight reduction in temperature. This is well described and studied on matured oocytes at metaphase II (MII). However, little is known about the influence of low temperatures under meiotic spindle of imature oocytes. In this way, we sougth to evaluate: 1) the influence of low temperatures on mice oocyte meiotic spindle matured in vitro e 2) the oocyte meiotic spindle from human oocytes matured in vitro and cryopreserved by slow-rate freezing or vitrification at GV stage. Methods: Two experiments were done: the first one on mice and the second one on women.At experiment 1, immature mice oocytes at metaphase I (MI), telophase I (TI) and MII were cultured at 37º C (control), room temperature (22oC) and 4º C for 0, 10, 30 and 60 minutes and then spindle analysis was made with polarized light microscopy (PLM) (LC-Polscope-Oosight image software) or immunocytochemistry (ICC). At experiment 2, GV oocytes retrieved from women submitted to ovulation induction and in vitro fertilization were randomly divided in three groups: fresh oocytes (A), cryopreserved by slow-freezing (B) and cryopreserved by vitrification (C). Fresh, thawed and warmed oocytes were matured in vitro to metaphase II oocytes (MII). A meiotic spindle analysis was done by polarized light microscopy (ICSI Guard Octax). Results: Experiment 1: At time 0 min and 37º C, all oocytes had polymerized spindles both at PLM or ICC. At 4º C, the number of MI oocytes with detectable spindles at PLM was smaller than those analysed by ICC, and it decreased with time, which had also occured with TI oocytes at a smaller proportion. However, at 4º C, TI meiotic spindle recognition with polarized light microscopy and ICC was comparable. When MII oocytes were cultured at 4º C, the spindle visualization decreased proportionally in correlation with culture time at PLM, and the same happened with ICC in a less pronounced manner. At room temperature there was a little descrease regarding visualization of meiotic spindle, both at PLM and ICC, altought it was not significant for TI oocytes. Experiment 2: Oocyte survival immediately after thawing/warming were 44.6% for group B and 79% for group C. After 24 hours of culture, oocyte survival was 29.2% and 69%, respectively. The median time for maturation was 26 hours for groups A and C, and 27 hours for group B. The percentage of MII after maturation in vitro were smaller in group B and similar between groups A and C. The same oocured for spindle visualization which were lower in group B and similar between groups A and C. Conclusions: There was a difference on the percentages of meiotic spindle depolymerization in response to cooling in mice oocytes at different stages of meiotic division. Spindle depolymerization was lower in TI. Also, meiotic spindle depolimerization was proportional to culture time, except for TI oocytes at room temperature.Vitrified GV oocytes had a better survival when warmed, compared to slow-rate frozen oocytes. Vitrified GV oocytes had similar maturation in vitro rates and polymerized spindles detection when compared to fresh oocytes

Introdução: O fuso meiótico dos oócitos de mamíferos pode se despolimerizar quando exposto a pequenas variações de temperatura. Este fato já está bem estabelecido e estudado em oócitos maduros em metáfase II (MII). No entanto, pouco se sabe a respeito da influência da diminuição da temperatura sobre o fuso meiótico dos oócitos imaturos. Desse modo, este estudo tem como objetivos: 1) avaliar a influência da diminuição da temperatura sobre o fuso meiótico de oócitos de camundongas maturados in vitro e 2) avaliar o fuso meiótico em oócitos humanos maturados in vitro submetidos à criopreservação pela técnica de congelação lenta ou por vitrificação quando em estágio de vesícula germinativa. Métodos: Realizaram-se dois experimentos, denominados 1 e 2, sendo o primeiro em oócitos de camundongas e o segundo em oócitos humanos. No experimento 1 oócitos imaturos de camundongas nos estágios de metáfase I (MI), telófase I(TI) e MII foram cultivados nas seguintes temperaturas: 37º C (controle), temperatura ambiente (22oC) e 4º C por 0, 10, 30 e 60 minutos. Após este período de tempo o fuso meiótico oocitário foi avaliado por meio de microscopia de luz polarizada (MLP) (LC-Polscope-Oosight image software) e imunocitoquímica (IC). No experimento 2 oócitos em estágio de vesícula germinativa (GV) coletados de pacientes submetidas à indução da ovulação e fertilização in vitro, foram divididos de forma randômica em três grupos: oócitos a fresco (A), oócitos congelados pela técnica de congelação lenta (B) e oócitos congelados pela técnica de vitrificação (C). Os oócitos a fresco, os descongelados e os aquecidos foram maturados in vitro até estágio de (MII). A análise do fuso meiótico foi realizada por microscópio invertido equipado com uma câmera de vídeo analógica e um sistema de imagens que combina luz polarizada em cristal líquido (ICSI Guard Octax). Resultados: Experimento 1: No tempo 0 e à 37º C, todos os oócitos apresentavam o fuso meiótico visível tanto pela MLP quanto pela IC. À 4º C, o número de oócitos em MI com fuso meiótico visível por meio da MLP foi menor do que com a IC, e descresceu com o tempo, fato que também ocorreu, em menor proporção, com os oócitos em TI. No entanto, a 4º C, o reconhecimento do fuso meiótico dos oócitos em TI foi semelhante tanto para MLP como para IC. Quando os oócitos MII foram expostos à 4º C, a detecção do fuso meiótico teve descréscimo diretamente proporcional ao tempo de cultura quando foi utilizada a MLP, sendo que o mesmo ocorreu para a IC, porém de forma menos pronunciada. À temperatura ambiente houve um pequeno descéscimo na visualização do fuso meiótico tanto por MLP quanto por IC, porém este não foi estatisticamente significativo para os oócitos em TI. Experimento 2: A taxa de sobrevivência imediatamente após o descongelamento/ aquecimento foi de 44,6% para o grupo B e de 79% para o grupo C. Após 24 horas em cultura , estas taxas passaram para 29,2% e 69%, respectivamente. A mediana de tempo para maturação foi de 26 horas para os grupos A e C, e de 27 horas para o grupo B. Ao final da maturação in vitro a porcentagem de oócitos em MII foi menor no grupo B e semelhante nos grupos A e C. Assim como para a detecção do fuso meiótico que foi menor no grupo B e similar nos grupos A e C. Conclusões: Houve diferença na porcentagem de despolimerização do fuso meiótico em resposta à baixa temperatura entre os oócitos de camundongas nos diferentes estágios da divisão meiótica, sendo menor nos oócitos em TI. A porcentagem de despolimerização do fuso meiótico foi diretamente proporcional ao tempo de cultivo, à exceção dos oócitos em TI à temperatura ambiente. Os oócitos hmanos em GV vitrificados apresentaram melhores taxas de sobrevivência quando comparados com oócitos humanos em GV criopreservados pelo congelamento lento. Os oócitos humanos em GV vitrificados apresentaram taxas semelhantes de maturação in vitro e detecção do fuso meiótico polimerizado quando comparados a oócitos a fresco / Introduction: The meiotic spindle of most mammals is sensitive to cooling and depolymerizes even after a slight reduction in temperature. This is well described and studied on matured oocytes at metaphase II (MII). However, little is known about the influence of low temperatures under meiotic spindle of imature oocytes. In this way, we sougth to evaluate: 1) the influence of low temperatures on mice oocyte meiotic spindle matured in vitro e 2) the oocyte meiotic spindle from human oocytes matured in vitro and cryopreserved by slow-rate freezing or vitrification at GV stage. Methods: Two experiments were done: the first one on mice and the second one on women.At experiment 1, immature mice oocytes at metaphase I (MI), telophase I (TI) and MII were cultured at 37º C (control), room temperature (22oC) and 4º C for 0, 10, 30 and 60 minutes and then spindle analysis was made with polarized light microscopy (PLM) (LC-Polscope-Oosight image software) or immunocytochemistry (ICC). At experiment 2, GV oocytes retrieved from women submitted to ovulation induction and in vitro fertilization were randomly divided in three groups: fresh oocytes (A), cryopreserved by slow-freezing (B) and cryopreserved by vitrification (C). Fresh, thawed and warmed oocytes were matured in vitro to metaphase II oocytes (MII). A meiotic spindle analysis was done by polarized light microscopy (ICSI Guard Octax). Results: Experiment 1: At time 0 min and 37º C, all oocytes had polymerized spindles both at PLM or ICC. At 4º C, the number of MI oocytes with detectable spindles at PLM was smaller than those analysed by ICC, and it decreased with time, which had also occured with TI oocytes at a smaller proportion. However, at 4º C, TI meiotic spindle recognition with polarized light microscopy and ICC was comparable. When MII oocytes were cultured at 4º C, the spindle visualization decreased proportionally in correlation with culture time at PLM, and the same happened with ICC in a less pronounced manner. At room temperature there was a little descrease regarding visualization of meiotic spindle, both at PLM and ICC, altought it was not significant for TI oocytes. Experiment 2: Oocyte survival immediately after thawing/warming were 44.6% for group B and 79% for group C. After 24 hours of culture, oocyte survival was 29.2% and 69%, respectively. The median time for maturation was 26 hours for groups A and C, and 27 hours for group B. The percentage of MII after maturation in vitro were smaller in group B and similar between groups A and C. The same oocured for spindle visualization which were lower in group B and similar between groups A and C. Conclusions: There was a difference on the percentages of meiotic spindle depolymerization in response to cooling in mice oocytes at different stages of meiotic division. Spindle depolymerization was lower in TI. Also, meiotic spindle depolimerization was proportional to culture time, except for TI oocytes at room temperature.Vitrified GV oocytes had a better survival when warmed, compared to slow-rate frozen oocytes. Vitrified GV oocytes had similar maturation in vitro rates and polymerized spindles detection when compared to fresh oocytes

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Banca: João Carlos Pinheiro Ferreira / Banca: Maria Denise Lopes / Banca: Alício martins Júnior / Banca: Edson Guimarães Lo Turco / Resumo: Este trabalho teve como objetivo geral averiguar o efeito da BL-I e da ROS em bloquear temporariamente a retomada da meiose, atuando sobre os fatores que controlam o ciclo celular meiótico de oócitos bovinos e a expansão das células do cumulus oophoros. No Experimento I, os oócitos permaneceram em meio MIV durante 6, 12 e 24 h na presença de duas concentrações de ROS (12,5 μM e 25 μM) ou na presença de BL-I (50 μ e 100 μM) ou na presença da associação de ROS (6,25 μM) + BL-I (25 μM) e em seguida foram cultivados em meio MIV livre de fármacos por 18 h, 12 h ou 24 h. Após esse tempo, os oócitos inibidos por 6 ou 12 h foram fertilizados e cultivados in vitro. O tratamento com ROS e BL-I não resultou em atraso na quebra da vesícula germinativa em relação ao controle. Entretanto, quando utilizados por 24 h, elevadas taxas de degeneração oocitária foram encontradas. Quando estes fármacos foram utilizados por 12 h com reversão por mais 12 h, verificamos uma menor taxa produção de blastocistos em relação ao grupo controle. No entanto, após a retirada do bloqueio por 6 h e maturação por 18 h um maior número de oócitos tratados tanto com ROS, como BL-I encontraram-se em MII. Da mesma forma, ao reduzirmos a dose e o tempo de inibição, os grupos tratados por 6 h de inibição meiótica e reversão por 18 h apresentaram taxas de produção embrionária similares ao grupo controle. No Experimento II, os oócitos permaneceram em meio MIV durante 6h na presença de 12,5 μM de ROS ou na presença de 50 μM de BL-I ou com a associação de ROS (6,25 μM) + BL-I (25 μM) sendo em seguida cultivados em meio MIV livre de fármacos por 18 h. Após esse tempo, os oócitos inibidos foram fertilizados, cultivados in vitro e os embriões produzidos foram submetidos a vitrificação. Os grupos BI-I e ROS + BL-I apresentaram superioridade de produção embrionária, tanto em relação ao grupo ROS como o controle. O grupo ... / Abstract: This work had as main objective to investigate the effect of BL-I and ROS in temporarily blocking the resumption of meiosis, acting on the factors that control the meiotic cell cycle of bovine oocytes and expansion of cumulus oophoros cells. In Experiment I, the oocytes remained in IVM mediafor 6, 12 and 24h in the presence of two concentrations of ROS (12.5 μM and 25 μM) or in the presence of BL-I (50 μ to 100 mM) or the association of ROS (6.25 μM) + BL-I (25 μM) and then cultured in a drug-free IVM media for 18, 12 or 24 h. After this time, the inhibited oocytes by 6 or 12 h were fertilized and cultured in vitro. Treatment with ROS and BL-I did not resulted in delay in germinal vesicle breakdown in relation to control. However, when used for 24 h, higher rates of oocyte degeneration were found. When these drugs were used for 12 h with reversion for more than 12 h, a lower blastocyst production rate compared to the control group was verified. However, after removal of the blockage for 6 h and maturation for 18 h, a higher number of oocytes treated with both ROS and BL-I were found in MII. Similarly, when the dose and duration of inhibition were reduced, the groups treated for 6 h of meiotic inhibition and reversion for 18 h showed similar embryo production rates to the control group. In Experiment II, oocytes remained in IVM mediafor 6 h in the presence of 12.5 μM of ROS or the presence of 50 μM of BL-I or the association of ROS (6.25 μM) + BL-I (25 μM) and then cultured in drug-free IVM media for 18 h. After this time, the inhibited oocytes were fertilized in vitro and the produced embryos were submitted to vitrification. The BI-I and ROS + BL-I groups showed superiority in embryo production, both in relation to the control as ROS group. The ROS + BL-I group showed higher rate of re-expansion after vitrification. Additionally, embryos from BL-I and BL-I + ROS showed lower number of apoptotic cells when compared to ... / Doutor

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of the present study was to examine the role of oxytocin (OT) on the control of oocyte meiotic resumption in the events that involves progesterone (P4) and prostaglandins (PGs). Oocytes were co-cultured with follicular hemisections for 15 h to determine the effect of different doses of OT or atosiban (ATO; oxytocin receptor antagonist) on the oocyte meiotic resumption. In another experiment, we examine the effect of P4, OT and PGs interaction on the regulatory cascade of the induction of oocyte meiotic resumption. Oxytocin in the concentration of 1 μM was effective in inducing the resumption of meiosis of oocytes co-cultured with follicular cells (84.0%), not differing statistically from the positive control group (74.4%). Similarly, atosiban inhibited the positive effect of OT on meiotic resumption in a dose-dependent manner, in which the metaphase I (MI) rate was only 27.6% in the presence of 10 μM ATO, not differing from the negative control group (25.5%). The possible toxic effect of ATO was tested in a 15 or 24 h-cumulus-oocyte complex culture system. In the third experiment, we demonstrated that P4 was able to induce the oocyte meiotic resumption, which was inhibited by ATO. However, the positive effect of OT was not blocked by mifepristone (P4 antagonist) but was inhibited by indometacine (a non-selective PTGS2 inhibitor). Collectively, these results evidenced that P4 is upstream to OT and PGs are required for the positive effect of OT to induce oocyte meiotic resumption. In conclusion, our results evince that together with Ang II, already proved by our group as involved in oocyte meiotic resumption, P4, OT and PGs are sequential steps in the hormonal cascade that culminates with resumption of meiosis in cattle. / O objetivo do presente estudo foi examinar o papel da ocitocina (OT) no controle da retomada meiótica de oócitos bovinos, além da interação desse peptídeo com a progesterona (P4) e prostaglandinas (PGs) neste evento fisiológico. Nesse estudo, verificamos a interação da P4, OT e PGs na cascata de indução de retomada meiótica do oócito. Oócitos foram co-cultivados com metades foliculares por 15 h para determinar o efeito de diferentes doses de OT ou atosiban (ATO; antagonista do receptor de ocitocina) no reinício da maturação meiótica A OT na concentração de 1 μM foi eficaz em induzir a retomada da meiose de oócitos co-cultivados com células foliculares (84,0%), não diferindo estatisticamente do grupo controle positivo (74,4%). O ATO inibiu o efeito positivo da OT sobre o reinício da meiose de uma forma dose-dependente onde a porcentagem de oócitos que atingiu o estádio de metáfase I (MI), foi apenas 27,6% na presença de 10 μM de ATO, não diferindo do grupo controle negativo (25,5%). Para confirmar que este efeito não era resultante de toxicidade ocasionada pelo ATO, foi realizado um experimento onde o efeito tóxico do ATO foi testado em um cultivo durante 15 e 24 horas, e foi possível observar que ele não apresenta efeitos tóxicos aos oócitos em cultivo, permitindo a retomada da meiose. Foi demonstrado também que a P4 foi capaz de induzir a retomada da meiose do oócito bovino ao qual foi inibida pelo ATO. No entanto, o efeito positivo da OT não foi bloqueado pela mifepristona (antagonista P4), mas foi inibida por indometacina (inibidor não-seletivo de PTGS2). Coletivamente, estes resultados evidenciam que P4 requer OT e esta requer PGs para que oócitos bovinos reiniciem a meiose. Em conclusão, nossos resultados demonstram que, P4, OT e PGs são passos seqüenciais da cascata hormonal que culmina com a retomada da meiose em bovinos.