Orientador: Sony Dimas Bicudo / Coorientador: Fernanda da Cruz Landim Alvarenga / Banca: Eunice Oba / Banca: Nereu Carlos Prestes / Banca: José Antonio Visintin / Banca: Lindsay Unno Gimenes / Resumo: Esta pesquisa visou avaliar o perfil de expressão de determinados genes e o potencial de desenvolvimento in vitro de complexos cumulus-oócitos (COCs) de ovinos temporariamente bloqueados no estadio de vesícula germinativa (GV) com uso da roscovitina. Neste contexto, diferentes composições de meio (com e sem soro fetal bovino e gonadotrofinas), tempos (0, 6, 12 e 20 horas) e métodos de cultivo (com e sem cobertura de óleo mineral) foram testados com intuito de garantir a máxima eficiência de inibição meiótica promovida pela roscovitina a 75μM. A avaliação do grau de expansão das células do cumulus, em estereomicroscópio, e do estadio da maturação nuclear, por meio da coloração com Hoescht 33342, revelou que a presença ou ausência de LH, FSH e soro fetal bovino não interferiu no potencial de ação da roscovitina. No entanto, máxima eficiência inibitória foi observada em meio suplementado apenas com soro fetal bovino. Foi constatado ainda que, na ausência de óleo mineral, quantidade significativamente maior de oócitos tratados com roscovitina foi mantida em GV o que reforça a hipótese de lipossolubilidade do referido inibidor. Embora o potencial de inibição meiótica da roscovitina tenha se mantido nos diferentes tempos de cultivo, a exposição prolongada dos COCs ao inibidor afetou de maneira irreversível a expansão do cumulus. Em todas as situações, a inibição meiótica foi completamente reversível após cultivo por 18 horas em meio de maturação livre de inibidor. Sendo assim, para análise da expressão gênica e desenvolvimento embrionário in vitro, foi preconizado o tratamento com roscovitina a 75μM por 6 horas na presença de soro e sem óleo mineral. Nestas condições assim como após a reversibilidade por 18 h, a quantidade relativa da maioria dos genes investigados nas células do cumulus e nos oócitos foi similar ao observado nos COCs não inibidos (controle). Do mesmo modo, não foi ... / Abstract: This study aimed to evaluate the expression profile of certain genes and the potential of in vitro development of sheep cumulus-oocytes complexes (COCs) temporarily arrested at germinal vesicle (GV) stage using roscovitine. In this context, different medium compositions (with and without fetal bovine serum and gonadotropins), times (0, 6, 12 and 20 hours) and methods of culture (with and without mineral oil overlay) were tested in order to ensure maximum efficiency of meiotic inhibition promoted by 75μM roscovitine. The evaluation of cumulus expansion degree, under stereomicroscope, and nuclear maturation stage, by staining with Hoechst 33342, revealed that the presence or absence of LH, FSH and fetal bovine serum did not influence the action potential of roscovitine. However, maximum efficiency of meiotic inhibition was observed in medium supplemented with fetal bovine serum. It was also found that, in the absence of mineral oil overlay, significantly higher quantity of oocytes treated with roscovitine was kept at GV, which reinforces the hypothesis of liposolubility of this inhibitor. Although the potential of meiotic inhibition of roscovitine had remained at different culture times, the prolonged exposure of COCs to inhibitor irreversibly affect the cumulus expansion. In all cases, the meiotic arrest was completely reversible after culture for a further 18 h in inhibitor-free medium. Therefore, for analysis of gene expression and in vitro embryo development, it was chosen the treatment with 75μM roscovitine for 6 h under serum-supplemented medium and without mineral oil overlay. Under these conditions as well as after the reversibility for 18 h, the relative amount of most investigated genes in cumulus cells and oocytes was similar to that observed in the uninhibited COCs (control). Similarly, no difference was found between roscovitine treatment and control with respect to blastocyst rate and quality of embryos obtained. Therefore, ... / Doutor

Orientador: Doralice Maria Cella / Coorientador: Marielle Cristina Schneider / Banca: Adilson Ariza Zacaro / Banca: Douglas de Araujo / Resumo: As espécies de aranhas pertencentes aos grupos Mygalomorphae e Haplogynae (Araneomorphae) exibem uma grande diversidade cariotípica, isto é, 2n=14 a 2n=110 e sistemas cromossômicos sexuais (SCS) dos tipos X0, XY, X1X20 e X1X2X3X40, nas 19 espécies de migalomorfas analisadas; e 2n=7 a 2n=40, e SCS dos tipos X0, X1X2Y, XY e X1X20, nas 51 espécies de aranhas haploginas estudadas. Nestes grupos, a morfologia meta e submetacêntrica dos cromossomos é predominante. Contudo, os dados citogenéticos em aranhas correspondem a menos de 2% do total de espécies taxonomicamente descritas. Considerando as particularidades cromossômicas encontradas nestes dois grupos, bem como a escassez de informações citogenéticas em representantes que ocorrem no Brasil, o objetivo deste trabalho é caracterizar citogeneticamente, utilizando técnicas de coloração convencional e diferencial (impregnação pelo íon prata, bandamento C e coloração com fluorocromos base-específicos), quatro espécies de aranhas caranguejeiras (Mygalomorphae, Theraphosidae) e duas espécies de Haplogynae basais (Araneomorphae, Filistatidae), visando estabelecer os mecanismos de evolução cromossômica que podem ter ocorrido nestes grupos. A análise das espécies de Mygalomorphae revelou 2n=63, XY1Y2 para Guyruita cerrado e 2n=22, X1Y1+X2Y2 em Oligoxystre bolivianum, Oligoxystre caatinga e Oligoxystre rufoniger. O uso de colorações diferenciais no estudo de células mitóticas e meióticas foi imprescindível para identificar estes SCS, os quais são inéditos para o grupo bem como para todas as aranhas. Além disso, os números diploides encontrados nestas quatro espécies, nunca haviam sido descritos para as migalomorfas, e o 2n=22 representa o segundo menor número diploide já descrito para Theraphosidae. A comparação dos dados obtidos, com aqueles de espécies filogeneticamente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The spider species belonging to the Mygalomorphae and Haplogynae (Araneomorphae) groups exhibit a great karyotype diversity, that is, 2n=14 to 2n=110 and sex chromosome systems (SCS) of the X0, XY, X1X20 and X1X2X3X40 types in the 19 species of mygalomorph analyzed, and 2n=7 to 2n=40 and SCS of the X0, X1X2Y, XY and X1X20 types in the 51 haplogyne spiders studied. In these groups, the meta and submetacentric chromosome morphology is predominant. However, the cytogenetic data correspond to less than 2% of the total of species taxonomically described. Considering the chromosomal particularities recorded for these two groups as well as the scarcity of cytogenetic information in representatives from Brazilian fauna, the aim of this work is to characterize cytogenetically, using conventional and differential techniques (silver nitrate impregnation, C-banding and base-specific fluorochrome staining) four species of tarantula spiders (Araneomorphae, Theraphosidae) and two species of basal Haplogynae spiders (Araneomorphae, Filistatidae), with the purpose of establishing the mechanisms of chromosomal evolution that have occurred in these groups. The analyses of Mygalomorphae species revealed 2n=63, XY1Y2 for Guyruita cerrado and 2n=22, X1Y1+X2Y2 in Oligoxystre bolivianum, Oligoxystre caatinga and Oligoxystre rufoniger. In the study of mitotic and meiotic cells, the use of differential staining was indispensable for identifying these SCS, which are original for this group and spiders as a whole. Moreover, the diploid numbers observed in the four species studied here had never been described for the mygalomorphs, and the 2n=22 corresponds to the second lowest diploid number described for Theraphosidae until now. The comparison of the obtained data with those of phylogenetically related species allowed us to infer that these SCS were probably originated from... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Cláudia Lima Verde Leal / Resumo: O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da inibição da meiose com inibidores farmacológicos ou biológicos durante o transporte de oócitos bovinos por 6 horas sobre: 1) progressão da maturação nuclear; 2) maturação citoplasmática e 3) competência no desenvolvimento e qualidade dos embriões produzidos. Para tanto, o meio de transporte de oócitos foi suplementado com butirolactona-I (BL), milrinona (MR), IBMX e forskolina (CL) ou fluido folicular puro (FF) e o meio de maturação somente do grupo transportado com IBMX e forskolina foi suplementado com cilostamida. Os oócitos foram incubados em incubadora portátil (Minitub®) para simulação de transporte, durante 6h. Posteriormente, foram submetidos à maturação in vitro (MIV) até completar 24h e, em seguida, foram fecundados e os prováveis zigotos foram cultivados in vitro durante 7 dias. Foram feitos dois grupos controle no experimento I: MIV em 5% de CO2 em ar por 24h (C1); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (C2). No experimento II foram feitos três grupos controle: MIV com 10% de SFB (Contr SFB); MIV com 0,6% de BSA (Contr BSA); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (Contr Transp) No primeiro experimento foi avaliada a cinética da maturação nuclear após o transporte e durante a MIV, quando também foi avaliada a expansão das células do cumulus. As avaliações da maturação citoplasmática após o transporte e ao final da MIV foram feitas pelos seguintes parâmetros: avaliação do posicionamento de mitocôndrias, do potencial de membrana mitocondrial, do posicionamento dos microfilamentos de actina, da taxa de apoptose e do conteúdo intracelular de espécies reativas do oxigênio. No experimento 2, foi feita a avaliação da taxa de clivagem (72 hpi) e do desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos (168 hpi), sendo que a qualidade dos embriões foi avaliada pela contagem do número total de... / Abstract: The aim of this trial was to evaluate the effects of meiotic inhibiton with biological and pharmacological inhibitors during transportation of bovine oocytes for 6 hours in: 1) nuclear maturation progress; 2) cytoplasmic maturation and 3) embryo development and quality. Thus, the transportation media were supplemented with butyrolactone-I, milrinone, IBMX and forskolin or follicular fluid. Oocytes were transported during 6 hours and then submitted to in vitro maturation (IVM) until completing 24 hours, then they were fertilized and the presumptive zygotes cultured during 7 days. There were made two control groups in the first experiment: 24h IVM in 5% CO2 in air (C1); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (C2). In the second experiment there were made three control groups: IVM with 10% FCS (Contr FCS); IVM with 0,6% BSA (Contr BSA); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (Contr Transp). Experiment 1 evaluated nuclear maturation kinetics and cumulus cell expansion. Cytoplasmic maturation was also evaluated after transport and after IVM through the evaluation of mitochondria position and membrane potential, actin microfilaments distribution. Apoptotic rates and intracellular measurement of reactive oxygen species were evaluated as well. Experiment 2 evaluated cleavage (72 hpi) and blastocyst (168 hpi) rates and embryo quality by total cell number, apoptosis and caspases activity. In experiment 1 no differences (P>0.05) were observed between treatments in metaphase II rates after 24h IVM (61.2%-74.7%). Cumulus cells expansion was higher (P<0.05) in FF group after 6h and there were no differences (P>0.05) between treatments after IVM (4.8- 5.0). Actin microfilaments distribution was higher (P<0.05) in MR group for diffuse category (37.4%) after 6h IVM when compared to immature (6.4%) and FF groups (8.1%), but it was predominantly in normal category and did not differ (P>0,05) between groups after IVM ... / Mestre

Orientador: José Maurício Barbanti Duarte / Banca: Luiz Renato de França / Banca: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Resumo: A espécie Mazama americana tem sido bastante estudada nas áreas de ecologia, genética e reprodução devido às recentes dúvidas quanto à validade de seu táxon. Estudos citogenéticos e moleculares demonstram que atualmente este táxon é composto de uma espécie que apresenta até seis citótipos diferentes. Instituições voltadas à conservação classificam este táxon como "Dados insuficientes", devido às incertezas taxonômicas. Este trabalho teve como objetivo avaliar a fertilidade dos animais resultantes de cruzamentos intra e intercitótipos para inferir sobre a existência de isolamento reprodutivo entre os citótipos e conclusões acerca da existência de espécies novas. Foram avaliados o sêmen, histologia testicular, perfil de metabólitos fecais de testosterona e a meiose de sete animais, sendo dois puros (cruzamento intracitótipo), três híbridos de mesma linhagem evolutiva e dois híbridos de linhagens evolutivas diferentes. Os resultados mostram que os animais puros tiveram melhores desempenhos reprodutivos seguidos pelos animais híbridos entre citótipos de mesmas linhagens evolutivas, que foram sugestivos de subfertilidade. Os animais de linhagens evolutivas diferentes apesar de apresentarem atividade estereidogênica foram azoospérmicos o que nos permite concluir que dentro do táxon existem pelo menos duas espécies diferentes com possibilidade de duas subespécies dentro de cada ramo filogenético. Estes resultados implicam na necessidade de novas caracterizações taxonômicas, inclusive para que sejam estruturados planos de ação para conservação de espécies que pudessem estar correndo risco de extinção / Abstract: Mazama americana (Mammalia, Cervidae), has been widely studied in ecologic, genetic and reproductive areas given recent doubts about its taxonomic validity. Cytogenetic and molecular studies showed that currently this taxon is composed by a species with up to six different cytotypes. The World Conservation Union IUCN classified this taxon as "data deficient" given the taxonomic uncertain of this species. This research aimed to evaluate the fertility of of intra and intercytotypic breeding products in order to conclude about the occurrence of novel species. Semen analysis, testicular histology, fecal testosterone metabolites and meiosis of seven breeding products, being two of them pure (intracytotipic breeding), three hybrids from the same evolutive lineage and two hybrids from different evolutive lineages. Results show that pure products have better reproductive performances, being the hybrids from the same evolutive lineage suggestive of subfertility. The hybrid products from different evolutive lineages were azoospermics, despite their steroid activity. These results show the occurrence of almost two different species and the possibility of almost four subspecies. It implies the necessity of new taxonomic review, which will aid in the design of action plans for the conservation of endangered species / Mestre

Orientador: Fausto Foresti / Coorientador: José Carlos Pansonato Alves / Banca: Orlando Moreira-Filho / Banca: Roberto Ferreira Artoni / Banca: Diogo Teruo Hashimoto / Banca: Patrícia Elda Sobrinho Scudeler / Resumo: No presente trabalho, foram analisadas seis espécies/citótipos de peixes do gênero Eigenmannia, sendo E. microstoma, E. limbata, E. virescens, E. aff trilineata, Eigenmannia sp1 e Eigenmannia sp2, de diferentes bacias hidrográficas brasileiras, com o uso de técnicas citogenéticas básicas envolvendo a coloração com Giemsa e bandamento C e também técnicas de citogenética molecular, com a aplicação de hibridação in situ fluorescente (FISH) envolvendo o uso de sondas de DNAr 18S e 5S, DNA histônico H3/H4 e de RNAsn U2. Também foi estudado o comportamento meiótico e o nível de diferenciação do sistema múltiplo de cromossomos sexuais de Eigenmannia sp2 por imunodetecção de proteínas do complexo sinaptonêmico (SYCP3), proteínas relacionadas com a atividade da cromatina (H3K9me) e marcadores do tipo proteína γH2AX envolvida no reparo das quebras do DNA e associadas ao nível de pareamento dos bivalentes nos cromossomos meióticos. Finalmente, os dados da caracterização citogenética foram comparados com análises de DNA barcode para permitir uma melhor delimitação das espécies/citótipos analisados neste estudo. Os representantes analisados deste grupo confirmara a apresentação de expressiva variação no número diplóide, tendo sido observados deste cariótipos compostos por 28 cromossomos em Eigenmannia sp1 até o número diplóide de 38 cromossomos em E. microstoma, E. limbata e E. virescens. Em E. aff trilineata foi descrita pela primeira vez a ocorrência de um polimorfismo cromossômico do tipo ZZ/Z0 associado ao sexo, em que os machos apresentam cariótipos compostos por 32 cromossomos enquanto as fêmeas possuem cariótipos constituídos por 31 cromossomos. Sequências de DNAr 5S e RNAsn U2 foram localizadas em diferentes cromossomos, com variação na quantidade de sítios entre as espécies, enquanto o DNAr 18S apresentou-se conservado em relação ao número de cromossomos portadores, porém variando na... / Abstract: In the present study, six species/cytotypes from de genus Eigenmannia collected at different Brazilian hydrographic basins were analyzed, including E. microstoma, E. limbata and E. virescens, E. aff trilineata, Eigenmannia sp1, and Eigenmannia sp2 using classical (Giemsa conventional staining and C-banding) and molecular cytogenetic techniques (fluorescence in situ hybridization with 5S and 18S rDNA, H3/H4 histone genes and U2 snDNA probes). Besides that, it was studied the meiotic behavior and the differentiation level of multiple sex chromosome system in Eigenmannia sp2 by immunodetection for synaptonemal complex proteins (SYCP3), proteins related to chromatin activity (H3K9me) and associated markers with the bivalent level pairing of the meiotic chromosomes (γH2AX). Finally, the cytogenetics results were analyzed in conjunction with the barcode DNA analysis for a better delineation of species/cytotypes studied. The analyzed species/cytotypes showed diploid number variation, with diploid numbers ranging from 28 chromosomes in Eigenmannia sp1 to 38 chromosomes in E. microstoma, E. limbata and E. virescens. In E. aff trilineata, for the first time, showed a ZZ/Z0 sex chromosome system, where males have karyotypes with 32 chromosomes to 31 chromosomes to females. 5S rDNA and U2 snDNA were located on different chromosomes, with variations on the number of clusters in the different species, while the 18S rDNA was conserved in number of sites per genome and variable in location. The meiotic analysis in the sex chromosomes of Eigenmannia sp2 showed a completely synaptic sexual trivalent X1X2Y formation without unsynaptics presence and inactive chromatin regions throughout its structure. These results suggest that this sex chromosomes system would be a recent rearrangement or simply it is a sex-linked character in this population. All the six species/cytotypes of Eigenmannia analyzed were easily ... / Doutor

Apesar do grande volume de pesquisas e dos avanços da produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, a eficiência da técnica ainda está distante do desejável, principalmente quando comparada a embriões produzidos in vivo. A maturação in vitro é etapa importante da PIV, visto que a qualidade dos embriões é dependente da qualidade do oócito e, assim, modificações nas condições de maturação in vitro podem trazer avanços à produção de embriões. A melatonina é um hormônio que foi detectado no fluido folicular de humanos, suínos e, mais recentemente, de bovinos. Ainda, seus receptores foram localizados em oócitos e células da granulosa. Estudos in vitro apontam efeitos benéficos de sua utilização na maturação e cultivo in vitro de oócitos e embriões, embora os resultados sejam por vezes contraditórios. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da melatonina na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos e também seu potencial como indutor de genes de enzimas antioxidantes e inibidor de fragmentação nuclear em células do cumulus. Para tanto, complexos cumulus-oócitos (CCOs), obtidos de ovários de abatedouro, foram maturados in vitro na presença de melatonina (10-9 e 10-6 M), FSH (controle positivo) ou sem hormônios (controle negativo). As taxas de maturação nuclear foram avaliadas às 6, 12, 18 e 24 horas de cultivo (Experimento 1). No Experimento 2, os mesmos grupos experimentais foram avaliados quanto à abundância relativa de transcritos de genes de enzimas antioxidantes (Cu,ZnSOD, MnSOD e GPx) em oócitos e células do cumulus (24 horas de MIV) por PCR em tempo real. No Experimento 3 foi avaliado o efeito dos tratamentos sobre a fragmentação nuclear em células do cumulus pela técnica de TUNEL e citometria de fluxo (24 horas de MIV). A taxa de maturação avaliada às 6 h de MIV foi de 100% de oócitos imaturos em vesícula germinativa (VG) (P&GT;0,05). Às 12 horas de cultivo foi observado o efeito da melatonina similar ao FSH, variando a proporção de oócitos em metáfase I (MI) de 54,0 a 80,7 % entre os grupos (P&LT;0,05). Após 18 h de MIV observou-se que a maioria dos oócitos já havia atingindo o estádio de metáfase II (MII) variando de 57,2 a 74,2 % (P&GT;0,05). Após 24 h de MIV, observou-se que a maioria dos oócitos atingiu o estádio de MII (50,7 a 89,5%), sendo que a melatonina na maior concentração apresentou efeito similar ao da gonadotrofina (P&LT;0,05). Em relação à expressão de enzimas antioxidantes em oócitos não houve efeito de nenhum tratamento (P&GT;0,05%). Já em células do cumulus houve maior expressão do MnSOD no grupo com FSH em relação ao grupo maturado sem hormônios ou imaturo (P&LT;0,05). A melatonina nas diferentes concentrações apresentou efeito similar ao da gonadotrofina (P&GT;0,05). Transcritos para a enzima Cu,ZnSOD foram mais abundantes em cumulus de CCOs maturados com a maior concentração de melatonina (10-6 M) em relação ao grupo imaturo (P&LT;0,05), não havendo variação nos demais (P&GT;0,05). GPX4 não foi afetado pelos tratamentos (P&GT;0,05). A quantidade de células do cumulus com fragmentação nuclear não foi afetada por nenhum tratamento (33,4 a 41,5/10.000 células; P&GT;0,05) Com base nestes resultados conclui-se que a melatonina nas concentrações avaliadas (10-9 e 10-6 M), embora seja capaz de estimular a maturação nuclear e induzir a expressão de alguns genes antioxidantes em células do bovinas, ainda que de forma semelhante ao FSH, não provocou redução da fragmentação nuclear nestas células. / Nevertheless the great volume of research and the advances in in vitro production (IVP) of bovine embryos, the efficiency of this techinque is still beyond the desireable, specially when compared to embryos produced in vivo. in vitro maturation (IVM) is an important step in IVP, since the quality of embryos is dependent on the quality of oocytes, and, therefore, modifications to in vitro maturation conditions can bring improvements to embryo production. Melatonin is a hormone which has been detected in the folicular fluid of humans, pigs, and more recently, in bovine. Also, its receptores have been identified in oocytes and granulosa cells. Studies in vitro have shown that melatonin may have beneficial effects when used in oocyte maturation and embryo culture, although results are sometimes contradictory. The aim of the present work was to assess the effect of melatonin during IVM on nuclear maturation of bovine oocytes as well as its potential to induce expression of antioxidant enzymes and to reduce nuclear fragmentation in cumulus cells. Cumulus-oocyte comprexes (COCs), obtained from abbattoir ovaries, were matured in vitro in the presence of melatonin (10-9 e 10-6 M), FSH (positive controle) or without hormones (negative control). Maturation rates were evaluated at 6, 12, 18 and 24 h (Experiment 1). In Experiment 2, the same groups were evaluated for the relative abundance of transcripts encoding antioxidant enzymes (Cu,ZnSOD, MnSOD and GPx) in oocytes and cumulus cells (24 h IVM) by real time PCR. In Experiment 3, the effect of treatments on nuclear fragmentation in cumulus cells was determined by TUNEL and flow cytometry (24 h IVM). At 6 h IVM, all oocytes were at immature germinal vesicle (GV) stage. After 12 h of cuture the effect of melatonin was similar to that of FSH, with proportions of oocytes in metaphase I (MI) varying from 54.0 to 80.7% between groups (P&GT;0.05). After 18 h IVM most oocytes had reached metaphase II (MII) stage (57.2 to 74.2%, P&GT;0.05). At 24 h IVM, oocytes were also mostly in MII stage (50.7 to 89.5%), and the highest melatonin concentration was similar to the gonadotrophin (P&GT;0.05). Regarding expression of antioxidant enzymes in oocytes there was no effect of treatments for any of the genes (P&GT;0.05). However, in cumulus cells MnSOD expression was higher in FSH compared with the groups matured without hormones or immature cells (P&LT;0.05). Melatonin in both concentrations were similar to FSH (P&GT;0.05). Transcripts for Cu,ZnSOD were more abundant in cumulus from COCs matured with the highest melatonin concentration (10-6 M) in relation to immature cells (P&LT;0.05), but was not diferent from other groups (P&GT;0.05). GPx was not affected by treatments (P&GT;0.05). The number of nuclear fragmentation in cumulus cells was also not affected by treatments (33.4 to 41.5/10,000 cells; P&GT;0.05). According to these results it is concluded that melatonin is able to induce meiosis resumption in oocytes (10-9 and 10-6 M) and expression of some antioxidant genes in bovine cumulus cells, similar to the effect of FSH, but was ineffective in reducing nuclear fragmentation in these cells.

Wolbachia pipientis é uma alfa-protobactéria intracelular obrigatória, endossimbionte de artrópodes e nematódeos que é herdada por via materna ao longo das gerações. A presença desta bactéria nos tecidos germinativos pode provocar nos hospedeiros alterações fenotípicas reprodutivas, como partenogênese, feminização genética de machos, morte de machos, incompatibilidade citoplasmática (IC) e alterações de fitness. Alguns mecanismos moleculares dessas alterações baseiam-se na modulação da expressão gênica do hospedeiro, ou seja, a bactéria pode suprimir ou estimular genes de forma a produzir ambiência favorável à manutenção da endossimbiose. Devido a esse potencial manipulador, Wolbachia tem sido testada como \"ferramenta\" para controle populacional de insetos vetores de patógenos. O mosquito Culex quinquefasciatus, naturalmente infectado por Wolbachia na região Neotropical, é um importante vetor de diversos patógenos que atingem humanos e animais. A presença da bactéria causa IC e altera o fitness no mosquito, mediante alterações temporais na ovogênese, fecundidade e fertilidade reprodutivas. Sabe-se que a presença da Wolbachia altera a expressão do gene grauzone e há fortes indícios de que esta expressão diferencial induza à IC em Cx. quinquefasciatus. Sabe-se também que este gene possui duas cópias parálogas em Cx. quinquefasciatus, porém estudos observaram a relevância de apenas um parálogo como importante regulador dos ciclos celulares da ovogênese e espermatogênese. No entanto, as bases genéticas dos fenótipos IC e \"fitness alterado\" do modelo Wolbachia-Cx. quinquefasciatus Neotropical ainda permanecem desconhecidas. Objetivamos inicialmente neste modelo quantificar e silenciar a expressão do gene grauzone (ambos parálogos) para suportar a hipótese pré-existente de que a superexpressão deste gene em mosquitos infectados por Wolbachia causa as alterações fenotípicas reprodutivas. Durante o desenvolvimento do projeto houve intercorrências que alteraram o rumo do trabalho: a necessidade de substituição da colônia experimental de mosquitos devido a baixas demográficas e à alta variabilidade intraespecífica do gene grauzone. Frente às intercorrências, formulamos como neo-objetivo a comparação filogenética entre as variantes do gene grauzone. Detectamos também variabilidade em um dos parálogos e concluímos que as cópias parálogas do gene encerram proteínas estruturalmente distintas e talvez funcionalmente distintas no tocante à alteração reprodutiva (IC) causada pela presença da Wolbachia. Foi possível observar que fêmeas infectadas apresentam amplificações de grauzone mais intensas quando comparadas com fêmeas não-infectadas no 4° dia de emergência, corroborando dados da literatura. Em conjunto, esses achados indicam que é promissora a continuidade do estudo do papel de grauzone na IC, mas demonstra também que este gene é mais complexo do que se imaginava, o que demandará maior esforço investigativo. A expectativa de uso futuro de Wolbachia como controlador biológico de mosquitos-vetores poderá se beneficiar de estudos como aqui proposto. / Wolbachia pipientis is an obligate intracellular alpha-protobacterium, endosymbiont of arthropods and nematodes, which is inherited through maternal route over generations. The presence of this bacterium in germinative tissues can cause reproductive phenotypic alterations in the hosts, such as parthenogenesis, genetic feminization of males, death of males, cytoplasmic incompatibility (CI) and fitness changes. Some molecular mechanisms of these alterations are based on the modulation of gene expression of the host, that is, the bacterium can suppress or stimulate genes in order to produce favorable environment for the maintenance of the endosymbiosis. Due to this potential manipulator, Wolbachia has been tested as a \"tool\" for population control of pathogen vector insects. The mosquito Culex quinquefasciatus, naturally infected by Wolbachia in the Neotropical region, is an important vector of several pathogens that affect humans and animals. The presence of the bacteria causes CI and changes the fitness in the mosquito, through temporal changes in ovogenesis, reproductive fertility and fertility. The presence of Wolbachia is known to alter the expression of the grauzone gene and there are strong indications that this differential expression induces the CI in Cx. quinquefasciatus. It is known that this gene occurs with two paralogs copies in Cx. quinquefasciatus, but studies have observed the relevance of only one paralog as important regulator of oogenesis and spermatogenesis cell cycles. However, the genetic basis of the phenotypes \"changed fitness\" and CI of Wolbachia-Cx quinquefasciatus Neotropical model remain unknown. We initially aimed at quantifying and knockdown of grauzone gene (both paralogs) to support the preexisting hypothesis that overexpression of this gene in Wolbachia-infected mosquitoes causes reproductive phenotypic changes. During the development of the project there were intercurrences that altered the course of work: the need to replace mosquito populations due to demographic lows and the high intraspecific variability of grauzone gene. In view of the intercurrences we formulated the neo-objective phylogenetic comparison between the variants of the grauzone gene. We also detected variability in one of the paralogs and concluded that the paralogs copies of the gene contain structurally distinct and perhaps functionally distinct proteins with respect to the reproductive alteration (CI) caused by the presence of Wolbachia. It was possible to observe that infected females show more intense grauzone amplifications when compared to uninfected females on the 4th day of emergence, corroborating data from the literature. Taken together, these findings indicate that the continuity of the study of the role of grauzone in CI is promising, but also demonstrates that this gene is more complex than previously thought, which will require more investigative effort. The expectation of future use of Wolbachia as a biological control of mosquito-vectors may benefit from studies as proposed here.

O arsênio inorgânico, um contaminante ambiental, produz uma série de respostas de estresse em células de mamíferos, incluindo o comprometimento da função mitocondrial, acompanhado por inibição do crescimento celular e carcinogênese. Como previamente identificamos efeitos deletérios do comprometimento da função mitocondrial e dos radicais livres do oxigênio na oogênese, investigamos os efeitos do arsenito na meiose, no desenvolvimento embrionário pré-implantação e na apoptose embrionária em camundongos. Camundongas com 6 semanas de idade foram tratadas com baixa (0,16 mg) ou média dose de arsenito (0,32 mg), por meio de 7 injeções intraperitoneais, 1 a cada 2 dias, durante 14 dias. Os controles foram injetados com solvente. A incidência de anomalias meióticas, caracterizadas por anormalidades do fuso celular e/ou mal alinhamento cromossômico, foi significantemente aumentada tanto nos oócitos in vivo ovulados, como nos in vitro maturados, oriundos dos animais tratados com arsenito. Foram detectadas reduções significativas das taxas de clivagem (24 horas de cultivo), de formação de mórula (72 h) e de desenvolvimento para blastocisto (96 h), nos embriões dos grupos tratados com arsenito. Apesar do número total de núcleos não ter diferido significativamente entre os blastocistos dos grupos controle e de tratamento, a percentagem de núcleos apoptóticos foi significantivamente maior nos blastocistos derivados dos animais tratados com a dose média de arsenito. Estes dados sugerem que o arsenito causa aberrações meióticas, que podem contribuir tanto para o comprometimento do desenvolvimento embrionário pré-implantação, como para a apoptose embrionária. / Inorganic arsenic, an environmental contaminant, produces a variety of stress responses in mammalian cells, including mitochondrial uncoupling accompanied by growth inhibition and carcinogenesis. Because previously we identified detrimental effects of mitochondrial uncoupling, and reactive oxygen species (ROS) on oogenesis, we investigated effects of arsenite on meiosis, early embryo development, and apoptosis in mice. Six-week-old CD-1 mice were treated with either low (0.16mg) or medium (0.32mg) doses of arsenite every two days by 7 intraperitoneal injections for 14 days, and controls were injected with solvent. The incidence of meiotic anomalies, characterized by spindle disruption and/or chromosomal misalignment or spreading, was significantly increased in both in vivo and in vitro treated oocytes. Further, we found a significant decrease in cleavage rates at 24h, morula formation at 72h, and development to blastocyst at 96h in treated groups. Although the total number of nuclei in developed blastocysts did not significantly differ between the treated and control groups, the percentage of apoptotic nuclei was significantly increased in blastocysts derived from the medium dose treated group. These data suggest that arsenite causes meiotic aberrations, which may contribute to decreased cleavage and preimplantation development, as well as increased apoptosis.

The cohesin complex is essential for mitosis and meiosis. The specific meiotic roles of individual cohesin proteins are incompletely understood. We report in vivo functions of the only meiosis-specific STAG component of cohesin, STAG3. Newly generated STAG3-deficient mice of both sexes are sterile with meiotic arrest. In these mice, meiotic chromosome architecture is severely disrupted as no bona fide axial elements (AE) form and homologous chromosomes do not synapse. Axial element protein SYCP3 forms dot-like structures, many partially overlapping with centromeres. Asynapsis marker HORMAD1 is diffusely distributed throughout the chromatin, and SYCP1, which normally marks synapsed axes, is largely absent. Centromeric and telomeric sister chromatid cohesion are impaired. Centromere and telomere clustering occurs in the absence of STAG3, and telomere structure is not severely affected. Other cohesin proteins are present, localize throughout the STAG3-devoid chromatin, and form complexes with cohesin SMC1β. No other deficiency in a single meiosis-specific cohesin causes a phenotype as drastic as STAG3 deficiency. STAG3 emerges as the key STAG cohesin involved in major functions of meiotic cohesin.

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico gerado pela atividade da enzima óxido nítrico sintase (NOS) a qual foi detectada em vários órgãos incluído o sistema reprodutor. O sistema NOS/NO parece desempenhar papel importante na maturação oocitária entre outras funções. No entanto, apesar das evidências, há poucos estudos sobre o papel desse sistema em oócitos da espécie bovina. Sabe-se que o NO atua pela via da guanilato ciclase (GC) estimulando a produção do nucleotídeo GMPc, que por sua vez é capaz de influenciar os níveis de outro nucleotídeo, o AMPc, que é um importante elemento da via de sinalização das gonadotrofinas nos oócitos e no controle da maturação oocitária. O objetivo do presente estudo foi de investigar o envolvimento da via do GMPc na ação do sistema NOS/NO na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos e seu efeito sobre a via do AMPc. Com a maior concentração estudada do doador de NO (10-7M de SNAP), apenas 36% dos oócitos conseguiram alcançar o estágio de RVG (P< 0,05), após 9 horas de maturação. Esse atraso também foi observado com diferentes concentrações do estimulador de GC (5, 10 ou 50&mu;M de Proptoporfirina IX) e pelo análogo de GMPc (1, 2 e 4mM de 8-Br-GMPc ), que apresentaram uma taxa média de RVG de 50% para os tratamentos e 70% para os grupos controles sem as drogas (P<0,05). No início da maturação (0h), os níveis de GMPc foram de 5,29 pmol/oócito sofrendo uma queda logo na primeira hora de cultivo para 2,97 pmol nos oócitos do grupo controle e 1,54 pmol nos cultivados com associação de 10-7M de SNAP (doador de NO) e 100&mu;M de OQD (inibidor de GC (P<0,05). No grupo de oócitos cultivados apenas com SNAP, os níveis de GMPc se mantiveram em 4,51 pmol/oócito, semelhante ao grupo imaturo (0h de cultivo, P>0,05). O doador de NO manteve estável o nível de GMPc somente na primeira hora de maturação. Após 3 e 6 h de MIV, os níveis de GMPc permaneceram baixos e similares (0,07 a 2,46 pmol/oócito, P>0,05) nos grupos controle (sem drogas), tratado com doador de NO (10-7M de SNAP) associado ou não ao inibidor de guanilato ciclase (100&mu;M de OQD). Também foi observada uma queda nos níveis de AMPc em relação ao grupo imaturo (32,42 fmol de AMPc/oócito) para os demais grupos (P<0,05), que apresentaram aproximadamente, 12,0 a 16,0 fmol de AMPc/oócito durante a primeira hora, 3,3 a 8,0 fmol/oócito durante a terceira hora e 7,4 a 18,3 durante a sexta hora de maturação (P>0,05). O NO afetou os níveis de GMPc no início da maturação, mas não os níveis de AMPc. O NO e o GMPc podem atuar no controle da expressão gênica de uma série de proteínas envolvidas no controles dos níveis de AMPc e GMPc ou suas funções. Esse controle pode ser efeito direto do NO (PKG2, PDE3A, PDE4D e PDE8A), do GMPc (ADCY6) ou do NO via GMPc (PKA1) e varia com o compartimento considerado (oócito ou células do cumulus). Esses resultados demonstraram a inter-relação das vias NO/GMPc/AMPc e toda a sua complexidade dependendo do tipo celular e da fase da maturação de oócitos bovinos. / The NOS/NO system seems to play an important role in oocyte maturation besides other functions. However, despite the evidence, there are few studies on the possible role of this system in bovine oocytes. It is known that NO acts via guanylate cyclase (GC) by stimulating the production of the nucleotide cGMP, which in turn can influence the levels of another nucleotide, cAMP, which is an important element of the signaling pathway of gonadotropins in oocytes and in the control of oocyte maturation. The aim of the present study was to investigate the involvement of the cGMP pathway in the action of the NOS/NO system on the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes and its effect on the cAMP pathway. The highest studied concentration of the NO donor (10-7M SNAP), only 36% of oocytes were able to undergo GVBD (P<0.05) after 9 hours of maturation. This delay was also observed with different concentrations of the GC stimulator (5, 10 or 50&mu;M Proptoporfirin IX) and the cGMP analogue (1, 2 and 4 mM 8-Br-cGMP), which had an average of 50% GVBD for treatment groups and 70% for control groups without drugs (P<0.05). At the beginning of maturation (0 h) cGMP levels were 5.29 pmol/oocyte and decreased within the first hour of culture to 2.97 pmol and 1.54 pmol in the control group and in oocytes cultured in 10-7M SNAP (NO donor) associated with 100&mu;M OQD (GC inhibitor; P<0.05). In the group of oocytes cultured only with SNAP, cGMP levels remained at 4.51 pmol/oocyte similar to the immature group (0 h culture, P> 0.05). The increase of NO maintained cGMP levels stable only during the first hours of maturation. After 3 and 6 h IVM, cGMP levels remained low and similar (0.01 to 2.5 pmol/ ocyte, P>0.05) in control (without drugs), treated with NO donor (SNAP 10-7M) with or without the guanylate cyclase inhibitor (100&mu;M OQD). A decrease in cAMP levels was also observed when compared with the immature group (32.42 fmol cAMP/oocyte) for the other groups (P <0.05), which showed 12.0 to 16.0 fmol cAMP/oocyte after the first hour, 3.3 to 8.0 fmol/oocyte after the third hour and 7.4 to 18.3 after the sixth hour of IVM (P>0.05). NO and cGMP may act to control gene expression in a series of proteins involved in control of the levels of cAMP and cGMP or their functions. The control may be a direct effect of NO (PKG2, PDE3, PDE4D and PDE8A), cGMP (ADCY6) or NO via cGMP (PKA1) and varies with the compartment considered (oocyte or cumulus cells). The results showed the interrelationship of the NO/cGMP/cAMP pathway and all its complexity depending on the cell type and the stage of maturation in bovine oocytes.