The nematode Auanema rhodensis has recently been established as a new model organism. A. rhodensis is characterized by the simultaneous existence of three phenotypical sexes (males, females and hermaphrodites; called trioecy), skewed sex ratios which do not follow Mendel's laws, and variant segregation patterns according to sex and type of gametogenesis. Recently, A. rhodensis has been used to study the possible mechanisms for sex determination in three-sexed species and the variability of basic processes during sexual reproduction including meiotic divisions. During male meiosis, a diploid primary spermatocyte undergoes two consecutive divisions to form four haploid spermatids. Surprisingly, male meiosis in A. rhodensis results in two functional and two nonfunctional spermatids depending on the presence of an X-chromatid. A. rhodensis males exhibit a set of paired autosomes and one single X-chromosome, like males of the wellestablished nematode model organism Caenorhabditis elegans. In contrast to C. elegans, however, the X-chromosome in A. rhodensis divides precociously into its sister chromatids during the first meiotic division followed by a lagging X-chromatid and its uneven distribution during meiosis II. Additionally, the second meiotic divi-sion within this species is characterized by an asymmetric organelle distribution and a spindle structure reminiscent of a monopolar spindle. In this study, serial section electron tomography was used to analyse the ultrastructure of the microtubule skeleton in spermatocytes of A. rhodensis. The analysis of spermiogenesis using electron tomography posed some key advantages compared to standard transmission electron microscopy. First, the microtubule (MT) network could be studied in detail including spindle formation, organization of spindle poles, rearrangement of MTs, and inter-action between MTs and chromosomes. Second, the number and shape of chromosomes could be visualized. And third, the morphology of organelles could be observed at high resolution, and different organelles as well as their distribution pattern could be distinguished and quantified. This study provides highresolution 3D information about male meiosis in A. rhodensis. The results of this thesis confirm the complexity of the male meiotic program and the promi-nent position of the X-chromatid in meiosis II in this organism. Like previous light microscopic studies, electron tomography supports the hypothesis of an X-chromatid-dependent distribution of cellular organelles such as fibrousbody membranousorganelles (FB-MOs) and mitochondria. Furthermore, the formation of an asymmetric spindle could be observed with progressing anaphase II and might be associated with the X-chromatid distribution. Additionally, the analysis of the number of chromosome-associating MTs and their association character gives new insights into possible chromosome segregation mechanisms. Finally, significant differences to the male meiotic program in C. elegans have been identified. For the first time, the MT network in A rhodensis spermatocytes of different division stages has been observed in detail, and several different analyses could be done, including an analysis of the length distribution of MTs in the spindles. Because this ultrastructural analysis is based on fixed samples, live-cell imaging should be performed in the future to gain further information on the chromosome dynamics in this species. / Der Fadenwurm Auanema rhodensis hat sich in den letzten Jahren mehr und mehr zu einem neuen Modellorganismus entwickelt. Typisch für A. rhodensis ist das zeitgleiche Vor-kommen dreier phänotypischer Geschlechter (Männchen, Weibchen und Hermaphroditen; die sogenannte Triözie) und deren zahlenmäßig ungleiches Verhältnis zueinander, welches sich nicht durch Mendelsche Regeln erklären lässt. Ebenfalls auffällig sind nach Geschlecht und Gametogenese (Oogenese oder Spermatogenese) abweichende chromosomale Segregationsmuster. Unlängst hat A. rhodensis zu Erkenntnissen über die Geschlechtsdeterminierung in dreigeschlechtlichen Arten und die Varianz grundlegender Prozesse in der Meiose beigetragen. Während der männlichen Meiose (Spermatogenese) teilt sich eine diploide primäre Vorläuferzelle (primäre Spermatozyte) in zwei aufeinanderfolgenden Teilungen in insgesamt vier haploide Spermatiden. Bei A. rhodensis führt die Spermatogenese ungewöhnlicher-weise zu zwei funktionalen und zwei nicht-funktionalen Spermatiden, wobei die Funktionsfähigkeit vom Auftreten eines X-Chromatids abhängt. Männchen von A. rhodensis besitzen, ähnlich wie im Modellorganismus Caenorhabditis elegans, eine Reihe gepaarter Autosomen sowie ein einzelnes X-Chromosom. Im Gegensatz zu C. elegans teilt sich das ungepaarte X-Chromosom in A. rhodensis vorzeitig schon während der ersten meiotischen Teilung in seine Chromatiden, wodurch es zu einer verzögerten und ungleichen Verteilung des X-Chromatids während der zweiten meiotischen Teilung kommt. Diese zweite meiotische Teilung bei A. rhodensis ist außerdem durch eine asymmetrische Verteilung der Organellen und Mikrotubuli gekennzeichnet, letztere ähneln einer monopolaren Spindel. In dieser Arbeit wurde die Methode der seriellen Elektronentomographie genutzt, um die Ultrastruktur der Mikrotubuli in meiotischen Spindeln in Spermatozyten von A. rhodensis zu untersuchen. Zum einen wurden mittels Elektronentomographie das Netzwerk der Mikrotubuli und die Spindelorganisation, die Struktur der Spindelpole sowie die Interaktion zwischen Mikrotubli und Chromosomen drei-dimensional (3D) analysiert. Zum anderen wurde die Form der Chromosomen und die Morphologie und Verteilung der verschiedenen Organellen quantitativ erfasst. Somit stellt diese Studie hochauflösende 3D-Information über den Ablauf der männlichen Meiose in A. rhodensis zur Verfügung und bestätigt damit die Komplexität der männlichen Meiose und die zentrale Rolle des X-Chromatids während der zweiten meiotischen Teilung in diesem Organismus. Basierend auf vorangegangenen lichtmikroskopischen Experimenten an fixierten Proben unterstützt die Elektronentomographie die Hypothese einer vom X-Chromatid abhängigen Verteilung zellulärer Organellen wie spermienspezifischer FB-MOs oder Mitochondrien während der zweiten meiotischen Teilung. Außerdem konnte die Ausbildung einer asymmetrischen Spindel beobachtet werden, welche ebenfalls mit der ungleichen Verteilung des X-Chromatids in Zusammenhang stehen könnte. Eine zusätzliche Analyse chromosomenassoziierter Mikrotubuli brachte erste Erkenntnisse über mögliche zugrundeliegende Mechanismen der Chromosomensegregation. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten mit ähnlichen Untersuchungen in C. elegans verglichen und Unterschiede herausgearbeitet werden. Zum ersten Mal wurden hier meiotische Spindeln unterschiedlicher Teilungsstadien in 3D untersucht und unterschiedliche quantitative Analysen zur Längenverteilung der Mikrotubuli durchgeführt. Da alle hier gewonnenen Ultrastrukturdaten auf fixierten Proben basieren, sollte eine Betrachtung einer transgenen Wurmlinie mit Fluoreszenzmarkern mittels live-cell imaging auf diese Ultrastrukturanalyse folgen.

Meiosis is a specialized cell cycle, which generates haploid gametes from diploid parental cells. During meiosis one round of cohesion establishment during premeiotic DNA replication mediates two rounds of chromosome segregation. During meiosis I homologous chromosomes separate, whereas sister chromatids segregate during the second meiotic division without an intervening round of DNA replication. Both rounds of chromosome segregation are triggered by an ubiquitin ligase called the Anaphase-Promoting Complex or Cyclosome (APC/C). APC/C-dependent destruction of securin/Pds1 is required to activate separase, a thiol protease that mediates chromosome segregation by cleavage of the cohesin complex. The first meiotic division is preceded by an extended prophase I, during which maternal and paternal chromatids undergo recombination. The persistence of cohesion during premeiotic S- and prophase I is essential for recombination and both meiotic nuclear divisions. In order to prevent premature loss of cohesion, the APC/C has to be inactivated during early meiosis. How the APC/C is kept inactive during premeiotic S- and prophase I was unknown. This question has been addressed by studying the APC/C subunit Mnd2 from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. This work demonstrates that Mnd2 is required for the persistence of cohesion during premeiotic S- and prophase I. Mnd2 prevents premature activation of the APC/C by the meiosis-specific substrate recognition factor Ama1. In cells lacking Mnd2, the APC/C-Ama1 enzyme triggers premature ubiquitin-dependent degradation of Pds1, which leads to premature separation of sister chromatids due to an unrestrained activity of separase. Thus, chromosome segregation during meiosis depends on both inhibition of a meiosis-specific APC/C and timely activation of APC/C- dependent proteolysis. / Die Meiose ist ein spezialisierter Zellzyklus, der zum Ziel hat haploide Gameten aus diploiden Vorläuferzellen zu produzieren. Dafür erfolgen nach der prä-meiotischen DNA Replikation zwei aufeinanderfolgende Kernteilungen. In der ersten meiotischen Teilung erfolgt die Trennung der homologen Chromosomen. In einer zweiten meiotischen Teilung werden dann die Schwesterchromatiden getrennt. Die Trennung der Chromosomen wird durch den Anaphase-Promoting Complex oder Cyclosome (APC/C), einer Ubiquitin Ligase, reguliert. Der APC/C initiiert den Abbau von Securin/Pds1, einem Inhibitor der Thiol-Protease Separase, welche für die Trennung der Chromosomen zum Beginn der Anaphase verantwortlich ist. In einer im Vergleich zur Mitose extrem langen meiotischen Prophase I findet Rekombination zwischen maternalen und paternalen Chromosomen statt. Für diesen Vorgang, sowie für die beiden folgenden meiotischen Teilungen, wird Kohäsion zwischen den Schwesterchromatiden benötigt. Ein frühzeitiger Verlust der Kohäsion führt zur frühzeitigen Trennnung der Schwesterchromatiden, wodurch aneuploide Gameten produziert werden können. Daher muss die Aktivität des APC/C während der meiotischen Prophase I inhibiert werden. Wie der APC/C während der Prophase I inaktiviert wird, war bisher unbekannt. Einsicht in dieses Problem ergab sich aus der Untersuchung der APC/C Untereinheit Mnd2 aus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Es wird gezeigt, dass Mnd2 für den Verbleib der Kohäsion zwischen den Schwesterchromatiden während der meiotischen S- und Prophase I benötigt wird. Während dieser Phase verhindert Mnd2 die frühzeitige Aktivierung der Meiose-spezifischen Form des APC/C-Ama1. In meiotischen Zellen, die kein Mnd2 besitzen, löst das APC/C-Ama1 Enzym die Ubiquitin-abhängige Zerstörung von Pds1 aus. Dies führt zu einer frühzeitigen Aktivierung von Separase, welches die Trennung der Schwesterchromatiden schon während der meiotischen S- und Prophase I zur Folge hat. Die korrekte Verteilung der Chromosomen hängt daher sowohl von der Inhibierung als auch der Aktivierung des APC/C ab.

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Meiosis is a specialized cell cycle, which generates haploid gametes from diploid parental cells. During meiosis one round of cohesion establishment during premeiotic DNA replication mediates two rounds of chromosome segregation. During meiosis I homologous chromosomes separate, whereas sister chromatids segregate during the second meiotic division without an intervening round of DNA replication. Both rounds of chromosome segregation are triggered by an ubiquitin ligase called the Anaphase-Promoting Complex or Cyclosome (APC/C). APC/C-dependent destruction of securin/Pds1 is required to activate separase, a thiol protease that mediates chromosome segregation by cleavage of the cohesin complex. The first meiotic division is preceded by an extended prophase I, during which maternal and paternal chromatids undergo recombination. The persistence of cohesion during premeiotic S- and prophase I is essential for recombination and both meiotic nuclear divisions. In order to prevent premature loss of cohesion, the APC/C has to be inactivated during early meiosis. How the APC/C is kept inactive during premeiotic S- and prophase I was unknown. This question has been addressed by studying the APC/C subunit Mnd2 from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. This work demonstrates that Mnd2 is required for the persistence of cohesion during premeiotic S- and prophase I. Mnd2 prevents premature activation of the APC/C by the meiosis-specific substrate recognition factor Ama1. In cells lacking Mnd2, the APC/C-Ama1 enzyme triggers premature ubiquitin-dependent degradation of Pds1, which leads to premature separation of sister chromatids due to an unrestrained activity of separase. Thus, chromosome segregation during meiosis depends on both inhibition of a meiosis-specific APC/C and timely activation of APC/C- dependent proteolysis. / Die Meiose ist ein spezialisierter Zellzyklus, der zum Ziel hat haploide Gameten aus diploiden Vorläuferzellen zu produzieren. Dafür erfolgen nach der prä-meiotischen DNA Replikation zwei aufeinanderfolgende Kernteilungen. In der ersten meiotischen Teilung erfolgt die Trennung der homologen Chromosomen. In einer zweiten meiotischen Teilung werden dann die Schwesterchromatiden getrennt. Die Trennung der Chromosomen wird durch den Anaphase-Promoting Complex oder Cyclosome (APC/C), einer Ubiquitin Ligase, reguliert. Der APC/C initiiert den Abbau von Securin/Pds1, einem Inhibitor der Thiol-Protease Separase, welche für die Trennung der Chromosomen zum Beginn der Anaphase verantwortlich ist. In einer im Vergleich zur Mitose extrem langen meiotischen Prophase I findet Rekombination zwischen maternalen und paternalen Chromosomen statt. Für diesen Vorgang, sowie für die beiden folgenden meiotischen Teilungen, wird Kohäsion zwischen den Schwesterchromatiden benötigt. Ein frühzeitiger Verlust der Kohäsion führt zur frühzeitigen Trennnung der Schwesterchromatiden, wodurch aneuploide Gameten produziert werden können. Daher muss die Aktivität des APC/C während der meiotischen Prophase I inhibiert werden. Wie der APC/C während der Prophase I inaktiviert wird, war bisher unbekannt. Einsicht in dieses Problem ergab sich aus der Untersuchung der APC/C Untereinheit Mnd2 aus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Es wird gezeigt, dass Mnd2 für den Verbleib der Kohäsion zwischen den Schwesterchromatiden während der meiotischen S- und Prophase I benötigt wird. Während dieser Phase verhindert Mnd2 die frühzeitige Aktivierung der Meiose-spezifischen Form des APC/C-Ama1. In meiotischen Zellen, die kein Mnd2 besitzen, löst das APC/C-Ama1 Enzym die Ubiquitin-abhängige Zerstörung von Pds1 aus. Dies führt zu einer frühzeitigen Aktivierung von Separase, welches die Trennung der Schwesterchromatiden schon während der meiotischen S- und Prophase I zur Folge hat. Die korrekte Verteilung der Chromosomen hängt daher sowohl von der Inhibierung als auch der Aktivierung des APC/C ab.

Der mitteleuropäische Wasserfroschkomplex umfasst Pelophylax lessonae (Genotyp LL), Pelophylax ridibundus (RR) und deren Hybriden Pelophylax esculentus (LR), der sich hemiklonal durch Rückkreuzen mit LL in lessonae-esculentus (L-E)-Populationen oder RR in ridibundus-esculentus (R-E)-Populationen reproduziert. Außerdem können Hybriden in reine Hybridpopulationen (E) bilden, in denen triploide Individuen die Elternarten funktionell ersetzen. Bislang ist wenig über die molekularen Mechanismen bekannt, die der klonalen Gametenbildung in der Keimbahn der Hybridform zugrunde liegen. In dieser Studie wurden erstmalig 160 Gene der Elternarten untersucht, die an der Gametenbildung beteiligt sind. Zusätzlich wurden 131 SNPs von 52 dieser Gene von 652 Wasserfröschen aus 26 Populationen analysiert. Im Ergebnis wurden 14 SNPs von 10 Genen entdeckt, deren Frequenzen mit dem Populationssystem assoziiert waren. In Übereinstimmung mit ihren Funktionen könnten diese Gene im Zusammenheng mit den system-spezifischen hybridogenetischen Reproduktionsmodi stehen. Sowohl transkriptomische als auch SNP-Daten lieferten Hinweise auf genetische Introgression, d. h. einen Transfer lessonae-spezifischer Allelen in den ridibundus-Genpool oder umgekehrt. Außerdem wurde bei P. lessonae eine kryptische genetische Diversität beobachtet. SNP-Analysen ergaben auch, dass LR-Individuen aus E-Populationen eine höhere genetische Ähnlichkeit mit LR-Individuen aus R-E als aus L-E-Populationen aufweisen. Diese Ergebnisse werfen die Frage nach dem Ursprung der E-Populationen auf, von denen bisher angenommen wurde, dass sie aus L-E-Populationen hervorgegangen sind. Die neuen molekularen Daten stehen mit den hemiklonalen Fortpflanzungsmodi von P. esculentus im Einklang und unterstreichen, dass diese wahrscheinlich auf komplexen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Genen und Faktoren basieren. / The Central European water frog complex comprises Pelophylax lessonae (genotype LL), Pelophylax ridibundus (RR), and their hybridogenetic hybrid Pelophylax esculentus (LR), which reproduces by backcrossing with LL in lessonae-esculentus (L-E) populations or RR in ridibundus-esculentus (R-E) populations. In addition, hybrids are able to reproduce in all-hybrid (E) populations in which triploid individuals functionally replace the parental species. To date, little is known about the molecular mechanisms underlying clonal gamete formation in the hybrid germline. In this study, 160 genes from P. lessonae and P. ridibundus known to be involved in gametogenesis were characterized for the first time. In addition, 131 single nucleotide polymorphisms (SNP) from 52 of these genes were analyzed, derived from 652 water frogs of 26 populations. As a result of logistic regressions, 14 SNPs of 10 genes were detected whose frequencies were associated with the population system. Consistent with their functions during gametogenesis, these genes can be considered as candidates associated with the system-specific hybridogenetic modes, i.e. clonal inheritance of the L and/or R genomes. Both transcriptomic and SNP data provided evidence for genetic introgression, i.e. a transfer of lessonae-specific alleles into the ridibundus gene pool or vice versa. In addition, cryptic genetic diversity was observed in P. lessonae. SNP analysis also revealed that LR individuals from E populations exhibit higher genetic similarity to LR individuals from R-E than L-E populations where triploid frogs do not occur. These findings raise the question of the origin of E populations, which were previously thought to have arisen from L-E populations after the emergence of triploid hybrids. The new molecular data are consistent with the reproductive modes of P. esculentus and emphasize that clonal inheritance is most likely caused by complex interactions of different genes and genetic factors.