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"Efeitos da melatonina sobre a produção de óxido nítrico em células endoteliais em cultura" / "Effects of melatonin in the production of nitric oxide in endothelial cells cultured"Tamura, Eduardo Koji 08 March 2006 (has links)
O hormônio melatonina produzido pela glândula pineal no período de escuro, participa na regulação circadiana de processos, fisiológicos e fisiopatológicos envolvendo vasos sanguíneos. Alguns destes estudos sugerem que as células endoteliais, que revestem os vasos sanguíneos são alvo para a melatonina circulante e medeiam a regulação do tônus vascular, em condições fisiológicas, e da interação neutrófilo-endotélio, em resposta a um estímulo injuriante. O óxido nítrico produzido pelas células endoteliais é um dos responsáveis por grande parte dos eventos vasculares, e a melatonina inibe a produção de óxido nítrico em diversos modelos. O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da melatonina na produção de óxido nítrico induzido por bradicinina em células endoteliais em cultura. Para tanto, utilizamos uma técnica de cultura primária de células endoteliais de rato e através de um marcador fluorescente de óxido nítrico intracelular, mensuramos a fluorescência em microscópio confocal. Foi verificado que a melatonina e seu precursor N-acetilserotonina inibem a produção de óxido nítrico induzido por bradicinina e este efeito não ocorre pela inibição do aumento de cálcio que induz a produção de óxido nítrico. O análogo de receptores MT2 (4P-PDOT) e MT3 (5-MCA-NAT) não provocaram qualquer alteração sobre o aumento de óxido nítrico induzido por bradicinina, e a utilização do antagonista de receptores MT1 e MT2 (luzindol) não reverteu o efeito inibitório da melatonina. Portanto, nossos dados indicam que o efeito da melatonina sobre a atividade da NOS constitutiva não é mediado por receptores de membrana. Considerando que a melatonina é capaz de ligar-se à calmodulina, inibindo desta maneira a atividade da NOS endotelial constitutiva, poderíamos sugerir que este seria o mecanismo de ação. No entanto, é preciso ressaltar que tal atividade não é comprovada para a N-acetilserotonina, assim, apesar de ser este um possível mecanismo de ação, há a necessidade de demonstrar que a N-acetilserotonina está se ligando a calmodulina extraída de células endoteliais. Em resumo, neste trabalho mostramos que a melatonina em concentrações compatíveis com o pico noturno encontrado na circulação, pode modular eventos vasculares no organismo, através da inibição da produção de óxido nítrico em células endoteliais induzida por bradicinina. / Melatonin, the hormone synthesized by the pineal gland at night, signalizes darkness and modulates, in a circadian basis, blood vessels activity. Previous studies suggest that endothelial cells are the target for circulating melatonin and mediate changes in vascular tone and leukocyte-endothelial adherence properties. Melatonin effects can be mediated by several pathways, such as G protein-coupled receptors (MT1 and MT2 receptors), a putative membrane receptor, most probably an enzyme-binding site (MT3 receptor), and several intracellular mechanisms, including calmodulin binding and inhibition of constitutive and induced nitric oxide synthase. The aim of the present study was to characterize melatonin effect on the production of nitric oxide by bradykinin-stimulated endothelial cells in culture. Nitric oxide production was measured in real time at cellular level by detecting fluorescent stimulation of the probe DAF by confocal microscopy. After determining the ideal conditions for recording cumulative dose-response curves for bradykinin (1 100 nM) the effect of pre-incubated (1 min) melatonin and analogs was evaluated. Melatonin and its precursor, N-acetylserotonin, but not the selective ligands for receptors MT2 (4P-PDOT) and MT3 (5-MCA-NAT) receptors inhibited bradykinin-stimulated nitric oxide production. This effect was not blocked by the classical antagonist of MT1 and MT2 receptors, luzindol; excluding therefore the participation of membrane receptors. Taking into account that melatonin inhibits calmodulin activation of several enzymes, including constitutive nitric oxide synthase in brain and cerebellum, it could be suggested a similar mechanism for endothelial cells. However, this hypothesis is discussed taking into account that N-acetylserotonin was shown to do not bind neural cells calmodulin. In addition, here we discuss the relevance of the present finding according to physiological and physiopathological roles of endothelial nitridergic system. This analysis point melatonin modulation of constitutive nitric oxide synthase activity as a putative mechanism for explaining melatonin control of vascular tone.
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Efeito da melatonina sobre a produção endotelial de óxido nítrico in vitro e in vivo / Melatonin effect on the endothelial nitric oxide production in vitro and in vivoTamura, Eduardo Koji 10 March 2009 (has links)
A melatonina é produzida pela glândula pineal somente durante o escuro e atinge rapidamente a circulação, além disso, outros tecidos e células são capazes de produzir melatonina. As células endoteliais, devido a sua localização, são excelentes alvos para as ações da melatonina. O entendimento dos mecanismos de ação pelos quais a melatonina desenvolve seus efeitos sobre as células endoteliais, possibilitaria o uso desta indolamina e de seus análogos como uma importante ferramenta farmacológica. No presente trabalho, demonstramos que a melatonina em concentrações compatíveis com as encontradas na circulação durante o pico noturno de produção pela pineal, atua sobre as células endoteliais inibindo a produção de NO proveniente da enzima constitutiva (eNOS), enquanto altas concentrações de melatonina, que podem ser atingidas por exemplo pela produção por células imunocompetentes ativadas, inibem a produção induzida de NO mediada pela iNOS. A melatonina (1 nM) inibe a produção constitutiva de NO induzida por agonistas que atuam através da ativação de receptores acoplados à proteína G (histamina, carbacol e ATP/P2Y), e este efeito deve-se à inibição do aumento de [Ca2+]i por liberação de estoques intracelulares, sendo independente da ativação de receptores de melatonina. A melatonina inibe os efeitos decorrentes da produção de NO induzida por bradicinina como a produção de GMPc por células endoteliais e a vasodilatação de arteríolas \"in vivo\". A melatonina inibe a produção de NO induzida por LPS também de maneira independente da ativação de seus receptores, porém, em concentrações muito maiores (1-10 µM) do que a necessária para inibir a produção constitutiva. Estes efeitos devem-se à inibição da expressão da enzima iNOS por impedir a translocação do NF-kB ao núcleo. A vasodilatação de aortas induzida por LPS também é inibida por melatonina. Podemos concluir até o momento que as células endoteliais, devido a sua localização, são excelentes sensores para as ações da melatonina e podem auxiliar no melhor entendimento do conceito \"eixo imune-pineal\". Os estudos sobre os mecanismos pelos quais a melatonina atua em condições fisiológicas e fisiopatológicas são essenciais para se conhecer o potencial terapêutico da melatonina. / Melatonin, the darkness hormone, produced at night by the pineal gland, is also synthesized in a non-rhythmic manner by other cells. Pineal and extra-pineal melatonin reaches endothelial layer, and the understanding of its mechanism of action will improve the possibilities of using this indolamine and derivates as pharmacological tools. Here we showed that melatonin, in concentrations compatible to nocturnal melatonin surge impairs the activity of eNOS, while much higher concentrations, which can be attained by activated immune competent cells, impair the induction of iNOS synthesis. As a consequence of inhibiting eNOS we showed that melatonin inhibits vasodilation of the microcirculation induced by bradykinin. The inhibitory effect of melatonin is observed only when eNOS is activated by triggering G protein-coupled receptors (bradykinin B2, muscarinic and P2Y purine receptors). Activation of eNOS by calcium-channel operated receptors (P2X) is not blocked by melatonin. Inhibition of the transcription of iNOS results in inhibition of the LPS-induced vasodilation of rat aorta. As a matter of fact, here we show that LPS effect is dependent on the endothelial layer. The mechanism of action of melatonin in inhibiting iNOS transcription is due to block of the NF-kB pathway. Our work contributed to unravel the role of endothelium cells as targets for melatonin and as a key player in the \"immune-pineal axis\". The understanding of the concentrations ranges reached by endogenous production, i.e., the discrimination between the levels achieved during physiological and physiopathological responses, are essential for using these substances as analogous therapeutical tools.
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Fator de transcrição NFKB em glândulas pineais de ratos / NFKB transcription factor in rat pineal glandsCecon, Erika 21 May 2010 (has links)
A glândula pineal é um órgão neuroendócrino que tranduz a informação fótica ambiental em sinal humoral pela produção noturna do hormônio melatonina. Recentemente, trabalhos de nosso grupo apontam para a existência de um eixo imunepineal, que considera não só a influência que a melatonina exerce sobre células imunocompetentes, mas também o efeito de mediadores da inflamação sobre a atividade biossintética da glândula. Foi demonstrado que a síntese de melatonina pode ser inibida por agentes pró-inflamatórios e potenciada por substâncias antiinflamatórias. Ambos os efeitos são dependentes da via do fator de transcrição NFKB, sendo que seu conteúdo nuclear nos pinealócitos está inversamente relacionado à produção de melatonina. Esta via de sinalização do NFKB foi inicialmente relacionada somente aos processos de resposta imunológica. Entretanto, seu envolvimento em processos fisiológicos tem sido cada vez relatado. A detecção desta via em glândulas pineais e da sua potencialidade em modular a síntese de melatonina induziu à pesquisa do possível papel fisiológico de NFKB neste órgão, objetivo da presente dissertação. Glândulas pineais obtidas de animais hígidos apresentam a via NFKB constitutivamente ativada, sendo que o conteúdo nuclear deste fator apresenta-se de forma rítmica ao longo do dia. Na fase de claro ambiental há um acúmulo nuclear gradativo, mas assim que inicia a fase de escuro os níveis nucleares de NFKB são bruscamente reduzidos e mantidos baixos durante toda a fase de escuro. Essa dependência do ritmo de NFKB com relação à informação fótica ambiental é, na verdade, consequência do efeito de ritmos hormonais atuantes sobre a essa via. A corticosterona induz a queda abrupta nos níveis nucleares deste fator no início do escuro, enquanto que a própria melatonina produzida pela pineal mantém essa inibição sobre a translocação nuclear de NFKB durante o restante da noite. Assim, postula-se que a regulação deste fator garanta a funcionalidade fisiológica da glândula, uma vez em que alterações no seu conteúdo nuclear resultam em alterações na produção de melatonina. Além disso, tais dados abrem novas perspectivas quanto aos mecanismos regulatórios da atividade da pineal por agentes que atuam via NFKB / The pineal gland is a neuroendocrine organ that transduces the environmental photic information into humoral signals through the nocturnal production of melatonin. Recently, our group have showed the existence of a Immune-pineal axis, that consider not only the melatonin effects on immunocompetent cells, but also the effect of inflammatory mediators on the biosynthetic activity of the pineal gland. It was shown that the melatonin production can be inhibited by pro-inflammatory agents and potenciated by the anti-inflammatory ones. Both effects rely on the NFKB nuclear factor pathway, since its nuclear content in pinealocytes is inversely related to melatonin production. The NFKB pathway was firstly related only to the immune response processes. However, its role in several physiological functions is well documented nowadays. The detection of this pathway in pineal glands and the detection of its modulatory effects on melatonin production lead to the investigation of the putative physiologic role of NFKB in the gland, which was the aim of this project. Pineal glands from healthy animals show NFKB pathway constitutively activated and its nuclear contents show a rhythm through out the 24h of the day. During the light phase, the amount of NFKB increases continuously and a sharp drop occurrs when lights are turned off and there is low level of nuclear NFKB all night long. Actually, the relation between the NFKB rhythm and the light/dark cycle is dependent on endogenous hormonal rhythms. Corticosterone induces the abrupt drop in nuclear NFKB at the beginning of the dark phase, while the pineal melatonin keeps this inhibitory effect through the night. Therefore, it is suggested that the control of NFKB nuclear translocation is required to the physiological function of pineal gland, since any alteration on its nuclear content results in alteration on melatonin production. In addition, these data opens new perspectives on the regulatory mechanisms of the pineal biosynthetic activity by agents that act through the NFKB pathway
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Sistema melatonérgico como alvo do peptídeo β-amiloide / The melatonergic system as a target of amyloid-β peptideCecon, Erika 02 July 2014 (has links)
A doença de Alzheimer (AD) é a doença neurodegenerativa relacionada ao envelhecimento mais frequente no mundo. Uma das características moleculares de AD é a produção exacerbada de peptídeos beta-amiloide (Aβ), principalmente dos fragmentos de 40 e 42 aminoácidos (Aβ1-40 e Aβ1-42). Aβ induz respostas neuroinflamatórias e alterações moleculares relacionadas à perda sináptica e morte neuronal. Diversos relatos mostram que pacientes de AD apresentam redução na concentração plasmática de melatonina, hormônio produzido pela glândula pineal e também alteração na expressão dos receptores de melatonina, mas os mecanismos envolvidos ainda não são conhecidos. De acordo com o conceito do eixo imunepineal, agentes inflamatórios são capazes de atuar diretamente sobre a glândula pineal e inibir a síntese de melatonina. No presente estudo investigamos, portanto, se o peptídeo Aβ atua diretamente sobre o sistema melatonérgico, modulando a síntese de melatonina ou a função de seus receptores. Pineais em cultura tratadas com Aβ 1-40 ou Aβ 1-42 apresentaram redução na produção de melatonina. Aβ 1-40 ativou a via do fator de transcrição NF-κB na pineal, resultando em aumento da transcrição de diversos genes inflamatórios, como interleucinas e quimiocinas, e inibição da expressão da enzima arilalquilamina N-acetiltransferase, essencial à síntese de melatonina. Em células HEK293 expressando estavelmente receptores MT1 ou MT2 recombinantes, a ativação da via ERK1/2 pela melatonina foi inibida tanto por Aβ 1-40 quanto por Aβ 1-42. O mesmo efeito inibitório foi observado em células endoteliais primárias que expressam MT1 e MT2 constitutivamente. O presente trabalho mostra que a síntese de melatonina pela pineal e a função dos receptores de melatonina são diretamente regulados por Aβ, o que amplia nossos conhecimentos a respeito dos efeitos prejudiciais de Aβ. Considerando que a melatonina tem propriedades neuroprotetora e antioxidante, a disfunção do sistema melatonérgico pode contribuir para os processos neurodegenerativos que ocorrem na patologia de AD / Alzheimer\'s disease (AD) is the most common age-related neurodegenerative disorder worldwide. Excess of amyloid beta peptides (Aβ), composed mainly by 40 and 42 aminoacids-long fragments (Aβ 1-40 e Aβ 1-42) is a molecular hallmark in AD. Aβ-induced neuroinflammatory responses and molecular changes are related to synapse impairment and neuronal loss. It is well documented that AD patients show impaired melatonin synthesis, the pineal gland-derived hormone, and altered expression of melatonin receptors, but the underlying mechanisms remain unclear. According to the immune-pineal axis concept, inflammatory mediators act on the pineal gland, leading to inhibition of melatonin synthesis. Therefore, in the present study we sought to investigate whether Aβ? directly targets the melatonergic system, modulating melatonin synthesis and/or melatonin receptors function. Pineal glands cultured in the presence of Aβ 1-40 or Aβ 1-42 showed reduced melatonin production. Aβ 1-40 activated the nuclear factor kappa B (NF-κ B) pathway in the pineal gland, leading to up-regulation of several inflammatory genes, as interleukins and chemokines, and inhibition of the arylalkylamine N-acetyltransferase enzyme expression, the key enzyme in melatonin synthesis. In HEK293 cells stably expressing recombinant melatonin MT1 or MT2 receptors melatonin-induced ERK1/2 activation was markedly impaired by Aβ 1-40 and Aβ 1-42. Similar results were obtained in primary culture of endothelial cells expressing melatonin receptors endogenously. The present study shows that melatonin synthesis and melatonin receptors function are directly impaired by Aβ, thus extending our understanding on the detrimental effects of Aβ. Because melatonin shows neuroprotective and antioxidant properties, impairment of the melatonergic system may contribute to the neurodegenerative processes that take place in AD. 1-42) is a molecular hallmark in AD. Aβ-induced neuroinflammatory responses and molecular changes are related to synapse impairment and neuronal loss. It is well documented that AD patients show impaired melatonin synthesis, the pineal gland-derived hormone, and altered expression of melatonin receptors, but the underlying mechanisms remain unclear. According to the immune-pineal axis concept, inflammatory mediators act on the pineal gland, leading to inhibition of melatonin synthesis. Therefore, in the present study we sought to investigate whether Aβ?directly targets the melatonergic system, modulating melatonin synthesis and/or melatonin receptors function. Pineal glands cultured in the presence of Aβ 1-40 or Aβ 1-42 showed reduced melatonin production. Aβ 1-40 activated the nuclear factor kappa B (NF-&kappa B) pathway in the pineal gland, leading to up-regulation of several inflammatory genes, as interleukins and chemokines, and inhibition of the arylalkylamine N-acetyltransferase enzyme expression, the key enzyme in melatonin synthesis. In HEK293 cells stably expressing recombinant melatonin MT1 or MT2 receptors melatonin-induced ERK1/2 activation was markedly impaired by Aβ 1-40 and Aβ 1-42. Similar results were obtained in primary culture of endothelial cells expressing melatonin receptors endogenously. The present study shows that melatonin synthesis and melatonin receptors function are directly impaired by Aβ, thus extending our understanding on the detrimental effects of Aβ. Because melatonin shows neuroprotective and antioxidant properties, impairment of the melatonergic system may contribute to the neurodegenerative processes that take place in AD
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Melatonina e termorregulação. / Melatonin and thermoregulation.Mendes, Caroline 20 September 2017 (has links)
A melatonina desempenha funções fisiológicas importantes, como o aumento da capacidade de termogênese do tecido adiposo marrom. Além dos depósitos adiposos branco e marrom, há um terceiro tipo, as células adiposas beges. Presentes no tecido adiposo branco, apresentam características semelhantes aos adipócitos marrons via um processo denominado browning que está relacionado com a termogênese e aumento do gasto energético. Diante disso, o objetivo deste estudo foi investigar o papel da melatonina sobre a regulação da temperatura corporal em animais idosos obesos da linhagem Wistar que apresentam produção de melatonina prejudicada. Por 16 semanas os animais foram divididos nos grupos controle e suplementado com melatonina e viu-se que os adipócitos marrons e beges atuam de forma coordenada e complementar para garantir a produção de calor de maneira adequada e que a melatonina tem papel importante nos mecanismos termorregulatórios, assegurando maior capacidade de suportar ao frio e, ainda, participando da regulação do balanço energético. / The hormone melatonin plays several physiological functions, one of them is the increase of thermogenesis capacity of brown adipose tissue. In addition to white and brown adipose deposits, there is also a third type, the beige adipocyte, which presents similar characteristics to brown adipocytes, induced in a process called browning. This process is related to thermogenesis and the increase of energy expenditure. Thus, the aim of this study was to investigate the role of melatonin on the regulation of body temperature in elderly obese animals that have impaired production of melatonin. Male-Wistar were divided into control group and group supplemented with melatonin, and the experimental protocol lasted 16 weeks. The main results showed that brown and beige adipocytes act in a coordinated and complementary way to ensure adequate heat production and that melatonin plays an important role in the thermoregulatory mechanisms, ensuring greater capacity to withstand the cold and, also, participating in the regulation of the energy balance.
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Efeito da estimulação purinérgica sobre a produção de melatonina em macrófagos da linhagem RAW 264.7 / Purinergic stimulation effect on melatonin production in RAW 264.7 macrophages lineageGarcia, Letícia D\'Argenio 22 February 2016 (has links)
A melatonina é um hormônio produzido de forma rítmica e no período de escuro pela glândula pineal bem como de forma não rítmica por diversos tecidos e células imunocompetentes. É sintetizada pela acetilação e metilação da serotonina pela ação das enzimas arilalquilamina N-acetiltransferase (AA-NAT) e acetilserotonina -O-metiltransferase (ASMT) que levam à formação de N-acetilserotonina (NAS) e melatonina (MEL), respectivamente. Nos últimos anos temos demonstrado que síntese de melatonina pela pineal pode ser negativamente modulada por mediadores inflamatórios e pelo ATP que atua como co-transmissor juntamente com a noradrenalina liberada no terminal nervoso simpático que a inerva. Perifericamente, contudo, estes mediadores inflamatórios apresentam um efeito contrário induzindo a produção de melatonina em células imunocompetentes. Estas observações levaram à criação da hipótese de um eixo imune-pineal. Esse trabalho teve como objetivo verificar o efeito do ATP sobre produção de melatonina em macrófagos da linhagem RAW 264.7 Os dados desse trabalho mostram que o ATP é capaz de induzir de maneira dose dependente a produção de melatonina em macrófagos através da modulação das enzimas AA-NAT e ASMT. Foi demostrado também que esse efeito é mediado pelo receptor P2X7 e que a melatonina produzida age autocrina e paracrinamente aumentando a fagocitose de particulas de zimosan. Com isso, podemos concluir que o ATP é um ativador endógeno do eixo imune-pineal / During the dark phase, melatonin is produced rhythmically by the pineal gland. Besides, a non rhythmical production is observed in several tissues and immunocompetent cells. In both scenarios, melatonin biosynthetic pathway is dependent on serotonina methylation by the action of arylalkylamine N-acetyltransferase (AA-NAT), leading to the formation of N-acetylserotonin (NAS), which will be a further target for acetylserotonin O-methyltransferase (ASMT), the last step in melatonin synthesis. In the last years, we have demonstrated that melatonin synthesis by the pineal gland may be negatively modulated by inflammatory mediators such as adenosine triphosphate (ATP), which also acts as co-transmitter released along with noradrenalin by the sympathetic nerve terminals. However, these inflammatory stimuli have the opposite effect inducing melatonin production in immunocompetent cells. These observations led us to the hypothesis of an immune-pineal axis. Therefore, this study aimed to investigate if the ATP was able to induce melatonin production in RAW 264.7 macrophages. ELISA assays demonstrate that high doses of ATP induce melatonin synthes. Accordingly, ATP is able to induce an increase in the expression of AA-NAT as well as the ASMT. Herein, we also demonstrated that this effect is mediated by P2X7 receptor, and melatonin-ATP induced acted as an autocrine and paracrine message that increases the phagocytosis of zymosan particles. Therefore, we conclude that ATP is an endogenous activator of the RAW 264.7
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Modulação da expressão dos genes para melanopsina, clock, per1, per2 e bmal1 por melatonina em melanóforos dérmicos do anfíbio Xenopus laevis / Modulation of the expression of melanopsin, clock, per1, per2 e bmal1 , and by melatonin in dermal melanophores of Xenopus laevisBluhm, Ana Paula Canel 11 July 2008 (has links)
O ritmo diário de atividade é uma característica de todos os organismos vivos, que tem a capacidade de se orientar no tempo e no espaço, e distinguir entre tempo linear e tempo cíclico. O ciclo claro:escuro é um importante indicador circadiano para todos os organismos. O trabalho do relógio circadiano envolve mecanismos de retroalimentação positiva e negativa dos genes CLOCK e BMAL1 (brain and muscle Arnt-like protein 1) que formam um heterodímero, funcionando como fator de transcrição para a expressão dos genes per (period), cry (cryptochrome) e o receptor órfão REV-ERB. Em geral, o ciclo circadiano tem início nas primeiras horas da manhã com a ativação da transcrição de per e cry por CLOCK/BMAL1. A periodicidade do relógio circadiano resulta da combinação entre retroalimentação transcricional positiva e negativa destes genes. Hoje já se sabe que os vertebrados, além do relógio central (NSQ) possuem vários relógios, distribuídos pelo corpo, os chamados relógios periféricos. A resposta ao estímulo luminoso é resultado da interpretação da informação luminosa por diferentes tipos celulares. A molécula fotorreceptora de melanóforos dérmicos embrionários de X. laevis foi denominada melanopsina (Opn4/Opn4). Neste anfíbio, cones e bastonetes, continuam a exibir ritmo circadiano em cultura durante vários dias, e a sua capacidade de se ajustar pelo estímulo luminoso indica a presença do sistema circadiano. Os objetivos deste projeto foram: verificar qual é o padrão de expressão para Opn4, per1, per2, bmal1 e clock em melanóforos de X. laevis submetidos a diferentes fotofases; verificar se a expressão para Opn4, per1, per2 ,bmal1 e clock nos melanóforos de X. laevis é modulada pela melatonina. Opn4, per1, per2 ,bmal1 e clock Dados obtidos no presente estudo demonstram que nesta linhagem celular estes genes apresentam um padrão de expressão aparentemente rítmico, quando estas células são expostas a um ciclo claro:escuro (14C:10E), que difere do padrão obtido quando mantidas em regime de escuro constante. Em geral, estas células mantidas em escuro constante durante 5 dias tendem a apresentar aumento de expressão de RNAm para estes genes e, quando mantidas em escuro constante também durante 5 dias, mas com adição de melatonina por 1h, 24 h antes de sua extração, estes níveis de RNAm tendem a diminuir. Porém, quando comparamos as três situações, podemos observar que a adição da melatonina restaura, em geral, o padrão de expressão dos genes analisados em 14C:10E. O conjunto de resultados, que obtivemos em melanóforos dérmicos de Xenopus laevis, sugere que esta linhagem celular possue características de relógio periférico. / The daily rhythm of activity is a characteristic of all living organisms, which have the ability of to behave accordingly time and space, and distinguish between linear and cyclic time. The dark:light cycle is an important time cue for all organisms. The work of circadian clock involves mechanisms of positive and negative feedback of CLOCK and BMAL1 which as a heterodimer act as a transcription factor for the expression of per (period), cry (cryptochrome) and the orphan receptor REV-ERB. A typical circadian cycle begins in the first hours of daytime, which the activation of the transcription of per and cry by CLOCK/BMAL1. It is well known that the vertebrates, besides the central clock (SCN), have several other clocks distributed by the body, the so called peripheric clock. The responses to light are the result of the interpretation of light signal by several cell types The photoreceptor molecule in the dermal melanophores of X. laevis was denominated melanopsin (Opn4/Opn4). In this amphibian, rods and cones maintain circadian rhythm during several days in culture, and their ability to synchronize by light suggest the presence of a circadian system. The objectives of this project were: verify the expression pattern for Opn4, per1, per2 ,bmal1 e clock in dermal melanophores of X. laevis, under different photo phases; and verify whether the expression for Opn4, per1, per2, bmal1 and clock were modulated by melatonin. Our data show that these genes have a rhythmic pattern expression, when these cells are under a 14L:10D, which is different from the pattern exhibited in constant dark. In general, these cells in constant dark have a higher mRNA expression, and in the same condition, but with melatonin applied for 1h, 24h before the data collect, these mRNA levels are lower. However, when we compared these three different experimental conditions, we observed that melatonin resets, in overall, the expression pattern of 14L:10D. These data, taken together, suggest that Xenous laevis dermal melanophores have characteristics of a peripheric clock.
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Modulação dos níveis plasmáticos de corticosterona e imunocompetência em resposta ao tratamento exógeno com ACTH em Hypsiboas faber / Modulation of plasma corticosterone levels and immunocompetence in response to exogenous treatment with ACTH Hypsiboas faberBarsotti, Adriana Maria Giorgi 15 December 2014 (has links)
Em resposta a diversos estressores, o hipotálamo de anfíbios secreta o hormônio liberador de corticotropina (CRH), o qual estimula a hipófise a liberar o hormônio adrenocorticoctrópico (ACTH) na corrente sanguínea. O ACTH, por sua vez, atua na glândula inter-renal estimulando a liberação de glicocorticoides, sendo a corticosterona o principal glicocorticoide em anfíbios. Embora a modulação exercida pelos glicocorticoides de diversas respostas fisiológicas de estresse seja fundamental para a manutenção da homeostase em curto prazo, a ativação muito frequente e/ou prolongada do eixo hipotálamo-hipófise-interrenais (HHI) pode inibir processos importantes em longo prazo, tais como a reprodução e a imunocompetência e afetar a síntese de melatonina atuando diretamente sobre a pineal. O objetivo do presente estudo foi avaliar possíveis alterações nos níveis plasmáticos de corticosterona, testosterona, níveis oculares de melatonina, hematócrito e aspectos imunitários (contagem total de leucócitos e capacidade antimicrobiana plasmática - contra Escherichia coli) de machos da perereca Hypsiboas faber em resposta à injeção de ACTH, bem como o curso temporal destas respostas. Amostras de sangue e plasma foram obtidas a partir de 30 machos capturados em campo, dentro de 3 minutos da captura. Os animais foram trazidos para o laboratório e, após dois meses, divididos em seis grupos para serem amostrados em três horários distintos 1 h, 3h e 6h após o tratamento. Para cada horário um grupo controle e um grupo experimental foram adicionados, recebendo uma injeção de 105 μL de solução salina ou de solução de ACTH (0,446 μg de ACTH/g de massa corpórea (grupo experimental)). O tratamento com ACTH aumentou significativamente os níveis plasmáticos de corticosterona e diminuiu os níveis plasmáticos de testosterona bem como os níveis oculares de melatonina após 1 hora. Após 6 h da injeção de ACTH, houve um aumento da porcentagem do hematócrito e dos níveis de melatonina ocular. O tratamento com ACTH não afetou os aspectos imunitários estudados dentro do intervalo amostrado. Os resultados confirmam o papel da ativação do eixo HHI na inibição da secreção de testosterona e na modulação da secreção de melatonina, embora os possíveis efeitos imunomodulatórios possam se dar em intervalos temporais mais tardios / In response for several stressors, the amphibian hypothalamus release the corticotrophin release hormone (CRH), which stimulates pituitary to release the adenocorticotropic hormone (ACTH) in the bloodstream. The ACTH, in your turn, acts in inter renal glands stimulating the glicocorticoids releasing, being the corticosterone the main glicocorticoid in anphibians. While the modulation exercised by the glicocorticoids of diverses physiological responses of the stress is fundamental for de maintainance of homeostasis in short period, the frequent and/or prolongued activation of the hypothamlamus pituitary interenal axis (HHI) could inhibit important process in long periods, as the reproduction and immunocompetence and affect melatonin synthesis acting directly in pineal gland. The objective of the present study was evaluate possible alterations in plasmatic corticosterone levels, testosterone, eyes melatonin levels, hematocrit and immunity aspects (Total count leucocytes and antimicrobian plasmatic capacity - against Escherichia coli) from males of the treefrog Hypsiboas faber in response to ACTH injection, as well, the temporal course of these responses. Blood and plasma samples were obtained from the 30 males captured in the field, whitin 3 minutes from the capture. The animals were transferred to the laboratory and, after two months, divided in six groups to be sampled in three different times 1 h, 3 h and 6 h after treatment. For each time one control group and one experimental group were added, receiving one injection of 105 μL of saline or ACTH solution (0,446 μg de ACTH/g of body mass (experimental group)). The ACTH treatment increase significantly the plasmatic corticosterone levels and decrease the plasmatic testosterone levels, as well, the eye melatonin levels after one hour. After six hours of the ACTH injection, occurred the increase of the hematocrit percentage and the eye melatonin levels. The ACTH treatment did not affect the immunity aspects studied in the sampling interval. The results confirm the role of the activation on the axis HHI in the inhibition of the testosterone secretion and in the modulation of melatonin secretion, althougth the possible immunomodutatory effects could happen in temporal intervals later
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Expressão gênica temporal de Melanopsina (Opn4), Clock, Cry e Per e sua regulação por melatonina em células de Danio rerio / Temporal gene expression of melanopsin (Opn4), Clock, Cry and Per and regulation by melatonin in Danio rerio cellsMartins, Cássia Borges Lima Bulhões 17 December 2007 (has links)
Determinamos a presença de RNA mensageiro de melanopsina em células embrionárias ZEM-2S por PCR, o que foi confirmado por sequenciamento. Os experimentos de PCR para receptores de melatonina em cDNA de células ZEM-2S sugeriram a presença do subtipo MT2 em células ZEM-2S. Não foram identificadas bandas correspondentes ao peso esperado para MT1 ou Mel 1C. A identidade do receptor MT2 em ZEM-2S foi confirmada por sequenciamento. Determinamos ainda que, em células embrionárias ZEM-2S, os seis genes Cry conhecidos para Danio rerio estão expressos. Quando as células ZEM-2S foram expostas ao regime de claro e escuro (12C:12E), a expressão de melanopsina apresentou dois picos: no início da fase de claro ZT3, e no início da fase de escuro ZT12. Estes picos foram mantidos quando as células foram submetidas a escuro constante e, curiosamente, em todos os ZTs houve aumento significativo de expressão quando comparados aos ZTs equivalentes das células submetidas a ciclo claro:escuro. Melanopsina não apresentou ritmicidade de expressão em células ZEM-2S em nenhuma das condições. No entanto, há uma tendência a ritmicidade em células mantidas em 12C:12E, que desaparece em escuro constante. O pulso de melatonina aparentemente estimulou a expressão na fase de escuro subjetivo, mas sem significância estatística. O RNAm de Clock não exibiu ritmo em células ZEM-2S mantidas em condições de 12C:12E, escuro constante, ou em escuro constante recebendo pulso de melatonina. Há no entanto visível tendência a aumento de expressão na escotofase e durante o escuro subjetivo, a qual é abolida pelo pulso de melatonina. O RNAm de Per 1 e Cry 1b apresentou marcada ritmicidade em células submetidas a fotoperíodo 12C:12E. Vê-se aumento significativo 3 horas antes do início da fase de luz (ZT21), e acentuado declínio na fase de escuro. Em escuro constante, a ritmicidade de Per1 e Cry1b foi grandemente atenuada, mas persistiu. O pulso de melatonina foi ineficaz em recuperar a amplitude da ritmicidade observada em 12C:12E, e ainda mais, aboliu a ritmicidade para ambos os genes. Após um pulso de melatonina, os genes Clock, Per1 e Cry1b de células ZEM- 2S perderam a expressão rítmica que ainda persistia em escuro constante. É provável que melatonina, semelhantemente ao observado em outras preparações, iniba a fosforilação de CREB nas células ZEM-2S, assim reduzindo a ativação dos promotores dos genes do relógio. De qualquer forma, poderíamos interpretar que a melatonina traz os genes de relógio para um mesmo patamar, dessa forma reajustando o ritmo, independente da fase. Nosso estudo traz contribuições importantes para o conhecimento da fisiologia de relógios periféricos e abre novas perspectivas para futuras investigações sobre mecanismos subjacentes a ritmos em células isoladas e sua regulação por hormônios e luz. / The presence of melanopsin mRNA in ZEM-2S embryonic cells was determined through PCR, followed by sequencing. PCR experiments for melatonin receptors with ZEM-2S cell cDNA suggested the presence of the MT2 subtype. Bands corresponding to the expected weight for MT1 or Mel 1C were not identified. The identity of the MT2 receptor in ZEM-2S was confirmed through sequencing. We have also determined that the six Cry genes known in Danio rerio are expressed in ZEM-2S embryonic cells. When ZEM-2S cells were submitted to a light:dark (12L:12D) cycle, melanopsin expression presented two peaks, one at the beginning of the light phase (ZT3), the other at the beginning of the dark phase (ZT12). These peaks of expression remained when the cells were kept under constant darkness, and interestingly, a significant rise in expression was found in all ZTs when compared with the corresponding ZTs of cells kept under the light:dark cycle. Melanopsin did not exhibit a rhythmic expression in ZEM-2S cells in none of the conditions. However, there is a tendency of a rhythm in cells kept under 12L:12D, which disappears under constant darkness. Melatonin pulse seems to stimulate the expression during the subjective dark phase, but without any statistical significance. Clock mRNA did not present a rhythm in ZEM-2S cells kept either under 12L:12D, constant darkness or constant darkness with a melatonin pulse. However, there is a tendency of a rise in expression during the dark phase and during the subjective darkness, which is abolished by the melatonin pulse. Per 1 and Cry 1b mRNAs presented a robust rhythmicity in cells kept under 12L:12D. There is a significant rise three hours before the beginning of the light phase (ZT21), and sharp fall during the dark phase. Under constant darkness, Per1 and Cry1b rhythmicity, although present, was greatly attenuated. Melatonin pulse was not able to recover the amplitude observed under 12L:12D, moreover, it abolished rhythmicity of both genes. After melatonin pulse, Clock, Per1 and Cry1b genes in ZEM-2S cells lost the rhythmic expression, which still persisted under constant darkness. It is possible that 48 melatonin, as observed in other preparations, inhibits the phosphorylation of CREB in ZEM-2S cells, reducing the activation of the Clock genes promoters. Anyway, one could interpret that melatonin brings the Clock genes to the same level, therefore resetting the rhythm, independently of the phase. This study brings important contributions to the understanding of peripheral Clock physiology and opens new perspectives for future investigations of the underlying mechanisms of rhythms in isolated cells and their regulation by hormones and light.
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Análise in vitro e in vivo da ação conjunta dos hormônios Dehidroepiandrosterona (DHEA) e Melatonina (MEL) contra Trypanosoma cruzi / Evaluation in vitro and in vivo of the combined action of the hormones Dehydroepiandrosterone (DHEA) and Melatonin (MEL) against Trypanosoma cruzi.Kuehn, Christian Collins 04 September 2009 (has links)
Estudos prévios mostram que tanto a melatonina (MEL) como a Dehidroepiandrosterona (DHEA) aumentaram a resposta imune contra distintos parasitas. O presente estudo investigou a atividade in vitro da MEL e DHEA associados em um período de 24 horas e in vivo durante o curso da infecção por T. cruzi. A atividade in vitro da MEL e DHEA sozinhos, bem como juntos foram testados sobre formas tripomastigotas (doses variando de 0.5, 8, 20, 32, 40 to 128 µM). In vitro, tanto MEL como DHEA sozinhos não mostraram qualquer atividade contras formas tripomastigotas, embora quando utilizadas em concentrações mais elevadas, a associação de MEL e DHEA mostrou-se ativa contra formas tripomastigotas do parasita. Entretanto, para estas altas concentrações, verificou-se alta toxicidade sobre os macrófagos peritoneais. Para avaliação in vivo, ratos machos Wistar foram infectados com a cepa Y de T. cruzi. Os animais foram oralmente tratados com 5 mg/kg peso corpóreo/dia de MEL e de forma subcutânea com 40mg/kg peso corpóreo/dia de DHEA. Tratamento com MEL, DHEA e associado mostrou uma redução significante no número de tripomastigotas sangüíneos durante a fase aguda da infecção quando comparado aos animais não trados (P<0.05). Um significante aumento no número de macrófagos e concentração de óxido nítrico (NO) foram observados durante o pico da parasitemia apenas com MEL ou combinado com DHEA. Entretanto, observou-se que o DHEA sozinho aumentou a concentração de NO (P<0.05), bem como os níveis de TNF-alfa durante a infecção (P<0.05). Estes resultados mostram que a MEL, DHEA ou a associação de ambos reduz a parasitemia durante a fase aguda de infecção. A ação combinada de ambos os hormônios não exerceu uma ação sinérgica sobre a magnitude da resposta imune do hospedeiro, ficando o DHEA como a substância que induziu a resposta imune mais eficiente. / Previous studies show that melatonin (MEL) and dehydroepiandrosterone (DHEA) enhances the immune response against parasitic pathogens. The present study investigated the in vitro activity of MEL and DHEA association in a period of 24 hours and in vivo during the course of T. cruzi infection. The in vitro activity of MEL and DHEA alone, as well as together, were tested for the trypomastigote forms (doses ranging from 0.5, 8, 20, 32, 40 to 128µM). In vitro, nor MEL nor DHEA alone did not show any activity against trypomastigote forms, although when the highest concentration of MEL and DHEA association was used, it was active against the trypomastigote forms of the parasite. However, for this concentration, a quite toxicity on peritoneal macrophages was observed. For in vivo evaluation, male Wistar rats were infected with the Y strain of T. cruzi. They were orally treated with 5mg/kg body weight/day of MEL and subcutaneously with 40mg/kg body weight/day of DHEA. Treatment with MEL, DHEA and the association showed a significant reduction in the number of blood trypomastigotes during the acute phase of infection as compared to untreated animals (P<0.05). A significant increase in the number of macrophages and nitric oxide (NO) concentrations were observed during the peak of parasitemia with MEL alone or combined with DHEA. However, with DHEA alone, the highest concentration of NO was observed (P<0.05). Moreover, DHEA treatment increased TNF-alpha levels during infection (P<0.05). These results show that MEL, DHEA or the association of both reduces parasitemia during the acute phase of infection. The combined action of both hormones did not exert a synergic action on the hosts ability to fight infection, and it seems that among all treatments DHEA induces a more efficient immune response.
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