A ferrugem da folha é a moléstia de maior importância econômica para a cultura da aveia e a resistência qualitativa, geralmente utilizada para o seu controle, apresenta pouca durabilidade. A utilização de resistência parcial, caracterizada pelo progresso lento da moléstia, tem sido reconhecida como alternativa para obtenção de genótipos com resistência mais durável. Os objetivos deste trabalho foram determinar o progresso da ferrugem, o controle genético da resistência, e identificar marcadores moleculares associados a essa resistência, em várias gerações e anos. Populações F2, F3, F4, F5 e F6 do cruzamento UFRGS7/UFRGS910906 (sucetível/parcialmente resistente) (1998, 1999 e 2000) e F2 do cruzamento UFRGS7/UFRGS922003 (1998), foram avaliadas a campo quanto à porcentagem de área foliar infectada, para determinar a área sob a curva do progresso da doença (ASCPD). Mapeamento molecular, com marcadores AFLP (amplified fragment length polymorphism), foi realizado em F2 e F6, do primeiro cruzamento, identificando marcadores associados à resistência quantitativa (“quantitative resistance loci” ou QRLs). Resultados de três anos evidenciaram alta influência do ambiente na expressão da resistência, apresentando, entretanto, variabilidade genética para resistência parcial nas populações segregantes. A distribuição de freqüências do caráter ASCPD nas linhas recombinantes F5 e F6 foi contínua, indicando a presença de vários genes de pequeno efeito em seu controle. Estimativas de herdabilidade variaram de moderada a alta. O mapa molecular F2 foi construído com 250 marcadores, em 37 grupos de ligação, e o mapa F6 com 86 marcadores em 17 grupos de ligação. Cinco QRLs foram identificados na F2 e três na F6. O QRL identificado na F6, pelo marcador PaaMtt340 apresentou consistência em dois ambientes.

A toxicidade do alumínio é um fator limitante para a obtenção de maior produtividade na cultura da aveia (Avena sativa L.). O desenvolvimento de genótipos tolerantes a altos níveis de toxidez ao alumínio é uma alternativa mais barata e viável para o cultivo em solos com subsolo ácidos. Os objetivos deste estudo foram avaliar genótipos de aveia quanto à reação ao alumínio tóxico em três soluções nutritivas, bem como, determinar a ação gênica, o número de genes, a herdabilidade do caráter e identificar marcadores moleculares associados a tolerância ao alumínio tóxico em genótipos de aveia. Oito genótipos foram avaliados em soluções nutritivas quanto à tolerância ao alumínio tóxico. A utilização de solução nutritiva foi eficiente para a discriminação dos genótipos de aveia quanto à tolerância ao alumínio. Os genótipos apresentaram variabilidade, sendo classificados como tolerantes, intermediários e sensíveis. A ação gênica aditiva foi a de maior importância, tanto na análise de média de gerações de oito cruzamentos, quanto na análise de um dialélico parcial envolvendo quatro genótipos. Em oito cruzamentos para determinação do número de genes envolvidos no caráter, através da análise do recrescimento da raiz principal de plantas em solução nutritiva, a segregação foi de apenas um gene com alelos múltiplos, sendo dois para tolerância (A1 e A2) e um para sensibilidade (a). A herdabilidade da característica foi alta, evidenciando que este caráter pode ser selecionado em programas de melhoramento, nas gerações iniciais. Na análise por microssatélites e AFLP, considerando as condições avaliadas, não foram identificados marcadores moleculares associados ao caráter.

Seleção recorrente é um método indicado para o melhoramento de características quantitativas, como rendimento de grãos em aveia. Consiste em selecionar e recombinar de forma cíclica genótipos superiores de uma população geneticamente variável. Sua implantação depende do estabelecimento de uma estratégia que permita a condução das atividades inerentes ao método de forma compatível com a estrutura física e de mão-de-obra do programa. Este trabalho teve como objetivos investigar a possibilidade do uso de uma unidade experimental de tamanho reduzido para a condução das avaliações e seleção, indicar a geração de autofecundação a ser submetida à seleção e caracterizar a variabilidade dos genitores de uma população sintetizada pelo cruzamento dialélico de dez genótipos de aveia . Dados de três anos de ensaios mostram que unidades experimentais constituídas de uma única linha de três metros de comprimento reproduzem as classificações dos genótipos obtidas em parcelas de tamanho padrão para ciclo, estatura e rendimento de grãos. No entanto, o uso posterior de linhas como unidade experimental em ensaios que ocuparam uma área muito extensa, demonstrou que a variação de ambiente reduziu muito a eficiência da seleção. A avaliação da base genética para rendimento de grãos de aveia indica uma forte determinação de efeitos não aditivos. Nesta situação, a seleção em gerações mais avançadas de homozigose são mais adequadas. Porém, a seleção em geração F4 não apresentou vantagens sobre a realizada em F2 devido a grande variação de ambiente relacionada ao tamanho da área necessária para a condução dos ensaios. A estrutura da variabilidade fenotípica dos genitores confirma o caráter complementar dos genótipos em relação às características agronômicas e de adaptação pretendidas na população..

O milho é uma das culturas que mais evoluiu nos últimos anos. A estimativa do progresso genético que a cultura obteve é importante para a análise de programas de melhoramento. O objetivo deste trabalho foi analisar o progresso genético do milho e a amplitude da variabilidade genética em 15 híbridos lançados em diferentes épocas, provenientes de três diferentes empresas de sementes. Desta forma, foi realizada a caracterização fenotípica e molecular dos híbridos em quatro ambientes e em duas densidades de semeadura. A avaliação fenotípica revelou um ligeiro progresso apenas para o caráter número total de espigas por parcela. Para os demais caracteres avaliados, não foi observado progresso genético evidente. A análise molecular, através de marcadores microssatélites, mostrou que os programas de melhoramento de milho exploram uma grande amplitude de variabilidade genética e que as empresas estão empregando germoplasma distinto, uma vez que o dendograma mostrou um agrupamento conforme as empresas. Os programas de melhoramento observados neste trabalho foram eficientes em produzir híbridos com características agronômicas superiores, como elevado rendimento de grãos, baixa estatura e baixa altura de inserção de espigas. / The maize is one of the cultures that more evolved in recent years. The estimate of the genetic progress in the culture is important for the analysis of breeding programs. The objective of this work was to analyze the genetic progress in maize and the amplitude of the genetic variability in 15 hybrids released at different times, proceeding from three different seed companies. Phenotypic and molecular characterization of the hybrids was done in four environments and two plant densities. The phenotypic evaluation showed a progress only for the trait number of ears per plot. For the other evaluated traits, genetic progress was not statistically observed. The molecular analysis, using microssatelites, showed that the maize breeding programs are exploring a large amplitude of genetic variability and that the companies are using distinct germoplasm, since the dendogram showed an agreement in the grouping of companies. The observed breeding programs in this work had been efficient in producing hybrids with superior agronomic traits, such as high grain yield, low plant height and low ear insertion.

A ferrugem da folha é a principal moléstia da cultura da aveia branca. A resistência parcial é uma alternativa à resistência qualitativa, por ser potencialmente mais durável. Este trabalho teve como objetivos caracterizar o progresso da epidemia e a herança genética da resistência parcial à ferrugem da folha em genótipos brasileiros de aveia branca. Os estudos foram realizados em Eldorado do Sul, RS, nos anos de 2007 e 2008, em populações segregantes para esse caráter, derivadas do cruzamento entre linhagens parcialmente resistentes, desenvolvidas pelo Programa de Melhoramento Genético da UFRGS, e o cultivar suscetível, URS 22. Em 2007 foi avaliada a geração F2 de seis populações e, em 2008, a geração F2:3 de duas destas populações. Os resultados mostraram progresso lento da doença, com atraso no aumento da severidade da mesma, em genótipos com resistência parcial. O caráter possui herança genética quantitativa, com ação gênica aditiva, devendo estar sob o controle de um número de locos entre 3 e 9, havendo a presença de locos principais e modificadores. O número médio estimado do total de locos que governam o caráter é de 6,9, entre as seis populações, sendo que, destes 5,5 são locos de efeito principal e 1,4 de efeito modificador. Em uma das populações, com nível mais reduzido de resistência, foi verificada a superação da mesma, no período do estudo. Enquanto em outra, altamente resistente, a qual era controlada por seis locos principais e dois modificadores, mostrou evidências de superação da resistência em um loco principal, sem afetar o nível de resistência do seu genitor resistente. Embora níveis elevados da resistência tenham sido encontrados, em genitores e em genótipos segregantes, há indícios que a superação da resistência parcial em ambientes altamente favoráveis ao desenvolvimento da moléstia, como o Sul do Brasil, pode ocorrer rapidamente. A herdabilidade da característica foi média a elevada, indicando ser possível iniciar a seleção para resistência parcial à doença em gerações precoces e a seleção concomitante para outros caracteres de importância agronômica, uma vez que a resistência parcial não está fortemente associada a caracteres adaptativos, como estatura, ciclo e resistência à ferrugem do colmo. / Crow rust is the main and most destructive oat disease. Partial resistance to crown rust is a potentially more durable alternative to major gene resistance. This study aimed to determine the inheritance of partial resistance to crown rust in oat Brazilian genotypes and characterize the disease development progress on segregating populations. This study was conducted in Eldorado do Sul, Southern Brazil, on segregating populations, derived from the cross between partially resistant lines, developed by the UFRGS Oat Breeding Program, and the susceptible variety URS 22. Six F2 populations were evaluated in 2007 and two F2:3 populations were assessed in 2008. Partially resistant genotypes showed slow disease progress, as a result of the reduced rate of disease increase. Quantitative inheritance, due to additive gene action, was found to control partial resistance to crown rust on oats. A number between 3 to 9 loci seems to control this trait. On average, a total number of 6.9 loci explained the observed variation, corresponding 5.5 major loci and 1.4 modifier loci, on average. In one of the populations, one of the less resistant, the resistance was overcome during the duration of the study. While in another, with the highest level of partial resistance, which was probably controlled by 6 major and 2 minor loci, there indication of resistance breakdown in one of the major loci, without affecting the overall resistance level of the parental resistant genotype. Although high levels of resistance have been found in both parental and in segregating genotypes, there is evidence that the partial resistance overcoming may occur faster in environments highly favorable to the disease development, as Southern Brazil. Medium to high heritability estimates were found in partial resistance to oat crown rust, indicating that the selection to this trait can start as early as the F2 and F3 generations. Also, concomitant selection to other agronomic traits seems appropriate, since there was no strong association between partial resistance to oat crown rust and plant height, cycle and resistance to stem rust.

O objetivo deste estudo foi selecionar marcadores morfológicos, capazes de discriminar precocemente plântulas de alfafa (Medicago sativa L.) Crioula com a finalidade de utilizá-los na seleção precoce de alfafa para aptidão ao pastejo e ainda avaliar a eficiência do processo simbiótico entre alfafa e bactéria, Sinorhizobium meliloti, em comparação à adubação nitrogenada na produção de matéria seca. A seleção, avaliação e caracterização de marcadores morfológicos ocorreram na casa de vegetação do Departamento de Plantas Forrageiras e Agrometeorologia da UFRGS, em Porto Alegre, RS, e a avaliação da eficiência do processo de fixação de nitrogênio atmosférico (FBN) foram realizadas na Estação Experimental Agronômica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, em Eldorado do Sul, RS. Os procedimentos utilizados na seleção de marcadores precoces constaram de experimentos que avaliaram as características morfológicas de alfafa como comprimento do 1°entrenó e o comprimento do 2° entrenó, assim como a simulação de pastejo onde as plantas eram submetidas a desfolhas frequentes (2cm) sob cortes semanais. As avaliações morfológicas dos marcadores evidenciaram diferenças (P<0,05), quando as plântulas de comprimento do 1° entrenó e 2° entrenó curto e longo, foram selecionadas, as quais apresentaram diferenças no seu comprimento (cm), freqüência (%) e estatura. Houve também diferença (P<0,05) quanto à sobrevivência das plantas (%) quando as populações de alfafa foram submetidas à simulação de pastejo. As avaliações revelaram que os marcadores morfológicos selecionados ainda no estágio de plântulas apresentam variabilidade para a aptidão ao pastejo. O marcador morfológico comprimento do 1° entrenó curto é o que apresenta maiores possibilidades de discriminar precocemente os genótipos contrastantes em relação a aptidão ao pastejo. Em nível de campo foi demonstrada a eficiência da estirpe SEMIA-116 recomendada para alfafa na produção MS em relação à testemunha. Porém pela análise da curva de diluição do teor de nitrogênio na parte aérea, evidenciou-se que a efetividade do rizóbio não maximizou à máxima produtividade, demonstrando assim, a possibilidade de se selecionar e testar a nível de campo estirpes mais eficientes. / The aim of this study was to select morphological markers capable to discriminate seedlings of Crioula alfalfa (Medicago sativa L.) in order to be used in early selection of alfalfa for grazing aptitude and also to evaluate the efficiency of the symbiotic process between alfalfa and the bacterium Sinorhizobium meliloti in comparison with nitrogen fertilization on dry matter production. The selection, evaluation and characterization of morphological markers was made in the greenhouse of the Department of Forage Plants and Agrometeorologia of UFRGS in Porto Alegre, RS, and the evaluation of the efficiency of the atmospheric nitrogen fixation was carried out at the Agronomic Experimental Station of Federal University of Rio Grande do Sul, in Eldorado do Sul, RS. The procedures used in the selection of early markers consisted of experiments that evaluated alfalfa morphological characteristics, such as length of 1st and 2nd internode and a simulation of grazing, with the plants being subjected to a continuous and heavy grazing (2cm ) by weekly cuts. Assessments of morphological markers showed differences (P <0.05) when the seedlings were selected based on short or long length of the 1st internode as well as for the length of the 2nd internode, showing differences in their length (cm), frequency (% ) and height. There were also differences (P <0.05) on the survival of plants (%) when the populations of alfalfa were subjected to simulated grazing. The evaluations revealed that the morphological markers selected in the stage of seedlings have variability in relation to grazing aptitude. The morphological marker short length of the 1st internode presents more opportunities to discriminate contrasting genotypes for grazing tolerance in early stages. In the field, it was shown the efficiency of strain SEMIA-116 recommended for alfalfa in the production DM compared to control. However, the analysis of the N dilution curve in shoots showed that the effectiveness of rhizobia did not maximize the productivity, thus demonstrating the possibility to select and test under field conditions strains more efficient.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Pós-Graduação em Agronomia, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-06-20T14:18:49Z No. of bitstreams: 1 2017_ClotildesNevesdaSilva.pdf: 2075349 bytes, checksum: 9be9f45442385dc96ced72bfa03eb745 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-08-03T19:44:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_ClotildesNevesdaSilva.pdf: 2075349 bytes, checksum: 9be9f45442385dc96ced72bfa03eb745 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-03T19:44:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_ClotildesNevesdaSilva.pdf: 2075349 bytes, checksum: 9be9f45442385dc96ced72bfa03eb745 (MD5) Previous issue date: 2017-08-03 / O gênero Passiflora tem como principal centro de diversidade genética a América Tropical, e o território brasileiro é privilegiado com uma variedade imensa de espécies silvestres nativas. O conhecimento das características fenológicas e morfoagronômicas destas espécies é importante para o desenvolvimentodo seu potencial comercial. Neste trabalho, objetivou-se analisar aspectos fenológico s de três espécies silvestres de maracujá e as características morfoagronômicas e moleculares de progênies de meio- irmãos de Passiflora maliformis L.. Os aspectos fenológicos foram avaliados em três espécies de maracujá silvestre no período de setembro de 2015 a agosto de 2016. Foram analisados os períodos de floração e frutificação e m condições naturais para uma progênie selecionada de Maracujá-maçã Passiflora( maliformis L.) e as cultivares BRS Pérola do Cerrado (P. setacea DC.) e BRS Sertão Forte ( P. cincinnata Mast.) para verificar o início, a duração e o término dessas fe nofases. Foi observado que o período de floração em condições naturais para essas três e spécies em estudo é do tipo contínuo, no qual há a produção de flores ao longo de todo o ano, ao contrário do que se observa para a espécie comercial de maracujazeiro azedo Passiflora edulis Sims que apresenta uma entressafra devido à redução do comprimento do dia e redução da temperatura e da umidade relativa do ar. Progênies de meio-irmãos daespécie (Passiflora maliformis L.) foram obtidas a partir de matrizes selecionadas no programa de melhoramento genético por seleção recorrente realizado na Embrapa Cerrado s. O experimento foi conduzido no período de março de 2015 a dezembro de 2016. Para a valiação da produtividade, foram contabilizados os frutos produzidos durante o pico de produção no mês maio de 2016 e durante o período que corresponde à entressafra do maracujazeiro azedo no mês de setembro do mesmo ano. Foram também avaliadas as características físicas dos frutos. Não houve efeito significativo das progênies para produtividade em ambas as avaliações, mas houve para algumas características de frutos como diâmetro longitudinal, massa, porcentagens de suco e sementes. O pequeno efeito das progênies sobre as características avaliadas, tanto na safra como na entressafra, possivelmente ocorreu devido à variabilidade genética das plantas dentro das progênies, evidenciando a necessidade de seleção entre e dentro de progênies para obter ganhos genéticos para produtividade e características físicas de frutos. Os parâmetros genéticos, obtidos com a caracterização morfoagronômica, evidenciaram ganhos genéticos baixos obtidos por meio de seleção de progênies, e altos por meio da seleção de plantas individuais, sinalizando que a seleção entre e dentro de progênies é a melhor estratégia de seleção para maximizar os ganhos genéticos nos ciclos de seleção e recombinação dessa população de melhoramento. Plantas individuais sele cionadas foram caracterizadas com base em marcadores moleculares RAPD e ISSR. Além dacaracterização molecular, a variabilidade genética de 22 plantas selecionadas foi realizada. Para este estudo, foram obtidos 100 marcadores RAPD e 81 marcadores ISSR a partir dos quais foram estimadas as dissimilaridades genéticas entre as plantas selecionadas que variaram entre 0,15 e 0,78. Análises de agrupamento foram realizadas a partir da matriz de dissimilaridade e evidenciaram uma tendência de agrupamento das plantas oriundas da mesma progênie. Os marcadores RAPD e ISSR foram eficientes na caracterização das plantas selecionadas de P. maliformis e na quantificação da variabilidade genética entre elas. / The Passiflora genus has its main genetic diversity center in the Tropical America. Brazilian territory is privileged with an immense variety of Passiflora native wild species. Knowledge of the phenological and morphoagronomic characteristics of these species is important for the development of their commercial potential. The objective of this work was to analyze the phenological aspects of three Passiflora wild species and the morphoagronomic and molecular characteristics of half-sib progenies of Passiflora maliformis L. Phenological aspects were evaluated in three cultivars of wild passion fruit from September 2015 to August 2016. Flowering and fruiting periods under natural conditions were analyzed for a selected progeny of Maracujá-maçã (Passiflora maliformis L.), and the cultivars BRS Pérola do Cerrado (P. setacea DC.) and BRS Sertão Forte ( P. cincinnata Mast.). The beginning, duration and the end of the different phenophases were analyzed. It was observed that the flowering period of these three Passiflora species is of the continuous type. Flowers and fruits production occurs throughout the year, unlike what is observed for the commercial species of sour passion fruit (Passiflora edulis Sims).This species present an out-of-season yield with reduced day length, temperature and relative air humidity. Half-sib progenies of the Passiflora maliformis L. were obtained from matrices selected in the genetic breeding program by recurrent selection performed at Embrapa Cerrados. The experiment was conducted from March 2015 to December 2016. For the productivity evaluation, the fruits were counted during the production peak (May 2016) and during the period corresponding to the out-of-season yield of passion fruit in the month of September of the same year. The physical fruit characteristics were also evaluated. There was no significant effect of the progenies on the fruit productivity in both evaluations, but there were for some fruit characteristics such as longitudinal diameter, mass, juice and seeds percentages. The small progenies effect on the evaluated characteristics, probability occurred due to the genetic variability of the plants within the progenies. This result highlights s the need of selection among and within progenies to obtain genetic gains for productivity and physical fruit characteristics. The genetic parameters obtained with a morphoagronomic characterization evidenced lower genetic gains obtained through progenies selection than through individual plant selection , signaling that a selection among and within progenies is a better selection strategy to maximize the genetic gains in the cycles of selection and recombination of this breeding population. Individual plants selected were characterized based on RAPD and ISSR molecular markers. The genetic variability of the 22 selected plants was carried out. For this study, 100 RAPD and 81 ISSR markers were obtained. The genetic dissimilarity among the selected plants varies between 0,15 and 0,78. Grouping analyzes were conducted from the dissimilarity matrix and evidenced a tendency of grouping of the plants from the same progeny. The RAPD and ISSR markers were efficient in the characterization of the selected plants of P. maliformis and in the genetic variability quantification.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-08-03T19:51:12Z No. of bitstreams: 1 2017_MartizaOcampoBetancur.pdf: 8305814 bytes, checksum: 5836c0b5d49fa976faaa55a8e11cd642 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-15T14:49:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MartizaOcampoBetancur.pdf: 8305814 bytes, checksum: 5836c0b5d49fa976faaa55a8e11cd642 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-15T14:49:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MartizaOcampoBetancur.pdf: 8305814 bytes, checksum: 5836c0b5d49fa976faaa55a8e11cd642 (MD5) Previous issue date: 2017-09-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / O aumento do número de cópias do gene heterólogo é uma das abordagens empregadas no melhoramento genético de Komagataella phaffii como sistema de expressão. O uso de marcas auxotróficas defectivas é uma estratégia para a obtenção de integrantes multicópia. Para garantir estabilidade mitótica, os cassetes de expressão são integrados no genoma por recombinação homóloga, portanto é necessário haver no vetor sequências genômicas que propiciem esses eventos de integração. O foco deste trabalho foi identificar sítios repetitivos no genoma de K. phaffii nunca antes testados como alvos de integração, em combinação com o uso da marca defectiva leu2-d, para aumentar a expressão heteróloga. Como alvos para integração múltipla foram avaliados os seguintes loci: rDNA 5S, região NTS do rDNA e regiões repetidas dos cromossomos 2 e 3. Um vetor contendo a marca leu2-d e o gene repórter EGFP (Enhanced Green FluorescentProtein) foi construído e foi usado como plataforma para clonar as diversas sequências repetidas. Todas as construções foram utilizadas para transformar K. phaffii M12 (leu2). A determinação do número de cópias integradas do cassete de expressão confirmou a obtenção de clones multicópia com todas as construções. Até 78 cópias do cassete contendo a sequência repetitiva do cromossomo 2 foram integradas. Todos os clones multicópiaapresentaram uma maior produção intracelular de GFP em comparação a um clone contendo uma única cópia do gene, chegando a se obter um aumento de 197 vezes com o clone contendo 78 cópias integradas do cassete. Para validar a estratégia apresentada neste estudo, foi testada a produção extracelular da proteína repórter α-amilase. Clones multicópia foram obtidos com as diferentes construções e até 43 cópias do cassete contendo a sequência repetitiva do cromossomo 2 foram integradas. A atividade amilolítica no sobrenadante confirmou a produção de amilase, que foi maior para os clones multicópia em comparação a um clone contendo uma cópia do gene, chegando a se obter um aumento de 4,6 vezes com o clone contendo 43 cópias integradas do cassete. A produção das duas proteínas avaliadas, demonstrou a possibilidade de obter clones multicópia que produzem uma maior quantidade da proteína recombinante. Contudo, foi observada perda de algumas cópias do cassete quando os clones transformantes foram crescidos em meio complexo, indicando baixa estabilidade genética na falta de pressão seletiva. Além disso, dependendo do local de integração, um alto número de cópias mostrou ter um efeito negativo no crescimento da levedura, porém, em nenhum dos casos a produção da proteína heteróloga diminuiu. / Increasing heterologous gene copy number is one of most commonly used strategies to improve Komagataellaphaffii as an expression system. The use of defective auxotrophic markers is an approach to obtain multicopy integrants. Expression cassettes must be integrated into the K. phaffii genome by homologous recombination to ensure mitotic stability. Therefore, it is necessary that the vector carries genomic sequences that will promote integration events. The aim of this work was to identify different sites for the integration of vectors carrying the auxotrophic defective marker leu2-d into the genome in order to increase the expression levels of heterologous genes in K. phaffii. The targets for integration studied were the following loci: 5S rDNA, NTS rDNA and repetitive regions of chromosomes 2 and 3. A vector carrying defective marker leu2-d and the EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein) reporter gene was constructed. This vector was used as platform to test repetitive sequences as targets for DNA integration. All constructions were used to transform K. phaffii M12 (leu2). Copy number determination confirmed the generation of multicopy clones with all the constructions. Up to 78 copies of the cassette containing the sequence of chromosome 2 were integrated. All multicopy clones showed more intracellular GFP production compared with a single-copy clone. A 197- fold increase of protein production was observed with the clone containing 78 copies of the cassette. To validate the strategy presented in this study, the expression of the reporter protein α- amylase was evaluated. Multicopy clones were obtained with the diverse constructions. Up to 43 copies of the cassette containing the sequence of chromosome 2 were integrated. Amylolytic activity in culture supernatants confirmed amylase production, which was higher for multicopy clones in comparison with a single-copy clone. A 4.6-fold increase of protein production was observed with the clone containing 43 copies of the cassette. Production of the two proteins tested showed the possibility to obtain multicopy clones which produce a larger quantity of the recombinant protein. Nevertheless, loss of some copies of the expression cassette was observed when transformants were grown in complex medium. This indicated low genetic stability in the absence of selective pressure. Moreover, depending of the integration locus higher copy number showed a negative effect in yeast growth. However, heterologous protein production was not decreased.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-10-20T17:07:12Z No. of bitstreams: 1 2017_MarianaMagalhãesNóbrega.pdf: 4174042 bytes, checksum: 9430066583171a82f1e6611d82358934 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-24T12:11:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MarianaMagalhãesNóbrega.pdf: 4174042 bytes, checksum: 9430066583171a82f1e6611d82358934 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-24T12:11:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MarianaMagalhãesNóbrega.pdf: 4174042 bytes, checksum: 9430066583171a82f1e6611d82358934 (MD5) Previous issue date: 2017-10-24 / A caracterização de peptídeos encriptados em proteínas pode ser uma estratégia que possibilita diversas aplicações na biotecnologia, que vão desde o desenvolvimento de novos fármacos até a produção de plantas geneticamente modificadas. O presente estudo tem como objetivo geral a prospecção, bem como, o desenho de novas moléculas a partir de peptídeos encriptados em proteínas que possam apresentar atividades biológicas. Dessa forma, foram desenhados dois peptídeos que apresentam dupla atividade (opioide e hipotensora). Tais peptídeos foram sintetizados isoladamente e também de maneira que formassem uma única cadeia polipeptídica, dando origem a uma pequena proteínas de 35 resíduos contendo duas pontes dissulfeto denominada MTOXI. O objetivo do desenho da MTOXI é a otimização da atividade frente à ação de proteases, permitindo uma liberação possivelmente controlada de peptídeos. Tanto os peptídeos separadamente, quanto a proteína MTOXI foram sintetizados por meio de síntese química em fase sólida, seguida da purificação em cromatografia líquida em alta eficiência. O grau de pureza e a confirmação foram determinados por espectrometria de massa, MALDI e ESI. Os peptídeos foram testados em camundongos por via intraperitoneal, com intuito de avaliar sua possível atividade antinociceptiva nos testes da placa quente (Hot Plate) e teste de retirada da cauda (Tail Flick). Os testes in vivo demonstraram que os peptídeos sintéticos PSLEM 11011 e 11012 apresentaram atividade antinociceptiva com perfil de atividade mais lento e duradouro em relação à morfina. A proteína MTOXI foi digerida com tripsina, em quadruplicatas, sendo avaliado o perfil de proteólise e liberação dos fragmentos peptídicos durante uma hora. O ensaio da digestão foi analisado por LC-MS incluindo os controles positivo (digestão da proteína reduzida) e negativo. A área de cada fragmento no respectivo tempo foi determinada. Os peptídeos bioativos permaneceram íntegros durante o processo de digestão e apresentaram aumento na área ao longo do tempo, o que sugere que a estratégia desenvolvida é promissora para a liberação controlada de peptídeos e para otimização do perfil de atividade. Posteriormente foi iniciada a expressão de peptídeos antimicrobianos encriptados no genoma de Arabidopsis thaliana (planta modelo) para serem reinseridos no genoma da própria planta com o objetivo de diminuir a suscetibilidade da planta contra o fungo Botrytis cinerea. A utilização de peptídeos encriptados para desenhar peptídeos e proteínas com atividade biológica mostrou-se promissora para futuras aplicações biotecnológicas. / The characterization of encrypted peptides from source proteins can be a strategy that enables several biotechnological applications, ranging from the development of new drugs to the production of genetically modified organisms. The following work aimed at prospecting and designing new molecules using peptides encrypted in proteins that may present biological activities. Thus, two peptides with dual activity (opioid and hypotensive) were designed and subsequently inserted into a small protein (MTOXI) with two dissulfide bridges, in order to optimize activity against the action of proteases and allowing a controlled release of the peptides. The peptides and the MTOXI protein were synthesized by chemical solid-phase synthesis using the fmoc strategy, followed by High Performance Liquid Cromatography (HPLC) purification. The purity and sequence confirmation were determined by MALDI and ESI mass spectrometry. The peptides were intraperitoneally injected in mice with the purpose of evaluating the antinociceptive activity via Hot plate and Tail Flick tests. In the in vivo assays, the synthetic peptides PSLEM 11011 and PSLEM 11012 presented antinociceptive activity with a later and long-lasting activity profile compared to morphine. The MTOXI protein was digested with trypsin, in four replicates, and the proteolysis profile and peptide fragment release analyzed during 5, 10, 15, 30, 45 and 60 minutes. The digestion assay was analyzed in each time by LC-MS, including the positive (reduced protein digestion) and negative controls. Determination of the area of each fragment in the respective time was obtained and disulfide pair formation identified. Bioactive peptides remained intact during the digestion process and showed increased area over time, which suggests that the developed strategy for the controlled release of peptides and optimization of activity profile is promising. Later, the identification and selection of peptides with antimicrobial physicochemical properties, encrypted in the genome of Arabidopsis thaliana was conducted. These peptides were reintroduced into A. thaliana´s own genome aiming at reducing plant susceptibility to the pathogen Botrytis cinerea. The use of encrypted peptides to design peptides and proteins with biological activity has shown promise for future biotechnological applications.

Solos ácidos com toxidez por Al são comuns, sendo geralmente destinados à pecuária. A utilização de leguminosas forrageiras adaptadas a esta situação minimizaria o uso de correção de acidez e ainda possibilitaria um aporte de N ao sistema via fixação biológica. A caracterização e a identificação de mecanismos de tolerância ao Al tóxico são os passos iniciais em um programa de seleção e melhoramento visando maior adaptação a esta condição de estresse. Este trabalho objetivou: (i) caracterizar genótipos de cornichão (L. corniculatus), espécies diplóides, inclusive da espécie modelo L. japonicus e linhas endogâmicas recombinantes (LER) de Lotus, quanto à tolerância ao Al tóxico; (ii) identificar o acúmulo de Al e exsudação radicular de ácidos orgânicos nas espécies cultivadas; e (iii) selecionar genótipos com respostas contrastantes ao Al tóxico, comparando-os através de caracteristicas agronômicas e moleculares. Os resultados da caracterização mostraram que as espécies modelo diplóides MG-20 e GIFU, a população UFRGS, e as cvs. San Gabriel e São Gabriel foram as mais produtivas de maneira geral. A população UFRGS apresentou ainda uma grande superioridade em situações de moderada acidez do solo (22,2% de Al), demonstrando um potencial de utilização em regiões onde se realize correção parcial do solo. Das 180 LERs testadas, 24 foram superiores e 39 foram inferiores a espécie modelo GIFU. Com relação à exsudação radicular de ácidos orgânicos, na ausência de Al observaram-se baixos níveis de exudação para todos os genótipos. Já na presença do Al, os resultados mostraram que o genótipo UFRGS, selecionado para tolerância ao Al (UF-T2), apresentou aumento significativo (pelo menos 50% superior) da exudação de ácido oxálico em relação aos demais genótipos, assim como a população UFRGS mostrou-se superior à cv. Draco em todas as avaliações. O resultado de dois ciclos de seleção massal visando tolerância ao Al mostrou incrementos na produção de matéria seca em todas as concentrações de Al testadas, enquanto que a seleção para sensibilidade ao Al pareceu estar relacionada com o baixo vigor das plantas, uma vez que na ausência de Al estes genótipos apresentaram menor acúmulo de matéria seca em relação às populações originais. A grande diversidade observada nos genótipos avaliados pode indicar que mecanismos de tolerância ao Al possam atuar em diferentes intensidades. A exudação de ácido oxálico parece ser um mecanismo que permite a manutenção do crescimento do cornichão em condições de Al tóxico, sendo que a seleção de um genótipo mais tolerante ao Al proporcionou aumentos significativos neste mecanismo de defesa. / Acid soils with aluminum (Al) toxicity are common, being generally destined for cattle livestock. The utilization of forage legumes adapted to this situation would minimize the use of agricultural liming materials and still allow a nitrogen input to the system via biological fixation. The characterization and identification of tolerance mechanisms to toxic Al are the initial steps in a selection and breeding program aiming a greater adaptation to this stress condition. This work was aimed to: (i) characterize cultivated populations of birdsfoot trefoil (tetraploid), model species (diploid) and recombinant inbred lines (RIL) of Lotus, regarding toxic Al tolerance; (ii) identify the accumulation of Al and root exudation of organic acids in the cultivated species; and (iii) select genotypes with contrasting responses to the toxic Al, comparing their morphological and molecular characteristics. The results of the characterization showed that the diploid genotypes, MG-20 and GIFU, and the cultivated UFRGS genotypes, San Gabriel and São Gabriel were the most productive in a general matter. The UFRGS genotype also presented a great superiority in situations of moderate soil acidity (22,2% of Al), demonstrating a utilization potential in regions where partial soil amelioration is done. Of the180 RILs tested, 24 were superior and 39 were inferior to the GIFU genotype. Regarding root exudation of organic acids, in the absence of aluminum, low levels of exudation were observed for all genotypes. However, in the presence of aluminum, the results showed that the UFRGS genotype selected for Al tolerance presented a significant increase (at least 50% higher) of oxalic acid exudation compared to the other genotypes, and the UFRGS genotype proved superior to the Draco genotype in all evaluations. The result of two mass selection cycles aiming Al tolerance showed increments in dry matter production in all of the toxic aluminum concentrations tested, while the selection for Al sensibility seemed to be related to the plants’ low vigor, since in the absence of Al these genotypes presented a lower accumulation of dry matter compared to the original populations. The great diversity observed in the evaluated genotypes may indicate that the Al tolerance mechanisms may act in different intensities. The exudation of oxalic acid is apparently a mechanism that permits the maintenance of the birdsfoot trefoil growth in different conditions of toxic Al, as well as the selection of a more tolerant genotype to aluminum permitted a significant increase in this defense mechanism.