Orientador: Reinaldo José da Silva / Coorientador: Iracy Lea Pecora / Banca: Pedro Luiz Silva Pinto / Banca: Marlene Tiduko Ueta / Banca: Maria Isabel Muller / Banca: Fábio Hideki Yamada / Resumo: Angiostrongylus cantonensis é o agente etiológico da meningoencefalite eosinofílica, também chamado de "verme do pulmão do rato". Mundialmente, a expansão desse nematóide está ligada à dispersão e colonização pelo caracol gigante africano (Achatina fulica). O objetivo deste trabalho foi verificar a ocorrência de larvas de A. cantonensis em moluscos A. fulica naturalmente infectados, nos nove municípios que compõem a Baixada Santista. Foram capturados 540 exemplares na área urbana dos municípios: São Vicente, Santos, Praia Grande, Cubatão, Mongaguá, Itanhaém, Peruíbe, Guarujá e Bertioga. A técnica utilizada para a obtenção de larvas foi a de Wallace & Rosen e sedimentação, por 3 h, pelo método de Baermann. Após a sedimentação, o material foi observado em microscópio estereoscópico de campo claro, para visualização das larvas que foram posteriormente congeladas a -70°C. O DNA foi extraído e submetido à PCR-RFLP (reação em cadeia da polimerase e polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição) direcionada para a região espaçadora transcrita interna dois (ITS2-rDNA) e clivada com a enzima ClaI. Para as análises morfológicas e morfométricas foram utilizadas 60 larvas, sendo 30 em estágio L2 e 30 em L3. No total, foram analisados 90 pontos (bairros), dos quais 73 (81,11%) apresentaram moluscos com larvas de nematóides. Dos 540 caracóis analisados, 204 (37,77%) apresentaram larvas de nematóides, sendo que 79 (38,72%) foram submetidos às análises moleculares; constatou-se a infecção por A. cantonensis em 63 (79,75%) moluscos. O número de larvas por molusco variou de 1 a 9.723 em exemplares que apresentavam 61,0 e 70,0 mm de comprimento de concha, respectivamente. Não foram observadas diferenças significativas entre o número de larvas de A. cantonensis e o comprimento das conchas dos indivíduos adultos jovens e adultos e nem entre as médias de larvas encontradas entre indivíduos ... / Abstract: Angiostrongylus cantonensis is the causative agent of eosinophilic meningoencephalitis, also called "rat lungworm". Worldwide, the expansion of this nematode is linked to the dispersal and colonization by giant African snail (Achatina fulica). The aim of this work was to verify the occurrence of larvae of A. cantonensis in mollusks A. fulica naturally infected in nine cities that compose the "Baixada Santista" region. About 540 specimens were collected in urban areas of the following cities: São Vicente, Santos, Praia Grande, Cubatão, Mongaguá, Itanhaém, Peruibe, Guarujá and Bertioga. The technique used for obtaining larvae was based on Wallace & Rosen and sedimentation for 3 h using the method of Baermann. After sedimentation, the material was observed under bright-field stereoscopic microscope for viewing larvae that were subsequently frozen at -70°C. DNA was extracted and submitted to PCR - RFLP (polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism) directed to the internal transcribed spacer region two (ITS2 - rDNA) and cleaved with ClaI enzyme. For morphological and morphometric analyses, 60 larvae were used, 30 in stage L2 and 30 in stage L3. Overall, 90 points (neighborhoods) were analyzed, of which 73 (81.11 %) showed mollusks with nematode larvae. Of the 540 snails examined, 204 (37.77 %) showed nematode larvae, and 79 (38.72 %) were submitted to molecular analyses, and infection by A. cantonensis was found in 63 (79.75 %) mollusks. The number of larvae per mollusk varied from 1 to 9723 in specimens showing 61.0 and 70.0 mm in shell length, respectively. No significant differences were observed between number of larvae of A. cantonensis and the shell length of young adults and adults, nor between the average number of larvae found between young adults and adults. Significant differences were found when comparing the number of young adult and adult individuals ... / Doutor

Resumo: Meningoencefalite não supurativa causada pelo Herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) ocorre de forma endêmica em algumas regiões do Brasil, com ênfase no Rio Grande do Sul. No entanto, outras regiões possuem poucos relatos da ocorrência da doença, como os estados de São Paulo e Mato Grosso do Sul. O presente trabalho objetivou realizar a classificação histológicas das lesões desenvolvidas durante a infecção aguda pelo BoHV-5, no encéfalo de 20 animais naturalmente acometidos pelo infecção. As principais lesões observadas, em 80% dos animais, foram de meningoencefalite não supurativa, caracterizadas por infiltrado linfo-histiocitária inflamatório. Em 20% dos animais as lesões encontradas foram não significativas, mas nestes casos todos os bovinos desenvolveram sintomatologia neurológica, e o diagnóstico da doença foi confirmado na reação em cadeia pela polimerase (PCR), com amplificação do DNA do BoHV-5. Esta classificação histológica permitiu observar alterações compatíveis com a doença, mas também mostrou que nem sempre nestes casos vai ocorrer o desenvolvimento de alterações histológicas. Todas as amostras frescas (n=20) foram submetidas ao isolamento viral e a técnica da técnica de PCR. Já os fragmentos fixados em formol e incluídos em parafina foram testados quanto à presença do vírus por meio da técnica de PCR. As vinte amostras congeladas foram consideradas positivas para o isolamento viral e para a amplificação do DNA viral na técnica de PCR, enquanto apenas 15 das 20 incluídas em parafina foram consideradas positivas para o vírus. Os fragmentos de tecidos que apresentaram alterações histopatológicas permitiram suspeitar de infecção viral por BoHV-5, mas nos casos em que estas alteração não estão presentes testes mais sensíveis são necessários. / Abstract: Meningoencephalitis occasioned by Bovine Herpesvirus type 5 (BoHV-5) has been described as localized in some regions inside Brazil, like Rio Grande do Sul State and, also characterized as an endemic encephalitis disorder. However, the often description of its occurrence in São Paulo end Mato Grosso has being notice. The aim of this work was to first characterize the histologic lesions obtained from bovine brains suspected of suffering of neurological disorders. For this purpose, 20 brains were collected from acute cases of the disease, naturally infected by BoHV-5, confirmed by virus isolation and PCR. The most observed lesions were described as being: inflammatory cells, specially infiltrated lymphocytes (80%), necrosis (20%), and less focal gliosis and hemorrhage, in spite of these lesions have been characterized as no-specific. Brains were divided into two halves, one kept fresh for virus isolation and PCR assay, targeting the glycoprotein C gene from BoHV-5 genome. The other half brain, corresponding to cortex region, was submitted to formalin fixation and embedded into paraffin blocks for total DNA isolation. The 20 fresh samples were confirmed, by virus isolation and PCR assay, as having the BoHV-5 virus, while 15 of 20 formalin-fixed, paraffin-embedded samples were considered positive for the same analysis. Finally, the gross lesions and microscopic damage of the brain structure were sufficient for the virus infection suspicion, however it is necessary the complementary techniques to confirm the diagnosis in most of the cases. / Orientador: Tereza Cristina Cardoso Silva / Coorientador: Maria Cecília Rui Luvizotto / Banca: Jane Megid / Banca: Iveraldo dos Santos Dutra / Mestre

O herpesvirus equino tipo 1 (EHV-1) é um importante patógeno que causa doença respiratória, abortamento e desordens neurológicas em equinos. O presente estudo foi realizado visando estabelecer um modelo murino de infecção pelo EHV-1 para investigar a resposta do hospedeiro frente à infecção viral e as alterações neurológicas causadas por esse agente. Camundongos das linhagens BALB/c, BALB/c nude, C3H/HeJ, C57BL/6, C57BL/6 CD4-/- e C57BL/6 CD8-/- foram inoculados por via intranasal com as estirpes brasileiras A4/72, A9/92 e A3/97 do EHV-1. Neste estudo, associou-se a histopatologia, a imunoistoquímica e o método de transcrição reversa seguida pela PCR quantitativa em tempo real para investigar a relação entre a infecção pelo vírus com o desenvolvimento de lesões e a resposta de citocinas pró-inflamatórias no SNC de camundongos das diferentes linhagens. As estirpes brasileiras A4/72 e A9/92 do EHV-1 causaram infecção aguda e letal nas diferentes linhagens de camundongos isogênicos. Os sinais clínicos e neurológicos, tais como perda de peso, pelos arrepiados, postura arqueada, apatia, descarga nasal e ocular, dispnéia, desidratação e sialorréia apareceram entre o 2º e 3º dpi. Essas manifestações foram acompanhadas pelo aumento da sensibilidade a estímulos externos, convulsões, recumbência e morte. O vírus foi consistentemente isolado do SNC, pulmões, fígado, baço e timo de todos os camundongos com sinais neurológicos. As alterações histopatológicas consistiram de leptomeningite, hemorragia focal, ventriculite, degeneração e necrose neuronal, neuronofagia, inflamação não supurativa, gliose multifocal e infiltração perivascular de células polimorfonucleares e mononucleares. A análise imunoistoquímica demonstrou que as estirpes A4/72 e A9/92 do EHV-1 replicaram-se nos neurônicos do bulbo olfatório, cortex cerebral e no hipocampo. Ao contrário, os camundongos inoculados com a estirpe A3/97 do EHV-1 não apresentaram perda de peso ou quaisquer sinais clínicos ou neurológicos; entretanto, o vírus foi isolado dos pulmões no 3º dpi. As estirpes A4/72 e A9/92 do EHV-1 apresentaram tropismo pelo tecido nervoso com capacidade de neuroinvasão e neurovirulência. A estirpe A3/97 do EHV-1 não foi neurovirulenta, apesar de ter sido reisolada do SNC de camundongos BALB/c nude infectados. Detectou-se aumento da expressão de mRNA para TNF-α, IL-6 e CCL2 no SNC dos camundongos infectados pelo EHV-1 com 2 e 3 dpi; entretanto, não houve expressão de mRNA para IFN-γ. Os camundongos com o fundo genético C57BL/6, que apresentam predominantemente resposta do tipo Th1, mostraram níveis mais altos de expressão de mRNA para TNF-α, IL-6 e CCL2, quando comparados com os BALB/c. A gravidade dos sinais observados em camundongos infectados pode ser correlacionada com o pico destas citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-6) e da quimiocina CCL2, que são produzidas logo após a infecção viral por células residentes da glia e/ou infiltrativas no SNC. Esses achados indicam que as diferentes linhagens de camundongos isogênicos são susceptíveis a infecção por estirpes neuropatogênicas do EHV-1 e poderiam servir como modelo para o estudo da patogênese e dos mecanismos que contribuem no desenvolvimento da mieloencefalopatia herpética equina. / Equid herpesvirus type 1 (EHV-1) is a major pathogen which causes respiratory disease, abortions and neurological disorders in horses. The present study was carried out to establish a murine model of EHV-1 infection and investigate host response against the virus and neurological disorders caused by this pathogen. BALB/c, BALB/c nude, C3H/HeJ, C57BL/6, C57BL/6 CD4-/- and C57BL/6 CD8-/- mice were intranasally inoculated with EHV-1 A4/72, A9/92 and A3/97 Brazilian strains. In this study, we combined histopathology, immunohistochemistry, and a quantitative real-time RT-PCR method to investigate the relationship between virus infection and the development of lesions and cytokine responses in the CNS of different strains of mice. Intranasal inoculation of EHV-1 A4/72 and A9/92 induced acute and lethal meningoencephalitis in mice. Clinical and neurological signs appeared between the 2nd and 3rd dpi and included weight loss, ruffled fur, a hunched posture, crouching in corners, nasal and ocular discharges, dyspnoea, dehydration and increased salivation. These signs were followed by increased reactivity to external stimulation, seizures, recumbency and death. The virus was consistently recovered from the CNS and visceral organs of all mice with neurological symptoms. Histopathological changes consisted of leptomeningitis, focal hemorrhage, ventriculitis, neuronal degeneration and necrosis, neuronophagia, non-suppurative inflammation, multi-focal gliosis and perivascular infiltration of polymorphonuclear and mononuclear cells. Immunohistochemical examination demonstrated that EHV-1 strains A4/72 and A9/92 replicated in neurons of the olfactory bulb, cortical regions and hippocampus. In contrast, mice inoculated with the EHV-1 strain A3/97 showed neither weight loss nor apparent clinical or neurological signs of the disease; however, the virus was recovered from their lungs at 3 dpi. While EHV-1 strains A4/72 and A9/92 exhibited a high degree of tropism for the CNS with robust neuroinvasiveness and neurovirulence, the EHV-1 strain A3/97 was not neurovirulent despite being detected in the CNS of infected BALB/c nude mice. Increased mRNA levels of TNF-α, IL-6 and CCL2 were detected in the nervous tissue of EHV-1 infected mice at 2 and 3 dpi; however, IFN-γ mRNA was not consistently expressed. Mice with the background C57BL/6, which exhibit predominantly Th1-type responses, showed the highest levels of TNF-α, IL-6 and CCL-2 mRNA in the CNS, when compared to BALB/c mice. The severity of signs observed in infected mice could be correlated with the peak of these proinflammatory cytokines (TNF-α and IL-6) and the chemokine CCL2, which are produced early after viral infection by both cells infiltrating into the CNS from the periphery and/or glial resident cells. These findings indicate that several inbred mouse strains are susceptible to neuopathogenic EHV-1 strains and should be useful models for studying the pathogenesis and mechanisms contributing to equine herpes myeloencephalopathy in horses.

O herpesvirus equino tipo 1 (EHV-1) é um importante patógeno que causa doença respiratória, abortamento e desordens neurológicas em equinos. O presente estudo foi realizado visando estabelecer um modelo murino de infecção pelo EHV-1 para investigar a resposta do hospedeiro frente à infecção viral e as alterações neurológicas causadas por esse agente. Camundongos das linhagens BALB/c, BALB/c nude, C3H/HeJ, C57BL/6, C57BL/6 CD4-/- e C57BL/6 CD8-/- foram inoculados por via intranasal com as estirpes brasileiras A4/72, A9/92 e A3/97 do EHV-1. Neste estudo, associou-se a histopatologia, a imunoistoquímica e o método de transcrição reversa seguida pela PCR quantitativa em tempo real para investigar a relação entre a infecção pelo vírus com o desenvolvimento de lesões e a resposta de citocinas pró-inflamatórias no SNC de camundongos das diferentes linhagens. As estirpes brasileiras A4/72 e A9/92 do EHV-1 causaram infecção aguda e letal nas diferentes linhagens de camundongos isogênicos. Os sinais clínicos e neurológicos, tais como perda de peso, pelos arrepiados, postura arqueada, apatia, descarga nasal e ocular, dispnéia, desidratação e sialorréia apareceram entre o 2º e 3º dpi. Essas manifestações foram acompanhadas pelo aumento da sensibilidade a estímulos externos, convulsões, recumbência e morte. O vírus foi consistentemente isolado do SNC, pulmões, fígado, baço e timo de todos os camundongos com sinais neurológicos. As alterações histopatológicas consistiram de leptomeningite, hemorragia focal, ventriculite, degeneração e necrose neuronal, neuronofagia, inflamação não supurativa, gliose multifocal e infiltração perivascular de células polimorfonucleares e mononucleares. A análise imunoistoquímica demonstrou que as estirpes A4/72 e A9/92 do EHV-1 replicaram-se nos neurônicos do bulbo olfatório, cortex cerebral e no hipocampo. Ao contrário, os camundongos inoculados com a estirpe A3/97 do EHV-1 não apresentaram perda de peso ou quaisquer sinais clínicos ou neurológicos; entretanto, o vírus foi isolado dos pulmões no 3º dpi. As estirpes A4/72 e A9/92 do EHV-1 apresentaram tropismo pelo tecido nervoso com capacidade de neuroinvasão e neurovirulência. A estirpe A3/97 do EHV-1 não foi neurovirulenta, apesar de ter sido reisolada do SNC de camundongos BALB/c nude infectados. Detectou-se aumento da expressão de mRNA para TNF-α, IL-6 e CCL2 no SNC dos camundongos infectados pelo EHV-1 com 2 e 3 dpi; entretanto, não houve expressão de mRNA para IFN-γ. Os camundongos com o fundo genético C57BL/6, que apresentam predominantemente resposta do tipo Th1, mostraram níveis mais altos de expressão de mRNA para TNF-α, IL-6 e CCL2, quando comparados com os BALB/c. A gravidade dos sinais observados em camundongos infectados pode ser correlacionada com o pico destas citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-6) e da quimiocina CCL2, que são produzidas logo após a infecção viral por células residentes da glia e/ou infiltrativas no SNC. Esses achados indicam que as diferentes linhagens de camundongos isogênicos são susceptíveis a infecção por estirpes neuropatogênicas do EHV-1 e poderiam servir como modelo para o estudo da patogênese e dos mecanismos que contribuem no desenvolvimento da mieloencefalopatia herpética equina. / Equid herpesvirus type 1 (EHV-1) is a major pathogen which causes respiratory disease, abortions and neurological disorders in horses. The present study was carried out to establish a murine model of EHV-1 infection and investigate host response against the virus and neurological disorders caused by this pathogen. BALB/c, BALB/c nude, C3H/HeJ, C57BL/6, C57BL/6 CD4-/- and C57BL/6 CD8-/- mice were intranasally inoculated with EHV-1 A4/72, A9/92 and A3/97 Brazilian strains. In this study, we combined histopathology, immunohistochemistry, and a quantitative real-time RT-PCR method to investigate the relationship between virus infection and the development of lesions and cytokine responses in the CNS of different strains of mice. Intranasal inoculation of EHV-1 A4/72 and A9/92 induced acute and lethal meningoencephalitis in mice. Clinical and neurological signs appeared between the 2nd and 3rd dpi and included weight loss, ruffled fur, a hunched posture, crouching in corners, nasal and ocular discharges, dyspnoea, dehydration and increased salivation. These signs were followed by increased reactivity to external stimulation, seizures, recumbency and death. The virus was consistently recovered from the CNS and visceral organs of all mice with neurological symptoms. Histopathological changes consisted of leptomeningitis, focal hemorrhage, ventriculitis, neuronal degeneration and necrosis, neuronophagia, non-suppurative inflammation, multi-focal gliosis and perivascular infiltration of polymorphonuclear and mononuclear cells. Immunohistochemical examination demonstrated that EHV-1 strains A4/72 and A9/92 replicated in neurons of the olfactory bulb, cortical regions and hippocampus. In contrast, mice inoculated with the EHV-1 strain A3/97 showed neither weight loss nor apparent clinical or neurological signs of the disease; however, the virus was recovered from their lungs at 3 dpi. While EHV-1 strains A4/72 and A9/92 exhibited a high degree of tropism for the CNS with robust neuroinvasiveness and neurovirulence, the EHV-1 strain A3/97 was not neurovirulent despite being detected in the CNS of infected BALB/c nude mice. Increased mRNA levels of TNF-α, IL-6 and CCL2 were detected in the nervous tissue of EHV-1 infected mice at 2 and 3 dpi; however, IFN-γ mRNA was not consistently expressed. Mice with the background C57BL/6, which exhibit predominantly Th1-type responses, showed the highest levels of TNF-α, IL-6 and CCL-2 mRNA in the CNS, when compared to BALB/c mice. The severity of signs observed in infected mice could be correlated with the peak of these proinflammatory cytokines (TNF-α and IL-6) and the chemokine CCL2, which are produced early after viral infection by both cells infiltrating into the CNS from the periphery and/or glial resident cells. These findings indicate that several inbred mouse strains are susceptible to neuopathogenic EHV-1 strains and should be useful models for studying the pathogenesis and mechanisms contributing to equine herpes myeloencephalopathy in horses.

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Materiais e Métodos: Foi realizada um estudo longitudinal de coorte retrospectiva, através de revisão de prontuários, em que foram avaliados os fatores prognósticos de 62 pacientes com menos de 16 anos de idade, com diagnóstico de meningoencefalite criptocócica, admitidas no Hospital Universitário João de Barros Barreto, referência para pacientes com doenças infecciosas em Belém-PA, no período de 1999-2013. Resultados: A idade variou de 4 a 15 anos. A média de idade foi de 10 anos e 66% eram do sexo masculino. A distribuição dos casos conforme as microrregiões do Estado do Pará apresentou a seguinte classificação: Cametá (n=18; 29%), Guamá (n=8; 12,9%), Belém (n=8; 12,9%), Tomé-Açu (n=7; 11,3%), Bragantina (n=6; 9,7%), Castanhal (n=4; 6,5%) e outros (n=11; 17,7%). A apresentação clínica predominante foi a forma subaguda, descrito em 50% dos casos. As manifestações clínicas mais frequentes foram: cefaléia (n=61; 98,4%), febre (n=57; 91,9%) e vômito (n=55; 88,7%). A tomografia computadorizada do crânio foi realizada em 54 pacientes, e foram identificadas anormalidades em 43 (79,6%) crianças. A hidrocefalia foi descrita em 27 casos. O Cryptococcus gattii foi o principal agente envolvido (n=35; 71,4%). No total, (n=57; 91,9%) dos pacientes foram tratados com anfotericina B em monoterapia durante a fase de indução. Conclusões: Taxa de letalidade de 19,3%. A presença de convulsão foi um fator prognóstico de letalidade. No Estado do Pará, onde a criptococose por Cryptococcus gattii é endêmica, a doença em crianças é relativamente frequente. No entanto, os estudos nesta população são ainda escassos e não há diretrizes próprias para manejo dos casos. Novos estudos são necessários para melhorar o atendimento de crianças com meningite criptocócica. / Introduction: Cryptococcosis is a systemic fungal infection that often affects adults, especially those who have an alteration in their cellular immunity. Its frequency in children is low. Objective: to describe the clinical, epidemiological, radiological and laboratorial profile of children with meningitis cryptococcal, and to evaluate what are the circumstances that affect the evolution of these patients and increase the fatality rates of the disease. Materials and methods: we performed a retrospective review of medical records in which we evaluated the prognostic factors of 62 children less than 16 years old, diagnosed with cryptococcal meningoencephalitis, admitted in the at João de Barros Barreto Hospital, reference for patients with infectious diseases in Belém-PA, from 1999-2013. Results: Ages ranged from less than 4 to 15 years. The average age was 10 and 66% were male. The Para state microregions, presented by order of decreasing frequency, showed: Cametá (29%), Guamá (12,9%), Belém (12,9%), Tomé-Açu (11,3%), Bragantina (9,7%) and others (39%). The predominant clinical presentation was the subacute form, represented by 50% of the cases. The most frequent clinical manifestations were headache (98,4%), fever (91,9%) and vomiting (88,7%). A skull tomography was performed in 54 patients, and abnormalities were reported in 43 (79,6%). Hydrocephalus was described in 27 cases. Cryptococcus gattii was the main agent involved, identified in 35 children (71,4%). In total, 91,9% of the patients were treated with amphotecicin B (AmB) alone. Conclusions: Rate of lethality from 19,3%; Seizure was a prognostic factor of lethality. In the State of Pará, where cryptococcosis by Cryptococcus gattii is endemic, the disease in children is relatively frequent. However, studies in this population are still scarce and there are no own management guides. New studies are needed to improve the management of children by this fungal infection.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The neurological disorder caused by BoHV-5 replication in the brain of infected animals, in the acute phase, may not be associated with significant histological changes or a significant number of antigen-positive neurons. Thus, other mechanisms, such as oxidants and antioxidants mechanisms and important enzymes of the purinergic system might modulate the immune and inflammatory response in animals infected with bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) and contribute to the development of neurological signs observed during infection. This study aimed to understand the mechanisms of the neuropathogenesis of BoHV-5 during acute infection. For this, in article I, alterations in the hydrolysis of adenine nucleotides in synaptosomes of the cortex and hippocampus of rabbits experimentally infected with BoHV-5 were assessed through the activity of enzymes NTPDase and 5'-nucleotidase; in article II, we evaluated the involvement of oxidants and antioxidants mechanisms during BoHV-5 infection in systemic level and central nervous system of rabbits experimentally infected through the evaluation of catalase (CAT), reduced glutathione (GSH) and non-protein thiols (TSH), and the quantitation of reactive oxygen species (ROS) and thiobarbituric acid reactive species (TBARS). For the experiments, the animals were divided into groups, control groups, with no infected animals, and test groups, animals inoculated with BoHV-5. The animals of the test groups were inoculated with the parental strain SV-507/99 containing approximately 107,5TCID50 or 108TCID50, control animals received only minimal essential medium (MEM). All rabbits were inoculated intranasally and monitored for clinical and virological aspects during the experiment. At 7 and 12 days p.i. the rabbits were anesthetized and euthanized for blood and brain structures collection. Regarding the activity of 5'-nucleotidase and NTPDase (Article I), the results showed a decrease in hydrolysis of ATP and ADP at 7 days pi, and in hydrolysis of ADP and AMP at 12 days pi in synaptosomes of cerebral cortex in the infected animals; and increased ectonucleotidases activity in synaptosomes of hippocampus in the infected group compared to the control group, except for the hydrolysis of AMP at 12 days pi. The reduced hydrolysis of ATP in cerebral cortex can cause accumulation of the nucleotide into the extracellular milieu; it is known that the excess of ATP can be cytotoxic. Furthermore, with the decrease in enzyme activity less adenosine is produced, this nucleoside is an anticonvulsant and neuroprotective molecule. The increased enzyme activity in the hippocampus can occur to produce adenosine and confer neuroprotection; however at 12 days pi, it is not observed an increase in the hydrolysis of AMP to adenosine. In article II, the evaluation of oxidative parameters and antioxidants revealed that the levels of TBARS and ROS were higher in the infected group compared to controls, mainly in the cortex at 7 and 12 days pi, but also in the cerebellum at 7 days pi and hippocampus and striatum at 12 days pi. Moreover, GSH levels were decreased in the striatum and cerebellum of animals infected at 7 days pi. The oxidative stress process may occur in response to viral infection, but this process has a low specificity and eventually results in oxidative damage to the cell. Thereby, was possible to observe that there is a participation of the purinergic system and the oxidative stress process in the pathogenesis of BoHV-5, suggesting that these mechanisms may be involved in immunomodulation, dysfunction and neuronal death, and may contribute to the process of herpetic meningoencephalitis. / A doença neurológica causada pela replicação do BoHV-5 no cérebro de animais infectados, em sua fase inicial, pode não estar associada à alterações histológicas significativas ou à um número significativo de neurônios antígeno-positivos. Assim, outros mecanismos, como os mecanismos oxidantes e antioxidantes e importantes enzimas do sistema purinérgico, poderiam modular a resposta imune e inflamatória em animais infectados pelo herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) e contribuir para o desenvolvimento dos sinais neurológicos observados durante a infecção. Com este trabalho buscou-se compreender mecanismos da neuropatogenia do BoHV-5 durante infecção aguda. Para isso, no artigo I, foram avaliadas alterações na hidrólise de nucleotídeos de adenina em sinaptossomas de córtex e hipocampo, de coelhos experimentalmente infectados com BoHV-5, através da atividade das enzimas NTPDase e 5 -nucleotidase; no artigo II, foi avaliada a participação de mecanismos oxidantes e antioxidantes na infecção pelo BoHV-5 em nível sistêmico e de sistema nervoso central de coelhos, através da atividade dos antioxidantes catalase (CAT), glutationa reduzida (GSH) e tióis não-proteicos (TSH) e quantificação de espécies reativas de oxigênio totais (ERO-totais) e as espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Para realização dos experimentos, os animais foram divididos em grupos, grupos controle, não infectados, e grupos teste, inoculados com BoHV-5. Os animais dos grupos teste foram inoculados com a cepa parental SV-507/99 contendo aproximadamente 107,5TCID50 ou 108TCID50, os demais animais receberam apenas meio essencial mínimo (MEM). Todos os coelhos foram inoculados pela via intranasal e monitorados quanto aos aspectos clínicos e virológicos durante todo o experimento. Aos 7 e 12 dias p.i. os coelhos foram anestesiados e submetidos à eutanásia para coleta sanguínea e de estruturas encefálicas. Em relação à atividade da NTPDase e 5 -nucleotidase (artigo I), os resultados revelaram uma diminuição na hidrólise do ATP e ADP aos 7 dias p.i., e na hidrólise do ADP e AMP aos 12 dias p.i. em sinaptossomas de córtex cerebral dos animais infectados; e um aumento da atividade ectonucleotidásica em sinaptossomas de hipocampo no grupo infectado em relação ao grupo controle, com exceção da hidrólise do AMP aos 12 dias p.i. A reduzida hidrólise do ATP no córtex cerebral poderia causar acúmulo deste nucleotídeo no meio extracelular, sabe-se que o excesso de ATP pode ser citotóxico. Além disso, com a diminuição da atividade enzimática menos adenosina é produzida, sendo esta uma molécula neuroprotetora e anticonvulsivante. O aumento da atividade enzimática no hipocampo poderia ocorrer para produzir adenosina e conferir neuroproteção, no entanto, aos 12 dias p.i. não ocorreu aumento na hidrólise do AMP à adenosina. No artigo II, a avaliação dos parâmetros oxidativos e antioxidantes revelou que ocorre um aumento nos níveis de TBARS e de ERO-totais no grupo infectado em relação ao grupo controle, principalmente no córtex aos 7 e 12 dias p.i., mas também no cerebelo aos 7 dias p.i. e no hipocampo e estriado aos 12 dias p.i. Ainda, os níveis de GSH estavam diminuídos no estriado e cerebelo dos animais infectados aos 7 dias p.i. O processo de estresse oxidativo pode ocorrer em resposta à infecção viral, porém por ter baixa especificidade acaba resultando em danos oxidativos à célula. Desta forma, foi possível observar que existe uma participação do sistema purinérgico e do processo de estresse oxidativo na patogênese da infecção pelo BoHV-5, sugerindo que estes mecanismos possam estar envolvidos na imunomodulação, disfunção e morte neuronal, contribuindo, assim, para a processo da meningoencefalite herpética.

O herpesvirus equino tipo 1 (EHV-1) é um importante patógeno que causa doença respiratória, abortamento e desordens neurológicas em equinos. O presente estudo foi realizado visando avaliar a resposta inflamatória causada pelo EHV-1 por meio da análise das manifestações clínicas, alterações histopatológicas e resposta imune do hospedeiro no sistema nervoso central (SNC). Camundongos das linhagens BALB/c (H2d), C57BL/6 (H2b) e C3H/HeJ (H2k) foram inoculados por via intranasal com as estirpes brasileiras A4/72 e A9/92 do EHV-1. Nesse estudo, associou-se a histopatologia, a resposta de citocinas pró-inflamatórias no SNC de camundongos das diferentes linhagens e o método de transcrição reversa seguida pela reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) para investigar a relação entre a infecção pelo EHV-1 e a resposta inflamatória com o desenvolvimento de lesões. As estirpes brasileiras A4/72 e A9/92 do EHV-1 causaram infecção aguda e letal nas diferentes linhagens de camundongos isogênicos. Os sinais clínicos e neurológicos, tais como perda de peso, pelos arrepiados, postura arqueada, apatia, dispneia, desidratação e sialorreia apareceram entre o 2º e 3º dia pós-infecção (dpi). Essas manifestações foram acompanhadas pelo aumento da sensibilidade a estímulos externos, convulsões, recumbência e morte. As alterações histopatológicas consistiram em necrose neuronal, edema, necrose de liquefação, leptomeningite neutrofílica, manguito perivascular, hemorragia focal, inflamação não supurativa, gliose multifocal e infiltração perivascular de células polimorfonucleares e mononucleares. As características e a extensão das lesões variaram entre as linhagens de camundongos. Animais inoculados com a estirpe A4/72 apresentaram lesões histopatológicas de maior grau de severidade quando comparados com aqueles inoculados com a estirpe A9/92. Observou-se aumento da concentração plasmática de TNF-α, IL-6, CCL2 e IFN-γ nos camundongos infectados pelo EHV-1 no 2º dpi. Detectou-se aumento da concentração plasmática e da expressão de mRNA para TNF-α, IL-6 e CCL2 no SNC dos camundongos infectados pelo EHV-1 no 3º dpi; entretanto, não houve aumento da concentração plasmática nem da expressão de mRNA para IFN-γ no 3º dpi. Evidenciou-se que a estirpe A4/72 do EHV-1 induz uma resposta imune sistêmica mais efetiva, enquanto que o vírus A9/92 culmina em uma resposta imunológica mais efetiva no SNC. Os camundongos com o fundo genético C57BL/6 e BALB/c mostraram níveis mais altos de expressão de mRNA para TNF-α, IL-6 e CCL2, quando comparados com os C3H/HeJ. A gravidade dos sinais clínicos observados em camundongos infectados pode ser correlacionada com o pico dessas citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-6) e da quimiocina CCL2, que são produzidas logo após a infecção viral por células residentes da glia e/ou infiltrativas no SNC. Esses achados indicam que as diferentes linhagens de camundongos isogênicos são susceptíveis à infecção por estirpes neuropatogênicas do EHV-1; as diferenças no padrão de alterações histopatológicas mostram que elas dependem do hospedeiro infectado, da estirpe viral e da resposta imunológica; e a supressão do interferon (IFN) tipo 1 sugere ser um mecanismo de escape do EHV-1 frente ao sistema imune. A baixa expressão de IL-6, TNF-α e da quimiocina CCL2 em camundongos C3H/HeJ se explica pela mutação no gene toll-like receptor 4 (TLR-4) existente nessa linhagem de camundongo. Adicionalmente, os camundongos C3H/HeJ apresentaram lesões histopatológicas mais severas no SNC quando comparados com BALB/c e C57BL/6. Sugere-se que o IFN tipo I e o gene TLR-4 apresentam importante papel na patogênese do EHV-1 bem como proteínas do agente viral responsáveis pela supressão do IFN e partículas virais que sejam reconhecidas pelo TLR-4 podem ser alvos para o desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento da doença viral e para a eficiência de imunógenos / The equine herpesvirus type 1 (EHV-1) is an important pathogen that causes respiratory disease, abortion and neurological disorders in horses. This study was conducted to evaluate the inflammatory response caused by EHV-1 by the analysis of clinical manifestations, histopathological changes and the host immune response in the central nervous system (CNS). BALB/c (H2d), C57BL/6 (H2b) and C3H/HeJ (H2k) mice were inoculated intranasally with Brazilian EHV-1 strains A4/72 and A9/92. In this study, joined histopathology, the response of proinflammatory cytokines in the CNS of mice of different strains and reverse transcription method followed by quantitative polymerase chain reaction in real time (RT-qPCR) to investigate the relationship between infection by EHV-1 and inflammatory response in the development of lesions. Brazilian strains A4/72 and A9/92 EHV-1 caused acute lethal infection in different strains of inbred mice. Clinical and neurological signs such as weight loss, the bristly hair, hunched posture, apathy, dyspnoea, dehydration and salivary hypersecretion appeared between 2nd and 3rd day after infection (dpi). These events were accompanied by increase in the sensitivity to external stimuli, convulsions, recumbency and death. Histopathological changes were neuronal necrosis, edema, liquefaction necrosis, neutrophilic leptomeningitis, perivascular cuff, focal hemorrhage, non-suppurative inflammation, multifocal gliosis and perivascular infiltration of polymorphonuclear and mononuclear cells. The characteristics and the extent of the injuries varied between strains of mice. Animals inoculated with the A4/72 strain showed histopathological lesions of greater severity when compared with those inoculated with the A9/92 strain. There was an increase in plasma concentrations of TNF-α, IL-6, CCL2 and IFN-γ in mice infected by EHV-1 in 2nd dpi. Plasma concentrations and the expression of mRNA for TNF-α, IL-6 and CCL2 in the CNS of mice infected with EHV-1 at 3rd dpi were increased; however, there was no increase in plasma concentration or expression for the mRNA of IFN-γ at 3rd dpi. It was evident that the EHV-1 strain A4/72 induces a more effective systemic immune response, whereas the A9/92 virus culminates in a more effective immune response in the CNS. The C57BL/6 and BALB/c mice showed higher levels of mRNA expression for TNF-α, IL-6 and CCL2, compared to C3H/HeJ mice. The severity of clinical signs observed in infected mice can be correlated with the peak of these proinflammatory cytokines (TNF-α and IL-6) and CCL2 chemokine, which are then produced after viral infection by resident glial cells and/or infiltrative cells in the CNS. These findings indicate that different strains of inbred mice are susceptible to infection neuropathogenic EHV-1 strains; the differences in the pattern of pathological changes show that they depend on the infected host, the EHV-1 strain and the immune response; and the suppression of interferon (IFN) type I suggested to be an escape mechanism for the EHV-1 against the immune system. The low expression of IL-6, TNF-α and chemokine CCL2 in C3H/HeJ mice can be explained by a mutation in toll-like receptor 4 (TLR-4) gene existing in this mouse strain. Additionally, C3H/HeJ mice exhibited more severe histopathological lesions in the CNS as compared to BALB/c and C57BL/6. It is suggested that type I IFN and TLR-4 gene have important role in the pathogenesis of EHV-1 and viral agent proteins responsible for the suppression of IFN and the viral particles that are recognized by TLR-4 can be targets for the development of new approaches for the treatment of viral disease and the efficiency of immunogens

Enterovírus (HEV), herpesvírus 1 e 2 (HHV-1 e HHV-2) e adenovírus (HAdV) são importantes agentes de infecções do SNC. Neste trabalho, técnicas moleculares foram aplicadas para a detecção destes vírus em quadros de infecção do SNC. Amostras de líquor foram colhidas de pacientes atendidos no HU-USP entre agosto e novembro/2010 e fevereiro/2012 a janeiro/2013. Através da Nested-PCR HEV foram detectados em 9,8% das amostras, HAdV em 2,5% e HHV-1 e 2 em 1,1%, além de 3 casos de coinfecção, 2 entre HEV e HHV, e 1 entre HEV e HAdV. O material genético viral foi extraído através dos métodos Qiaamp DNA Blood (Qiagen®) e MagMAXTM Viral RNA Isolation (Ambiom), e este último pareceu mais adequado à aplicação na rotina clínica. A análise quimiocitológica do líquor mostrou-se importante no direcionamento da conduta clínica, mas a detecção do vírus é fundamental para a conclusão do diagnóstico. A PCR em tempo real, cuja padronização foi iniciada neste trabalho, consiste em importante ferramenta para a utilização futura no diagnóstico complementar das infecções virais do SNC. / Enteroviruses (HEV), herpesviruses 1 and 2 (HHV-1 and HHV-2) and adenoviruses (HAdV) are important causative agents of infections of the CNS. In this study, molecular techniques were applied to the detection of these viruses. CSF samples were collected from patients treated at the University Hospital of USP, between August and November, 2010, and February 2012 and January 2013. By the Nested-PCR reaction, HEV were detected in 9.8% of the samples, HAdV in 2.5% and HHV-1 and 2 in 1.1%. There were 3 cases of coinfection: 2 with HEV and HHV and other with HEV and HAdV. The viral genetic materials were extracted by QIAamp DNA Blood kit (Qiagen®) and MagMAXTM Viral RNA Isolation (Ambiom), and the second one showed to be more suitable for the application in clinical diagnosis. The CSF chemocytologic analysis proved to be important in directing the clinical conduct, but the detection of viruses is essential for the diagnosis. The real time PCR, which standardization was initiated in this work, will be an important tool for complementary diagnosis of viral infections of the CNS.

Enterovírus (HEV), herpesvírus 1 e 2 (HHV-1 e HHV-2) e adenovírus (HAdV) são importantes agentes de infecções do SNC. Neste trabalho, técnicas moleculares foram aplicadas para a detecção destes vírus em quadros de infecção do SNC. Amostras de líquor foram colhidas de pacientes atendidos no HU-USP entre agosto e novembro/2010 e fevereiro/2012 a janeiro/2013. Através da Nested-PCR HEV foram detectados em 9,8% das amostras, HAdV em 2,5% e HHV-1 e 2 em 1,1%, além de 3 casos de coinfecção, 2 entre HEV e HHV, e 1 entre HEV e HAdV. O material genético viral foi extraído através dos métodos Qiaamp DNA Blood (Qiagen®) e MagMAXTM Viral RNA Isolation (Ambiom), e este último pareceu mais adequado à aplicação na rotina clínica. A análise quimiocitológica do líquor mostrou-se importante no direcionamento da conduta clínica, mas a detecção do vírus é fundamental para a conclusão do diagnóstico. A PCR em tempo real, cuja padronização foi iniciada neste trabalho, consiste em importante ferramenta para a utilização futura no diagnóstico complementar das infecções virais do SNC. / Enteroviruses (HEV), herpesviruses 1 and 2 (HHV-1 and HHV-2) and adenoviruses (HAdV) are important causative agents of infections of the CNS. In this study, molecular techniques were applied to the detection of these viruses. CSF samples were collected from patients treated at the University Hospital of USP, between August and November, 2010, and February 2012 and January 2013. By the Nested-PCR reaction, HEV were detected in 9.8% of the samples, HAdV in 2.5% and HHV-1 and 2 in 1.1%. There were 3 cases of coinfection: 2 with HEV and HHV and other with HEV and HAdV. The viral genetic materials were extracted by QIAamp DNA Blood kit (Qiagen®) and MagMAXTM Viral RNA Isolation (Ambiom), and the second one showed to be more suitable for the application in clinical diagnosis. The CSF chemocytologic analysis proved to be important in directing the clinical conduct, but the detection of viruses is essential for the diagnosis. The real time PCR, which standardization was initiated in this work, will be an important tool for complementary diagnosis of viral infections of the CNS.

O herpesvirus equino tipo 1 (EHV-1) é um importante patógeno que causa doença respiratória, abortamento e desordens neurológicas em equinos. O presente estudo foi realizado visando avaliar a resposta inflamatória causada pelo EHV-1 por meio da análise das manifestações clínicas, alterações histopatológicas e resposta imune do hospedeiro no sistema nervoso central (SNC). Camundongos das linhagens BALB/c (H2d), C57BL/6 (H2b) e C3H/HeJ (H2k) foram inoculados por via intranasal com as estirpes brasileiras A4/72 e A9/92 do EHV-1. Nesse estudo, associou-se a histopatologia, a resposta de citocinas pró-inflamatórias no SNC de camundongos das diferentes linhagens e o método de transcrição reversa seguida pela reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) para investigar a relação entre a infecção pelo EHV-1 e a resposta inflamatória com o desenvolvimento de lesões. As estirpes brasileiras A4/72 e A9/92 do EHV-1 causaram infecção aguda e letal nas diferentes linhagens de camundongos isogênicos. Os sinais clínicos e neurológicos, tais como perda de peso, pelos arrepiados, postura arqueada, apatia, dispneia, desidratação e sialorreia apareceram entre o 2º e 3º dia pós-infecção (dpi). Essas manifestações foram acompanhadas pelo aumento da sensibilidade a estímulos externos, convulsões, recumbência e morte. As alterações histopatológicas consistiram em necrose neuronal, edema, necrose de liquefação, leptomeningite neutrofílica, manguito perivascular, hemorragia focal, inflamação não supurativa, gliose multifocal e infiltração perivascular de células polimorfonucleares e mononucleares. As características e a extensão das lesões variaram entre as linhagens de camundongos. Animais inoculados com a estirpe A4/72 apresentaram lesões histopatológicas de maior grau de severidade quando comparados com aqueles inoculados com a estirpe A9/92. Observou-se aumento da concentração plasmática de TNF-α, IL-6, CCL2 e IFN-γ nos camundongos infectados pelo EHV-1 no 2º dpi. Detectou-se aumento da concentração plasmática e da expressão de mRNA para TNF-α, IL-6 e CCL2 no SNC dos camundongos infectados pelo EHV-1 no 3º dpi; entretanto, não houve aumento da concentração plasmática nem da expressão de mRNA para IFN-γ no 3º dpi. Evidenciou-se que a estirpe A4/72 do EHV-1 induz uma resposta imune sistêmica mais efetiva, enquanto que o vírus A9/92 culmina em uma resposta imunológica mais efetiva no SNC. Os camundongos com o fundo genético C57BL/6 e BALB/c mostraram níveis mais altos de expressão de mRNA para TNF-α, IL-6 e CCL2, quando comparados com os C3H/HeJ. A gravidade dos sinais clínicos observados em camundongos infectados pode ser correlacionada com o pico dessas citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-6) e da quimiocina CCL2, que são produzidas logo após a infecção viral por células residentes da glia e/ou infiltrativas no SNC. Esses achados indicam que as diferentes linhagens de camundongos isogênicos são susceptíveis à infecção por estirpes neuropatogênicas do EHV-1; as diferenças no padrão de alterações histopatológicas mostram que elas dependem do hospedeiro infectado, da estirpe viral e da resposta imunológica; e a supressão do interferon (IFN) tipo 1 sugere ser um mecanismo de escape do EHV-1 frente ao sistema imune. A baixa expressão de IL-6, TNF-α e da quimiocina CCL2 em camundongos C3H/HeJ se explica pela mutação no gene toll-like receptor 4 (TLR-4) existente nessa linhagem de camundongo. Adicionalmente, os camundongos C3H/HeJ apresentaram lesões histopatológicas mais severas no SNC quando comparados com BALB/c e C57BL/6. Sugere-se que o IFN tipo I e o gene TLR-4 apresentam importante papel na patogênese do EHV-1 bem como proteínas do agente viral responsáveis pela supressão do IFN e partículas virais que sejam reconhecidas pelo TLR-4 podem ser alvos para o desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento da doença viral e para a eficiência de imunógenos / The equine herpesvirus type 1 (EHV-1) is an important pathogen that causes respiratory disease, abortion and neurological disorders in horses. This study was conducted to evaluate the inflammatory response caused by EHV-1 by the analysis of clinical manifestations, histopathological changes and the host immune response in the central nervous system (CNS). BALB/c (H2d), C57BL/6 (H2b) and C3H/HeJ (H2k) mice were inoculated intranasally with Brazilian EHV-1 strains A4/72 and A9/92. In this study, joined histopathology, the response of proinflammatory cytokines in the CNS of mice of different strains and reverse transcription method followed by quantitative polymerase chain reaction in real time (RT-qPCR) to investigate the relationship between infection by EHV-1 and inflammatory response in the development of lesions. Brazilian strains A4/72 and A9/92 EHV-1 caused acute lethal infection in different strains of inbred mice. Clinical and neurological signs such as weight loss, the bristly hair, hunched posture, apathy, dyspnoea, dehydration and salivary hypersecretion appeared between 2nd and 3rd day after infection (dpi). These events were accompanied by increase in the sensitivity to external stimuli, convulsions, recumbency and death. Histopathological changes were neuronal necrosis, edema, liquefaction necrosis, neutrophilic leptomeningitis, perivascular cuff, focal hemorrhage, non-suppurative inflammation, multifocal gliosis and perivascular infiltration of polymorphonuclear and mononuclear cells. The characteristics and the extent of the injuries varied between strains of mice. Animals inoculated with the A4/72 strain showed histopathological lesions of greater severity when compared with those inoculated with the A9/92 strain. There was an increase in plasma concentrations of TNF-α, IL-6, CCL2 and IFN-γ in mice infected by EHV-1 in 2nd dpi. Plasma concentrations and the expression of mRNA for TNF-α, IL-6 and CCL2 in the CNS of mice infected with EHV-1 at 3rd dpi were increased; however, there was no increase in plasma concentration or expression for the mRNA of IFN-γ at 3rd dpi. It was evident that the EHV-1 strain A4/72 induces a more effective systemic immune response, whereas the A9/92 virus culminates in a more effective immune response in the CNS. The C57BL/6 and BALB/c mice showed higher levels of mRNA expression for TNF-α, IL-6 and CCL2, compared to C3H/HeJ mice. The severity of clinical signs observed in infected mice can be correlated with the peak of these proinflammatory cytokines (TNF-α and IL-6) and CCL2 chemokine, which are then produced after viral infection by resident glial cells and/or infiltrative cells in the CNS. These findings indicate that different strains of inbred mice are susceptible to infection neuropathogenic EHV-1 strains; the differences in the pattern of pathological changes show that they depend on the infected host, the EHV-1 strain and the immune response; and the suppression of interferon (IFN) type I suggested to be an escape mechanism for the EHV-1 against the immune system. The low expression of IL-6, TNF-α and chemokine CCL2 in C3H/HeJ mice can be explained by a mutation in toll-like receptor 4 (TLR-4) gene existing in this mouse strain. Additionally, C3H/HeJ mice exhibited more severe histopathological lesions in the CNS as compared to BALB/c and C57BL/6. It is suggested that type I IFN and TLR-4 gene have important role in the pathogenesis of EHV-1 and viral agent proteins responsible for the suppression of IFN and the viral particles that are recognized by TLR-4 can be targets for the development of new approaches for the treatment of viral disease and the efficiency of immunogens