Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-30T14:25:39Z No. of bitstreams: 1 texo completo.pdf: 2677049 bytes, checksum: 4119454474e0194b1ec3c3efcf9fa533 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-30T14:25:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texo completo.pdf: 2677049 bytes, checksum: 4119454474e0194b1ec3c3efcf9fa533 (MD5) Previous issue date: 2014-08-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / É comum a suposição de que plantas C4, por sua fotorrespiração desprezível, tenham menor restrição de CO2 quando a transpiração for reduzida pelo fechamento estomático e, consequentemente, maior tolerância à seca. No entanto, esta interpretação foi demonstrada não ser verdadeira e relativamente pouca informação existe sobre a tolerância a deficiência hídrica em plantas C4, em particular, cana-de- açúcar. Aqui analisou-se dois genótipos contrastantes quanto à tolerância à seca, os quais apenas informações empíricas existem, sem dados publicados disponíveis. Embora em pequenos vasos não se observou diferenças entre cultivares, utilizando vasos maiores (30L) e rizotrons longos (1,2 m-38L) demonstramos que a cultivar RB 867515 foi mais tolerante à seca que a cultivar RB 855536, principalmente devido à redução da desidratação foliar e maior massa seca do colmo sob estresse hídrico severo. A tolerância à seca não foi associada com maior massa seca e volume de raízes ou maior relação raiz/parte aérea, mas foi claramente associada com comprimento total e profundidade da raiz sendo que a cultivar tolerante apresentou raízes mais finas e apesar da inferior massa, teve maior área superficial radicular. Este dado é um bom exemplo de como importante para a tolerância à seca é a arquitetura e morfologia das raízes comparada a analise apenas da massa. As trocas gasosas, análise de fluorescência da clorofila a, atividade total de algumas enzimas antioxidantes (SOD, APX e CAT) não contribuíram para tolerância diferencial ao défict hídrico da cultivar RB 867515. Apesar disso, resultados de proteômica diferencial e fosfoproteômica mostraram aumento exclusivo de abundância de 10 de proteínas fotossintéticas sob estresse severo e aumento da fosforilação de 14, sendo 8 exclusivamente na cultivar tolerante. Esta discrepância entre a medição pontual da fotossíntese e a análise sistêmica ilustra a importância desta última abordagem para obter não só uma visão mais integrada das respostas bioquímicas, mas também uma visão mais fiável das respostas de plantas a seca. Estas evidências sugerem que alterações moleculares na fotossíntese podem contribuir para a tolerância à seca em cana devido a sua contribuição parcial para o aumento da biomassa do colmo sob estresse. O maior nível de ABA foliar sob déficit hídrico severo na cultivar tolerante poderia estar envolvido na mudança de profundidade e área superficial radicular, mas não parece contribuir para um comportamento estomático diferencial. Análises do proteoma diferencial e fosfoproteoma das folhas indicam a importância do metabolismo da glutationa na tolerância ao estresse hídrico, embora o genótipo tolerante tenha apresentado maior carbonilação de proteínas e sem diferenças relativas na peroxidação lipídica e extravasamento de eletrólitos. A análise do redoxproteoma não permitiu inferências claras sobre a tolerância à seca sendo que a maior parte de proteínas com carbonilação foram detectadas em genótipos tolerantes. Levando-se em conta o atraso do enrolamento foliar sob estresse e da maior biomassa do colmo, pode-se interpretar que o genótipo tolerante não teve uma queda tão pronunciada no fluxo fotossintético como resultado de uma maior carbonilação, e sugere-se que o aumento na abundância e fosforilação de proteínas envolvidas neste processo seria uma resposta ao aumento da carbonilação observada. A contribuição específica da glicólise na tolerância ao estresse severo também foi visualizada simultaneamente no proteoma diferencial e fosfoproteoma, e o aumento da fosforilação de várias enzimas dessa via não pode ser atribuído ao aumento da abundância relativa das mesmas. Mais uma vez as duas abordagens proteômicas citadas mostroram claras evidências da importância do metabolismo de aminoácidos nas folhas na tolerância à seca, mas a contribuição de diferentes aminoácidos poderem mudar, dependendo do grau de estresse. Essas mudanças na proteômica foram fortemente reforçadas por dados enzimáticos e metabolômicos. Genótipo tolerante apresentou maiores teores de aminoácidos totais sob estresse, e sob estresse severo, níveis mais elevados de cisteína, substrato para biossíntese de glutationa, além de maiores níveis de glicina, serina, lisina, treonina e isoleucina. Estes dados sugerem a importância de vários aminoácidos diferentes para ajuste osmótico, e poderia explicar parcialmente a menor desidratação foliar no genótipo tolerante sob déficit hídrico severo. Outra boa concordância entre os dados de proteômica e metabolômica foi observada para a respiração. Análise funcional do proteoma diferencial e fosfoproteoma claramente indicam o enriquecimento da abundância de enzimas glicolíticas e genes do metabolismo de açúcares no genótipo tolerante. Adicionalmente, os dados de metabolômica indicam níveis mais elevados de glicose, isocitrato, aconitato e malato nesse genótipo, o que sugere que um maior fluxo respiratório suportando o aumento da biossíntese de aminoácidos nas folhas sob estresse possa ser um importante mecanismo de tolerância à seca em cana. Em síntese, este estudo ilustra a natureza poligênica da tolerância à seca, bem como a importância do uso de abordagens sistêmicas para complementar as medidas pontuais, a fim de compreender melhor os mecanismos de resposta das plantas ao déficit hídrico. / Is a quite usual the assumption that C4 plants, because their negligible photorespiration, will have lower CO2 restriction when transpiration will be reduced by stomatal closure and consequently higher drought tolerance. However this interpretation was shown not to be true, and relatively reduced information exist about C4 drought tolerance, in particular, with sugarcane. Here we analyzed two contrasting genotypes regarding drought tolerance, from which only empirical information exist, without any published data available. Although with small pots we were unable to show differences between cultivars, using large pots (30L) and long rizotrons (1,2 m), we have demonstrated that the cultivar RB 867515 was more drought tolerant that cultivar RB 855536, mainly due to reduced leaf dehydration and higher culm dry mass under severe water stress. Drought tolerance was not associated with higher root dry mass and root volume or higher root/shoot ratio, but was clearly associated with individual root length, root deepness, and the tolerant cultivar have thinner roots, and despite lower root mass, have higher root surface area. This data is a good picture how more important for drought tolerance is root architecture and morphology than root mass. Gas exchange, chlorophyll a fluorescence analysis and total activity of some antioxidative enzymes (SOD, APX and CAT) do not contribute for the differential drought tolerance of cultivar RB 867515. Despite that, differential proteomics and phosphoproteomics shows an exclusive increase of abundance of 10 photosynthesis proteins under severe stress, and increase in phosphorylation of 14 of then, 8 exclusively in the tolerant. This discrepancy between single time point measurement of photosynthesis and systemic analysis illustrate the importance of this last approach to get not only a more integrated picture of biochemical responses, but also a more reliable time picture of the whole drought plant responses. These evidences suggest that molecular changes in photosynthesis could contribute to drought tolerance in sugarcane, due its partial contribution to the increased culm biomass under stress. The higher leaf ABA under severe water deficit of tolerant cultivar could be involved in the change of root deep and root surface area, but do not seems to contribute to a differential stomatal behavior. Differential proteomics and phosphoproteomics analysis of leafs indicate the importance of glutathione metabolism in water deficit tolerance, although the tolerant genotype has higher protein carbonilation and no relative differences in lipid peroxidation and electrolyte leakiness. The redox proteomics analyses do not allow clear inferences about drought tolerances, and the greater part of proteins with carbonilation were detected in tolerant genotypes. Taking in account the delay of leaf rolling under stress and the high culm biomass, we could interpret that tolerant genotype do not have a so pronounced decrease in photosynthetic flux, which could result in higher carbonilation, and could suggest that increase in protein abundance and phosphorylation of proteins involved in this process as an response to the increased oxidative carbonilation observed. The specific contribution of glycolysis in tolerance to severe stress was also simultaneously sustained by differential proteomics and fosfoproteomics, and increase in phosphorilation of several enzymes of this pathway could not be attributed to the abundance increase of them. Again both proteomic approaches cited have gave clear evidences of the importance of amino acid metabolism in leaves for drought tolerance, but the contribution of different amino acids could change depending of the stress degree. These changes in proteomics are strongly reinforced by enzymatic and metabolomics data. Tolerant genotype have higher total amino acids under stress, and under severe stress, higher levels of cysteine, substrate for glutathione biosynthesis, besides higher increases in glycine, serine, lysine, threonine and isoleucine. This data clear suggest the importance of several different amino acids to osmotic adjustment, and could partially explain the lower leaf dehydration of tolerant genotype under severe water deficit. Other good agreement between proteomic and metabolomics data is observed for respiration. Topological analysis of differential proteomics and phosphoproteomics clear indicates the enrichment of the abundance of glycolytic enzymes and sugar metabolism genes in the tolerant genotype. Additionally, metabolomics data indicates the higher levels of glucose, isocitrate, aconitate and malate in this genotype, which strongly suggest that an higher increase in respiration flux to support increased amino acid biosynthesis in leaves under stress could be an important mechanism for drought tolerance in sugarcane. This study offers a good picture to illustrate the polygenic nature of drought tolerance, and the importance of the use of systemic approaches to complement single time point measurements, in order to better understand the mechanism of plant responses to water deficit.

Made available in DSpace on 2016-03-07T19:20:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-09-17. Added 1 bitstream(s) on 2016-03-07T19:24:13Z : No. of bitstreams: 1 000854411_20170917.pdf: 427684 bytes, checksum: 6328427be3c7e3bb317d47f40312ec19 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-09-22T12:16:27Z: 000854411_20170917.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-09-22T12:17:17Z : No. of bitstreams: 1 000854411.pdf: 2712482 bytes, checksum: 2c6ff9e2456e5f600eb3ac6e153b3a9b (MD5) / Apesar dos recentes avanços em cromatografia líquida monodimensional, a complexidade de algumas amostras exige o emprego de técnicas de separação capazes de oferecer maior poder de resolução e capacidade de picos. Como consequência, o desenvolvimento de técnicas cromatográficas bidimensionais abrangentes (LC×LC, GC×GC, LC×GC) tem recebido atenção crescente nos últimos anos. A principal vantagem dessas técnicas comparadas às técnicas tradicionais é a maior capacidade de picos e possiblidade de se empregar diferentes mecanismos de separação em cada dimensão. O maior desafio relacionado à otimização de métodos desta natureza está relacionado à seleção de complexos parâmetros experimentais, frequentemente baseada na experiência do analista ao invés de rigorosamente estruturada em estratégias teoricamente embasadas. A primeira e mais importante etapa no processo de otimização de métodos LC×LC é a seleção do par cromatográfico (fase estacionária e fase móvel, 1D e 2D). Quando a amostra é precisamente conhecida, algumas características podem servir como um guia qualitativo na seleção destes parâmetros; em outros casos, padrões representativos podem ser empregados para avaliar a correlação entre os sistemas 1D e 2D, porém, quando pouca ou nenhuma informação é disponível, esta continua sendo uma tarefa difícil. Este trabalho apresenta uma nova estratégia de seleção do par cromatográfico empregando amostras reais de extrema complexidade e cálculos de recobrimento da superfície de separação, além da otimização de métodos em cromatografia líquida bidimensional abrangente baseada em planejamentos estatísticos. A amostra selecionada para o desenvolvimento do método foi uma mistura de extratos vegetais previamente estudados pelo grupo de pesquisa, contendo uma vasta diversidade de metabólitos com diferentes características estruturais e... / Despite recent advances in monodimensional liquid chromatography, the complexity of some samples requires the use of separation techniques that can provide greater resolving power and peak capacity. As a consequence, the development of comprehensive two-dimensional chromatographic techniques (LC×LC, GC×GC, LC×LC) has received increasing attention in recent years. The main advantage of these techniques compared to traditional techniques is the largest peak capacity and possibility to employ different separation mechanisms in each dimension. The biggest challenge related to method optimization of this kind of techniques is related to the selection of complex experimental parameters, often based on the analyst's experience rather than theoretically based strategies. The first and most important step in the method optimization process in LC×LC is the selection of the chromatography pair (stationary phase and mobile phase, 1D and 2D). When the sample is precisely known, some features may serve as qualitative guidance in the selection of these parameters; in other cases, representative standards can be used to evaluate the correlation between 1D and 2D systems, however, when little or no information is available, this remains a difficult task. This work presents a new strategy for the selection of the chromatographic pair using real and extremely complex samples and fractional coverage surface calculations, besides the method optimization in comprehensive two-dimensional liquid chromatography based on statistical designs. The sample selected for the method development was a mixture of plant extracts previously studied by the research group and containing a wide diversity of metabolites with distinct structural characteristics and therefore different challenges to be overcome in the chromatographic separation. Employing such strategy and comprehensive elution conditions, it was possible to select the...

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:10:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-13. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:25:58Z : No. of bitstreams: 1 000842942.pdf: 1305110 bytes, checksum: ed16ab2adb76a2f20c550720b66bbcd9 (MD5) / Neste estudo foram avaliadas duas cultivares de cana-de-açúcar sob estresse salino. O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 2 x 4, representado pelas cultivares SP81-3250 e IAC87-3396 e concentrações salinas de 0, 200, 400 e 800 mg dm-3 de NaCl, com avaliações aos 15 e 30 dias após a aplicação dos tratamentos salinos. Foram avaliados os teores foliares de sódio e potássio, o potencial de água de antemanhã, o conteúdo relativo de água, a concentração de prolina e glicina betaína, a atividade enzimática da dismutase do superóxido, ascorbato peroxidase e catalase, a concentração de aldeído malônico, o extravasamento de eletrólitos, a concentração de clorofilas a e b, a eficiência fotoquímica máxima do fotossistema II e o perfil de metabólitos secundários baseado em técnicas metabolômicas. Os tratamentos salinos promoveram aumento do teor foliar de sódio nas cultivares estudadas, com maior teor no 30° dia de avaliação, enquanto que os teores de potássio apresentaram leve redução. Por outro lado, o potencial de água de antemanhã e o conteúdo relativo de água foram reduzidos em ambas as cultivares e dias de avaliação com o aumento da severidade do estresse salino. Foi observado aumento na concentração de prolina e glicina betaína, sendo este incremento mais evidente na cv. IAC87-3396 em ambos os dias de avaliação. Similarmente, as enzimas ascorbato peroxidase e catalase tiveram aumento em suas atividades, em particular na cv. IAC87-3396 no 30° dia. Inclusive, esta cultivar de cana-de-açúcar apresentou maior concentração de aldeído malônico e extravasamento de eletrólitos em comparação a cv. SP81-3250 em ambos os dias de avaliação. Verificou-se que o estresse salino reduziu a concentração de ambos os pigmentos clorofilianos sem diferenças pronunciadas entre as cultivares nos dois dias. A eficiência fotoquímica máxima do fotossistema... / In the present study was evaluated two cultivars of sugarcane under salt stress. The experiment was conducted in a greenhouse with temperature and relative humidity average of 30.2 ± 1 ° C and 40.7 ± 1%. The experimental design was completely randomized in a factorial 2 x 4, represented by the cultivars SP81-3250 and IAC87-3396 and salt concentrations of 0, 200, 400 and 800 mg dm-3 NaCl. The study was evaluated 15 and 30 days after application of the saline treatments. We evaluated foliar concentrations of sodium and potassium, predawn leaf water potential, relative water content, proline and glycine betaine concentration, enzymatic activity of superoxide dismutase, catalase and peroxidase ascorbate, malondialdehyde concentration, electrolyte leakage, chlorophyll a and b concentration, the maximum photochemical efficiency of photosystem II and the profile of secondary metabolites based on metabolomics techniques. Saline treatments caused an increase in leaf sodium content in cultivars and both days of evaluation, while the potassium had a mild reduction. On the other hand, predawn leaf water potential and relative water content were reduced in both cultivars and evaluation days with increasing severity of salt stress. There was an increase in the concentration of proline and glycine betaine. This increase was more evident in cultivar IAC87-3396 in both days of evaluation. Similarly, enzymes ascorbate peroxidase and catalase had an increase in their activities, particularly in cultivar IAC87-3396 in the 30th day. This cultivar of sugarcane had malondialdehyde concentration and electrolytes leakage higher compared to cv. SP81-3250 in both days of evaluation. Salt stress reduced the concentration of both chlorophyllian pigments with no pronounced differences among cultivars in two days evaluated. The cultivar IAC87-3396 not presented photochemical efficiency of photosystem II with significant differences between the salt ...

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-25Bitstream added on 2014-12-02T11:21:03Z : No. of bitstreams: 1 000774521_20150425.pdf: 591036 bytes, checksum: 68e51704330ca050817edd1af813d018 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-04-28T18:32:04Z: 000774521_20150425.pdf,Bitstream added on 2015-04-28T18:32:39Z : No. of bitstreams: 1 000774521.pdf: 8721514 bytes, checksum: 1e4d9f25e7af862c5c68fd21215a3975 (MD5) / A cana-de-açúcar é a principal cultura agrícola em importância econômica das regiões tropicais, sendo que o Brasil possui a maior área cultivada e em expansão do mundo. As variedades modernas são oriundas principalmente do cruzamento entre Saccharum officinarum e Saccharum spontaneum. Com o desenvolvimento tecnológico dos programas de melhoramento genético, muitas doenças antigas da cana-de-açúcar foram superadas através do desenvolvimento de genótipos resistente. Entretanto, no ano de 2009 o aparecimento da ferrugem alaranjada no estado de São Paulo causou grande prejuízo econômico, porque variedades com características de alta produtividade e resistência à ferrugem marrom, mostraram-se suscetíveis à ferrugem alaranjada. Diante disso, este trabalho teve por objetivo a caracterização micromolecular de genótipos de cana-de-açúcar resistentes e suscetíveis à ferrugem alaranjada, visando à identificação de marcadores moleculares de resistência a esse patógeno. Para isso, empregaram-se LC-DAD-MS e 1H NMR para obtenção de dados analíticos e métodos quimiométricos para análise multivariada. Para a etapa de caracterização, o extrato hidro-alcoólico preparado a partir de 500 mg das folhas de cana-de-açúcar foi fracionado em HPLC-DAD, fornecendo 60 frações que foram analisadas por LC-DAD-MS e 1H NMR. Esta etapa permitiu a identificação de 52 metabólitos, entre aminoácidos, açúcares, derivados do ácido benzoico, ácido hidroxicinâmico e flavonas C e O glicosiladas. Na segunda etapa foram avaliados os fingerprintings metabólicos dos genótipos resistentes (IAC95 5000) e suscetíveis (SP89 1115) empregando LC-DAD e submetidos a PCA. No primeiro planejamento experimental as mudas de ambos os genótipos com 30 dias foram transferidas para câmara de crescimento e mantidas a 25 ºC durante 30 dias. A PCA deste experimento mostrou que o genótipo resistente possui maior correlação com derivados de... / Sugarcane is the main agricultural crop in economic importance of tropical regions and Brazil has the largest cultivation acreage in the world. The modern varieties are arising mainly from the crossing of Saccharum officinarum X Saccharum spontaneum. With the technological development of breeding programs, many old diseases affecting sugarcane were overcome through the development of resistant genotypes. However, in 2009 the first appeareance of orange rust in São Paulo State led to huge economic loss, because varieties with characteristics of high yield and resistance to brown rust were susceptible to orange rust. Therefore, this study aimed the micromolecular characterization of the sugarcane genotypes resistant and susceptible to orange rust by employing LC-DAD-MS and 1H NMR as well as analysis of both genotype extracts by HPLC-DAD and multivariate analysis. For the characterization step, the extract prepared from 500 mg of sugarcane leaves employing H2O/MeOH (8:2) was fractioned in 60 fractions and analyzed by LC-DAD-MS and 1H NMR. This step allowed the identification of 52 metabolites, including amino acids, sugars, organic acids, such as benzoic and phenolic, and flavones, out of which 33 are described for the first time in sugarcane. On the second step, the genotypes IAC95 5000 (resistant) and SP89 1115 (susceptible) growing under control conditions and inoculated with Puccinia kuehnii were analyzed by HPLC-DAD e submitted to multivariate analysis by PCA. In the first experimental design, the seedlings of IAC95 5000 and SP89 1115 genotypes with 30 days were maintained in growth room at 25 ºC. The harvest was carried out on 30, 35, 40, 45 and 60 day old seedlings at 6 am and 8 pm. The PCA of this experiment showed that the resistant genotype has the highest correlation of with luteolin derivatives. In the second experimental design, 25 plants were inoculated and 25 were considered as control for each genotype. The seedlings were...

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-28Bitstream added on 2015-03-03T12:07:18Z : No. of bitstreams: 1 000806902_20150828.pdf: 529126 bytes, checksum: 0ba8a9d77911f516559558294b02f40f (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-28T16:08:57Z: 000806902_20150828.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-28T16:10:00Z : No. of bitstreams: 1 000806902.pdf: 2067465 bytes, checksum: 40c8b4a1cf5b96c8d6428c73cac91c66 (MD5) / A abordagem reducionista na busca por substâncias bioativas em produtos naturais nem sempre é capaz de compreender em sua totalidade a dinâmica envolvida nas respostas farmacológicas de matrizes complexas como extratos vegetais. Inserido neste paradigma, este trabalho visou ao desenvolvimento de métodos e abordagens racionais que permitissem o entendimento das relações moleculares em produtos naturais bioativos. Para tanto, espécies vegetais da família Chrysobalanaceae com potencial citotóxico, depositadas na extratoteca do NuBBE, foram os objetos de estudo na aplicação de metodologias para a determinação de sua composição metabólica e para a avaliação do potencial citotóxico. Os extratos hidroalcoólicos de Couepia grandiflora, Hirtella hebeclada, Licania hoehnei, Licania kunthiana, Licania huminis e Parinari excelsa foram analisados por CG-EM, CLAE-DAD-EM/EM e CLAE-autoEM/EM para a identificação in situ de sua composição metabólica, através de comparação dos dados espectrais a uma base de dados contendo valores de massas de alta resolução e espectros de UV de todos os metabólitos secundários já relatados para a família Chrysobalanaceae. O uso de ferramentas de análise multivariada, como a deconvolução empírica proposta pelo software AMDIS e a extração espectral desenvolvidas pelos algoritmos RAMSY e MCR-ALS, assistiram à desreplicação ao extrair os espectros dos compostos, mesmo em baixa resolução cromatográfica. A desreplicação das espécies de Chrysobalanaceae permitiu a detecção in situ de metabólitos primários (aminoácidos, ácidos e açúcares) e secundários (flavonoides-O-glicosilados e polímeros de proantocianidinas). Adicionalmente ao estudo de determinação metabólica das matrizes vegetais, realizaram-se ensaios de atividade citotóxica. Resultados preliminares da bioatividade ante diferentes linhagens de Saccharomyces cereviceae, obtidos... / The reductionist approach for the search of bioactive compounds in natural products is not always being able to understand the complete dynamics involved in the pharmacological responses of complex matrices such as plant extracts. Based on this paradigm, this study aimed to develop rational methods approaches to runderstand the molecular relationships present in bioactive natural products. Chrysobalanaceae plant species with cytotoxic potential, deposited NuBBE`s bank of extracts, were the objects of study in the application of methodologies for defining the metabolic composition and evaluate their cytotoxic potential. Couepia grandiflora, Hirtella hebeclada, Licania hoehnei, Licania kunthiana, Licania huminis and Parinari excelsa ethanol extracts were analyzed by GC-MS, HPLC-DAD-MS/MS and HPLC-autoMS/MS for in situ metabolic identification based on spectral comparison with a high resolution mass spectra and UV spectral database developed using previously reported data for Chrysobalanaceae. The use of multivariate analysis tools, the empirical deconvolution software AMDIS and the spectral extraction algorithms RAMSY and MCR-ALS assisted the dereplication by extracting spectral data for pure compounds even at low chromatographic resolution. The dereplication of Chrysobalanaceae species allowed the in situ detection of primary metabolites (amino acids, and sugars) and secondary (O-glycosylated-flavonoids and proanthocyanidins polymers). In addition to the metabolic determination of Chrysobalanaceae extracts, were performed cytotoxicity bioassays. Preliminary results of cytotoxicity against Saccharomyces cereviceae, carried out during the construction of the bank of extracts, indicated cytotoxic potential, especially for Hirtella hebeclada and Parinari excelsa. However, the cytotoxic assay against different tumor cell lines showed that the extracts were not active, which may be related to which may be...

Orientador: Humberto Márcio Santos Milagre / Banca: Eduardo Maffud Cilli / Banca: José Augusto Rosário Rodrigues / Resumo: A técnica de ionização MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) foi uma das responsáveis por revolucionar a Espectrometria de Massas, tornando possível sua aplicação a moléculas termolábeis e de alta massa molecular, como as proteínas. Apesar de seu grande desenvolvimento, esta técnica ainda apresenta algumas limitações como a seleção da matriz utilizada e o método de preparo de amostras. Estes fatores são determinantes na reprodutibilidade da análise e na faixa de aplicação de m/z. Neste trabalho, inicialmente analisou-se diferentes linhagens de cianobactérias por MALDI-TOF-MS, com a finalidade de se buscar por novos analitos para os quais fosse possível o monitoramento utilizando-se as matrizes iônicas. Posteriormente avaliou-se as características destas matrizes, a metodologia de preparo de amostras, a composição do analito e a intensidade do laser da fonte de MALDI, com o objetivo de selecionar as melhores metodologias de análise. Após esta etapa, as matrizes iônicas e metodologias selecionadas foram aplicadas na detecção e quantificação de cianotoxinas e na análise de fármacos por MALDI-MS. Neste estudo obteve-se como resultados: a diferenciação de linhagens de cianobactérias através dos fingerprints obtidos por MALDI-TOF-MS que também permitiram a detecção de importantes metabólitos; a detecção da homoanatoxina-a, uma cianotoxina de baixa massa molecular, diretamente de células de cianobactérias; o desenvolvimento de um método quantitativo de análise de microcistinas com ótima precisão; e o desenvolvimento de uma metodologia inédita para a detecção dos componentes ativos de medicamentos, ampliando, portanto, o leque de aplicações da técnica de MALDI. / Abstract: The Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization technique was one of the ionization sources responsible for revolutionizing Mass Spectrometry, making possible its application to labile and high molecular weight molecules, such as proteins. Despite its great development, this technique still has some limitations like the selection of the matrix and the sample preparation method. These factors determine the reproducibility of analysis and the m/z application range. Initially, in this work, we analyzed different cyanobacteria strains by MALDI-TOF-MS, in order to check for new analytes to be monitored using ionic matrices. Subsequently, the characteristics of these matrices, the sample preparation method, the composition of the analyte and laser intensity of the MALDI source were evaluated aiming to select the best methodologies of analysis. After this step, the selected ionic matrices and methodologies have been applied in the detection and quantification of cianotoxins and analysis of pharmaceutical drugs by MALDI-MS. In this study we obtained as results: the differentiation of strains of cyanobacteria through the fingerprints obtained by MALDI-TOF-MS which allowed the detection of important metabolites; the detection of homoanatoxin-a, a low molecular weight cyanotoxin, directly from cyanobacteria cells; the development of a quantitative method for the analysis of microcystins with great precision; and the development of a new methodology for the detection of active compounds of medicines, increasing, therefore, the application range of MALDI technique. / Mestre

Orientador: Alberto José Cavalheiro / Co-orientador: Cristiano Soleo de Funari / Banca: Paulo Clairmont Feitosa de Lima Gomes / Banca: Fabíola Manhas Verbi Pereira / Banca: Álvaro José dos Santos Neto / Banca: Carmen Lúcia Cardoso / Resumo: Apesar dos recentes avanços em cromatografia líquida monodimensional, a complexidade de algumas amostras exige o emprego de técnicas de separação capazes de oferecer maior poder de resolução e capacidade de picos. Como consequência, o desenvolvimento de técnicas cromatográficas bidimensionais abrangentes (LC×LC, GC×GC, LC×GC) tem recebido atenção crescente nos últimos anos. A principal vantagem dessas técnicas comparadas às técnicas tradicionais é a maior capacidade de picos e possiblidade de se empregar diferentes mecanismos de separação em cada dimensão. O maior desafio relacionado à otimização de métodos desta natureza está relacionado à seleção de complexos parâmetros experimentais, frequentemente baseada na experiência do analista ao invés de rigorosamente estruturada em estratégias teoricamente embasadas. A primeira e mais importante etapa no processo de otimização de métodos LC×LC é a seleção do par cromatográfico (fase estacionária e fase móvel, 1D e 2D). Quando a amostra é precisamente conhecida, algumas características podem servir como um guia qualitativo na seleção destes parâmetros; em outros casos, padrões "representativos" podem ser empregados para avaliar a correlação entre os sistemas 1D e 2D, porém, quando pouca ou nenhuma informação é disponível, esta continua sendo uma tarefa difícil. Este trabalho apresenta uma nova estratégia de seleção do par cromatográfico empregando amostras reais de extrema complexidade e cálculos de recobrimento da superfície de separação, além da otimização de métodos em cromatografia líquida bidimensional abrangente baseada em planejamentos estatísticos. A amostra selecionada para o desenvolvimento do método foi uma mistura de extratos vegetais previamente estudados pelo grupo de pesquisa, contendo uma vasta diversidade de metabólitos com diferentes características estruturais e... / Abstract: Despite recent advances in monodimensional liquid chromatography, the complexity of some samples requires the use of separation techniques that can provide greater resolving power and peak capacity. As a consequence, the development of comprehensive two-dimensional chromatographic techniques (LC×LC, GC×GC, LC×LC) has received increasing attention in recent years. The main advantage of these techniques compared to traditional techniques is the largest peak capacity and possibility to employ different separation mechanisms in each dimension. The biggest challenge related to method optimization of this kind of techniques is related to the selection of complex experimental parameters, often based on the analyst's experience rather than theoretically based strategies. The first and most important step in the method optimization process in LC×LC is the selection of the chromatography pair (stationary phase and mobile phase, 1D and 2D). When the sample is precisely known, some features may serve as qualitative guidance in the selection of these parameters; in other cases, "representative" standards can be used to evaluate the correlation between 1D and 2D systems, however, when little or no information is available, this remains a difficult task. This work presents a new strategy for the selection of the chromatographic pair using real and extremely complex samples and fractional coverage surface calculations, besides the method optimization in comprehensive two-dimensional liquid chromatography based on statistical designs. The sample selected for the method development was a mixture of plant extracts previously studied by the research group and containing a wide diversity of metabolites with distinct structural characteristics and therefore different challenges to be overcome in the chromatographic separation. Employing such strategy and comprehensive elution conditions, it was possible to select the... / Doutor

Orientador: Ian Castro-Gamboa / Banca: Isabele Rodrigues Nascimento / Banca: Flávia Talarico Saia / Resumo: A cada ano vem crescendo a busca por novas fontes de produtos naturais, na qual os micr o - organismos recebem uma grande atenção, sendo eles de extrema importância na descoberta de compostos bioativos e promissores a novos fármacos. Esse trabalho teve como foco o estudo de fungos filamentosos da rizo sfera de Senna spectabilis . F oram testadas suas viabilid ad es e a pós esse processo, dez fungos foram escolhidos para esse trabalho e submetidos a os testes biológicos como citotóxico, anti colinesterásico e antifúngico e t ambém foram obtidos seus perfis cromatográficos e químicos por CLAE - DAD e RMN, além da identificação filogenética. A pós esses resultados iniciais, dois fungos foram escolhidos para desenvolver o método de desreplicação, sendo eles Fusarium solani e F . oxysporum . Esses fungos apresentaram atividade antifúngica contra C. cladosporioides e C. sphaerospermun e também apresentaram atividade anticolinesterásica, além disso, F. oxysporum apresentou também atividade antitumoral contra câncer do colorretal. Através das téc n icas CG - EM, CLAE - EM, CLAE - EM/EM e RMN foram propostas estruturas moleculares interessantes para substâncias produzidas por e sses micro - organismos, sendo que para o extrato de Fusarium solani foram identificados 1 2 metabólitos: ácido fumárico, ácido málico, tirosol, ácido p - hidroxibenzóico, ácido azelaico, ácido fusárico, ( - ) - ácido jasmônico/ácido (+) - 7 - iso - jasmônico, 10 - hidroxicaptotecina, C - 16 - esfinganina, xestoaminol C, armilarina/armilaripina e beauvericina e para o extrato d o fungo Fusarium oxysporum foram observados 14 metabólitos: ácido succínico, ácido p - hidroxibenzóico, ácido hexadecanó i co, ácido octadecanóico, ácido fusárico e três de seus derivados, integracídeo C, fusagerina C/D, C - 16 - esfinganina, xextoaminol C, armila rina/armilaripina e beauver i cina . Além desses... / Abstract: T he search for new sources of natural products has been increasing to the rational exploration of microorganisms as great sources for the discovery of bioactives and promising compounds as well as new drugs. This work focused on the study of filamentous fungi, isolated from Senna spectabilis's rhizosphere from which were tested its viabilities. Thereon, ten fungi were chosen for this work and were s ubmitted to biological tests, such as cytotoxic, anticholinesterase and antifungal. In addition, their chemical profiles were obtained for HPLC and NMR, besides phylogenetic identification. Finally, tw o fungi were chosen to develop dereplication method, being them Fusarium solani and F . oxysporum. Th ese fungi howed anticholinesterase activity and antifungal activity aga in st C. cladosporioides and C. sphaerospermun . Additionally, F. oxysporum showed antitumor activity against colorectal cancer. Through the GC - MS, HPLC - MS, HPLC - MS/MS and NMR, we were able to obtained interesting molecular chem o types for these microorganisms; for F. solani we identified 12 metabolites, fumaric acid, malic acid, tyrosol, p - hydroxybenzoic acid, azelaic acid, fusaric acid, (+) - 7 - iso - jasmonic acid/( - ) - jasmonic acid, 10 - hydroxycamptotecin, C16 - sphinganine, xestoaminol C, armillarin/armillaripin and beauvericin and for F. oxysporum was observed 14 metabolites, succinic acid, p - hydroxybenzoic acid, hexadecanoic acid, octadecanoic acid, fusaric acid and its three derivatives, integracide C, fusagerin C/D, C - 16 - sphinganine, xestoaminol C, armillarin/armillaripin and beauvericin . Besides these compounds, others 5 metabolites common to both species ( solani and ox y sporum ) couldn't be structurally characterized thorough LC - MS/MS, but they were accounted in several Fusarium species. / Mestre

Orientador: Mario Sergio Palma / Banca: Zila Luz Paulino Simões / Banca: Norberto Peporine Lopes / Resumo: As abelhas têm sido utilizadas como modelos robustos e influentes para o estudo de memória e aprendizagem, contribuindo para o melhor entendimento das bases da cognição. Nesse contexto, diferentes metabólitos foram caracterizados por desempenharem funções distintas no processo de aprendizagem e formação de memória em insetos. Considerando que pouco se sabe sobre os metabólitos em relação ao desenvolvimento das habilidades cognitivas em A. mellifera, ou mesmo em relação aos comportamentos reflexos (condicionados e/ou não condicionados), o presente estudo teve como objetivo a análise metabolômica do cérebro de abelhas submetidas ao ensaio comportamental de reflexo de extensão de probóscide (REP). Para isto, foi padronizada a técnica de análise metabolômica com o uso do sistema LC-ESI- MS e MSn, construindo-se inicialmente uma biblioteca de compostos característicos de cérebro de abelhas (neurotransmissores, aminoácidos livres, poliaminas, nucleotídeos, nucleosídeos, ácidos orgânicos, etc). Nesta primeira abordagem, dentre os 112 compostos da biblioteca, 48 foram identificados e quantificados; alguns destes compostos foram únicos para o grupo controle (cadaverina, espermina, glicose, uracila e n-acetil-L-glutamato 5-semialdeido), enquanto que outros foram únicos para o grupo REP (fenilalanina, betaína, espermidina, serina e creatina). Dentre os compostos identificados em ambos os grupos, apenas 5 compostos apresentaram diferenças quantitativas estatisticamente significantes (arginina, asparagina, guanosina monofosfato, putrescina e 4-guanitinobutanoato). Visando o estudo dos perfis metabólicos regionais (em cada região do cérebro), foi também padronizado o protocolo experimental utilizando-se a estratégia MALDI Spectral Imaging e o desenvolvimento de um método semi-quantitativo de metabólitos ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico) / Abstract: The honeybee Apis mellifera has long served as an invertebrate model organism for learning and memory research, contributing to a better understanding of cognition bases. In this context, different metabolites (especially neurotransmitters) were characterized by play distinct roles in learning process and in memory formation in insects. Whereas little is known about the metabolites in relation to the development of cognitive skills in A. mellifera, the present study aims to perform a metabolomic analysis of the honeybee brains submitted to the behavioral test of proboscis extension reflex (PER). For this, has been standardized a metabolomic analysis technique through the use of LC-ESI-MS and MSn system. Initially a low molecular weight compounds library was created, containing characteristic compounds of bee brain (neurotransmitters, free amino acids, polyamines, nucleotides, nucleosides, organic acids, etc.). In this first approach, from the library of 112 compounds, 48 compounds were identified and quantified; some of these compounds were only identified in the control group (cadaverine, spermine, glucose, uracil and N-acetyl-L-glutamate 5- semialdehyde), while others were only identified in PER group (phenylalanine, betaine, spermidine, serine and creatine). Among the compounds identified in both groups, only five compounds showed statistically significant differences in quantitative results (arginine, asparagine, guanosine monophosphate, putrescine and 4-guanidinebutanoate). In order to study the metabolic profiles by regions (within each brain region) it was also standardized an experimental protocol using a novel semi-quantitative method of MALDI Spectral Imaging strategy. This strategy allowed the study and the mapping of the spatial distribution of metabolites identified in honeybee brain sections, as well as a better understanding ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Danielle Karla Martins Silva (danielle.martins@ufpe.br) on 2015-03-13T13:23:18Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Maria de Jesus Santos.pdf: 2877099 bytes, checksum: 04af70722e8d7edebcc4a65d2877869b (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T13:23:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Maria de Jesus Santos.pdf: 2877099 bytes, checksum: 04af70722e8d7edebcc4a65d2877869b (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014 / Neste trabalho foram investigadas as composições dos voláteis a partir de mangas da cultivar Tommy Atkins expostas à radiação gama na dose de 0,5 kGy quando comparadas à composição de voláteis obtidos a partir de mangas que não passaram por este tratamento fitossanitário. O objetivo foi construir um modelo metabolômico para classificar as mangas através de modelo não invasivo. Foram analisadas 80 amostras classificadas com grau de maturação entre 4 e 5, segundo classificação da Embrapa. Os voláteis foram coletados após 18 dias de armazenamento sob temperatura de 12°C, usando um sistema Headspace Dinâmico (HD) e submetidos à corrida cromatográfica em fase gasosa seguida de detecção por espectrometria de massas (GC/MS). Os compostos foram identificados a partir da determinação do Índice de Retenção Van den Dool and Kratz e do espectro de massas, que foram comparados aos descritos na biblioteca de espectros do ADAMS. Foram identificados 16 compostos já mencionados na literatura e classificados como terpenos (mono e sesquiterpenos) e ésteres. Entre os terpenos, o α-Pineno e o 3-Careno foram os majoritários tanto para as mangas irradiadas, como para as não irradiadas. Após a identificação dos mesmos, os cromatogramas foram utilizados para a construção de uma matriz para tratamento estatístico, o qual foi realizado utilizando a plataforma online MetaboAnalyst 2.0 e o software “R Program”. As ferramentas de estatística multivariada utilizadas foram a PCA (Análise de Componentes Principais), PLS-DA (Análise Discriminante e Regressão por Mínimos Quadrados Parciais) e KNN (K-nearest neighbor). A PCA não apresentou um resultado satisfatório para a discriminação entre as mangas irradiadas e não irradiadas. Na PLS-DA, treze compostos foram responsáveis pela discriminação entre as mangas da cultivar Tommy Atkins irradiadas e não irradiadas, com destaque para o Octanoato de Etila, o α-Felandreno e o Germacreno-D. O KNN também indicou que os teores de Octanoato de Etila, α-Felandreno e Germacreno-D são responsáveis pela discriminação entre as mangas irradiadas e não irradiadas. No entanto, a acurácia observada na classificação utilizando KNN foi maior que a observada utilizando PLS-DA. No modelo construído com KNN, o teste de validação cruzada indicou acurácia igual a 81% contra 55% da observada para o modelo construído utilizando PLS-DA. Esse resultado garante um modelo metabolômico que é capaz de classificar as amostras de mangas da cultivar Tommy Atkins que foram expostas, ou não, à radiação gama para fins fitossanitários.