Assignment (MPhil)--University of Stellenbosch, 2002. / ENGLISH ABSTRACT: The study conducted was aiming on evaluating the influence of different levels of energy and amino acids, mainly lysine and methionine, on production performance of the layer bird. There were three treatments, namely the Control diet, a high energy, lysine and methionine diet (High spec.) and a low energy, lysine and methionine diet (Low spec.). The energy levels were 11.2 MJ/kg, 11.5 MJ/kg and 10.9 MJ/kg respectively. Lysine levels were 0.67%, 0.73% and 0.63% whereas methionine levels were 0.36%, 0.38% and 0.34% respectively. The experimental design was 3 x 4 factorial, which is 3 treatments with 4 replicates each. Results showed no significant difference (P>0.05) between treatments in egg production, egg mass, egg output, bodyweight and mortality. Feed intakes of the High spec. diet were significantly lower (P<0.05) than that of the control diet and the Low spec. diet. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Hierdie studiestuk handeloor die evaluering van die invloed wat die verskillende vlakke van die energie en aminosure, veraiiisien en methionine op die produksie van 'n lê hoender het. Daar was gebruik gemaak van drie behandelings, naamlik die kontrole dieet, 'n hoë energie, lisien en methionien dieet (Hoë spesifikasie), en 'n lae energie, lisien en methionien dieet (Lae spesifikasie). Die energievlakke was 11.2 MJ/kg, 11.5 MJ/kg en 10.9 MJ/kg onderskeidelik. Lisienvlakke was 0.67%, 0.73% en 0.63% waarby methionienvlakke was 0.36%, 0.38% and 0.34% onderskeidelik. Die eksperimentele ontwerp was 3 x 4 fakulteitsfunksies: 3 behandelings met 4 replikas elk. Die resultate het geen noemenswaardige verskille (P>0.05) tussen die behandelinge in eierproduksie, eiergewig, eier-uitset, liggaamsgewig en mortaliteite nie. Die voerinnames van die hoë spesifikasie dieet was aansienlik laer (P<0.05) as die van die kontrole en lae spesifikasie dieet.

Haemophilus influenzae is a host adapted human mucosal pathogen involved in a variety of acute and chronic respiratory tract infections, including chronic obstructive pulmonary disease and asthma, all of which rely on its ability to efficiently establish continuing interactions with the host. Here we report the characterization of a novel molybdenum enzyme, TorZ/MtsZ that supports interactions of H. influenzae with host cells during growth in oxygen-limited environments. Strains lacking TorZ/MtsZ showed a reduced ability to survive in contact with epithelial cells as shown by immunofluorescence microscopy and adherence/invasion assays. This included a reduction in the ability of the strain to invade human epithelial cells, a trait that could be linked to the persistence of H. influenzae. The observation that in a murine model of H. influenzae infection, strains lacking TorZ/MtsZ were almost undetectable after 72 h of infection, while similar to 3.6 x 10(3) CFU/mL of the wild type strain were measured under the same conditions is consistent with this view. To understand how TorZ/MtsZ mediates this effect we purified and characterized the enzyme, and were able to show that it is an S- and N-oxide reductase with a stereospecificity for S-sulfoxides. The enzyme converts two physiologically relevant sulfoxides, biotin sulfoxide and methionine sulfoxide (MetSO), with the kinetic parameters suggesting that MetSO is the natural substrate of this enzyme. TorZ/MtsZ was unable to repair sulfoxides in oxidized Calmodulin, suggesting that a role in cell metabolism/energy generation and not protein repair is the key function of this enzyme. Phylogenetic analyses showed that H. influenzae TorZ/MtsZ is only distantly related to the Escherichia colt TorZ TMAO reductase, but instead is a representative of a new, previously uncharacterized Glade of molybdenum enzyme that is widely distributed within the Pasteurellaceae family of pathogenic bacteria. It is likely that MtsZ/TorZ has a similar role in supporting host/pathogen interactions in other members of the Pasteurellaceae, which includes both human and animal pathogens.

Várias evidências sugerem que a dieta é um fator relevante na modificação dos riscos de desenvolvimento de câncer e que a interação nutriente-genoma tem uma influência significativa para a manutenção da saúde. A nutrigênomica estabelece uma relação entre dieta e a investigação das alterações epigenéticas do DNA, que podem ter um papel importante na etiologia de várias doenças degenerativas. A metilação do DNA é um evento epigenético importante na modificação da expressão gênica e já existem relatos de cânceres associados com a metilação da região promotora de genes supressores tumorais, como o gene p16. A metionina (Met) é um aminoácido essencial e necessário para a manutenção do ciclo de metionina, um importante mecanismo nas reações de metilação. Outro fator que pode alterar o padrão de metilação do DNA são os quimioterápicos. A alteração da metilação do DNA, também pode modificar a estrutura dos cromossomos e levar a instabilidade genômica, relacionada com o desenvolvimento de neoplasia. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da suplementação de metionina sobre as alterações no padrão de metilação da região promotora do gene p16 no fígado e rins de ratos e as possíveis modificações induzidas pela interação com o antitumoral doxorrubicina (DXR), além da possível instabilidade genômica em células da medula óssea. Para isso, seis grupos de ratos Wistar machos (n=60) foram tratados durante seis semanas com ração comercial normal ou suplementada com 2% de Met, sendo que na 3º semana e 24 horas antes da eutanásia administrou-se salina ou DXR (1 ou 10 mg/Kg p.c.), intraperitonealmente. Os rins e o fígado foram utilizados para extração do DNA e para o estudo do padrão de metilação pelo método COBRA, após a modificação do DNA com bissulfito de sódio e amplificação por PCR. As enzimas EcoRI, TaqI e HphI foram utilizadas para verificar o padrão de metilação da região promotora do gene p16 e a enzima TasI para avaliar a modificação do DNA pelo bissulfito. Em todos os animais houve a restrição do fragmento de estudo pelas enzimas TasI e HphI, porém nenhuma restrição com as enzimas EcoRI e TaqI. O padrão de metilação da região promotora do gene p16 nos rins e no fígado não foi alterado pela suplementação de Met ou pela administração de DXR, quando se comparou os grupos controles e os tratados. A justificativa é que o gene p16 é importante na regulação do ciclo celular, apoptose e senescência e sua regulação segue um mecanismo bem controlado. Para estudar o efeito da suplementação de Met na instabilidade genômica, realizou-se o teste do micronúcleo (MN) na medula óssea dos ratos. Pela a análise do MN, a suplementação com Met não alterou a frequência de MN, mas o tratamento com a DXR (1 e 10mg/Kg) induziu a formação de MN quando comparado com o grupo Controle. A associação de Met+DXR não reduziu a freqüência de MN induzida pela DXR. Conclui-se que a Met na dieta ou a administração do quimioterápico DXR não alterou o padrão de metilação da região promotora do gene p16. O excesso de Met não apresentou ação mutagênica no teste do MN. Não houve efeito antimutagênico da Met quando associada com a DXR. / Several evidences suggest that to diet is a relevant factor in modifying the risks of developing cancer and the nutrient-genome interaction has a significant influence for the maintenance of a good health condition. Nutrigenomic establishes a relation between to diet and the investigation of epigenetic DNA modifications, which may play an important role in the etiology of various degenerative diseases. DNA methylation is an important epigenetic event modification of gene expression and there been reports of cancers associated with promoter methylation region of tumor suppressor genes such as p16 gene. Methionine (Met) is an essential aminoacid to maintain methionine cycle, very important mechanism in methylation reactions. Another factor that can change the methylation pattern is the chemotherapeutic drugs. DNA methylation alteration can also modify chromosome structure and lead to a genomic instability related to the development of neoplasia. The aim of this study was to analyze the effect of methionine supplementation on changes in the methylation pattern of the promoter region of the p16 gene in the liver and kidneys of rats and the possible changes induced by interaction with the antitumoral doxorubicin (DXR), besides the possible genomic instability in bone marrow cells. Six Wistar rats groups (n=60) received commercial diet or commercial diet plus Met 2% for six weeks. At third week and 24 hours before euthanasia they received saline or DXR (1 or 10 mg/Kg) intraperitoneally. DNA extraction of the kidneys and liver was used for the study of the methylation pattern of promoter region on the p16 gene by COBRA method, after DNA sodium bisulfite modification and PCR amplification. EcoRI, TaqI and HphI enzymes were used to determine the methylation pattern of promoter region of the p16 gene and TasI enzyme was used to validate bisulfite conversion. All animals had digestion with TasI and HphI enzymes, however no restriction with EcoRI and TaqI enzymes. Kidneys and liver DNA methylation pattern promoter region of p16 gene did not change by Met supplementation or DXR administration, when comparing the controled and the treated groups. The justification is that the p16 gene is very important in cycle cellular regulation, apoptosis and senescence and its regulation follows a well controlled mechanism. To study Met supplementation in genomic instability the micronucleus (MN) test was realized in the rat bone marrow. By Micronuclei analysis, met supplementation did not alter MN frequency, but DXR treatment (1 or 10 mg/Kg) induced MN formation when compared to Control group. The association of Met+DXR did not decrease MN frequency by induced DXR. In conclusion, Met on the diet or DXR administration did not change methylation pattern of promoter region of the p16 gene. The supplemented Met did not show mutagenic effect in MN test. There was no antimutagenic effect of Met when associated to DXR.

O objetivo neste trabalho foi avaliar a concentração de aminoácidos essenciais (Lisina e Metionina) considerada na literatura como ideal, de acordo com a via de fornecimento (sucedâneo ou concentrado inicial), e sua associação com a suplementação de Glutamato e Glutamina, para bezerros em dois sistemas de aleitamento: convencional ou programado. No primeiro experimento foi realizado o levantamento da composição bromatológica e em aminoácidos dos principais sucedâneos comercializados no Brasil. Nos segundo e terceiro experimentos foram utilizados 45 bezerros da raça Holandês, em delineamento de blocos casualizados distribuídos nos tratamentos: 1) Controle: sem suplementação; 2) Suplementação de lisina e metionina para atingir consumo de 17 e 5,3 g/d, respectivamente, com correção feita com base na análise do sucedâneo, 3) Suplementação de lisina e metionina, para atingir consumo de 17 e 5,3 g/d, respectivamente, com correção feita com base na análise do concentrado inicial. A diferença entre os experimentos foi o sistema de aleitamento ao qual os bezerros foram submetidos: no segundo experimento os animais receberam 6L/d de sucedâneo; enquanto no terceiro estudo os animais foram submetidos ao sistema de aleitamento programado (4L/d até a 2ª semana; 8L/d da 3ª a 6ª semana; 4L/d da 7ª a 8ª semana). No quarto experimento o mesmo delineamento foi utilizado para avaliar, em sistema de aleitamento convencional, os tratamentos: 1) Controle: sem suplementação; 2) Sucedâneo lácteo suplementado com Lisina e Metionina, para atingir consumo de 17 e 5,3g/d, respectivamente + 1% na MS de produto contendo 10% de glutamato e de glutamina; 3) Sucedâneo lácteo suplementado com Lisina e Metionina para atingir consumo de 17 e 5,3g/d + 0,6% na MS de produto contendo 10% de glutamato e de glutamina. Os animais foram alojados em abrigos individuais, com livre acesso a água e concentrado inicial. O consumo de concentrado inicial e o escore fecal dos animais foram registrados diariamente. Semanalmente, foram realizadas pesagens e medidas de crescimento corporal. Nas semanas 2, 4, 6, 8 e 10 de vida foram realizadas colheitas de sangue para determinação de metabólitos como marcadores do status protéico dos animais (albumina, proteína total, N-ureico), status energético (glicose e ?-hidroxibutirato), crescimento ósseo (fosfatase alcalina) e crescimento muscular (creatinina). A composição em aminoácidos dos sucedâneos comercializados no Brasil foi menor que o esperado para dieta que substitui o leite integral. Nos experimentos 2 e 3 a suplementação com lisina e metionina no sucedâneo ou no concentrado inicial para bezerros não resultou em benefícios no desempenho ou no metabolismo. No estudo 4, a suplementação do sucedâneo com lisina, metionina em associação com glutamato e glutamina não alterou o desempenho, a saúde intestinal ou o metabolismo de bezerros leiteiros. / The aim in this work was to evaluate the concentration of essential amino acids (Lysine and Methionine) considered in the literature as ideal, according to feeding route (milk replacer or starter concentrate), and its association with the supplementation of glutamate and glutamine to calves in two feeding systems: conventional or step-down. In the first study, the chemical composition was analyzed and in amino acids of main milk replacer marketed in Brazil. In the second and third studies, 45 Holstein calves were used, in randomized blocks distributed in treatments: 1) Control: without supplementation; 2) Supplementation with lysine and methionine to reach consumption of 17 and 5.3 g/d, respectively, with correction based on the analysis basis of the milk replacer, 3) Supplementation of lysine and methionine to reach consumption of 17 and 5.3 g/d, respectively, with correction based on the analysis basis of starter concentrate. The difference between the experiments was the feeding system applied to the calves: in the second study, the animals received 6 L/d of milk replacer; while in the third study, the animals were submitted to the step-down system (4L/d until the 2nd week; 8L/d of the 3nd to 6th week; 4L/d of the 7th to 8th week). In the fourth study, the same experimental design was used to evaluate, in a conventional feeding system, treatments: 1) Control: without supplementation; 2) AminoGut 0.6%: milk replacer supplemented with Lysine and Methionine, to reach consumption 17 and 5.3g/d, respectively + 0.6% product containing 10% of glutamate and glutamine; 3) AminoGut 1%: milk replacer supplemented with Lysine and Methionine to reach consumption 17 and 5.3g/d + 0.6% product containing 10% of glutamate and glutamine. The animals were housed in individual hutches, with free access to water and starter concentrate. The consumption of starter concentrate and fecal scores of animals were monitored daily. Body growth was weighed and measured weekly. In weeks 2, 4, 6, 8 and 10, blood samples were collected to determine the metabolites as markers of protein status of animals (albumin, total protein, N-urea), energy status (glucose and BHBA), bone growth (alkaline phosphatase) and muscular growth (creatinine). The composition of amino acids of the milk replacer marketed in Brazil was lower than expected for diet that replaces the whole milk. In study 2 and 3, the supplementation of the milk replacer or starter concentrate with lysine and methionine resulted in no benefit on dairy calves performance or metabolism. In study 4 the supplementation of the milk replacer with lysine and methionine in association with glutamate and glutmine had no effect on performance, gut health nor metabolism of dairy calves.

Esta dissertação teve como objetivo avaliar o desempenho zootécnico e rendimento de cortes comercias de frangos de corte no período de 28 a 42 dias de idade utilizando níveis crescentes de DL-2-hidroxi-4metil-tio-butanóico 88% (HMTBA) como fonte de suplementação de metionina (MET) na dieta. Foram alojados 2.106 frangos de corte machos Cobb x Cobb 500 com 1 dia de idade, distribuídos aleatoriamente em 81 boxes (1,65 x 1,65 m) com 26 aves cada, recebendo uma dieta padrão para todos. Aos 28 dias, os boxes foram rearranjados de modo que não houvesse diferença no peso vivo entre os tratamentos. Um delineamento completamente casualizado foi utilizado para gerar curvas de regressão de respostas zootécnicas em função da suplementação com HMTBA. Uma dieta basal, sem adição de HMTBA, foi formulada a base de milho, farelo de soja e farinha de carnes. Esta dieta apresentava 3.200 kcal/kg e 19,35% de proteína bruta, sendo 0,52% de metionina e cisteína digestível (Met + Cis dig.), 0,95% de lisina digestível (dig)., 0,64% de treonina dig., 0,78% de valina dig., 0,69% de isoleucina dig., 1,50% de leucina dig., 1,16% de arginina dig. e 0,18% de triptofano dig. Oito níveis de suplementação de HMTBA foram adicionados à dieta basal (0,07; 0,14; 0,21; 0,28; 0,35; 0,42; 0,49 e 0,56% de inclusão na dieta). Avaliou-se o desempenho zootécnico dos 35 aos 42 dias de idade. Aos 42 dias 6 aves por unidade experimental foram abatidas para avaliação de rendimento de carcaça e cortes comerciais. As respostas de ganho de peso (GP), conversão alimentar, (CA), rendimento de peito e gordura abdominal tiveram ajustes quadráticos com a inclusão de HMTBA na dieta. Estimativa de respostas máximas para suplementação de HMTBA foram de 0,35% para GP, de 0,37% para CA, 0,33% para gordura abdominal e 0,35% para rendimento de carne de peito. O presente estudo fornece dados de regressão para aqueles que utilizam HMTBA como um suplemento dietético de MET. / This dissertation aimed to evaluate the performance and commercial cuts yield of broilers from 28 to 42 days of age by increasing levels of methionine hydroxy analogue 88% (HMTBA) as a source of methionine (MET) supplementation in the diet. A total of 2,106 male broilers Cobb x Cobb 500 were housed with one day of age, receiving a standard diet for everyone. At 28 days, birds were rearranged to have no difference in body weight among treatments. A completely randomized design was used to calculate equation regression of growth performance in response to HMTBA supplementation. A basal diet without adding HMTBA, was made from corn, soybean meal and meat meal. This diet had 3,200 kcal / kg and 19.35% crude protein, with 0.52% of digestible methionine and cysteine (dig. Met + Cis ), 0.95% dig. lysine , 0.64% of dig. threonine, 0.78% to dig valine., 0.69% to dig isoleucine., 1.50% of dig. leucine, 1.16% of dig arginine and 0.18% of dig. tryptophan. Eight HMTBA supplementation levels were added to the basal diet (0.07, 0.14, 0.21, 0.28, 0.35 0.42 0.49 and 0.56% of inclusion in diet). Growth performance was evaluated from 35 to 42 days. In adittion, six birds per pen were slaughtered at 42 days to evaluate carcass and commercial cut yields. The body weight gain (BWG), feed conversion ratio (FCR), breast meat and abdominal fat yields were quadratic fits with the inclusion of dietary HMTBA. Maximum responses estimated using HMTBA supplementation were estimated at 0.35% for BWG, 0.37% for FCR, 0.33% for abdominal fat and 0.35% for breast meat yield. The present study provides regression data for those using HMTBA as a MET dietary supplement.

O estudo consistiu em quatro experimentos com o objetivo de avaliar a redução proteica e níveis de metionina+cistina sobre o desempenho e qualidade de ovos (produção de ovos, consumo de ração, conversão alimentar, peso de ovo e fatores de qualidade dos ovos, unidade Haugh, espessura de casca, resistência à quebra, pigmentação de gema, gravidade específica) de poedeiras comerciais leves e semipesadas de 24 a 40 semanas de idade. Em cada experimento, foram utilizadas 240 poedeiras comerciais distribuídas em delineamento inteiramente casualisado com 8 aves por unidade experimental com 10 repetições. Os níveis dos aminoácidos, treonina, triptofano e valina foram mantidos os mesmos em todos os tratamentos através da suplementação de aminoácidos sintéticos. No primeiro e segundo experimentos avaliaram-se três níveis de proteína bruta (15,4%, 16,4% e 17,4%) em dietas para aves leves (experimento I) e aves semipesadas (experimento II) das linhagens Bovans White e Bovans Brown, respectivamente. No experimento I não foram observadas diferenças estatísticas para os parâmetros relacionados à qualidade da casca do ovo, nem mesmo para altura de albúmen e peso do ovo. A redução do nível proteico da dieta para 16,4% não afetou o desempenho das poedeiras leves (P<0,05). No experimento II, não houve diferenças estatísticas para os parâmetros avaliados. Nos experimentos III e IV avaliou-se o efeito de dois níveis de proteína bruta (16,4% e 17,4%) e dois níveis metionina+cistina (0,66% e 0,77) em dietas para aves leves (experimento III) e aves semipesadas (experimento IV) das linhagens Bovans White e Bovans Brown. No experimento III a qualidade de ovo não foi influenciada pelos tratamentos. Houve interação entre os níveis de proteína bruta e aminoácidos sulfurados para as variáveis de produção de ovos, consumo de ração e conversão alimentar por dúzia de ovos. As aves alimentadas com a dieta com 15,4% de proteína bruta apresentaram menor produção de ovos quando comparado às aves que receberam dietas com níveis de AAST elevados e com PB elevada. As aves alimentadas com 17,4% de PB e 0,77% de aminoácidos sulfurados apresentaram maior consumo e pior conversão alimentar (P<0,05). O aumento no nível de AAST resultou em maior peso do ovo. No experimento IV houve interação entre os fatores estudados, sendo que as aves alimentadas com níveis mais baixos de PB e AAST (16,4% e 0,66%, respectivamente), apresentaram menor produção de ovos e pior conversão alimentar. Para a variável peso de ovos, houve efeito dos níveis de AAST, sendo que as aves alimentadas com 0.77% produziram ovos com maior peso (P<0,05). / The study consisted of four experiments to evaluate the effect of protein and reduced levels of methionine+cystine on the performance and egg quality (egg production, feed intake, feed conversion, egg weight and egg quality factors, Haugh unit, shell thickness, breaking strength, yolk pigmentation) of light and semi heavy weight laying hens with 24-40 weeks of age. In each experiment 240 laying hens were distributed in a completely randomized design with 8 birds per experimental unit with 10 replicates. Levels of, threonine, tryptophan and valine were kept the same in all treatments by supplementation of synthetic aminoacid. In experiments I and II were evaluated three levels of crude protein (15.4%, 16.4% and 17.4 %) on diets for light Bovans White hens (experiment I) and Bovans Brown semi heavy weight (experiment II). In the first experiment there was no statistical differences in the parameters related to the quality of the egg shell, even for albumen height and egg weight were observed. The reduction of the protein level of the diet to 16.4% did not affect the performance of laying hens (P<0.05). In experiment II there were no statistical differences in the parameters evaluated. In experiments III and IV evaluated the effect of two levels of crude protein (16.4% and 17.4%) and two methionine + cystine levels (0.66% and 0.77%) on diets for light Bovans White hens (experiment III) and Bovans Brown semi heavy weight (experiment IV). In experiment III the egg quality was not affected by treatments. There was interaction between the levels of crude protein and sulfur aminoacids for the variables of egg production, feed intake and feed conversion per dozen eggs. Hens fed diets with lower protein levels had lower egg production when compared to hens fed diets with high levels of TSAA and high CP. Hens fed with diets with 17.4% of CP and 0.77% of sulfur aminoacids had higher intake and worse feed conversion (P<0.05). The increase in the level of TSAA resulted in higher egg weight. In experiment IV there was interaction between the factors studied, where lower levels of CP and TSAA (16.4% and 0.66 %, respectively), had lower egg production and lower feed conversion. For egg weight, there was effect of TSAA. Hens fed diets with 0.77% of TSAA produced heavier eggs (P<0.05).

Le premier acide aminé incorporé dans une chaîne polypeptidique naissante est toujours la méthionine. On identifie donc toujours ce premier résidu à la méthionine N-terminale. Cependant, les deux tiers des protéines accumulées à l’état stationnaire ne présentent plus leur méthionine initiatrice. Cet enlèvement résulte essentiellement d’une maturation protéolytique affectant chaque protéine. Ainsi, l’Excision de la Méthionine N-terminale (NME) concerne la majorité des protéines et ce dès que les premiers résidus émergent du ribosome. Ce mécanisme est retrouvé dans tous les compartiments cellulaires où une synthèse protéique a lieu : le cytoplasme, les plastes et les mitochondries. Les enzymes responsables du clivage de la méthionine initiatrice sont les METhionine AminoPeptidases (METAPs) ; les METAPs sont conservées dans le Règne vivant. Des études fonctionnelles de délétions géniques ont montré le caractère létal du maintien de la première méthionine dans tous les organismes. Il y a plus de dix ans, les METAPs ont été identifiées comme étant la cible de composés naturels ayant des effets anticellulaires. Aujourd’hui un nombre croissant d’études rapportent que la NME est une cible prometteuse pour le traitement de nombreuses pathologies. Néanmoins, les bases moléculaires qui expliquent le caractère essentiel de la NME restent très peu comprises, en particulier dans le cytoplasme des eucaryotes supérieurs. Grâce à un système inductible permettant de moduler finement la NME cytoplasmique dans la plante modèle Arabidopsis thaliana et différentes approches incluant des analyses protéomiques et métabolomiques, j’ai pu étudier les événements moléculaires précoces associés à l’inhibition de la NME cytoplasmique. J’ai également caractérisé la contribution relative des deux types de METAP cytoplasmiques au processus. Dans ce contexte, j’ai pu démontrer chez A. thaliana que la NME cytoplasmique agit sur deux voies de signalisation fréquemment dérégulées lors de conditions pathologiques : le statut des composés thiolés et la protéolyse. La diminution de la NME cytoplasmique induit une protéolyse accrue principalement via une augmentation du nombre de protéines destinées à une dégradation rapide. Ainsi, l’activité de la NME, en modulant la sensibilité de nombreuses protéines à subir la protéolyse, est un élément fondamental de la régulation de la demi-vie protéique. Finalement, mes résultats simialires obtenus également chez les Archées, levures et les lignées de cellules humaines suggèrent l’existence d’un mécanisme ubiquitaire associé à la NME. / The first amino acid incorporated in nascent polypeptide chain is always methionine so called N-terminale methionine. However, in a given proteome, more than fifty percent of proteins have not this first methionine. Indeed, the early proteolytic event affecting a majority of proteins is N-terminal Methionine Excision (NME) as soon as few residues exit from the ribosome. Enzymes ensuring NME process are conserved along species. This mechanism takes place in all compartments where protein synthesis occurs including cytoplasm, plastids and mitochondria and the enzymes responsible of N-methionine excision are METhionine AminoPeptidases (METAP). Early functional studies of gene deletion has quickly showed that NME is an essential process. Ten years ago, METAPs have been identified as the molecular target of natural compounds with anticancer activities. Now, a growing number of studies suggest that NME is a promising target for treatment of various deseases. Nevertheless, molecular mechanisms making NME an essential process is poorly understood in particular in higher eukaryote cytoplasms.Using a dedicated inducible system in the model organism Arabidopsis thaliana and multiple approaches, including proteomics and metabolomics, I examined the earliest molecular events associated with the inhibition of this process and the contribution of both METAP to NME process. In this context, I demonstrated that cytoplasmic NME in A. thaliana orchestrates a cross-talk between two fundamental signaling pathways frequently deregulated in pathological conditions: thiol status and proteolysis. In these studies, we demonstrated that developmental defects induced by cytoplasmic NME inhibition are associated with an increase of the proteolytic activity due to an increase of the proteins available for rapid degradation. Thus, NME activity that modifies the availability of several proteins for degradation is an integral and fundamental element protein turnover regulation. Finally my preliminary results obtained in Archea, Fungi and human cells seem to suggest the existence of a ubiquitous mechanism associated with NME process.

A urolitíase é um problema recorrente na clínica veterinária considerada como causa de morbidade. As urolitíases são estreitamente associadas ao pH urinário e a nutrição exerce um papel fundamental no controle desta afecção, pois através da manipulação da dieta, pode-se modificar o pH urinário. A dieta possui cátions e ânions na sua composição mineral e a diferença entre íons é medida em miliequivalentes (mEq/kg) e denominado excesso de bases (EB) da dieta, calculado através da equação: (49,9 x Ca) + (82,3 x Mg) + (43,5 x Na) + (25,6 x K) – (64,6 x P) – (62,4 x S) – (28,2 x Cl), sendo a concentração dos elementos em g/kg de MS. A finalidade deste estudo, dividido em dois experimentos, foi avaliar o efeito da adição de fontes de enxofre (S) e cálcio nas dietas de felinos sobre o pH urinário e equilíbrio ácido-básico. A adição de fontes de enxofre objetivou demonstrar a eficácia na acidificação urinária. No primeiro experimento avaliaram-se três diferentes fontes de enxofre: sulfato de cálcio (CaSO4), DL-metionina (DLM) e Metionina hidróxi análoga (MHA) adicionados a uma dieta controle em dois níveis cada um. No tratamento controle não houve adição de acidificantes. No primeiro nível adicionou-se 1,28 g de S/kg e no segundo 2,56 g de S/kg, resultando em sete tratamentos. No segundo experimento duas fontes de cálcio foram avaliadas com o objetivo de pesquisar a eficácia destes sais na alcalinização da urina. No tratamento controle não houve adição de fontes de cálcio. Nos tratamentos 2 e 3 foram adicionados à dieta controle carbonato de cálcio e gluconato de cálcio, respectivamente, nas doses de +160 mEq/kg, resultando em três tratamentos. A urina produzida em cada período de 24 horas teve aferida seu volume, densidade e pH. No segundo experimento foi também medida a excreção urinária de cálcio no período de 72h. O equilíbrio ácido-básico foi avaliado pela hemogasometria de sangue venoso. A DLM no maior nível e o MHA diferiram da dieta controle em relação ao pH urinário (p<0,001) e seu poder acidificante foi maior que o do sulfato de cálcio (p<0,05). As duas fontes de cálcio alcalinizaram a urina, mas o carbonato de cálcio atingiu um pH urinário mais alto que o gluconato de cálcio. Concluiu-se que o efeito diferenciado das fontes de S e cálcio sobre o pH urinário é um indicador de que a participação do cálcio é dependente dos ânions a que está associado, o que leva ao questionamento sobre qual a melhor forma de avaliar sua participação no cálculo do EB. / Urolithiasis is a commom problem in the veterinary clinic considered as a cause of morbidity. The urolithiasis are closely associated with urinary pH and nutrition plays a key role in the control of this disease, because through dietary manipulation, it´s possible modify the urinary pH. The diet has cations and anions in their mineral composition and the difference between ions is measured in milliequivalents (mEq/kg) and called base excess (BE) of the diet, calculated by the equation: (49.9 x Ca) + (82, Mg x 3) + (43.5 x Na) + (25.6 x K) - (64.6 x P) - (62.4 x S) - (28.2 x Cl), being the concentration of elements in g/kg DM. The purpose of this study, divided in two experiments, was to evaluate the effect of addition of sources of sulfur (S) and calcium in the diets of cats on the urinary pH and acid-base balance. The addition of sulfur sources aimed to demonstrate the efficacy in urinary acidification. In the first experiment were evaluated three different sources of sulfur, calcium sulfate (CaSO4), DLMethionine (DLM) and Methionine hydroxy analogue (MHA) added to a control diet at two levels each. In the control treatment there was no addition of acidifying. At the first level was added 1.28 g S/kg and in the second 2.56 g S/kg, resulting in seven treatments. In the second experiment two calcium sources were evaluated in order to research the effectiveness of these salts in alkalinize urine. In the control treatment there was no addition of calcium sources. In treatments 2 and 3 were added to the control diet calcium carbonate and calcium gluconate, respectively, at doses of +160 mEq/kg, resulting in three treatments. The urine produced in each period of 24 hours had measured its volume, density and pH. The second experiment also measured the urinary excretion of calcium in the period of 72 hours. The acid-base balance was evaluated by blood gas analysis of venous blood. The DLM at the highest level and MHA differed of the control diet in relation to urinary pH (p<0.001) and their acidifying power was greater than the calcium sulfate (p<0.05). The two sources of calcium alkalinized the urine, but the calcium carbonate reached a urine pH higher than calcium gluconate. It was concluded that the effect of different sources of S and calcium on urinary pH is an indicator that the participation of calcium is dependent of the anions that is associated, which leads to questions about how is the best way to evaluate its participation in calculation of BE.

Orientador: Luciano Hauschild / Banca: Nilva Kazue Sakomura / Banca: Melina Aparecida Bonato / Resumo: Objetivou-se através dessa dissertação embasar os primeiros passos para desenvolver uma nova maneira de estimar as exigências nutricionais de metionina para suínos alimentados individualmente. O primeiro passo foi uma meta-análise conduzida objetivando estudar a reposta de suínos alimentados com diferentes tipos de metionina, bem como quantificar a relação ideal de metionina: lisina para leitões da fase inicial a terminação. A base de dados foi composta por 41 artigos. Para determinação da relação metionina: lisina, 83% dos artigos da base forem excluídos pois não atendiam a exigência de lisina. Para análise de fontes de metionina foram utilizados 21 artigos para fase inicial não havendo diferença (P<0.05) entre L-metionina, DL-metionina e metionina hidroxi-análoga. A relação mínima de metionina: lisina encontrado foi de 26% de inclusão de metionina em função da exigência de lisina, uma relação menor que essa poderá representar perdas significativas no desempenho. Na sequencia foi realizado uma simulação com modelos fatoriais utilizados na suinocultura (Tabelas brasileiras de exigências nutricionais para suínos e aves (BT) e o NRC 2012), objetivando compara-los com o modelo do "Automatic and inteligent Precision feeder" (AIPF). Foram utilizados dados de 36 suínos com peso inicial de 25 kg, por um período de 28 dias. Peso corporal, consumo de ração e ganho médio foram estandardizados. Concluiu-se que os modelos NRC e BT foram calibrados para estimar as exigências de resposta máxima da população, assim, superestimam as necessidades do indivíduo médio em mais de 13%. Além disso, usar a exigência de um suíno ... / Abstract: The aim of this dissertation is to support the first steps to develop a new method to estimate methionine nutritional requirements for the pigs fed individually. The first step of this dissertation was perform a meta-analysis in order to study the response of pigs fed with different types of methionine and to quantify the ideal ratio of methionine: lysine for piglets from the initial phase to termination. The database consisted of 41 papers. To determine the methionine: lysine ratios, 83% of papers in the database were excluded because they did not meet the pigs requirement for lysine. For analysis of methionine sources were used 21 papers from initial phase, and it had no difference (P <0.05) between L-methionine, DL-methionine and methionine hydroxy-analogue. The minimum methionine: lysine ratio found was 26% methionine inclusion in function of lysine requirement. In sequence was performed a simulation study using factorials models used in pig farming (Brazilian tables of nutritional requirements for pigs and poultry (BT) and the NRC 2012), in order to compare them with the model "Automatic and intelligent Precision feeder" (AIPF). Data from 36 pigs were used with initial body weight of 25 kg for a period of 28 days. Body weight, feed intake and average daily gain were standardized. It was concluded that the NRC and BT models were calibrated to estimate the maximum response requirements of the population, thus overestimate the average pig requirement in more than 13%. In addition, the requirement of using an average pig in the middle of the feeding phase to estimate the requirements of a population, is a practice which must be handled with care. This is due to the wide variation in nutritional requirements that exist between the pigs from the same population. Finally the AIPF and BT models were used in a trial. The pigs were arranged in a randomized design, 2x3 factorial randomized design: two feeding programs (individual daily ... / Mestre

Submitted by Ubirajara Cruz (ubirajara.cruz@gmail.com) on 2017-06-07T16:23:22Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Diego Andres Velasco Acosta.pdf: 1957910 bytes, checksum: 57eabc538f89e509cac0a69175bd4efb (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-06-08T13:04:26Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Diego Andres Velasco Acosta.pdf: 1957910 bytes, checksum: 57eabc538f89e509cac0a69175bd4efb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-08T13:04:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Diego Andres Velasco Acosta.pdf: 1957910 bytes, checksum: 57eabc538f89e509cac0a69175bd4efb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-01-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / O balanço energético negativo (BEN) está associado com alterações na fertilidade de vacas leiteiras, portanto diferentes estratégias nutricionais e farmacológicas vêm sendo utilizadas para minimizar os efeitos negativos do BEN, visando aumentar a fertilidade. A aplicação pré-parto de somatotropina recombinante bovina (rbST) pode levar a uma redução da concentração sérica dos ácidos graxos não esterificados (AGNE) e β-hidroxibutirato (BHBA) no período pós-parto. Além disso têm sido demonstrado efeito significativo no desenvolvimento folicular ovariano pós-parto. Da mesma forma, estratégias nutricionais e o manejo da alimentação durante o período pré e pós-parto têm um impacto na saúde, produtividade e fertilidade da vaca leiteira. Estudos recentes mostram que a adição de aminoácidos na dieta durante o período de transição de vacas leiteiras pode ter efeitos benéficos no metabolismo, contribuindo para melhorar a performance reprodutiva. Diante desta problemática, esta tese apresenta três artigos, cujos objetivos foram: 1) determinar o efeito da administração pré-parto de somatotropina em novilhas leiteiras sobre marcadores do BEN, retomada da atividade ovariana e produção de leite. 2) Determinar o efeito da suplementação de metionina e colina protegidas da degradação ruminal, isoladas e em combinação, sobre o potencial esteroidogenico do folículo dominante da primeira onda folicular pós-parto de vacas leiteiras. 3) Determinar o efeito da suplementação de metionina e colina protegidas da degradação ruminal, isoladas e em combinação, sobre o desenvolvimento embrionário e nível de metilação global de DNA do embrião. O tratamento com somatotropina pré-parto em novilhas leiteiras aumentou a concentração de IGF-I intrafolicular e a expressão do receptor de LH e da proteína reguladora aguda da esteroidegênese em células foliculares do folículo dominante da primeira onda pós-parto. Essas mudanças foram associadas a um aumento da concentração de estradiol sérica e intrafolicular, o que pode, potencialmente, aumentar a chance de ovulação da primeira onda folicular pós-parto. Entretanto, somatotropina não afetou outros parâmetros metabólicos e produtivos no período pós-parto recente. A suplementação com metionina, colina ou ambas durante o período de transição parece não ter efeito sobre o desenvolvimento folicular pós-parto da primeira onda em vacas da raça Holandês. No entanto, a suplementação apenas com metionina durante o período de transição aumenta a expressão de 3β-HSD nas células foliculares. Além disso, a suplementação com metionina e colina induziu a uma down regulation dos genes pró-inflamatórios, indicando um menor processo inflamatório nas células foliculares. Em relação ao desenvolvimento embrionário, a suplementação com metionina durante o período de transição reduziu a metilação global do DNA e aumentou o acúmulo de lipídios nos embriões. A utilização de estratégias nutracêuticas durante o período de transição aumentaram o potencial esteroidogenico do folículo dominante da primeira onda folicular pós-parto e aumentou a expressão de genes relacionados a esteroidogenese, assim como uma redução na expressão de genes pró inflamatórios, indicando efeitos benéficos na fertilidade de bovinos leiteiros. Além disso, a suplementação de metionina parece aumentar a capacidade de sobrevivência dos embriões, desde que há fortes indícios de que as reservas lipídicas endógenas servem como um substrato energético. / The negative energy balance (NEB) is associated with changes in the fertility of dairy cows, therefore different nutritional and pharmacological strategies are being used to minimize the negative effects of the NEB in order to increase fertility. Pre-partum recombinant bovine somatotropin (rbST) administration can lead to a reduction in serum non-esterified fatty acids (NEFA) and β-hydroxybutyrate (BHBA) in the postpartum period, in addition to improving postpartum ovarian follicular development. Similarly nutritional strategies during the pre and postpartum period have a positive impact on health, productivity and fertility of dairy cows. Recent studies show that the use of amino acids in the diet during the transition period may have beneficial effects in metabolism. Faced with this problem, this thesis presents three papers whosethe objectives were: 1) Determine the effect of pre-partum administration of somatotropin in dairy heifers on the markers of NEB, resumption of ovarian activity and milk production. 2) Determine the effect of methionine, choline supplementation isolated and in combination on esteroidogenic potential of the fist postpartum dominant follicle. 3) Determine the effect of methionine, choline supplementation isolated and in combination on embryo development and global DNA methylation. Pre-partum somatotropin treatment in dairy heifers increased intrafollicular IGF-I and mRNA expression of LH receptor and steroidogenic acute regulatory protein in follicular cells of the first postpartum dominant follicle. These changes were associated to increased intrafollicular and serum estradiol concentration, which can potentially increase the chance of ovulation of the first postpartum follicular wave. Despite that, somatotropin did not affect other metabolic and productive parameters in the early postpartum period. Supplementing methionine, choline or both during the transition period seemed to have no effect on postpartum follicular development of the first postpartum wave in Holstein cows. However, supplementing methionine, during the transition period increased follicular cells 3β-HSD expression, methionine and choline supplementation also induced a down regulation of pro-inflammatory genes, indicating a lower inflammatory processes in follicular cells. Regarding to embryo development, supplementation of methionine, only during the transition period reduce global DNA methylation, moreover, supplemented methionine increase lipid accumulation in preimplantation embryos. The use of nutraceutical strategies during the transition period increased the steroidogenic potential of the first postpartum dominant follicle and increase the expression of genes related steroidogenesis also a down regulation of proinflammatory genes indicating beneficial effects on fertility in dairy cattle. Moreover, the methionine supplementation seems to impact the preimplantation embryo in a way that enhances its capacity for survival since there is strong evidence that endogenous lipid reserves serve as an energy substrate.