Nas últimas décadas, houve aumento progressivo das infecções hospitalares por leveduras principalmente, do gênero Candida. A fonte de infecção pode ser endógena ou exógena, desde que esporos unicelulares de leveduras, permanecem viáveis por meses sobre superfícies bióticas ou abióticas. Diversas espécies de leveduras são encontradas em pele e mucosas de indivíduos sadios. Em estado saprofítico ainda, as leveduras encontram-se no trato gastrintestinal humano mas, a relação entre a presença desses microorganismos e sua patogenicidade está associada a diversos fatores predisponentes, tais como: número e variedade de sítios topográficos colonizados, uso prolongado de antibióticos, infecções associadas causadas por outros microorganismos e particularmente, distúrbios imunológicos ou metabólicos. Leveduras do trato gastrintestinal podem ser transmitidas, via fecal-oral diretamente ou de modo indireto, de indivíduo para indivíduo. A transmissão de uma cepa em estado saprofítico para um hospedeiro suscetível, pode resultar em colonização seguida de infecção. A gravidade do quadro clínico depende de condições do hospedeiro e características do agente etiológico que engloba fatores de virulência e resistência a antifúngicos. Esses atributos são importantes em Candida albicans na qual, enzimas com atividade de fosfolipase e proteinase são marcadores de virulência. De outro modo, fenótipos de resistência, ocorrem, com maior freqüência, em espécies não-Candida albicans. Dada a possibilidade de instalação de doença endógena e a dispersão de cepas virulentas e resistentes, a partir de colonização gastrintestinal, estudos que contribuam para a determinação desses agentes constituintes da microbiota de pacientes internados, são importantes para o conhecimento da história natural das infecções nosocomiais por leveduras. Os objetivos deste trabalho foram avaliar o trato intestinal como fonte potencial de infecção hospitalar por leveduras, descrevendo as espécies prevalentes nas primeiras horas de internação e possíveis alterações temporais, quanto a fenótipo de virulência e resistência a antifúngicos. Foram analisadas 281 amostras de leveduras isoladas de 66 crianças internadas em unidades de pediatria e semi-intensiva de hospitais públicos das cidades de São Paulo e Guarulhos, Brasil. As amostras foram isoladas de fezes coletadas nas primeiras horas de internação e durante o período de internação. A identificação das leveduras quanto a gênero e espécie foram realizadas por métodos tradicionais, analisando aspectos morfológicos e fisiológicos. A capacidade de produção de enzimas, fosfolipase e proteinase, foram verificadas conforme proposto por Price et al. 1982 e Ruchël et al., 1982. A sensibilidade aos antifúngicos: anfotericina B (AMB), fluconazol (FZ), itraconazol (IZ), cetoconazol (CZ) e nistatina (NIS) foram analisada pela técnica de difusão por discos (CECON São Paulo, Brasil). Amostras resistentes ou com sensibilidade intermediária, foram re-avaliadas pelo método de microdiluição segundo NCCL (1997) modificado por EUCAST (2002). As espécies isoladas foram: Candida tropicalis (32,7%), C.albicans (29,9%), C.parapsilosis (27, 1%), Trichosporon cutaneum e T.inkin (3,2%), Rhodotorula mucilaginosa e R.glutinis (0,7%), C.krusei (3,6%), C.guilliermondii (2,1%), C.glabrata (0,4%) e C.kefyr (0,4%). A atividade enzimática foi observada na maioria das 84 amostras de C. albicans, sendo 96% de fosfolipase e 95% de proteinase. Entre as espécies não-albicans do gênero Candida foi verificada atividade em 97% de fosfolipase e 67% de proteinase. Amostras menos sensíveis às drogas azólicas, ou seja, amostras resistentes ou com sensibilidade dependente da dose, foram encontradas em 4,3% das 281 amostras de leveduras, sendo maior porcentagem observada em C.krusei (90%). Conclui-se que existem leveduras de diversas espécies em fezes de população pediátrica hospitalizada, com fenótipos de virulência e resistência a antifúngicos. A manutenção desses fenótipos durante o período de internação pode representar fator de risco para infecção hospitalar endógena, ou ainda, fonte de dispersão de patógenos em potencial, no meio ambiente hospitalar. / At the last decades the nosocomial infections caused by yeasts raised significantly especially by Candida yeasts. The infections source can be endogen or exogenous, since spores of unicellular and multicellular are kept viable for months and several yeasts species are found in skin and mucosa of healthy people. In a saprophytic state yeasts are found in the human gastrointestinal tract but the relationship between the presence of these microorganisms and their pathology is associated with several facts such as: number, variety of sites colonized, effective use of antibiotics, associated infections caused by another microorganisms and mainly disturbance in due to lack of immunity and metabolic. Yeasts in the gastrointestinal tract can be transmitted fecal-oral direct or indirectly from an individual to another. The transmission of a strain in a saprophytic state to a host can result in colony followed by infection. The infection can be serious depending on the host conditions and the etiologic agent that includes virulent factor and resistance to antifungal drugs. These attributes are important to Candida albicans in which enzymes with phospholipase activity are responsible for virulent factors. Resistance phenotypes, otherwise it should occur more frequently in non-albicans species. Concerning the possibility of an endogen disease and the spread of virulent and resistant strains, from the gastrointestinal colony, studies that contribute to determine these agents that constitute the microbiota of patients, are important to know the natural story of nosocomial infections caused by yeasts. This work aims at evaluating the intestinal tract as a source of hospital infections by yeasts describing the remaining species in the first hours and a possible change depending on the time that may happen to virulent phenotypic and resistance to ant fungi. Two hundred eighty one yeast samples from sixty-six children attended in pediatric and semi-intensive units in 2 public hospitals located in São Paulo and Guarulhos cities in Brazil were analyzed. The fecal samples were collected at the first hours after and during their arrival at the hospital. To identify the yeasts according to their gender and species traditional methods were used, analyzing morphological and physiological aspects. The ability to produce enzymes phospholipase and proteinase was verified the same way it was proposed by Price et al. 1982 and Ruchel et al. 1982. The sensibility to antifungals: amphotericin B (AMB), f1uconazole (FZ), ketoconazole (CZ) e nistatin (NIS), was analyzed by the diffusion technical by disks (CECON São Paulo, Brazil). Resistant samples or with intermediate sensibility were confirmed by micro-dilution method according to NCCLS (1997) modified by EUCAST (2002). The isolated species were: Candida tropicalis (30%), C.parapsilosis (27%), C.krusei (4%), Trichosporon cutaneum e T.inkin (3%), Rhodotorula mucilaginosa e R.glutinis (2%), C.guilliermondii (2%), C.glabrata (1%) and C.kefyr (1%). Enzymatic activity was verified in most of the 84 C.albicans samples being 96% of phosfolipase and 95% of proteinase production. Among the non-albicans species of Candida it was observed 97% of phospholipase and 67% of proteinase activity. Less sensitive samples to azoic drugs including resistant or SDD sensibility, which depends on the achieved dose, were found in 4.3% of the 281 samples of yeast. The hugest percentage was observed in C.krusei (90%). We can conclude that different yeast species occur in stools of pediatric population hospitalized, including virulent strains and antifungal resistant phenotypes. The persistent of these phenotypes in the intestinal tract during hospitalization period may represents a risk facto r contributing to endogen infection, or play a role in dissemination of potential pathogens inside a nosocomial environment.

Camundongos da linhagem BALB/ c foram infectados com 5x106 leveduras de S. schenckii e acompanhados durante vinte e oito dias de infecção. Através da contagem do número de UFC nos baços fígados verificou-se que a carga fúngica nos órgãos dos animais diminui drasticamente na segunda semana de infecção. O teste ELISA revelou que nos órgãos destes animais a citocina IL-10 produzida em níveis mais elevados durante toda a infecção, assim modulando o controle da infecção. O padrão de proteínas secretadas pelas células leveduriformes de S. schenckii quando cultivadas em meio de cultura líquido e visualizado através de SDS-PAGE, apresentou bandas com pesos moleculares entre 97kDa e 20,1 kDa. Uma banda de 70 kDa foi reconhecida pelos soros dos animais infectados somente após a segunda semana de infecção e persistiu até o final desta. Os níveis de Ig total produzidos contra o antígeno solúvel e a proteína de 70 kDa aumentaram na segunda semana infecção e os títulos mantiveram-se durante a infecção. A isotipagem dos anticorpos revelou a predominância dos isotipos IgG1 e IgG3 para os dois antígenos testados. Notou-se que o aumento dos níveis de Ig contra o exoantígeno e a proteína imunorreativa de 70kDa, assim como o reconhecimento desta proteína, ocorreu inversamente proporcional à diminuição da carga fúngica nos órgão dos animais infectados. As proteínas secretadas pelas leveduras de S. schenckii, principalmente a proteína de 70 kDa, são capazes de ativar uma resposta humoral e conseqüente produção de altos níveis anticorpos e inibir a fagocitose do fungo pelos macrófagos. Desta maneira, estes antígenos modulam a resposta imune na esporotricose e contribuem para a patogenicidade do fungo. / BALB/c mice had been infected with 5xl06 yeasts of S. schenckii and followed during twenty and eight days of infection. Through the counting of the number of UFC in the livers and spleens it was verified that the fungaI load in the organs of the animais decreased drastically in the second week of infection. The ELISA test disclosed that in the organs of these animaIs the cytokine IL-10 was produced in leveIs more raised during alI the infection, thus modulating the control of the infection. The protein standard secreted for the yeasts of S. schenckii when cultivated in liquid medium and visualized through SDS-PAGE, it presented bands with molecular weights between 97 and 20,1 kDa. A band of 70 kDa was recognized for the sera of the infected animals after the second week of infection and persisted until the end of this. The leveIs of total Ig produced against the exoantigen and the protein of 70 kDa had increased in the second week of infection and the titers had been remained during the infection. The isotyping of the antibodies disclosed the predominance of the IgG1 and IgG3 for two tested antigens. One noticed that the increase of the leveIs of Ig against antigens and the recognition of the protein of 70 kDa occurred parallel with the reduction of the fungal load in the organs of the infected animals. The proteins secreted by the yeasts of S. schenckii, mainly the protein of 70 kDa, they are capable to activate a humoral response and consequent production high leveIs of antibodies and to inhibit phagocytosis of the fungi for the macrophages. In this way, these antigens modulate the immune response in sporotricosis and contribute for the pathogenic potential of fungi.

Camundongos da linhagem BALB/ c foram infectados com 5x106 leveduras de S. schenckii e acompanhados durante vinte e oito dias de infecção. Através da contagem do número de UFC nos baços fígados verificou-se que a carga fúngica nos órgãos dos animais diminui drasticamente na segunda semana de infecção. O teste ELISA revelou que nos órgãos destes animais a citocina IL-10 produzida em níveis mais elevados durante toda a infecção, assim modulando o controle da infecção. O padrão de proteínas secretadas pelas células leveduriformes de S. schenckii quando cultivadas em meio de cultura líquido e visualizado através de SDS-PAGE, apresentou bandas com pesos moleculares entre 97kDa e 20,1 kDa. Uma banda de 70 kDa foi reconhecida pelos soros dos animais infectados somente após a segunda semana de infecção e persistiu até o final desta. Os níveis de Ig total produzidos contra o antígeno solúvel e a proteína de 70 kDa aumentaram na segunda semana infecção e os títulos mantiveram-se durante a infecção. A isotipagem dos anticorpos revelou a predominância dos isotipos IgG1 e IgG3 para os dois antígenos testados. Notou-se que o aumento dos níveis de Ig contra o exoantígeno e a proteína imunorreativa de 70kDa, assim como o reconhecimento desta proteína, ocorreu inversamente proporcional à diminuição da carga fúngica nos órgão dos animais infectados. As proteínas secretadas pelas leveduras de S. schenckii, principalmente a proteína de 70 kDa, são capazes de ativar uma resposta humoral e conseqüente produção de altos níveis anticorpos e inibir a fagocitose do fungo pelos macrófagos. Desta maneira, estes antígenos modulam a resposta imune na esporotricose e contribuem para a patogenicidade do fungo. / BALB/c mice had been infected with 5xl06 yeasts of S. schenckii and followed during twenty and eight days of infection. Through the counting of the number of UFC in the livers and spleens it was verified that the fungaI load in the organs of the animais decreased drastically in the second week of infection. The ELISA test disclosed that in the organs of these animaIs the cytokine IL-10 was produced in leveIs more raised during alI the infection, thus modulating the control of the infection. The protein standard secreted for the yeasts of S. schenckii when cultivated in liquid medium and visualized through SDS-PAGE, it presented bands with molecular weights between 97 and 20,1 kDa. A band of 70 kDa was recognized for the sera of the infected animals after the second week of infection and persisted until the end of this. The leveIs of total Ig produced against the exoantigen and the protein of 70 kDa had increased in the second week of infection and the titers had been remained during the infection. The isotyping of the antibodies disclosed the predominance of the IgG1 and IgG3 for two tested antigens. One noticed that the increase of the leveIs of Ig against antigens and the recognition of the protein of 70 kDa occurred parallel with the reduction of the fungal load in the organs of the infected animals. The proteins secreted by the yeasts of S. schenckii, mainly the protein of 70 kDa, they are capable to activate a humoral response and consequent production high leveIs of antibodies and to inhibit phagocytosis of the fungi for the macrophages. In this way, these antigens modulate the immune response in sporotricosis and contribute for the pathogenic potential of fungi.

Os objetivos deste estudo foram: re-identificar 70 isolados de Candida em micoteca por método tradicional e API 20C; identificar a presença de C. dubliniensis; determinar e comparar as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) das amostras, frente a sete antifúngicos (E-test); caracterizar molecularmente as amostras seqüenciais de Candida pela técnica de PFGE; estudar e comparar o perfil genotípico de isolados de C. albicans e C. parapsilosis, através da análise de marcadores microsatélites e cariotipagem. O nível de concordância entre o método tradicional e o API 20C foi de 93%. Nenhum isolado de C. dubliniensis foi identificado no estudo. Em relação à sensibilidade antifúngica, a maioria das amostras apresentou alta porcentagem de sensibilidade às sete drogas testadas. A análise molecular pela técnica de PFGE, mostrou seis perfis de cariótipos diferentes em 24 amostras seqüenciais. Em relação à comparação das técnicas de PFGE e microssatélites, observamos que a última mostrou maior poder discriminatório para as amostras de estudadas. / This study was aimed to: identify the 70 isolates of Candida in a culture collection by the traditional method and by API 20C; identify the presence of C. dubliniensis; determine and compare the minimum inhibitory concentrations (MICs) of these samples in regard to the seven drugs (E-test); molecularly characterize sequential samples from the same patient by the PFGE technique; study the genotypic profile of all the isolates of C. albicans and C. parapsilosis by means of the microsatellite technique and compare the results with those obtained by the PFGE technique. The level of agreement between the traditional method and the API 20C was 93%. No isolate of C. dubliniensis was identified in the study. In relation to antifungal susceptibility, most of the samples presented a high percentage of susceptibility to the seven drugs tested. The molecular analysis by the PFGE technique revealed six different karyotype profiles among 24 sequential samples. In the comparison between the PFGE and microsatellite, the latter showed a greater discriminatory power for samples.

A cromoblastomicose é uma micose subcutânea, com alto índice de morbidade, sendo Fonsecaea pedrosoi (F. pedrosoi) considerado o maior agente etiológico dessa micose, caracterizando uma doença crônica, geralmente confinada na pele e tecidos subcutâneos. Raramente os indivíduos apresentam cura dessa doença, pois as terapias contemporâneas mostram-se deficientes e poucos trabalhos relatam a relação parasito-hospedeiro. As células dendríticas (DCs) são especializadas na apresentação de antígenos para linfócitos T naive induzindo respostas imunes primárias. Diante disso, propomos estudar a capacidade migratória de DCs após infecção com conídios de F. pedrosoi, uma vez que o processo de migração dessas células está intimamente ligado com a sua função sobre as células T, levando ao desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa protetora. O fenótipo de DCs foi avaliado através de células obtidas dos linfonodos poplíteos, inguinais e patas de camundongos BALB/c após 12, 24 e 72 horas de infecção com conídios do fungo. Células obtidas foram marcadas com anticorpos específicos e analisadas por citometria de fluxo. Após 24 e 72 horas de infecção verificamos uma diminuição significativa na porcentagem de DCs nas patas, e um aumento significativo dessas células nos linfonodos após 72 horas. A expressão de marcadores de superfície como CCR7 e moléculas co-estimulatórias, mostraram-se diminuídas nas células obtidas das patas. Como no processo de imunofenotipagem podemos analisar DCs vindas de diversos locais, para melhor avaliar a capacidade migratória das DCs, células das patas foram marcadas in vivo injetando-se subcutaneamente o corante CFSE juntamente com conídios do fungo. Verificamos que após 12 e 72 horas, as DCs das patas dos animais infectados, migraram para os linfonodos regionais. Assim constatamos que o fungo F. pedrosoi é capaz de induzir a migração de macrófagos e neutrófilos para o sítio de infecção em poucas horas, leva ao aumento de células B nos linfonodos após 12 e 72 horas de infecção, e também leva ao aumento de linfócitos T CD4+ tanto no local de infecção quanto nos linfonodos. Os resultados também comprovam que o fungo F. pedrosoi foi capaz de ativar as DCs, induzindo sua migração para os linfonodos regionais. / The chromoblastomycosis is a subcutaneous mycosis with a high morbidity rate, Fonsecaea pedrosoi (F. Pedrosoi) being the largest etiologic agent of this mycosis, featuring a chronic disease, usually confined to the skin and subcutaneous tissues. Rarely do people have cure for this disease, because the therapies shown to be deficient contemporary and few studies report the host-parasite relationship. Dendritic cells (DCs) are specialized in presenting antigens to naïve T lymphocytes inducing primary immune responses. Therefore, we propose to study the migratory capacity of DCs after infection with conidia of F. pedrosoi, since the migration of these cells is intimately linked to its function on T cells, leading to development of a protective adaptive immune response. The phenotype of DCs was evaluated using cells obtained from popliteal lymph nodes, sub cutaneous tissue of BALB/c mice after 12, 24 and 72 hours of infection with conidia of the fungus. Cells were labeled with specific antibodies and analyzed by flow cytometry. After 24 and 72 hours of infection we found a significant decrease in the percentage of DCs in the sub cutaneous tissue, and a significant increase of these cells in the lymph nodes after 72 hours. The expression of surface markers such as CCR7 and costimulatory molecules, were reduced in cells obtained from the sub cutaneous tissue. Like the process of immunophenotyping we can analyze DCs coming from various locations, to better assess the migratory capacity of DCs, cells were stained paws in vivo by injecting dye subcutaneously with CFSE conidia of the fungus. We found that after 12 and 72 hours, DCs sub cutaneous tissue of infected animals migrated to regional lymph nodes. We found that the fungus F. pedrosoi is capable of inducing migration of macrophages and neutrophils to the site of infection within a few hours, leads to increased B-cells in lymph nodes after 12 and 72 hours of infection, and also leads to an increase of CD4 + T lymphocytes in both the site of infection and in the lymph nodes. The results also show that the fungus F. pedrosoi was able to activate the DCs, inducing their migration to regional lymph nodes.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica de homem e animais, causada pela implantação traumática do patógeno e que normalmente envolve a derme e o tecido subcutâneo. Desde 1898, quando o agente etiológico esporotricose foi descoberto por Schenck, esta doença tem sido atribuída a um único patógeno, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 º C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, os isolados identificados como S. schenckii demonstraram uma grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies crípticas. Com base nesta informação o nosso grupo está interessado no estudo da taxonomia polifásica deste complexo de espécies e suas implicações sobre a eco-epidemiologia da doença no Brasil. Foram estudadas 161 cepas de Sporothrix spp. provenientes de amostras clínicas e ambientais de diversas regiões do Brasil e outros países. Os parâmetros fenotípicos analisados levaram em consideração o crescimento vegetativo em meio PDA sob diferentes temperaturas (30, 35, 37 e 40 º C), a coloração da colônia em meio CMA, o padrão de assimilação de fontes de carbono (glicose, ribitol, rafinose e sacarose) e as características micro morfológicas in vitro. Os dados fenotípicos foram confirmados por biologia molecular utilizando as informações de sequenciamento de DNA de um fragmento do lócus calmodulina. Nossos dados mostram que S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S. schenckii tem uma ampla distribuição geográfica no Brasil. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira descrição na literatura da espécie S. mexicana fora do México, e provocando doença em hospedeiro humano. S. brasiliensis foi isolado com alta frequência de gatos nos estados do Rio Grande do Sul e Rio de Janeiro, sugerindo que este animal tem sido um importante vetor na epidemiologia desta espécie. Uma abordagem proteômica foi proposta neste trabalho para comparar o perfil protéico de isolados de Sporothrix spp. com o intuito de entendermos as diferenças em termos de expressão de proteína entre as espécies crípticas. Os perfis 2-D foram fortemente diferentes entre os isolados. Para elucidar o principal antígeno da esporotricose humana, o fungo foi cultivado em meio BHI caldo, 37 °C e as proteínas intracelulares foram fracionadas por eletroforese bidimensional. As proteínas foram transferidas para uma membrana e, em seguida, incubadas com soro de pacientes com as duas principais formas clínicas da doença (cutânea fixa e linfocutânea). Nossos resultados demonstram que anticorpos IgG presentes no soro de pacientes reagem com diferentes antígenos dos isolados do complexo Sporothrix schenckii. O imunoblot mostrou que existem imunoglobulinas que reagem com um antígeno de 70 kDa em três isolados (S. brasiliensis, S. globosa e S. schenckii). Diferenças no perfil de antigenicidade foram observadas entre S. mexicana e as demais espécies aqui avaliadas. / Sporotrichosis is a chronic mycotic infectious disease of man and animals caused by the traumatic implantation of a pathogenic fungus that typically involves the skin and subcutaneous tissue. Since 1898, when the sporotrichosis etiological agent was discovered by Schenck, this disease has been attributed to a single pathogen, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, a thermo dimorphic fungus that grow as a yeast at 37 ºC and as a mycelium at room temperature. However, isolates identified as S. schenckii showed a great deal of genetic variability, suggesting that this taxon consist in a cryptic species complex. Based on this information our group is interested in the study of the polyphasic taxonomy of this species complex and its implication on its ecoepidemiology in Brazil. We studied 161 strains of Sporothrix spp. provided from environmental and clinical samples obtained from diverse regions of Brazil and other countries. The phenotypic parameters assayed include vegetative growth on PDA media at different temperatures (30, 35, 37 and 40 ºC), the colony colors on CMA media, the assimilation pattern of carbon sources (raffinose, ribitol and sucrose) and morphological microscopic features of in vitro cultivation. The phenotypic data were confirmed by molecular biology using the sequencing information of a fragment of calmodulin locus. Our data show that the S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana and S. schenckii have a widespread geographical distribution in Brazil. To our knowledgement this is the first description of the specie S. mexicana outside of Mexico and causing disease in human host. S. brasiliensis was isolated with high frequency from cats in Rio Grande do Sul and Rio de Janeiro states, suggesting that cats has been an important vector in epidemiology of this specie. A proteomic approach was proposed in this work to compare protein profile of Sporothrix spp. isolates and get a better understanding about the differences in terms of protein expression among the cryptic species. The 2-D profiles were strongly different among the isolates. To elucidate the major antigen of human sporotrichosis, the fungus was cultured in BHI broth, 37 °C, and intracellular proteins were resolved by 2-DE. Proteins were transferred to a nitrocellulose membrane and then incubated with serum from patients with the two major clinical form of disease (cutaneous fixed and linfocutaneous). Our results show that IgG present in serum from patients react with different antigens from Sporothrix schenckii complex. Immunoblotting showed that the sera of patients had antibodies reacting with a 70 kDa antigen in three isolates (S. brasiliensis, S. globosa and S. schenckii). Profile differences in antigenicity were observed between S. mexicana and the other species studied here. / FAPESP: 2008/55975-8 / TEDE

A cromoblastomicose é uma micose subcutânea, com alto índice de morbidade, sendo Fonsecaea pedrosoi (F. pedrosoi) considerado o maior agente etiológico dessa micose, caracterizando uma doença crônica, geralmente confinada na pele e tecidos subcutâneos. Raramente os indivíduos apresentam cura dessa doença, pois as terapias contemporâneas mostram-se deficientes e poucos trabalhos relatam a relação parasito-hospedeiro. As células dendríticas (DCs) são especializadas na apresentação de antígenos para linfócitos T naive induzindo respostas imunes primárias. Diante disso, propomos estudar a capacidade migratória de DCs após infecção com conídios de F. pedrosoi, uma vez que o processo de migração dessas células está intimamente ligado com a sua função sobre as células T, levando ao desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa protetora. O fenótipo de DCs foi avaliado através de células obtidas dos linfonodos poplíteos, inguinais e patas de camundongos BALB/c após 12, 24 e 72 horas de infecção com conídios do fungo. Células obtidas foram marcadas com anticorpos específicos e analisadas por citometria de fluxo. Após 24 e 72 horas de infecção verificamos uma diminuição significativa na porcentagem de DCs nas patas, e um aumento significativo dessas células nos linfonodos após 72 horas. A expressão de marcadores de superfície como CCR7 e moléculas co-estimulatórias, mostraram-se diminuídas nas células obtidas das patas. Como no processo de imunofenotipagem podemos analisar DCs vindas de diversos locais, para melhor avaliar a capacidade migratória das DCs, células das patas foram marcadas in vivo injetando-se subcutaneamente o corante CFSE juntamente com conídios do fungo. Verificamos que após 12 e 72 horas, as DCs das patas dos animais infectados, migraram para os linfonodos regionais. Assim constatamos que o fungo F. pedrosoi é capaz de induzir a migração de macrófagos e neutrófilos para o sítio de infecção em poucas horas, leva ao aumento de células B nos linfonodos após 12 e 72 horas de infecção, e também leva ao aumento de linfócitos T CD4+ tanto no local de infecção quanto nos linfonodos. Os resultados também comprovam que o fungo F. pedrosoi foi capaz de ativar as DCs, induzindo sua migração para os linfonodos regionais. / The chromoblastomycosis is a subcutaneous mycosis with a high morbidity rate, Fonsecaea pedrosoi (F. Pedrosoi) being the largest etiologic agent of this mycosis, featuring a chronic disease, usually confined to the skin and subcutaneous tissues. Rarely do people have cure for this disease, because the therapies shown to be deficient contemporary and few studies report the host-parasite relationship. Dendritic cells (DCs) are specialized in presenting antigens to naïve T lymphocytes inducing primary immune responses. Therefore, we propose to study the migratory capacity of DCs after infection with conidia of F. pedrosoi, since the migration of these cells is intimately linked to its function on T cells, leading to development of a protective adaptive immune response. The phenotype of DCs was evaluated using cells obtained from popliteal lymph nodes, sub cutaneous tissue of BALB/c mice after 12, 24 and 72 hours of infection with conidia of the fungus. Cells were labeled with specific antibodies and analyzed by flow cytometry. After 24 and 72 hours of infection we found a significant decrease in the percentage of DCs in the sub cutaneous tissue, and a significant increase of these cells in the lymph nodes after 72 hours. The expression of surface markers such as CCR7 and costimulatory molecules, were reduced in cells obtained from the sub cutaneous tissue. Like the process of immunophenotyping we can analyze DCs coming from various locations, to better assess the migratory capacity of DCs, cells were stained paws in vivo by injecting dye subcutaneously with CFSE conidia of the fungus. We found that after 12 and 72 hours, DCs sub cutaneous tissue of infected animals migrated to regional lymph nodes. We found that the fungus F. pedrosoi is capable of inducing migration of macrophages and neutrophils to the site of infection within a few hours, leads to increased B-cells in lymph nodes after 12 and 72 hours of infection, and also leads to an increase of CD4 + T lymphocytes in both the site of infection and in the lymph nodes. The results also show that the fungus F. pedrosoi was able to activate the DCs, inducing their migration to regional lymph nodes.

Os objetivos deste estudo foram: re-identificar 70 isolados de Candida em micoteca por método tradicional e API 20C; identificar a presença de C. dubliniensis; determinar e comparar as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) das amostras, frente a sete antifúngicos (E-test); caracterizar molecularmente as amostras seqüenciais de Candida pela técnica de PFGE; estudar e comparar o perfil genotípico de isolados de C. albicans e C. parapsilosis, através da análise de marcadores microsatélites e cariotipagem. O nível de concordância entre o método tradicional e o API 20C foi de 93%. Nenhum isolado de C. dubliniensis foi identificado no estudo. Em relação à sensibilidade antifúngica, a maioria das amostras apresentou alta porcentagem de sensibilidade às sete drogas testadas. A análise molecular pela técnica de PFGE, mostrou seis perfis de cariótipos diferentes em 24 amostras seqüenciais. Em relação à comparação das técnicas de PFGE e microssatélites, observamos que a última mostrou maior poder discriminatório para as amostras de estudadas. / This study was aimed to: identify the 70 isolates of Candida in a culture collection by the traditional method and by API 20C; identify the presence of C. dubliniensis; determine and compare the minimum inhibitory concentrations (MICs) of these samples in regard to the seven drugs (E-test); molecularly characterize sequential samples from the same patient by the PFGE technique; study the genotypic profile of all the isolates of C. albicans and C. parapsilosis by means of the microsatellite technique and compare the results with those obtained by the PFGE technique. The level of agreement between the traditional method and the API 20C was 93%. No isolate of C. dubliniensis was identified in the study. In relation to antifungal susceptibility, most of the samples presented a high percentage of susceptibility to the seven drugs tested. The molecular analysis by the PFGE technique revealed six different karyotype profiles among 24 sequential samples. In the comparison between the PFGE and microsatellite, the latter showed a greater discriminatory power for samples.

A cromoblastomicose é uma infecção fúngica subcutânea causada por fungos da família Dematiceae sendo o principal agente etiológico o fungo Fonsecaea pedrosoi (F. pedrosoi). Estes fungos induzem uma lesão crônica na pele de freqüente recidivas. O objetivo do trabalho foi avaliar alguns aspectos imunológicos na cromoblastomicose experimental através de dois modelos de infecção pelas vias: intraperitoneal (i.p.) e subcutânea (s.c.). No primeiro modelo de infecção pela via s.c. em camundongos BALB/c infectados com 106 conídios de F. pedrosoi, ocorreu a cura espontânea da infecção em aproximadamente 4 semanas. Na subtipagem de linfócitos T em linfonodos regionais ocorreu um predomínio de células T CD4+ que foi constante até a 4ª semana de infecção, no entanto, observamos aumento significativo de linfócitos T CD8+ ao longo da infecção sugerindo que essa população tenha também uma importante participação no controle da doença. Os ensaios de linfoproliferação demonstraram, na 1ª semana de infecção, elevado índice de proliferação celular quando as células de linfonodos foram estimuladas in vitro com antígenos de F. pedrosoi, além da liberação principalmente da citocina IFN-γ, já na 4ª semana de infecção não foi detectado proliferação celular. Esses resultados sugerem que no início da infecção a resposta celular seja mediada principalmente por linfócitos T CD4+ produtores de IFN-γ, o que nos sugere, que neste modelo experimental, polarize uma resposta de células T do tipo Th1. No segundo modelo de infecção, via intraperitoneal (i.p.), camundongos BALB/c infectados com 106 conídios de F. pedrosoi mostraram desenvolvimento de infecção crônica com preservação da imunidade celular mesmo após a 8ª semana. Ainda pela via i.p., os camundongos C57BL/6 nocautes de T CD4+ apresentaram uma maior carga fúngica no início da infecção e em tempos mais tardios a carga fúngica foi semelhante aos camundongos controles (C57BL/6); esses mesmos animais nocautes não apresentaram uma ativação da resposta celular medida pelo teste de HTT (Hipersensibilidade do Tipo Tardio). Quando avaliamos o padrão de citocinas, a citocina IFN-γ produzida pelos órgãos baço e fígado apresentou menores níveis no início da infecção quando comparado ao camundongos controle. Já os níveis de IL-10 aumentaram gradativamente ao longo da infecção e IL-4 não apresentou diferenças em relação ao controle. Nos camundongos nocautes para coa (C57BL/6 CD8 \"KO\"), a carga fúngica, os níveis de citocinas e o teste de HTT foram semelhantes aos animais controle. Esses resultados mostraram que pela via i.p. os linfócitos T, principalmente células T CD4+ são importantes no controle inicial da infecção. Em tempos mais tardios a infecção foi controlada mesmo em camundongos deficientes de linfócitos TCD 4+ ou T CD8+, sugerido que outras células como macrófagos ou NK, estariam atuando de forma mais efetiva no controle da infecção. / Abstract not available.

A cromoblastomicose é uma infecção fúngica subcutânea causada por fungos da família Dematiceae sendo o principal agente etiológico o fungo Fonsecaea pedrosoi (F. pedrosoi). Estes fungos induzem uma lesão crônica na pele de freqüente recidivas. O objetivo do trabalho foi avaliar alguns aspectos imunológicos na cromoblastomicose experimental através de dois modelos de infecção pelas vias: intraperitoneal (i.p.) e subcutânea (s.c.). No primeiro modelo de infecção pela via s.c. em camundongos BALB/c infectados com 106 conídios de F. pedrosoi, ocorreu a cura espontânea da infecção em aproximadamente 4 semanas. Na subtipagem de linfócitos T em linfonodos regionais ocorreu um predomínio de células T CD4+ que foi constante até a 4ª semana de infecção, no entanto, observamos aumento significativo de linfócitos T CD8+ ao longo da infecção sugerindo que essa população tenha também uma importante participação no controle da doença. Os ensaios de linfoproliferação demonstraram, na 1ª semana de infecção, elevado índice de proliferação celular quando as células de linfonodos foram estimuladas in vitro com antígenos de F. pedrosoi, além da liberação principalmente da citocina IFN-γ, já na 4ª semana de infecção não foi detectado proliferação celular. Esses resultados sugerem que no início da infecção a resposta celular seja mediada principalmente por linfócitos T CD4+ produtores de IFN-γ, o que nos sugere, que neste modelo experimental, polarize uma resposta de células T do tipo Th1. No segundo modelo de infecção, via intraperitoneal (i.p.), camundongos BALB/c infectados com 106 conídios de F. pedrosoi mostraram desenvolvimento de infecção crônica com preservação da imunidade celular mesmo após a 8ª semana. Ainda pela via i.p., os camundongos C57BL/6 nocautes de T CD4+ apresentaram uma maior carga fúngica no início da infecção e em tempos mais tardios a carga fúngica foi semelhante aos camundongos controles (C57BL/6); esses mesmos animais nocautes não apresentaram uma ativação da resposta celular medida pelo teste de HTT (Hipersensibilidade do Tipo Tardio). Quando avaliamos o padrão de citocinas, a citocina IFN-γ produzida pelos órgãos baço e fígado apresentou menores níveis no início da infecção quando comparado ao camundongos controle. Já os níveis de IL-10 aumentaram gradativamente ao longo da infecção e IL-4 não apresentou diferenças em relação ao controle. Nos camundongos nocautes para coa (C57BL/6 CD8 \"KO\"), a carga fúngica, os níveis de citocinas e o teste de HTT foram semelhantes aos animais controle. Esses resultados mostraram que pela via i.p. os linfócitos T, principalmente células T CD4+ são importantes no controle inicial da infecção. Em tempos mais tardios a infecção foi controlada mesmo em camundongos deficientes de linfócitos TCD 4+ ou T CD8+, sugerido que outras células como macrófagos ou NK, estariam atuando de forma mais efetiva no controle da infecção. / Abstract not available.