Les vésicules extracellulaires telles que les microvésicules et les exosomes sont libérées lors de l’apoptose ou de l’activation cellulaire. Ce sont des médiateurs importants dans la communication intercellulaire, suggérant que ces vésicules pourraient jouer un rôle physiopathologique, en particulier dans les maladies cardiovasculaires. L'athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique de la paroi artérielle qui résulte de l’interaction entre les lipoprotéines, les cellules inflammatoires, et les cellules vasculaires. L'infarctus du myocarde est une complication aiguë et grave de l'athérosclérose. La réaction inflammatoire post-infarctus joue un rôle central dans la formation de néovaisseaux sanguins et la cicatrisation. Cependant, les mécanismes de l’inflammation sont encore mal connus dans ces pathologies. Mon travail de thèse a porté sur les effets des vésicules extracellulaires isolées de tissus pathologiques sur les cellules inflammatoires. Nous avons montré dans un premier travail que les microvésicules s’accumulant dans les lésions d’athérosclérose humaines contribuent à la surcharge en cholestérol et en triglycérides des macrophages et facilitent la formation de cellules spumeuses. L’accumulation des lipides intracellulaires induite par ces microvésicules est contrebalancée par une augmentation de l’efflux du cholestérol associée à une activation d’ABCA1. Dans un deuxième travail, nous avons examiné les effets des vésicules produites dans le cœur post-infarctus sur la réponse inflammatoire. Nos résultats montrent : 1- une augmentation de la libération in situ des microvésicules majoritairement d’origine cardiomyocytaire et des exosomes 15 heures après infarctus ; 2- la stimulation de la production de VEGF monocytaire par les vésicules extracellulaires ; 3- l’incapacité en ce qui concerne les vésicules isolées de cœur diabétique infarci à reproduire cet effet sur les monocytes des souris contrôles. Afin de clarifier les déterminants de l’angiogenèse post-ischémique, nous avons également étudié les profils de miARNs des vésicules contrôles et diabétiques. Après infarctus du myocarde, l’expression de miR-126-3p et de miR-92a-3p est significativement diminuée dans les vésicules diabétiques en comparaison avec les vésicules contrôles. Par ailleurs, nous avons observé une augmentation de miR-126-3p et de miR-92a-3p respectivement dans les microvésicules et les exosomes chez les souris contrôles post-infarctus. En conclusion, ce travail apporte des éléments nouveaux sur les fonctions des vésicules extracellulaires générées localement dans les tissus inflammatoires, en particulier leur capacité à promouvoir la transformation des macrophages en cellules spumeuses dans la plaque. Par ailleurs, les vésicules isolées du cœur ischémique pourraient favoriser l’angiogenèse post-infarctus en stimulant la production de VEGF monocytaire. La disparition de cet effet bénéfique dans le diabète pourrait être associée à des modifications d’adressage des miARNs dans les vésicules extracellulaires au cours de cette pathologie. / Extracellular vesicles, such as microvesicles and exosomes, are released during cell apoptosis or activation. They are important mediators of intercellular communication, suggesting that these vesicles could play a pathophysiological role, especially in cardiovascular diseases. Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the arterial wall which results from the interaction between lipoproteins, inflammatory cells, and vascular cells. Myocardial infarction is an acute and severe complication of atherosclerosis. The postinfarction inflammatory response plays a central role in the formation of new blood vessels and scarring. However, the mechanisms of inflammation are still poorly known in these pathologies. My thesis concerned the effects of extracellular vesicles isolated from pathological tissues on inflammatory cells. We showed in the first work that microvesicles accumulating in human atherosclerotic lesions contribute to cholesterol and triglyceride overload in macrophages and facilitate foam cell formation. The accumulation of the intracellular lipids induced by those microvesicles is offset by an increase in cholesterol efflux associated with activation of ABCA1. In the second study, we examined the effect of vesicles produced in the infarcted heart on the inflammatory response. Our results showed : 1- an increased release in situ of microvesicles mostly of cardiomyocyte origin and exosomes 15 hours after infarction ; 2- the stimulation of monocyte VEGF production by extracellular vesicles ; 3- the incapacity of diabetic vesicles isolated from infarcted heart to reproduce that effect on control mice monocytes. In order to clarify the determinants of postischemic angiogenesis, we also studied miRNA profiles of control and diabetic vesicles. After myocardial infarction, the expression level of miR-126-3p and miR-92a-3p was significantly decreased in diabetic vesicles compared to control vesicles. Furthermore, we observed an increased expression of miR-126-3p and miR-92a-3p respectively in the microvesicles and the exosomes isolated from control mice heart after myocardial infarction. In conclusion, this work provides new information on the functions of extracellular vesicles locally generated in inflamed tissues, particularly in promoting macrophage transformation into foam cells in the atherosclerotic plaque. Furthermore, vesicles isolated from ischemic heart could enhance postinfarction angiogenesis by stimulating monocyte VEGF production. The loss of this beneficial effect in diabetes may be associated with changes of miRNA cargo in extracellular vesicles in this pathology.

L'oncogène ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) est une tyrosine kinase constitutivement active, impliquée dans divers cancers, tels que les lymphomes anaplasiques à grandes cellules (LAGC), ou certains carcinomes bronchiques. Ces tumeurs sont traitées par chimiothérapie, ce qui n'est pas un traitement optimal (30% de rechutes, abaissement de la qualité de vie). Dans ce contexte, de nombreux inhibiteurs spécifiques de la tyrosine kinase ALK tels que le Crizotinib ont été développés et ont prouvé leur efficacité à la fois dans des modèles in vitro, in vivo ainsi que chez les patients. Néanmoins, le succès de cette thérapie ciblée est limité par l'apparition de résistances. Il est donc essentiel de mettre au jour de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de contrecarrer ces résistances. Récemment, l'autophagie, un processus catabolique intracellulaire de dégradation lysosomale, a été proposée comme nouvelle cible thérapeutique dans le traitement des cancers résistants aux inhibiteurs de tyrosine kinase. Le premier objectif de mon projet de thèse a été de caractériser ce processus autophagique dans les LAGC ALK+, en réponse à différents traitements. Nous avons montré que (1) l'autophagie était activée dans des lignées de LAGC en réponse à l'inhibition de ALK, (2) que cette autophagie jouait un rôle cytoprotecteur dans ce modèle et (3) que les traitements par chimiothérapies de ces cellules n'induisaient pas de réponse autophagique. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés à la régulation potentielle de l'autophagie par les microARNs. Nous avons montré que plusieurs microARNs, dont le miR-7, étaient sous-exprimés en réponse au traitement par le Crizotinib et que la réexpression ectopique de ce miR-7 permettait une potentialisation de l'effet du Crizotinib, par l'induction d'autophagie cytotoxique dans notre modèle. Nous avançons également l'hypothèse que le " switch " autophagique de la cytoprotection à la cytotoxicité, que nous observons pourrait s'expliquer par la régulation de l'expression de plusieurs protéines cibles de miR-7 telles que Bcl-2 ou c-Raf. Ainsi, l'ensemble de nos résultats nous permettent de mieux comprendre le rôle et la régulation de l'autophagie induite en réponse à l'inhibition de ALK dans les LAGC ALK+, et pourrait à terme contribuer à l'amélioration des thérapies actuelles de divers cancers dépendants de l'oncogène ALK. / The ALK oncogene (Anaplastic Lymphoma Kinase) is a constitutively activated tyrosine kinase implied in various cancers including Anaplastic Large Cell Lymphomas (ALCL), or some lung adenocarcinomas. The current operative treatment is standard chemotherapy, which is not optimal (30% of relapses, low quality of life). In this context, new specific ALK inhibitors such as Crizotinib have been developed, and have showed their efficiency in vitro, in vivo and in patients. However, the emergence of resistant mutations has been described. Thus, the identification of alternative therapies targeting new pathways appears as mandatory to counteract those resistances. In this context, autophagy, an intracellular catabolic lysosomal process, has been described as a new therapeutic target in the treatment of cancers resistant to tyrosine kinase inhibitors. The first aim of my project was to characterize the autophagic process in ALK+ ALCL, upon different treatments. We showed that (1) autophagy was activated in ALK+ ALCL cell lines in response to ALK inhibition (2) that this autophagy played a cytoprotective role in our model and (3) that treatment with chemotherapies did not trigger an autophagic response. In a second part of the project, we focused on the potential regulation of autophagy by microRNAs. We showed that several microRNAs including miR-7 were down-regulated upon Crizotinib treatment and that ectopic re-expression of this miR-7 potentiates the effects of Crizotinib by induction of cytotoxic autophagy in our model. We hypothesized that this switch in the role of autophagy from cytoprotection to cytotoxicity observed in our model, could be explained by the regulation of several protein targets of miR-7 such as Bcl-2 or c-Raf. Altogether, these results enable a better understanding of the role and regulation of autophagy induced upon ALK inhibition in ALCL, and could in the longer term, contribute to improvement of current therapies of cancers involving the ALK oncogene.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 joicematosbiselli_tese.pdf: 4248277 bytes, checksum: 46a8e90eea3be6a03251e5b3d7d8b0e5 (MD5) Previous issue date: 2011-11-28 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo / Trisomy 21 is the genetic basis of Down syndrome (DS), the most common human chromosomal disorder. DS phenotype may include several dysmorphic features, intellectual disability, immunological alteration, congenital heart disease, high risk for specific types of leukemia and neurological alterations. There are basically two hypotheses to explain how the presence of three copies of chromosome 21 results in DS phenotype. The gene dosage effect hypothesis states that over-expression in about 50% of a specific gene or a group of genes located on chromosome 21 present in triplicate in DS individuals is directly responsible for DS features. The second hypothesis suggests the existence of secondary effects of trissomic genes that affect multiple metabolic pathways, resulting in cellular dysfunction. Recent studies show that trisomy 21 results in the over-expression of microRNAs, small molecules of noncoding RNA involved in post-transcriptional gene regulation, which could result in low expression of specific proteins and contribute to DS phenotype. Objective: To identify differentially expressed microRNAs in peripheral blood mononuclear cells of DS and non-DS children and to identify biological processes relevant to DS pathogenesis associated with predicted gene targets of microRNAs differentially expressed in DS children. Casuistic and Methods: Six children with free trisomy 21 and six control children were included in the study. Mature microRNAs were quantified using TaqMan® Low Density Arrays (Applied Biosystems), which enable the quantification of 754 mature microRNAs by real time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) using fluorescent probes. The target prediction was performed using the software TargetScanHuman v. 5.2. Information about gene targets was obtained using the software Bioprocess, a database that obtains data from the National Center for Abstract xvi Biotechnology Information (NCBI). Results: Of the 490 mature microRNAs expressed in this cell type, 49 are low-expressed in DS group. The microRNAs located in chromosome 21 did not present differential expression between the groups. Bioinformatics analysis showed that genes involved in several relevant biological process to DS, including apoptosis, reactive oxygen species metabolism, mitochondrial metabolism, immune system, cell aging, cycle and division and control of gene expression, are predicted targets of microRNAs differentially expressed in DS children. Conclusion: DS children present low expression of microRNAs not located on chromosome 21 in peripheral blood mononuclear cells, as compared to children without DS. Biological processes relevant to DS pathogenesis are associated with predicted gene targets of microRNAs differentially expressed in DS children. / A trissomia do cromossomo 21 é a base genética da síndrome de Down (SD), a cromossomopatia humana mais frequente. O fenótipo da SD pode incluir várias características dismórficas, deficiência intelectual, alterações imunológicas, cardiopatias congênitas, risco aumentado para leucemias específicas, alterações neurológicas, entre outras. Existem basicamente duas hipóteses que tentam explicar como a presença de três cópias do cromossomo 21 resulta no fenótipo Down. De acordo com a hipótese do efeito da dosagem gênica , a expressão elevada em cerca de 50% de um gene específico ou de um grupo de genes do cromossomo 21 presente em triplicata em indivíduos com SD seria diretamente responsável pela manifestação de características da síndrome. A segunda hipótese sugere a existência de efeitos secundários de genes trissômicos, que afetariam múltiplas vias metabólicas, resultando em disfunção celular. Estudos recentes mostram que a trissomia do cromossomo 21 resulta na expressão elevada de microRNAs, pequenas moléculas de RNAs nãocodificantes envolvidos na regulação gênica pós-transcricional, o que pode levar à redução da expressão de proteínas específicas e contribuir para o fenótipo da SD. Objetivo: Identificar microRNAs diferencialmente expressos em células mononucleares do sangue periférico de crianças com SD em relação a crianças sem a síndrome e identificar processos biológicos relevantes para a patogênese da SD associados a genes-alvo preditos de microRNAs diferencialmente expressos em crianças com SD. Casuística e Métodos: Foram incluídas no estudo seis crianças com trissomia livre do cromossomo 21 e seis crianças sem a síndrome. A quantificação de microRNAs maduros foi realizada utilizando-se TaqMan® Low Density Arrays (Applied Biosystems), que possibilita a investigação da expressão de 754 microRNAs maduros Resumo xiv pelo método de reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCRq) fluorescente em tempo real. A predição de genes-alvo dos microRNAs foi realizada utilizando-se o programa TargetScanHuman v. 5.2. Para obtenção de informações sobre os genes-alvo preditos foi utilizada a ferramenta Bioprocess, um banco de dados alimentado com informações do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Resultados: Dos 490 microRNAs maduros expressos no tipo celular investigado, 49 apresentaram expressão reduzida no grupo de crianças com SD. Os microRNAs localizados no cromossomo 21 não apresentaram expressão diferencial entre os grupos. A análise de Bionformática revelou que genes envolvidos em diversos processos biológicos relevantes para a SD, tais como apoptose, metabolismo de espécies reativas de oxigênio, metabolismo mitocondrial, sistema imunológico, envelhecimento, ciclo e divisão celular e controle da expressão gênica, são alvos preditos de microRNAs diferencialmente expressos em crianças com SD. Conclusão: Crianças com SD apresentam expressão reduzida de microRNAs não localizados no cromossomo 21 em células mononucleares do sangue periférico, em relação a crianças sem a síndrome. Processos biológicos relevantes para a patogênese da SD estão associados a genes-alvo preditos de microRNAs diferencialmente expressos em crianças com SD.

Le cancer de vessie représente la sixième cause de mortalité par cancer en France. Son incidence a augmenté ces 20 dernières années, mais les taux de survie restent inchangés. La carcinogénèse vésicale fait intervenir différents mécanismes moléculaires qui agissent en réseau comme c’est le cas dans de nombreux cancers. Le développement récent de nouveaux traitements prenant spécifiquement pour cible certaines voies de signalisation apportent de nouveaux espoirs thérapeutiques. Nous nous sommes intéressés dans ce travail à trois axes de recherche pour tenter d’identifier, dans les carcinomes urothéliaux, de nouveaux marqueurs pronostiques moléculaires et de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles: l’angiogénèse, la voie de signalisation Hedgehog et les microARNs. Nous avons choisi la RT-PCR quantitative en temps réel à grande échelle permettant d’évaluer le niveau d’expression de nombreux gènes, avec une quantification précise et reproductible des transcrits. L’expression de ces gènes a été corrélée aux données de suivi clinique afin d’identifier de nouveaux biomarqueurs moléculaires prédictifs de l’évolution des tumeurs de vessie.Nous avons ainsi pu démontrer que les niveaux d’expression de certains de ces gènes variaient de façon significative dans les tumeurs de vessie, confirmant le rôle de l’angiogénèse dans la carcinogénèse urothéliale, et plus particulièrement de la voie du VEGF, et suggérant une implication majeure de la voie de signalisation Hedgehog et des microARNs. Par ailleurs, nous avons également pu identifier plusieurs biomarqueurs ayant une valeur pronostique en terme de survie globale dans les tumeurs infiltrantes. C’est le cas du VEGF, qui semble être un biomarqueur moléculaire particulièrement intéressant puisqu’il existe des thérapies ciblées spécifiquement dirigées contre ce ligand ou ses récepteurs avec plusieurs essais cliniques actuellement en cours dans le cancer de vessie. C’est également le cas d’une signature moléculaire associant 3 miARNs (miR-9, miR-182 et miR-200b) ayant une valeur péjorative dans les tumeurs infiltrantes, ouvrant la voie vers de nouvelles stratégies thérapeutiques.L’ensemble de ces études confirment l’intérêt majeur d’une meilleure compréhension des bases moléculaires de la carcinogénèse urothéliale vésicale débouchant sur l’utilisation rationnelle de nouvelles thérapies ciblées dans le cancer de vessie, avec l’espoir d’en améliorer la prise en charge et l’évolution. / Bladder cancer is the sixth cause of cancer mortality in France and its incidence is increasing since the last 20 years, with no improvement in survival outcomes. Bladder carcinogenesis involves different molecular mechanisms such as in many cancers. The recent development of new targeted therapies targeting signaling pathways provides new therapeutic hopes.In this work, we choose to study three molecular pathways in order to identify new prognostic markers and new therapeutic targets in urothelial carcinoma: angiogenesis, Hedgehog signaling pathway, and microRNAs. Real-time quantitative RT-PCR was performed to measure simultaneously expression levels of several genes with precise and reproductible RNA quantification. Our results were correlated with clinical outcomes to identify new molecular markers associated with bladder cancer evolution and to guide the potential use of targeted therapies.We were able to demonstrate that expression levels of several transcripts differ significantly in bladder tumors as compared to normal bladder and that some of them may have a prognostic implication. This is the case of VEGF, which appears to be an interesting molecular marker since there are targeted therapies specifically targeting the pathway and several ongoing trials in bladder cancer. The Hedgehog pathway also appears to be altered in bladder tumors, with a ligand-dependent activation. Then, we were able to identify several deregulated microRNAs and describe a molecular 3 miRNA-signature (miR-9, miR-182 and miR-200b) having a prognostic value in muscle-invasive bladder tumors. All these studies confirm the major interest of molecular biology and new targeted therapies in the treatment of bladder cancer, with the hope of improving management and evolution.

Le synaptic scaling est une forme de plasticité homéostatique par lequel les synapses ajustent leur efficacité pour compenser des variations normales ou pathologiques de l'activité neuronale notamment lors des maladies neurodégeneratives ou suite à la perte d’afférences sensorielles après une lésion. Dans un modèle expérimental classique, le traitement chronique des neurones primaires avec la tétrodotoxine (TTX) pour bloquer la propagation des potentiels d'action présynaptiques induit une augmentation significative de l'amplitude des courants miniatures excitateurs transmis par les récepteurs du glutamate AMPA postsynaptiques. Plusieurs voies de signalisation ont été proposées, dont celle impliquant les microARNs (miRs), de petits ARN non-codants qui inhibent la traduction des protéines en se liant aux ARN messagers cibles. Dans ce contexte, nous avons exploré l'hypothèse que le microARN, miR-124, fortement exprimé dans le cerveau, pourrait être un régulateur important de l'homéostasie synaptique en contrôlant l'expression de la protéine synaptopodine, une protéine structurante des épines dendritiques et indispensable à l'expression du synaptic scaling.En combinant des approches de RTq-PCR, d'immunocytochimie et d'électrophysiologie in vitro, nous avons montré dans un premier temps que la privation globale de l'activité des neurones primaires d’hippocampe diminuait le niveau d'expression de miR-124 et augmentait celui de la synaptopodine et des récepteurs AMPA dont la sous-unité GluA2 est une autre cible de miR-124. Par ailleurs, en rendant des synapses individuelles inactives via l’expression présynaptique de la toxine tétanique, nous avons observé que le recrutement synaptique des récepteurs AMPA et de la synaptopodine était spécifique de ces synapses, suggérant une régulation homéostatique locale. Dans un deuxième temps, nous avons trouvé que la surexpression de miR-124 ou l’inhibition de son interaction avec l’ARNm de la synaptopodine ou de GluA2 bloquaient la réponse synaptique homéostatique induite par le traitement TTX. Enfin, des expériences de FRAP ont suggéré que la synaptopodine influençait le trafic des récepteurs AMPA à la membrane probablement en les stabilisant à la synapse, ce qui expliquerait ainsi son rôle pendant la plasticité homéostatique. / Synaptic scaling is a form of homeostatic plasticity where synapses adjust their own efficacy to compensate for normal or pathological variations in neuronal activity such as neurodegenerative disorders or sensory deprivation after a lesion. In a well-established paradigm, the chronic application of tetrodotoxin (TTX) in primary neurons, to block presynaptic action potential propagation, induces a significant upscaling of miniature excitatory postsynaptic currents mediated-AMPA receptors. Numerous regulators of this plasticity have been identified including microRNAs (miR), which are small endogenous non-coding RNAs, inhibiting protein translation by binding to mRNA targets. This led us to hypothesize that the most highly expressed microRNA in the brain, miR-124, could be an important regulator of homeostatic scaling by controlling the expression of synaptopodin, a structural protein of dendritic spines playing a crucial role in homeostatic plasticity.By combining qRT-PCR, immunocytochemistry and in vitro electrophysiology approaches, first we showed that a global 48hrs TTX treatment in hippocampal primary neurons led to a decrease in miR-124 level and an increase in the expression of synaptopodin and synaptic AMPA receptors containing the GluA2 subunit which is another miR-124 target. Moreover, we observed that the synaptic accumulation of AMPA receptors and synaptopodin could be synapse-specific by expressing the tetanus toxin to block the activity of individual presynapses, which suggested a local homeostatic regulation. Importantly, we found that overexpressing miR-124 or inhibiting its interaction with synaptopodin or GluA2 mRNAs blocked the synaptic homeostatic response. In addition, FRAP experiments suggested that synaptopodin controlled AMPA receptor trafficking at the membrane by probably retaining them in dendritic spines, which could explain its role during homeostatic plasticity.

La progression tumorale MSI (Microsatellite Instable) est un processus multi-étapes résultant de mutations générées par un processus d'instabilité génétique qui affecte en majorité les motifs répétés en tandem de l'ADN (microsatellites). Ces mutations contribuent à l'oncogenèse lorsqu'elles perturbent la fonction d'oncogènes ou de gènes suppresseurs de tumeurs. Le trait phénotypique MSI est consécutif à l'inactivation du système de réparation des mésappariements de l'ADN (système MMR). Dans ce travail, je me suis intéressé au rôle des microARNs dans l'oncogenèse MSI. Les microARNs régulent l'expression de nombreux gènes pouvant avoir un rôle clé dans le cancer. J'ai donc fait l'hypothèse d'un rôle de ces microARNs lors des différentes étapes du processus tumorigénique MSI. Tout d'abord nous avons mis en évidence une surexpression du miR-155 (ciblant les principales protéines MMR) au niveau de la muqueuse colique non transformée des malades atteints d'une Maladie Inflammatoire Chronique Intestinale, qui pourrait constituer un évènement pré-tumoral favorisant l'émergence de clones MMR-déficients (notion d'effet de champs). Dans une deuxième partie, nous avons pu identifier la première mutation somatique touchant un microARN. Il s'agit du miR-3613 dont la répétition microsatellite est entièrement localisée dans le miR mature. L'instabilité au niveau de ce miR conduit à des changements de séquence à l'extrémité 3' du miR (notion d'IsomiRs). Les isomiRs produits ont un répertoire de cibles qui pour certaines sont communes à la forme sauvage et pour d'autres spécifiques à chacun des variants.

Le développement d’un lymphome gastrique du MALT (LGM) émane d’un processus inflammatoire chronique initié par Helicobacter pylori.A partir du matériel issu d’un modèle animal de LGM, préalablement développé au laboratoire, basé sur des infections chez des souris thymectomisées à la naissance, la réponse inflammatoire gastrique favorable à l’émergence de LGM a été étudiée. Une dérégulation de cytokines et chimiokines au stade LGM a été identifiée permettant de recruter, faire proliférer et faire émerger des infiltrats lymphoïdes. La susceptibilité des souris thymectomisées à développer des lymphomes n’est pas liée à un déficit en lymphocytes T régulateurs. Cinq microARNs ont été retrouvés dérégulés au stade lymphome agissant probablement en synergie pour favoriser la prolifération lymphocytaire en particulier via un mécanisme anti-apoptotique. Enfin, nous décrivons un modèle original de LGM basé sur l’utilisation de souris C57BL6 exprimant la chimiokine APRIL humaine au niveau des lymphocytes T infectées par des espèces du genre Helicobacter. Ce modèle est prometteur pour une meilleure compréhension de la lymphomagénèse gastrique. / The development of gastric MALT lymphoma (GML) originates from a chronic inflammatory process initiated by Helicobacter pylori.The gastric inflammatory response was investigated in a mouse model of GML previously described by the laboratory using BALB/c mice thymectomized at day 3 post-birth and infected by H. pylori. A deregulation of numerous cytokines and chemokines at GML stage was identified which explained the recruitment, proliferation and emergence of lymphoid infiltrates. The susceptibility of thymectomized mice to develop lymphoma was not linked to a deficiency in regulatory T cells. A deregulation of 5 microRNAs was observed at lymphoma stage. These microRNAs may be involved in cell survival and lymphocyte proliferation and act in synergy to promote the development of GML. Finally, we described an original model of GML based on infection by Helicobacter species of transgenic C57BL6 mice expressing the human form of the cytokine APRIL in T cells. This model is promising for a better understanding of gastric lymphomagenesis.

Nouveau modèle d’étude de l’hépatoblastome in vivo et identification de microARNs régulateurs de la β-caténineL’hépatoblastome (HBL) est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. Au niveau moléculaire, il est caractérisé par des mutations activatrices dans le gène de la β-caténine (CTNNB1) entrainant une accumulation de sa protéine et une activation anormale de la voie de signalisation Wnt, responsables de la transformation maligne des cellules hépatiques. Ainsi, la β-caténine est une cible thérapeutique majeure dans l’HBL.Ce manuscrit décrit les deux parties principales de mon projet de thèse, dont l’objectif était d’étudier le rôle de microARNs régulateurs de la β-caténine sur la carcinogenèse de l’HBL.La première partie présente le développement d’un nouveau modèle d’étude in vivo de l’HBL. Ce travail a consisté à réaliser des xénogreffes de cellules dérivées d’HBL sur la membrane chorioallantoidienne (CAM) de l’embryon de poulet, et à étudier le développement des tumeurs par des approches histologiques et moléculaires. Mes résultats montrent que les cellules d’HBL modifient leur phénotype et activent des mécanismes de survie et de prolifération pour former des nodules tumoraux structurés et vascularisés au sein de la CAM. Le traitement des cellules par le cisplatine conduit à un arrêt net de la progression tumorale.La seconde partie présente les résultats concernant la régulation de la β-caténine et des processus oncogéniques par les microARNs dans les cellules d’HBL. Un crible fonctionnel m’a permis d’identifier plusieurs microARNs ayant un effet inhibiteur sur la β-caténine. Quatre microARNs, sous-exprimés dans les tumeurs de patients, bloquent la prolifération cellulaire et l’activité de la voie Wnt in vitro. Le miARN le plus efficace interagit avec l’ARNm de la β-caténine via un site unique localisé dans sa région 3’ non traduite et bloque la croissance des tumeurs d’HBL sur la CAM.Durant ma thèse j’ai développé un nouveau modèle animal d’étude de l’HBL qui permet de modéliser la croissance tumorale et de tester l’impact de molécules thérapeutiques. Ce travail a également permis d’identifier de nouveaux microARNs sous-exprimés dans les tumeurs d’HBL, qui inhibent l’expression de la β-caténine et agissent comme des gènes suppresseurs de tumeur. Ces microARNs constituent de potentielles nouvelles molécules thérapeutiques dans le traitement de l’HBL et pourraient aussi être utilisés comme des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques. / Hepatoblastoma (HBL) is the most common pediatric liver cancer. At molecular level it is characterized by activating mutations in β-catenin gene (CTNNB1) that cause protein accumulation and abnormal Wnt signaling pathway activation leading to malignant transformation of hepatic cells. Therefore, β-catenin is a key therapeutic target in HBL.This manuscript describes two major parts of my thesis project that aimed to understand the role of β-catenin-regulating microRNAs in HBL carcinogenesis.The first part presents the development of a new in vivo HBL model. This work consisted of making HBL-derived cells xenograft on chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) and studying tumor development using histological and molecular approaches. My results show that HBL cells implanted on CAM modify their phenotype and activate survival and proliferation mechanisms to form organized and vascularized tumor nodules. Cell treatment with cisplatin leads to tumor progression arrest.The second part presents results concerning the regulation of β-catenin and oncogenic processes by microRNAs in HBL cells. A functional screening allowed me to identify several microRNAs with an inhibitory effect on β-catenin. Four microRNAs down-regulated in patient tumors inhibit cell proliferation and Wnt pathway activity in vitro. The most efficient microRNA directly interacts with β-catenin mRNA through a unique site localized in 3’ untranslated region and blocks HBL tumor growth on CAM.During my thesis I developed a new animal model to study HBL that allows modelling rapid tumor growth and testing the impact of therapeutic molecules. My work also led to the identification of new microRNAs down-regulated in HBL tumors that inhibit β-catenin expression and act as tumor suppressor genes. Those microRNAs represent new potential therapeutic molecules for HBL treatment and could be also used as diagnostic and prognostic biomarkers.

[ES] El alcohol es una de las drogas más aceptadas y consumidas a nivel mundial, y su ingesta crónica causa alteraciones en el sistema nervioso central, desde desmielinización hasta muerte neural. Se ha demostrado que gran parte de estos efectos estarían mediados por la activación del sistema inmune innato, principalmente a través del receptor TLR4, que desemboca en un estado inflamatorio. Para ahondar en estos mecanismos, en esta tesis se pretende analizar si el consumo crónico de etanol puede causar modificaciones en los miARNs de la corteza cerebral, regulando la expresión de genes proinflamatorios asociados a la ruta de señalización del TLR4 y si el uso de la curcumina como terapia es capaz de disminuir estos efectos. Además, analizaremos si el consumo de alcohol a largo plazo es capaz de alterar la microbiota intestinal, y la implicación del TLR4 en estos procesos. Nuestros resultados demuestran que el etanol es capaz de alterar la expresión de diferentes microARNs que regulan la expresión de genes proinflamatorios y asociados a la vía del TLR4. La ausencia del receptor causa un perfil de expresión distinto tanto en los controles como en los animales alcohólicos crónicos. Puesto que en los últimos años nos hemos interesado en la búsqueda de una posible terapia para paliar la neuroinflamación producida por el etanol, hemos usado el BDMC, un curcuminoide con capacidad antiinflamatoria y antioxidante, para revertir los daños causados por el abuso del alcohol. Para su administración proponemos su conjugación con un polipéptido que elimina los tradicionales problemas asociados al uso de estos compuestos naturales como son su vida media corta y su baja biodisponibilidad, sin que hayamos registrado toxicidad. El uso de este polímero en animales con un consumo crónico de etanol produce una disminución de la inflamación, tanto a nivel proteico como de expresión génica. Considerando que otra de las regiones del organismo más afectadas por el alcohol es el tracto gastrointestinal, y que la población bacteriana puede ser modificada en determinadas enfermedades o por el uso de sustancias nocivas, produciendo una disbiosis, hemos comparado el efecto del alcohol sobre la población bacteriana y la participación del receptor TLR4 en estos efectos. Mediante análisis de expresión génica, confirmamos que el tejido intestinal ausente del receptor TLR4 es menos susceptible de sufrir cambios debidos al consumo de alcohol. Sin embargo, no hemos encontrado en estos animales la expresión aumentada de genes proinflamatorios característica de los tratamientos alcohólicos. Además, los ratones carentes de este receptor presentan una microbiota intestinal única y diferente a la encontrada en animales de genotipo normal, con sus propios cambios en el equilibrio bacteriano en respuesta a la ingesta de alcohol. Esta microbiota presenta menor cantidad de especies Gram - y mayor resistencia al desequilibrio ocasionado por el alcohol, que su contraparte en los ratones WT. En general, los resultados científicos que aparecen en esta tesis resaltan el papel del TLR4 en las alteraciones causadas por el consumo crónico de alcohol. Mostramos como cambios causados por el etanol a niveles tan distintos como la regulación mediante miARNs o la microbiota intestinal dependen en gran medida de la respuesta inicial que causa el alcohol en el TLR4. Dado que es un receptor necesario para el correcto funcionamiento de muchos órganos, planteamos un posible tratamiento mediante la inhibición de esta cascada inflamatoria. / [CA] L'alcohol és una de les drogues més acceptades i consumides a nivell mundial, i la seva ingesta crònica causa alteracions al sistema nerviós central, des de desmielinització fins a mort neural. S'ha demostrat que gran part d'aquests efectes estarien intervinguts per l'activació del sistema immune innat, principalment a través del receptor TLR4, que desemboca en un estat inflamatori. Per aprofundir en aquests mecanismes, en aquesta tesi es pretén analitzar si el consum crònic d'etanol pot causar modificacions als miARNs de l'escorça cerebral, regulant l'expressió de gens proinflamatoris associats a la ruta de senyalització del TLR4 i si l'ús de la curcumina com a teràpia és capaç de disminuir aquests efectes. A més, analitzarem si el consum d'alcohol a llarg termini és capaç d'alterar la microbiota intestinal i la implicació del TLR4 en aquests processos. Els nostres resultats demostren que l'etanol pot alterar l'expressió de diferents microARNs que regulen l'expressió de gens proinflamatoris i associats a la via del TLR4. L'absència del receptor causa un perfil d'expressió diferent tant als controls com als animals alcohòlics crònics. Com que els darrers anys ens hem interessat en trobar una possible teràpia per pal·liar la neuroinflamació produïda per l'etanol, hem utilizat el BDMC, un curcuminoide amb capacitat antiinflamatòria i antioxidant, per revertir els danys causats per l'abús de l'alcohol. Per a la seva administració proposem la seva conjugació amb un polipèptid que elimina els problemes tradicionals associats a l'ús d'aquests compostos naturals com són la seva vida mitjana curta i la seva baixa biodisponibilitat, sense que haguem registrat toxicitat. L¿ús d¿aquest polímer en animals amb un consum crònic d¿etanol produeix una disminució de la inflamació, tant a nivell proteic com d¿expressió gènica. Considerant que una altra de les regions de l'organisme més afectades per l'alcohol és el tracte gastrointestinal, i que la població bacteriana pot ser modificada en determinades malalties o per l'ús de substàncies nocives, produint una disbiosi, hem comparat l'efecte de l'alcohol sobre la població bacteriana i la participació del receptor TLR4 en aquests efectes. Mitjançant una anàlisi d'expressió gènica, confirmem que el teixit intestinal absent del receptor TLR4 és menys susceptible de patir canvis deguts al consum d'alcohol. Tot i això, no hem trobat en aquests animals l'expressió augmentada de gens proinflamatoris característica dels tractaments alcohòlics. A més, els ratolins sense aquest receptor presenten una microbiota intestinal única i diferent de la trobada en animals de genotip normal, amb els seus propis canvis en l'equilibri bacterià en resposta a la ingesta d'alcohol. Aquesta microbiota presenta menor quantitat d'espècies Gram - i més resistència al desequilibri ocasionat per l'alcohol, que la contrapart en els ratolins WT. En general, els resultats científics que apareixen en aquesta tesi ressalten el paper del TLR4 a les alteracions causades pel consum crònic d'alcohol. Mostrem com a canvis causats per l'etanol a nivells tan diferents com la regulació mitjançant miARNs o la microbiota intestinal depenen en gran mesura de la resposta inicial que causa l'alcohol al TLR4. Atès que és un receptor necessari per al funcionament correcte de molts òrgans, plantegem un possible tractament mitjançant la inhibició d'aquesta cascada inflamatòria. / [EN] Alcohol is one of the most accepted and consumed drugs worldwide, and its chronic consumption causes alterations in the central nervous system, such as demyelination and neural death. It has been shown that these effects would be mediated by the activation of the innate immune system, mainly through the TLR4 receptor, which leads to an inflammatory response. To inquire into these mechanisms, this thesis aims to analyse whether chronic ethanol consumption can cause changes in miRNAs in the cerebral cortex, regulating the expression of proinflammatory genes associated with the TLR4 signalling pathway, and whether the use of curcumin as a therapy it is able to reduce these effects. In addition, we will analyse if long-term alcohol consumption can alter the intestinal microbiota, and the involvement of TLR4 in these processes. Our results show that ethanol can alter the expression of different microRNAs that regulate the expression of proinflammatory genes associated with the TLR4 pathway. The absence of this receptor causes a different expression profile in both controls and chronic alcoholic animals. Taking into account our interest in seeking a possible therapy to alleviate the neuroinflammation caused by ethanol, we have used BDMC, a curcuminoid with anti-inflammatory and antioxidant activity, to ameliorate the damage caused by alcohol abuse. For its administration, we propose its conjugation with a polypeptide that eliminates the traditional problems associated with the use of these natural compounds, such as their short half-life and low bioavailability, with no toxicity recorded. The use of this polymer in animals with chronic ethanol consumption produces a decrease in inflammation, at both protein level and gene expression. Considering that another of the regions of the body most affected by alcohol is the gastrointestinal tract, and that bacterial population can be modified in certain diseases or due to harmful substances, producing dysbiosis, we have compared the effect of alcohol on the bacterial population and the participation of the TLR4 receptor in these effects. Using gene expression analysis, we confirm that intestinal tissue without TLR4 receptor show less changes induced by the alcohol consumption. However, we have not found in these animals an increased expression of proinflammatory genes which are observed in alcoholic treatments. In addition, mice lacking this receptor have a unique intestinal microbiota, which is different from the normal genotype animals, with their own changes in bacterial balance in response to alcohol intake. This microbiota has less Gram - species and greater resistance to imbalance caused by alcohol than its counterpart in WT mice. In general, the results of this thesis highlight the role of TLR4 in the alterations caused by chronic alcohol consumption. We show that ethanol can cause changes at different levels, such as regulation of miRNAs or intestinal microbiota, which largely depend on the TLR4 activation induced by ethanol. Therefore, herein we demonstrate the importance of the TLR4 to the correct activity of several body organs, and we propose a possible treatment by inhibiting its inflammatory cascade. / Cuesta Díaz, CM. (2022). Papel de los receptores TLR4 y de la microbiota intestinal en los procesos inflamatorios y neuroinflamatorios causados por el consumo crónico de alcohol, y posibles terapias con curcuminoides [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/183832