No description available.

Microcosms were used in this research to assess the environmental risk associated with two types of stressors: genetically-engineered microorganisms (GEMs) and toxic chemicals. Approaches used to evaluate the potential environmental impact of these two stressors are fundamentally different, and arise mainly from the fact that the GEMs are living and capable of replication. Risk assessment for genetically-engineered Erwinia carotovora strain L-864 included investigations of its persistence and effect on structure and function of aquatic microcosms. Densities of genetically-engineered and wild type E. carotovora declined at the same rate in water or in sediment, falling in 32 days below the level of detection by viable counts. Selective media, antibiotic resistance, and most probable number analysis were used to enumerate genetically-engineered E. carotovora in environmental samples. This technique was able to detect as few as 1 to 10 target cells/10 g soil. In thermally-perturbed aquatic microcosms, genetically-engineered E. carotovora persisted significantly longer than in unperturbed microcosms, suggesting the vulnerability of stressed ecosystems to colonization by GEMs. Competition study showed that the genetically-engineered E. carotovora did not displace the wild type strain. Effects of genetically-engineered and wild type strain on indigenous bacteria belonging to specific functional groups important in nutrient cycling were similar: inoculation of either strain caused a temporary increase in densities of total and proteolytic bacteria, while it did not affect amylolytic and pectolytic bacteria. Treatment with engineered bacteria did not change biomass values of the receiving community, but caused a transitory increase in its metabolic activity. The inability of genetically-engineered E. carotovora to persist, displace resident species, and affect metabolic activity of a community indicates a low risk of adverse ecological effects in aquatic systems. Microcosms were also used to assess environmental risk for toxic chemicals. A study was conducted to assess the fate of sediment-associated copper and to investigate its effects on the structure and function of the aquatic community. Most of the added copper was bound to sediment particles. In microcosms containing 100 µg Cu/kg sediment, chlorophyll a content and respiration significantly decreased compared to the control. Addition of 1000 µg Cu/kg sediment caused a decrease in production, respiration, respiration/biomass ratio, ATP, and chlorophyll a. The last study compared responses of Simocephalus exspinosus (Daphniidae) to copper during a single-species test to responses of S. exspinosus populations in a microcosm test. Responses of S. exspinosus were similar in both test systems: there was an increased production of young at 30-46 µg Cu/l, while the organisms did not survive exposure to concentrations > 100 µg Cu/l. In these studies, microcosms showed a potential to predict fate and effects of chemical and biological contaminants released into the biosphere. / Ph. D.

Cystic fibrosis (CF) is a fatal, incurable genetic disease that affects over 30,000 people in the United States alone. People with this disease have a homozygous mutation in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) which causes defects in chloride transport and leads to build up of mucus in the lungs and disruption of function in various organs. CF patients often suffer from chronic bacterial infections within the lungs, wherein the bacteria persist as a biofilm, leading to poor prognosis. Two of these pathogens, <i>Stenotrophomonas maltophilia</i> and <i>Pseudomonas aeruginosa</i>, are often found in the lungs of patients with CF and are an increasing medical concerns due to their intrinsic antimicrobial resistance. Both species can readily form biofilms on biotic and abiotic surfaces such as intravascular devices, glass, plastic, and host tissue. Biofilm formation starts with bacterial attachment to a surface and/or adjacent cells, initiating the acute infection stage. Chronic, long-term infection involves subsequent or concurrent altered genetic regulation, including a downregulation of virulence factors, resulting in the bacteria committing to a sessile lifestyle, markedly different from the planktonic one. Many of these genetic switches from an acute to chronic lifestyle are due to pressures from the host immune system and lead to permanently mutated strains, most likely an adaptive strategy to evade host immune responses. Biofilms are extremely problematic in a clinical setting because they lead to nosocomial infections and persist inside the host causing long-term chronic infections due to their heightened tolerance to almost all antibiotics. Understanding the genetic networks governing biofilm initiation and maintenance would greatly reduce consequences for CF and other biofilm-related infections and could lead to the development of treatments and cures for affected patients. This study showed that in<i> S. maltophilia</i>, isogenic deletion of phosphoglycerate mutase (<i>gpmA</i>) and two chaperone-usher pilin subunits, <i>S. maltophilia</i> fimbrae-1 (<i>smf-1</i>) and<i> cblA</i>, lead to defects in attachment on abiotic surfaces and cystic fibrosis derived bronchial epithelial cells (CFBE). Furthermore, Δ<i>smf-1</i> and Δ<i>cblA</i> showed defects in long-term biofilm formation, mimicking that of a chronic infection lifestyle, on abiotic surfaces and CFBE as well as stimulating less of an immune response through TNF-α production. This study also showed that in <i>P. aeruginosa</i>, the Type III secretion system (T3SS), an important virulence factor activated during the acute stage of infection, is downregulated when <i>polB</i>, a stress-induced alternate DNA polymerase, is overexpressed. This downregulation is due to post-transcriptional inhibition of the master regulatory protein, ExsA. Taken together, this project highlights important genes involved in the acute and chronic infection lifestyle and biofilm formation in <i>S. maltophilia</i> and genetic switches during the acute infection lifestyle in <i>P. aeruginosa</i>.

Os fungos endofíticos têm sido reconhecidos pela sua grande importância para as plantas hospedeiras, pois podem conferir proteção contra insetos herbívoros e patógenos, promover o crescimento vegetal, além de produzir metabólitos secundários com atividades biológicas diversas, entre outros. A cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância social e econômica no Brasil, especialmente para o estado de São Paulo. Ultimamente esta cultura vem recebendo especial atenção devido ao crescente aumento da demanda de matéria prima, principalmente em função do acréscimo no consumo de etanol como biocombustível. Fungos do gênero Penicillium habitam os tecidos e a rizosfera de cana-de-açúcar, onde podem estabelecer associações mutualísticas com a planta e conferir diversos benefícios. Dentro deste contexto, estudos que avaliem a interação de Penicillium spp. com cana-de-açúcar são bastante promissores para geração de conhecimentos que auxiliem na otimização da agricultura. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivos a avaliação do potencial biotecnológico dos endofíticos de raiz e da rizosfera, do gênero Penicillium, pertencentes à comunidade fúngica de cana-de-açúcar, por meio de ensaios de antagonismo, produção de enzimas, solubilização de fosfato inorgânico e produção de ácido indol acético; assim como o estudo da interação de um isolado de P. pinophilum com cana-de-açúcar a partir do desenvolvimento de um sistema de transformação genética mediada pela bactéria Agrobacterium tumefaciens. Tanto a análise da atividade antimicrobiana como a produção de metabólitos apresentaram extensa variação fisiológica entre os isolados avaliados. Um isolado da espécie P. pinophilum (linhagem 44) foi escolhido para ser usado na transformação genética por mostrar-se superior estatisticamente em relação aos demais isolados nos ensaios anteriores. Para aumento da eficiência deste sistema de transformação foram avaliados diferentes parâmetros, dentre eles: tempo de co-cultivo (24 e 48 horas), concentração do indutor acetoseringona (200 M e 400 M) e tipos de membrana (papel filtro e náilon). O sistema de agrotransformação apresentou alta eficiência (482 transformantes por 107 conídios), gerando uma elevada quantidade de transformantes resistentes à higromicina B e expressando GFP. Dentre os parâmetros avaliados, a combinação que deu origem aos melhores resultados de transformação envolveu o co-cultivo por 48 horas sobre membrana de náilon, em meio de cultura contendo 200 M de acetoseringona. A interação fungo-planta foi avaliada a partir da inoculação de P. pinophilum linhagem selvagem e transformantes, em plântulas de cana-de-açúcar, seguida da análise por microscopia óptica de epifluorescência e reisolamento. Os resultados revelaram a natureza não patogênica desse fungo, uma vez que ele foi capaz de colonizar endofiticamente cana-de-açúcar e persistir nas raízes desta planta, sem levar ao desenvolvimento de qualquer sintoma de doença. Além disso, os ensaios de agrotransformação deram origem a uma biblioteca com mil e cem transformantes insercionais, o que constitui uma ferramenta importante para o estudo molecular do metabolismo secundário desse fungo endofítico e poderá contribuir para o entendimento da interação do complexo fungo-cana-de-açúcar, possibilitando no futuro a sua aplicação no melhoramento vegetal e exploração do seu potencial biotecnológico. / Endophytic fungi have been recognized for its great importance for the host plants, they may provide protection against herbivores and pathogens, promote plant growth, and produce secondary metabolites with biological activity, among other benefits. Sugarcane is a socially and economically important crop in Brazil, especially for the state of São Paulo. Lately, this culture has received special attention due to the growing demand for raw materials, mainly due to the increase in consumption of ethanol as a biofuel. Fungi Penicillium inhabit the tissues and rhizosphere of sugarcane, where they can establish mutualistic associations with the plant and provide several benefits. Within this context, studies evaluating the interaction of Penicillium spp. with sugar cane are very promising to generate knowledge in order to assist in the agriculture optimization. Thus, this study aimed to evaluate the biotechnological potential of endophytic Penicillium from root and rhizosphere, belonging to the fungal community of sugarcane, through tests of antagonism, enzyme production, solubilization of inorganic phosphate and indole acetic acid production, as well as studying the interaction of an isolate of P. pinophilum with sugarcane using the development of a system for genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Both the analysis of antimicrobial activity and the production of metabolites showed extensive physiological variation among isolates. An isolate of the species P. pinophilum (strain 44) was chosen to be used in genetic transformation for being statistically superior than the other strains in previous trials. Different parameters were evaluated to increase the efficiency of this transformation system, among them: co-culture time (24 and 48 hours), concentration of the inducer acetosyringone (200 µM and 400 µM) and types of membrane (filter paper and nylon). Agrotransformation system showed high efficiency, generating a high amount of hygromycin B resistant transformants that expressed GFP. Among the factors evaluated, the combination that showed the best results involved the transformation with a co-cultivation for 48 hours on a nylon membrane, in culture medium containing 200 µM of acetosyringone. The plant-fungus interaction was assessed from the inoculation of wild type and transformants P. pinophilum in seedlings of sugarcane followed by analysis by epifluorescence microscopy and reisolation. Results revealed the non-pathogenic nature of this fungus, since it was capable of endophytically colonize sugarcane and persisted in the roots of this plant, without developing any symptoms of illness. In addition, agrotransformation tests gave rise to a library with a thousand and one hundred insertional transformants, which is an important tool for molecular study of secondary metabolism of endophytic fungus, and may contribute to the comprehension of the complex interaction of fungus-sugarcane, allowing its future application in plant breeding and exploitation of their biotechnological potential.

A micologia marinha é uma ciência relativamente recente e pouco se conhece sobre a diversidade das suas comunidades. Assim, o isolamento, triagem e preservação de fungos derivados do mar podem levar à descoberta de novas tecnologias. O objetivo deste estudo foi conhecer a diversidade de fungos filamentosos derivados marinhos e selecionar isolados capazes de produzir enzimas celulolíticas. Para tanto, foram isolados seletivamente fungos filamentosos a partir de amostras de macro-organismos marinhos coletados em 2007 e 2008. Os resultados demonstraram uma ampla diversidade de fungos potencialmente celulolíticos, pertencentes ao filo Basidiomycota e Ascomycota. Nos experimentos de produção de celulases, 17 apresentaram resultados satisfatórios de CMCase e FPase e foram selecionados para a avaliação da Celobiase. Os experimentos de cinética enzimática apresentaram os melhores resultados de produção de celulases em meio contendo farelo de trigo. O trabalho demonstra o potencial para aplicação biotecnológica dos fungos e estimula novos estudos com as celulases. / The Marine mycology is a relatively recent and little is known about the diversity of its communities. Thus, the isolation, separation and preservation of fungi derived from the sea can lead to the discovery of new technologies. The aim of this study was the diversity of filamentous fungi isolates derived marine and select capable of producing cellulolytic enzymes. It had been selectively isolated filamentous fungi from samples of marine macro-organisms collected in 2007 and 2008. The results showed a wide range of potential cellulolytic fungi, belonging to the phylum Basidiomycota and Ascomycota. In the experiments to produce cellulases, 17 had satisfactory results of CMCase and FPase and were selected for evaluation of cellobiase. The enzyme kinetics experiments showed better results for the production of cellulases in a medium containing wheat bran. The work demonstrates the potential for biotechnological application of fungi and stimulate further research with cellulases.

Com o objetivo de se caracterizar o processo de recombinação somática em Trichoderma pseudokoningii foram feitos cruzamentos via anastomose de hifas entre duas linhagens contrastantes para quatro marcadores de auxotrofia, coloração dos conídios e marcadores de RAPD. Foram feitos quatro cruzamentos, sendo analisados um total de 1052 colônias obtidas a partir de suspensões de conídios provenientes das colônias heterocarióticas. Sessenta e oito colônias recombinantes foram analisadas quanto às marcas de auxotrofia em quatro gerações de crescimento, sendo observado que 58 mantiveram o fenótipo recombinante, enquanto que as colônias restantes reverteram para um dos parentais. A maioria das colônias recombinantes se mostrou instável. Entretanto, após 4 gerações de crescimento estas colônias se tornaram estáveis para as marcas de auxotrofia avaliadas. As colônias recombinantes instáveis apresentaram bordas de crescimento irregular, esporulação esparsa e a freqüente formação de setores. Estas colônias recombinantes foram analisadas quanto aos marcadores RAPD, tendo mostrado grande similaridade, em relação ao perfil de bandas apresentado, com a maioria dos primers analisados. Somente com um primer foi possível visualizar a presença de uma banda polimórfica entre os recombinantes e a presença de bandas nos parentais não existentes em alguns recombinantes. Cinco colônias recombinantes foram analisadas quanto ao perfil de bandas cromossomais (PFGE), tendo sido observado que 2 colônias apresentaram padrões cromossomais igual a um dos parentais e 3 colônias apresentaram padrões recombinantes. Nos estudos citológicos verificou-se a formação de conídios uninucleados na conidiogênese, e a presença de conídios verdes maduros multinucleados, devido a prováveis divisões nucleares durante o processo de maturação dos conídios. Observou-se durante a formação dos heterocários a ocorrência de anastomoses e a passagem de núcleos, tendo sido observado a presença de núcleos com várias conformações, sugerindo um movimento ativo dos mesmos. Os resultados acima sugerem a ocorrência de mecanismos de recombinação no heterocário (recombinação somática), diferentes daqueles descritos para o ciclo parassexual ou parameiose, sendo proposto a ocorrência da degradação, no heterocário, dos núcleos de um dos parentais envolvidos nos cruzamentos (parental não prevalente) e a incorporação de segmentos destes em núcleos íntegros do parental prevalente. Se estes eventos realmente estiverem ocorrendo, sugere-se que estes sejam devido a possíveis reações limitadas de incompatibilidade vegetativa, ocasionando processos de lise e morte celular em algumas regiões do micélio heterocariótico. / To understand the somatic recombination process in Trichoderma pseudokoningii, auxotrophic complementary mutant strains were used to produce 4 heterokaryons. These strains were contrasting for four auxotrophic markers, conidia colors and for some RAPD markers. It was analyzed a total of 1052 colonies obtained from conidial suspensions of the heterokaryotic colonies. Stability of auxotrophic markers was evaluated in 68 recombinant colonies after four growing generations. In this analysis, 58 colonies kept the recombinant phenotype, while 10 reverted to one parental strain. Most of the recombinant colonies were initially unstable, but after at least 4 growing generations these recombinants became stable for auxotrophic markers. The unstable recombinant colonies showed irregular growing borders, sparse sporulation and frequent sector formation. The recombinant colonies were analyzed by RAPD technique. These colonies showed high similarity for the most of used primers. However, one primer showed a polymorphic band and some recombinants missing bands observed in parental strains. Chromosomal band profile of 5 recombinants and two parental strains were analyzed by Pulsed Field Gel Electrophoresis technique (PFGE). Two recombinants showed parental profiles and 3 showed recombinant profiles, respectively. In cytological studies of the conidiogenesis was observed the formation of only uninucleated conidia. However, presence of multinucleated mature green conidia was evident, probably due to nuclear divisions in course of maturing process of the conidia. During the process of heterokaryotic mycelium formation was possible to observe the occurrence of anastomosis that showed nuclear transfer. The presence of nuclei in several conformations was observed at the different regions of the heterokaryon, suggesting an active movement. The results presented in this study suggest the occurrence of recombination mechanisms in the heterokayon (somatic recombination), different from those described in classic parasexual cycle or parameiosis. Thus, it was proposed that may occur during this recombinant process the degradation of nuclei from one parental (non-prevalent parental) in the heterokaryon, and that the resulting chromosomal fragments may be incorporated into whole nuclei of the another parental (prevalent parental). If this natural transformation is occurring during this recombination process could be suggested that this event is due to a limited incompatible vegetative reactions, generating cellular lyses and death in some regions of the heterokaryotic mycelium.

A transmissão de parasitas da malária por mosquitos vetores é dependente do desenvolvimento bem sucedido das formas infectantes de Plasmodium sp., especialmente os esporozoítas, que são as formas que infectam o hospedeiro vertebrado. A manipulação genética de mosquitos vetores tem sido uma estratégia alternativa na tentativa de controle da malária. Um componente extremamente importante desta estratégia é a escolha de uma molécula efetora capaz de reduzir a transmissão do patógeno. Microplusina é um peptídeo antimicrobiano rico em cisteína, originalmente descrito como um componente antimicrobiano da hemolinfa e dos ovos de carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Testes anteriores utilizando o modelo experimental mosquito Aedes aegypti infectado por Plasmodium gallinaceum mostraram que a microplusina é altamente tóxico para esporozoítas de Plasmodium gallinaceum em concentração relativamente baixa, sem apresentar toxicidade aos mosquitos vetores Aedes aegypti. Nosso objetivo foi analisar a expressão da microplusina e seu efeito na infecção de P. gallinaceum em mosquitos transgênicos. Obtivemos quatro linhagens através da integração de um transgene contendo a região promotora do gene da vitelogenina de Ae. aegypti, peptídeo sinal maltase-like I de Ae. aegypti e a sequência codificadora da microplusina (PMOS [3xP3-EGFP-AeVg Micro]). A atividade anti esporozoítas da microplusina expressa pelos mosquitos transgênicos mostrou diferença significante as linhagens. O desenho de novas moléculas utilizando como molde moléculas efetoras existentes e testadas, possibilitará o aperfeiçoamento da expressão de genes exógenos em mosquitos transgênicos, tornando-os refratários ao parasita. / Transmission of malaria parasites by mosquito vectors is dependent on the successful development of Plasmodium sp. infective forms, particularly the sporozoites, which are the forms that enter the vertebrate host. The genetic manipulation of mosquito vectors has been a strategy for malaria control. An extremely important component of this strategy is the effector molecule of choice which reduces parasite transmission. Microplusin is a cysteine-rich antimicrobial peptide originally described as an hemolymph and eggs antimicrobial component of the cattle tick Boophilus microplus. Previous tests using the experimental model Plasmodium gallinaceum infected Aedes aegypti showed that microplusin is highly toxic to P. gallinaceum sporozoites in relatively low concentration, without showing toxicity to the mosquito vector A. aegypti. Our goal was to analyze transgenic mosquitoes expressing microplusin and its effect on infection of P. gallinaceum. We obtained four lines through the integration of transgene that containing the promoter region of the A. aegypti vitelogenin gene, the maltase-like I signal peptide of A. aegypti and microplusin coding sequence (pMos[3xP3-EGFPAeVg-Micro]). The activity anti sporozoites microplusin expressed by transgenic mosquitoes showed significant differences between strains. The design of effector molecules using information from existing and tested molecules as template will enable the improvement of the expression of foreign genes in transgenic mosquitoes, making them resistant to the parasite.

Os micoplasmas são os menores microrganismos capazes de autoreplicação conhecidos na natureza, responsáveis por uma série de doenças no homem e nos animais, infectando ainda plantas e insetos. Constituem um grande grupo de bactérias, ordenadas em diferentes gêneros na classe Mollicutes, cuja principal característica em comum, além do genoma reduzido, é a ausência de parede celular. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsável pela Pleuropneumonia Contagiosa Bovina, foi o primeiro microrganismo desta classe de bactérias a ser identificado. Esta é uma doença bastante grave, com altas taxas de morbidade e mortalidade. A variedade Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC é responsável principalmente por casos de Pleuropneumonia Contagiosa Caprina, mastite no gado bovino, e ainda artrite em ovinos e caprinos em menor extensão. M. capricolum é um patógeno caprino, responsável principalmente por casos de artrite com grande importância econômica na medicina veterinária. M. pulmonis é um patógeno de roedores, considerado como o melhor modelo experimental para o estudo das micoplasmoses respiratórias. M. genitalium, o menor microrganismo conhecido capaz de se autoreplicar, é um patógeno humano responsável por casos de uretrite não gonocócica, cujo seqüenciamento completo do cromossomo tornou-se um marco na era da genômica. O estudo funcional do genoma destes micoplasmas, para a compreensão de sua biologia e patogenicidade, requer o desenvolvimento de ferramentas genéticas eficientes. No presente trabalho, análises in silico das seqüências na região das prováveis origens de replicação cromossômica (oriC) destes micoplasmas demonstraram a existência de possíveis DnaA boxes localizados em torno do gene dnaA. Estas regiões oriC foram caracterizadas funcionalmente após sua clonagem em vetores artificiais e a transformação dos micoplasmas com os plasmídeos recombinantes resultantes. O plasmídeo pMPO1, contendo a região oriC de M. pulmonis, sofreu integração no cromossomo do micoplasma por recombinação homóloga após poucas passagens in vitro. A redução desta oriC para o fragmento contendo somente os DnaA boxes localizados nas estremidades 5´ou 3´do gene dnaA não foi capaz de produzir plasmídeos replicativos em M. pulmonis, exceto quando estes dois fragmentos foram clonados no mesmo vetor, espaçados pelo determinante de resistência à tetraciclina tetM. Um fragmento interno do gene da hemolisina A (hlyA) de M. pulmonis foi clonado nestes plasmídeos oriC, e os vetores resultantes foram utilizados para transformar o micoplasma. A integração destes vetores por um crossing-over com o gene hlyA, causando a sua dirupção, foi documentada. Deste modo, estes plasmídeos oriC podem vir a se tornar ferramentas genéticas valiosas para o estudo do papel de genes específicos, notadamente aqueles potencialmente envolvidos na patogênese. / Mycoplasmas are the smallest microorganisms capable of self replication known to date, responsible for many diseases in man and animals, infecting also plants and insects. They constitute a large group of bacteria, classified in different genera in the class Mollicutes, which main common characteristic, besides the small genome, is the absence of a cell wall. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsible for the Bovine Contagious Pleuropneumonia, was the first microorganism of this class of bacteria to be identified. That is a quite severe disease, with high morbidity and mortality rates. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC is responsible mainly for cases of Caprine Contagious Pleuropneumonia, mastitis in cattle, and also arthritis in goats and sheep in less extension. M. capricolum is a pathogen of goats, responsible mainly by cases of arthritis with large economic impact in veterinary medicine. M. pulmonis is a rodent pathogen, considered to be the best experimental model for studying respiratory mycoplasmoses. M. genitalium, the smallest microorganism capable of self replication, is an human pathogen responsible for cases of non gonococcal urethritis, which complete chromosome sequencing has become a benchmark in the era of genomics. Functional studies of these mycoplasma genomes, for comprehension of their biology and pathogenicity, requires the development of efficient genetic tools. In the present work, in silico analysis of sequences of the putative origin of chromosome replication (oriC) region of these mycoplasmas demonstrates the existence of putative DnaA boxes located around the dnaA gene. These oriC regions were functionally characterized after cloning into artificial vectors and transformation of mycoplasmas with the resulting recombinant plasmids. The plasmid pMPO1, which contains the M. pulmonis oriC region, has integrated into the mycoplasma chromosome by homologous recombination after a few in vitro passages. Reduction of this oriC to the fragment containing only the DnaA boxes located upstream or downstream the dnaA gene could not produce plasmids able to replicate in M. pulmonis, except when these two fragments were cloned in the same vector, spaced by tetracycline resistance gene tetM. An internal fragment of the M. pulmonis hemolysine A gene (hlyA) was cloned into these oriC plasmids, and the resulting vectors were used to transform the mycoplasma. Integration of these disruption vectors by one crossing-over with the hlyA gene could be documented. Therefore, these oriC plasmids may become valuable genetic tools for studying the role of specific genes of mycoplasmas, specially those potentially involved in pathogenesis.

Com o objetivo de se caracterizar o processo de recombinação somática em Trichoderma pseudokoningii foram feitos cruzamentos via anastomose de hifas entre duas linhagens contrastantes para quatro marcadores de auxotrofia, coloração dos conídios e marcadores de RAPD. Foram feitos quatro cruzamentos, sendo analisados um total de 1052 colônias obtidas a partir de suspensões de conídios provenientes das colônias heterocarióticas. Sessenta e oito colônias recombinantes foram analisadas quanto às marcas de auxotrofia em quatro gerações de crescimento, sendo observado que 58 mantiveram o fenótipo recombinante, enquanto que as colônias restantes reverteram para um dos parentais. A maioria das colônias recombinantes se mostrou instável. Entretanto, após 4 gerações de crescimento estas colônias se tornaram estáveis para as marcas de auxotrofia avaliadas. As colônias recombinantes instáveis apresentaram bordas de crescimento irregular, esporulação esparsa e a freqüente formação de setores. Estas colônias recombinantes foram analisadas quanto aos marcadores RAPD, tendo mostrado grande similaridade, em relação ao perfil de bandas apresentado, com a maioria dos primers analisados. Somente com um primer foi possível visualizar a presença de uma banda polimórfica entre os recombinantes e a presença de bandas nos parentais não existentes em alguns recombinantes. Cinco colônias recombinantes foram analisadas quanto ao perfil de bandas cromossomais (PFGE), tendo sido observado que 2 colônias apresentaram padrões cromossomais igual a um dos parentais e 3 colônias apresentaram padrões recombinantes. Nos estudos citológicos verificou-se a formação de conídios uninucleados na conidiogênese, e a presença de conídios verdes maduros multinucleados, devido a prováveis divisões nucleares durante o processo de maturação dos conídios. Observou-se durante a formação dos heterocários a ocorrência de anastomoses e a passagem de núcleos, tendo sido observado a presença de núcleos com várias conformações, sugerindo um movimento ativo dos mesmos. Os resultados acima sugerem a ocorrência de mecanismos de recombinação no heterocário (recombinação somática), diferentes daqueles descritos para o ciclo parassexual ou parameiose, sendo proposto a ocorrência da degradação, no heterocário, dos núcleos de um dos parentais envolvidos nos cruzamentos (parental não prevalente) e a incorporação de segmentos destes em núcleos íntegros do parental prevalente. Se estes eventos realmente estiverem ocorrendo, sugere-se que estes sejam devido a possíveis reações limitadas de incompatibilidade vegetativa, ocasionando processos de lise e morte celular em algumas regiões do micélio heterocariótico. / To understand the somatic recombination process in Trichoderma pseudokoningii, auxotrophic complementary mutant strains were used to produce 4 heterokaryons. These strains were contrasting for four auxotrophic markers, conidia colors and for some RAPD markers. It was analyzed a total of 1052 colonies obtained from conidial suspensions of the heterokaryotic colonies. Stability of auxotrophic markers was evaluated in 68 recombinant colonies after four growing generations. In this analysis, 58 colonies kept the recombinant phenotype, while 10 reverted to one parental strain. Most of the recombinant colonies were initially unstable, but after at least 4 growing generations these recombinants became stable for auxotrophic markers. The unstable recombinant colonies showed irregular growing borders, sparse sporulation and frequent sector formation. The recombinant colonies were analyzed by RAPD technique. These colonies showed high similarity for the most of used primers. However, one primer showed a polymorphic band and some recombinants missing bands observed in parental strains. Chromosomal band profile of 5 recombinants and two parental strains were analyzed by Pulsed Field Gel Electrophoresis technique (PFGE). Two recombinants showed parental profiles and 3 showed recombinant profiles, respectively. In cytological studies of the conidiogenesis was observed the formation of only uninucleated conidia. However, presence of multinucleated mature green conidia was evident, probably due to nuclear divisions in course of maturing process of the conidia. During the process of heterokaryotic mycelium formation was possible to observe the occurrence of anastomosis that showed nuclear transfer. The presence of nuclei in several conformations was observed at the different regions of the heterokaryon, suggesting an active movement. The results presented in this study suggest the occurrence of recombination mechanisms in the heterokayon (somatic recombination), different from those described in classic parasexual cycle or parameiosis. Thus, it was proposed that may occur during this recombinant process the degradation of nuclei from one parental (non-prevalent parental) in the heterokaryon, and that the resulting chromosomal fragments may be incorporated into whole nuclei of the another parental (prevalent parental). If this natural transformation is occurring during this recombination process could be suggested that this event is due to a limited incompatible vegetative reactions, generating cellular lyses and death in some regions of the heterokaryotic mycelium.

Os fungos endofíticos têm sido reconhecidos pela sua grande importância para as plantas hospedeiras, pois podem conferir proteção contra insetos herbívoros e patógenos, promover o crescimento vegetal, além de produzir metabólitos secundários com atividades biológicas diversas, entre outros. A cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância social e econômica no Brasil, especialmente para o estado de São Paulo. Ultimamente esta cultura vem recebendo especial atenção devido ao crescente aumento da demanda de matéria prima, principalmente em função do acréscimo no consumo de etanol como biocombustível. Fungos do gênero Penicillium habitam os tecidos e a rizosfera de cana-de-açúcar, onde podem estabelecer associações mutualísticas com a planta e conferir diversos benefícios. Dentro deste contexto, estudos que avaliem a interação de Penicillium spp. com cana-de-açúcar são bastante promissores para geração de conhecimentos que auxiliem na otimização da agricultura. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivos a avaliação do potencial biotecnológico dos endofíticos de raiz e da rizosfera, do gênero Penicillium, pertencentes à comunidade fúngica de cana-de-açúcar, por meio de ensaios de antagonismo, produção de enzimas, solubilização de fosfato inorgânico e produção de ácido indol acético; assim como o estudo da interação de um isolado de P. pinophilum com cana-de-açúcar a partir do desenvolvimento de um sistema de transformação genética mediada pela bactéria Agrobacterium tumefaciens. Tanto a análise da atividade antimicrobiana como a produção de metabólitos apresentaram extensa variação fisiológica entre os isolados avaliados. Um isolado da espécie P. pinophilum (linhagem 44) foi escolhido para ser usado na transformação genética por mostrar-se superior estatisticamente em relação aos demais isolados nos ensaios anteriores. Para aumento da eficiência deste sistema de transformação foram avaliados diferentes parâmetros, dentre eles: tempo de co-cultivo (24 e 48 horas), concentração do indutor acetoseringona (200 M e 400 M) e tipos de membrana (papel filtro e náilon). O sistema de agrotransformação apresentou alta eficiência (482 transformantes por 107 conídios), gerando uma elevada quantidade de transformantes resistentes à higromicina B e expressando GFP. Dentre os parâmetros avaliados, a combinação que deu origem aos melhores resultados de transformação envolveu o co-cultivo por 48 horas sobre membrana de náilon, em meio de cultura contendo 200 M de acetoseringona. A interação fungo-planta foi avaliada a partir da inoculação de P. pinophilum linhagem selvagem e transformantes, em plântulas de cana-de-açúcar, seguida da análise por microscopia óptica de epifluorescência e reisolamento. Os resultados revelaram a natureza não patogênica desse fungo, uma vez que ele foi capaz de colonizar endofiticamente cana-de-açúcar e persistir nas raízes desta planta, sem levar ao desenvolvimento de qualquer sintoma de doença. Além disso, os ensaios de agrotransformação deram origem a uma biblioteca com mil e cem transformantes insercionais, o que constitui uma ferramenta importante para o estudo molecular do metabolismo secundário desse fungo endofítico e poderá contribuir para o entendimento da interação do complexo fungo-cana-de-açúcar, possibilitando no futuro a sua aplicação no melhoramento vegetal e exploração do seu potencial biotecnológico. / Endophytic fungi have been recognized for its great importance for the host plants, they may provide protection against herbivores and pathogens, promote plant growth, and produce secondary metabolites with biological activity, among other benefits. Sugarcane is a socially and economically important crop in Brazil, especially for the state of São Paulo. Lately, this culture has received special attention due to the growing demand for raw materials, mainly due to the increase in consumption of ethanol as a biofuel. Fungi Penicillium inhabit the tissues and rhizosphere of sugarcane, where they can establish mutualistic associations with the plant and provide several benefits. Within this context, studies evaluating the interaction of Penicillium spp. with sugar cane are very promising to generate knowledge in order to assist in the agriculture optimization. Thus, this study aimed to evaluate the biotechnological potential of endophytic Penicillium from root and rhizosphere, belonging to the fungal community of sugarcane, through tests of antagonism, enzyme production, solubilization of inorganic phosphate and indole acetic acid production, as well as studying the interaction of an isolate of P. pinophilum with sugarcane using the development of a system for genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Both the analysis of antimicrobial activity and the production of metabolites showed extensive physiological variation among isolates. An isolate of the species P. pinophilum (strain 44) was chosen to be used in genetic transformation for being statistically superior than the other strains in previous trials. Different parameters were evaluated to increase the efficiency of this transformation system, among them: co-culture time (24 and 48 hours), concentration of the inducer acetosyringone (200 µM and 400 µM) and types of membrane (filter paper and nylon). Agrotransformation system showed high efficiency, generating a high amount of hygromycin B resistant transformants that expressed GFP. Among the factors evaluated, the combination that showed the best results involved the transformation with a co-cultivation for 48 hours on a nylon membrane, in culture medium containing 200 µM of acetosyringone. The plant-fungus interaction was assessed from the inoculation of wild type and transformants P. pinophilum in seedlings of sugarcane followed by analysis by epifluorescence microscopy and reisolation. Results revealed the non-pathogenic nature of this fungus, since it was capable of endophytically colonize sugarcane and persisted in the roots of this plant, without developing any symptoms of illness. In addition, agrotransformation tests gave rise to a library with a thousand and one hundred insertional transformants, which is an important tool for molecular study of secondary metabolism of endophytic fungus, and may contribute to the comprehension of the complex interaction of fungus-sugarcane, allowing its future application in plant breeding and exploitation of their biotechnological potential.