Atualmente observa-se que a proporção de pessoas com 60 anos ou mais está crescendo mais rápido do que a de outras faixas etárias. Um dos resultados desta transição epidemiológica é o aumento das doenças cujo fator de risco é o envelhecimento, entre elas, a doença de Parkinson. Embora muitas regiões exibam os sinais neuropatológicos da doença de Parkinson, a degeneração dos neurônios, contendo neuromelanina, da substância negra é considerada como sendo uma característica importante, representando o critério cardinal para o diagnóstico. No entanto, ainda não está claro por que certas regiões do cérebro, como a substância negra, são vulneráveis em algumas doenças neurodegenerativas e alguns neurônios vizinhos, às vezes morfologicamente indistinguíveis, permanecem preservados. Análises moleculares de populações de neurônios podem conduzir a uma melhor compreensão sobre a fisiologia dos mesmos, bem como os mecanismos envolvidos nos processos de doença. Na era pós genômica, realizar análises proteômicas são de grande interesse científico, pois permitem avanços no conhecimento dos processos biológicos. A técnica de microdissecção e captura a laser tem sido uma ferramenta importante e cada vez mais utilizada para aquisição de populações puras de células a partir de secções histológicas, evitando que áreas não pertencentes ao tecido alvo sejam dissecadas. A união destes métodos pode contribuir de maneira relevante para o entendimento fisiopatológico dos neurônios contendo neuromelanina da substância negra. No entanto, para que a microdissecção e captura a laser e as análises proteômicas sejam eficazes, é imprescindível a aplicação de um protocolo bem estruturado. Dentro desse contexto, o presente trabalho tem como objetivo criar um protocolo de microdissecção a laser de neurônios contendo neuromelanina em indivíduos cognitivamente normais, para subsequente análise proteômica. Os casos utilizados neste estudo são provenientes do Banco de Encéfalos Humanos do Grupo de Estudos em Envelhecimento Cerebral. Para o desenvolvimento da nossa proposta, contamos com a colaboração do Centro de Proteômica Médica da Universidade de Bochum, Alemanha. O protocolo foi desenvolvido baseado em outros previamente descritos na literatura e otimizado de acordo com objetivos pretendidos. Analisamos o plano anatômico de amostragem do tecido, o método de congelamento, a espessura do corte para a microdissecção, a solução utilizada para a coleta do tecido durante a microdissecção e o método de digestão proteolítica para posteriores análises proteômicas. Através de ensaios comparativos, alcançamos os resultados desejados e os mesmos foram validados através de análises por espectrometria de massas. Consequentemente, também fomos capazes de reconhecer fatores técnicos que possivelmente impossibilitariam um efetivo estudo do proteoma / Currently the worldwide proportion of people aged 60 years and over is growing faster than any other age group. This strikingly epidemiological transition results in an increase of aging related diseases, including Parkinson\'s disease (PD). Although many brain areas exhibit the neuropathological signs of Parkinson\'s disease, the degeneration of neuromelanin containing cells in the substantia nigra is considered a hallmark feature, representing cardinal diagnostic criteria for PD. However, why certain brain regions -- such as the substantia nigra -- are vulnerable in some neurodegenerative diseases, while some neighboring morphologically indistinguishable neurons remain preserved, is still unclear. Molecular analysis of specific neuronal populations can lead us to a better understanding about the physiological role played by these neurons and mechanisms involved in disease\'s processes. In a post-genomic era, proteomic analyses are of great scientific interest since they allow a better understanding of the biological processes. The laser capture microdissection technique has also became an important tool in biological research, being increasingly used for acquisition of pure populations of cells from histological sections, preventing the dissection of areas outside the target tissue. The combination of these methods can significantly contribute to understand the pathophysiological role of the containing neuromelanin neurons of the substantia nigra. However, for an effective application of both techniques, laser capture microdissection and proteomic analysis, it is essential the application of an efficient protocol. In this context, this study aims to establish a protocol for laser microdissection of containing neuromelanin neurons in cognitively normal individuals for subsequent proteomic analyses. We selected cases from the Brain Bank of the Brazilian Aging Brain Study. A collaboration with the Medical Proteome Center, University of Bochum, Germany took part during the development of our proposal. Our protocol was developed based on previous published protocols and optimized according the intended aims. We analyzed anatomical planes for neuronal collection, freezing methods, thickness of tissue for microdissection sections, solution for tissue collection during laser microdissection and the proteolytic digestion methods. Through our comparative tests, we have achieved the desired results and validated them by mass spectrometry analyses. Consequently, we were also able to exclude technical factors that could possibly preclude one effective proteome analysis

O gênero Passiflora é o maior gênero da família Passifloraceae, que compreende mais de 500 espécies, a maioria originária de regiões neotropicais, sendo centenas distribuídas pela América Latina. Algumas dessas espécies apresentam importância econômica na produção de fruta in natura, suco concentrado, uso ornamental e medicinal com propriedades sedativas. Estudos do desenvolvimento reprodutivo e do fruto de espécies de Passiflora são fundamentais para melhor compreensão de aspectos do desenvolvimento que possam contribuir para a produção agronômica e compreensão da evolução de estruturas florais presentes em espécies desta família. A importância das sementes para a sua propagação, para estudos taxonômicos e a presença do arilo, estrutura de interesse fundamental para a comercialização de frutos e produção de suco em espécies desse gênero, estimulou a elaboração de um estudo comparativo entre duas espécies de interesse comercial, P. edulis e P alata, associando o estudo de características morfoanatômicas e moleculares. O presente projeto teve como objetivo caracterizar o desenvolvimento do embrião zigótico e arilo de Passiflora edulis Sims e Passiflora alata Curtis. Flores foram manualmente polinizadas e amostras coletadas periodicamente após a polinização, visando à obtenção de sementes em diferentes fases do desenvolvimento embrionário e do arilo. Primórdios do arilo são observados em pré-antese, quando o saco embrionário é organizado. Células epidérmicas na base do funículo sofrem divisões periclinais formando uma borda em torno da rafe. O desenvolvimento do primórdio do arilo é interrompido, observando-se a reativação de divisões celulares e o arilo recomeça o desenvolvimento em uma estrutura multicelular ao redor da semente em desenvolvimento. Aos 14 dias após a polinização o arilo já cobre dois terços da semente, crescendo rapidamente até a semente ser recoberta totalmente, desde o funículo, até o polo calazal. O endosperma é nuclear e seu desenvolvimento se inicia logo após a fertilização, através de divisões sucessivas, formando um sincício ao redor do proembrião, simultaneamente à diminuição tamanho do nucelo. A celularização do endosperma, com a deposição de paredes celulares é observada aproximadamente 20 dias após a polinização. A embriogênese se inicia com a primeira divisão do zigoto, observada aos 7 dias após a polinização. Essa primeira divisão é transversal dividindo o zigoto em duas células, assimetricamente. A célula apical sofre sucessivas divisões que levam a estádios subsequentes de desenvolvimento do embrião, tais como, 4-8 células, globular, coração e torpedo. Aproximadamente 30 dias após a polinização o embrião atinge o estádio cotiledonar e a partir de então apenas aumenta em tamanho consumindo o endosperma e ocupando seu espaço na semente. Essas observações permitiram que fossem definidos dois estádios específicos do desenvolvimento do arilo para futura captura por microdissecção a laser. A caracterização anatômica do desenvolvimento do embrião e do arilo em ambas as espécies subsidia o estabelecimento de estádios específicos do desenvolvimento que podem servir como alvos para estudos moleculares nessas espécies de Passiflora / Passiflora is the largest genus in Passifloraceae and most of the commercially used species develop an aril around the seed, which is commercially important for fresh fruit consumption, and concentrate juice. Reproductive developmental studies associating morphoanatomical and molecular characteristics are essential for a better understanding of particularities of this genus. The present project aimed to characterize the development of Passiflora edulis Sims and Passiflora alata Curtis zygotic embryo and aril. Pollination of flowers were done manually, fruits and ovaries were collected at regular intervals after pollination and processed for scanning and light microscopy, for analysis of embryos and aril in different stages of development. Aril primordium is observed in pre-anthesis when the embryo sac is organized. Epidermic cells at the base of the funiculus undergo periclinal divisions forming a rim surrounding the raphe. Aril development is arrested until after fertilization when cell divisions are reactivated and the aril resume development into a multicellular structure surrounding the developing seed from the funicle towards the chalazal end. At approximately 14 days after pollination the aril already covers two thirds of the seed, and grows rapidly until the whole seed is covered. The endosperm is nuclear and starts developing soon after fertilization through successive divisions forming a syncytium mostly at the chalazal region, and around the developing embryo, replacing the nucellus. Cell walls are formed and the endosperm begins cellularization approximately 20 days after pollination. Embryogenesis initiates with the first division of the zygote, approximately 7 days after pollination. This first cell division is transversal and asymmetrical; the apical cell undergoes successive divisions leading to the subsequent stages of embryo development such as 4- and 8-celled, globular, heart-shaped, torpedo. Approximately 30 days after pollination, the embryo reaches the cotyledonary stage and thereafter grows only in size, consuming the endosperm and occupying its space in the seed. The first division of the zygote was observed around seven days after pollination (DAP), with the mature embryo formed approximately 30 DAP. Initial development of the aril primordium is observed at the ovule basal region, before anthesis/pollination. Embryo and aril development occurs simultaneously. These observations allowed for the definition of two specific stages of aril development for laser-capture-microdissection and further molecular analysis aiming at the evaluation of the molecular basis of aril differentiation in Passiflora. The morphoanatomical characterization of embryo and aril development in these species will serve as a source of information for the definition of specific developmental stages, which can be targets for molecular studies in Passiflora

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1613.pdf: 2733672 bytes, checksum: 5d28936faff68884f2e78dbc12f2ebcb (MD5) Previous issue date: 2007-04-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / Chromosomes of distinct species of Triportheus (Characiformes, Characidae) from different hydrographic basins in Brazil, as well as in Argentina, were analyzed in the present work. Triportheus nematurus, from Piracicaba River (São Paulo State, Brazil), was analyzed for the first time, using conventional cytogenetic techniques, base-specific fluorochromes and physical mapping of 18S rDNA and 5S rDNA. The diploid number found in all species was 2n= 52 chromosomes, in both males and females. Females presented a pair of quite differentiated heteromorphic chromosomes, characterizing a ZZ/ZW sex chromosome system. The Z chromosome is the largest in the karyotype, bearing constitutive heterochromatin at pericentromeric and telomeric regions. The W chromosome is mostly heterochromatic, showing a heterogeneous heterochromatin, composed of GC- and AT-rich regions The Ag-NORs were equivalent to 18S rDNA sites detected through fluorescent in situ hybridization. The 5S rDNA is syntenic and adjacent to 18S rDNA site, characterizing an uncommon situation amongst fishes. The results obtained in T. nematurus agree with previous studies in this group, reinforcing the basal condition of the system ZZ/ZW in the phylogeny of this genus, prior to speciation events. Besides T. nematurus, other seven species/populations of Triportheus were analyzed by FISH with 18S and 5S rDNA probes. The results confirmed the presence of 18S sites on the W chromosome in all Triportheus species herein studied, even when Ag-NORs showed to be inactive. The 5S rDNA sites, not reported in this group so far, were always located on short arms of a single chromosomal pair, close to centromeres. The only exception was T. auritus, which presented ten 5S rDNA sites. Two distinct T. nematurus populations (Piracicaba River SP and Paraná River Argentina) presented synteny between 18S and 5S ribosomal genes, located on short arm of a NOR-bearing chromosomal pair. A probe for whole chromosome painting (WCP), specific to the Z chromosome of T. nematurus (Piracicaba River), was obtained by microdissection, followed by unspecific amplification via DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide Primed-PCR). Fluorescent in situ hybridization with such probe was performed in Triportheus species, as well as in other Characidae species belonging to genus closed to Triportheus. In male specimens of Triportheus, both Z chromosomes (1st large metacentric pair) presented conspicuous marks over their whole extension. In females, the Z chromosome showed the same pattern observed in males while the W chromosome bears only a subtle signal on the short arm, or on the long arm close to centromere, according to species. Therefore, the region of the W chromosome with homology to Z chromosome is relatively small. All the other Characidae species analyzed presented no positive signals after hybridization using Z chromosome of Tirportheus nematurus as a probe, even in those apparently closely related to this genus. Thus, these results stress out, positively, that the ZZ/ZW system should actually correspond to a synapomorphy shared by Triportheus species, likely to be unique to this Characidae group. / No presente estudo foram analisados os cromossomos de distintas espécies de Triportheus (Characiformes, Characidae), de diferentes bacias hidrográficas do Brasil, assim como da Argentina. Triportheus nematurus, proveniente do rio Piracicaba - SP, foi analisada pela primeira vez, utilizando técnicas de estudo convencionais, fluorocromos base-específicos e o mapeamento físico dos sitos de rDNA 18S e de rDNA 5S. O número diplóide encontrado foi de 2n=52 cromossomos, tanto em machos como em fêmeas. As fêmeas apresentaram um par de cromossomos heteromórficos bem diferenciados, caracterizando um sistema de cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW. O cromossomo Z é o maior do complemento, com a ocorrência de heterocromatina constitutiva nas regiões pericentromérica e teloméricas. O cromossomo W é em grande parte heterocromático, evidenciando heterocromatina heterogênea, composta por regiões GC- e AT-ricas. As Ag-RONs, em concordância com os sítios de rDNA 18S, detectados pela hibridação fluorescente in situ. O rDNA 5S, mostra uma localização sintênica e adjacente ao rDNA 18S, caracterizando uma situação pouco freqüente entre os peixes. Os resultados obtidos em T. nematurus concordam com estudos prévios nesse grupo, reforçando a condição basal do sistema ZZ/ZW na filogenia do gênero, provavelmente pré-datando os eventos de especiação. Além de T. nematurus, mais sete espécies/populações de Triportheus foram analisas por FISH com sondas de rDNA 18S e 5S. Os resultados confirmaram a presença de sítios 18S no cromossomo W em todas as espécies de Triportheus aqui analisadas, mesmo nos casos onde as Ag-RONs mostraram-se inativas. Os sítios de rDNA 5S, que ainda não tinham sido descritos para o grupo, encontram-se sempre localizados no braço curto de um só par de cromossomos, adjacentes ao centrômero. A única exceção ocorreu em T. auritus, que apresentou 10 sítios de rRNA 5S. Duas populações distintas de T. nematurus (rio Piracicaba SP e rio Paraná Argentina) apresentaram sintenia dos genes ribossomais no braço curto de um par cromossômico correspondente ao portador de Ag-RONs. Uma sonda para pintura cromossômica total (WCP - Whole Chromosome Painting), específica do cromossomo Z de T. nematurus (rio Piracicaba), foi obtida por intermédio de microdissecção, seguida por amplificação inespecífica por DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide Primed-PCR). Hibridações fluorescentes in situ, utilizando-se esta sonda, foram realizadas em espécies/populações de Triportheus, assim como em espécies de outros gêneros da família Characidae filogenticamente próximos de Triportheus. Nos espécimes machos de Triportheus, os dois cromossomos Z (1º par metacêntrico grande) apresentaram uma forte marcação em toda sua extensão. Nas fêmeas, o cromossomo Z (1o metacêntrico grande) mostra o mesmo padrão observado nos machos e o cromossomo W se apresenta apenas com sutil marcação no braço curto ou no braço longo, em uma região adjacente ao centrômero, conforme a espécie. Assim sendo, a região do cromossomo W que mantém homologia com o cromossomo Z é relativamente pequena, demonstrando a grande diferenciação desse cromossomo ao longo da evolução do sistema ZZ/ZW no grupo. Todas as demais espécies de Characidae testadas não apresentaram sinais positivos de hibridação com a sonda do cromossomo Z de Triportheus, mesmo sendo relativamente próximas desse gênero. Assim sendo, esses resultados reforçam, de modo mais positivo, que o sistema ZZ/ZW deve de fato corresponder à uma sinapomorfia entre as espécies de Triportheus, aparentemente exclusiva desse grupo de Characidae

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2828.pdf: 14647874 bytes, checksum: 8fb4ecaf07755c78ec51b1069a9943aa (MD5) Previous issue date: 2010-01-29 / Universidade Federal de Sao Carlos / Cyphocharax nagelii, Cyphocharax modestus, and Steindachnerina insculpta were the curimatid species analyzed in the present work. The objectives for all species were to identify sequences that could be used as chromosomal markers, to infer on the active mechanisms in their chromosomal evolution and of the family Curimatidae, and to determine indirectly the nucleotide composition of chromosomal regions. Additionally, the present work also aimed to analyze the B chromosome of C. nagelii, investigating the mitotic and meiotic behavior of this element and making inferences on its origins and evolution. The encountered diploid number was of 2n=54 with meta- and submetacentric chromosomes, corroborating the karyotypic macrostructure of the family Curimatidae. B chromosomes were detected in C. nagelii and analyses indicated that this element is potentially stable during mitosis. The presence of B chromosomes in other curimatid species suggests that this element represents an additional karyotypic differentiation mechanism. In the analyses of metaphase I cells of C. nagelii, the B chromosome behaved as a univalent, indicating possible segregation instability of this element. The C-banding technique evidenced heterochromatin blocks in the pericentromeric region of all chromosomes of the complement, as well as a few telomeric blocks, in the three studied species (B chromosomes in C. nagelii are heterochromatic). No chromosomal heteromorphisms regarding size, morphology, or C-banding pattern that could be associated with the presence of sex chromosomes were found in any of the three curimatid species. Microdissection of the B chromosome and consequent in situ hybridization with the produced probe showed that these elements share many mutual sequences, but the same does not occur with chromosomes of complement A of C. nagelii, C. modestus, or S. insculpta. The use of the base-specific CMA3/DAPI fluorochromes, silver nitrate staining, and 18S rDNA probes allowed the identification of 45S rDNA sites. These sites are present in an autossome pair in the three studied species, as well as in most curimatids. In C. nagelii and C. modestus, the 5S rDNA region is present in chromosome pairs 3 and 20; in S. insculpta only pair 3 contained the 5S rDNA gene. The presence of 5S rDNA in the third pair of the three described species points to a possible conserved location of this gene. A size difference was seen between the 5S rDNA sites, probably owing to the presence of two quantitavely different clusters of this ribosomal sequence. The B chromosomes of C. nagelii do not support 5S or 18S rDNA sequences and were not differentially marked by DAPI or CMA3. The hypothesis that karyotypic evolution in curimatids involves rearrangements of the centric fission/fusion and pericentric inversion type was suggested. Telomeric DNA sequences (TTAGGG)n were used in C. nagelii. The chromosomes of complement A as well as of complement B showed signs in the telomeric region. Furthermore, at least two autosome pairs exhibited telomeric sequences in an interstitial position, thus corroborating the hypothesis of centric fission/fusion evolution combined with pericentric inversion for the family Curimatidae. / Cyphocharax nagelii, Cyphocharax modestus e Steindachnerina insculpta, foram as espécies de curimatídeos analisadas no presente trabalho. Nas três espécies investigadas, os objetivos foram identificar sequências que pudessem ser usadas como marcadores cromossômicos, inferir sobre os mecanismos atuantes na evolução cromossômica destas espécies e paralelamente na família Curimatidae e ainda, determinar indiretamente a composição nucleotídica de regiões cromossômicas. Além disso, também foi objetivo do presente trabalho a análise do cromossomo B de C. nagelii, procurando investigar o comportamento mitótico e meiótico deste elemento e fazer inferências sobre sua origem e evolução. O número diplóide encontrado foi 2n=54 com cromossomos meta- ou submetacêntricos, corroborando a macroestrutura cariotípica da família Curimatidae. Foi detectada a presença de cromossomos B em C. nagelii, e as análises indicaram que este elemento seria mitoticamente estável. A presença de cromossomos B em outras espécies de curimatídeos sugere que este elemento represente um mecanismo de diferenciação cariotípica adicional. Nas análises de células metafásicas I de C. nagelii, o cromossomo B comportou-se como um univalente, indicando uma possível instabilidade segregacional desse elemento. A técnica de bandamento C, evidenciou blocos de heterocromatina na região pericentromérica de todos os cromossomos do complemento, e alguns blocos teloméricos, nas três espécies estudadas; os cromossomos B de C. nagelii são heterocromáticos. Nas três espécies de curimatídeos não foram encontrados heteromorfismos cromossômicos, quanto ao tamanho, morfologia ou padrão de bandamento C, que pudessem estar associados à presença de cromossomos sexuais. A microdissecção cromossômica do B e a conseqüente hibridação in situ com a sonda produzida, mostraram que estes elementos compartilham muitas seqüências entre si, mas, o mesmo não ocorre com os cromossomos do complemento A de C. nagelii ou de C. modestus e S. insculpta. O uso dos fluorocromos base-específicos CMA3/DAPI, impregnação por nitrato de prata e sondas de rDNA 18S, permitiram a identificação dos sítios de rDNA 45S. Estes sítios estão presentes em um par de autossomos nas três espécies estudadas, assim como na maioria dos curimatídeos. Em C. nagelii e em C. modestus a região de rDNA 5S, está presente nos pares cromossômicos 3 e 20; em S. insculpta apenas o par 3 continha o gene de rRNA 5S. A presença de rDNA 5S no par 3 das três espécies descritas, aponta para uma possível localização conservada desse gene. Foi constatada uma diferença de tamanho entre os sítios de rDNA 5S, devido provavelmente a presença de dois clusters quantitativamente diferentes desta seqüência ribossômica. Os cromossomos B de C. nagelii não comportam seqüências de rDNA 5S ou 18S e não foram marcados diferencialmente pelo DAPI ou CMA3. A hipótese de que a evolução cariotípica nos curimatídeos envolveria, rearranjos do tipo fissão/fusão cêntrica e inversão pericêntrica, foi sugerida. Seqüências de DNA telomérico (TTAGGG)n foram utilizadas em C. nagelii. Os cromossomos do complemento A, bem como os cromossomos B mostraram sinais na região telomérica. Além disso, pelo menos dois pares autossômicos mostraram seqüências teloméricas na posição intersticial, corroborando a hipótese de evolução por fissão/fusão cêntrica e inversão pericêntrica para família Curimatidae.

O gênero Passiflora é o maior gênero da família Passifloraceae, que compreende mais de 500 espécies, a maioria originária de regiões neotropicais, sendo centenas distribuídas pela América Latina. Algumas dessas espécies apresentam importância econômica na produção de fruta in natura, suco concentrado, uso ornamental e medicinal com propriedades sedativas. Estudos do desenvolvimento reprodutivo e do fruto de espécies de Passiflora são fundamentais para melhor compreensão de aspectos do desenvolvimento que possam contribuir para a produção agronômica e compreensão da evolução de estruturas florais presentes em espécies desta família. A importância das sementes para a sua propagação, para estudos taxonômicos e a presença do arilo, estrutura de interesse fundamental para a comercialização de frutos e produção de suco em espécies desse gênero, estimulou a elaboração de um estudo comparativo entre duas espécies de interesse comercial, P. edulis e P alata, associando o estudo de características morfoanatômicas e moleculares. O presente projeto teve como objetivo caracterizar o desenvolvimento do embrião zigótico e arilo de Passiflora edulis Sims e Passiflora alata Curtis. Flores foram manualmente polinizadas e amostras coletadas periodicamente após a polinização, visando à obtenção de sementes em diferentes fases do desenvolvimento embrionário e do arilo. Primórdios do arilo são observados em pré-antese, quando o saco embrionário é organizado. Células epidérmicas na base do funículo sofrem divisões periclinais formando uma borda em torno da rafe. O desenvolvimento do primórdio do arilo é interrompido, observando-se a reativação de divisões celulares e o arilo recomeça o desenvolvimento em uma estrutura multicelular ao redor da semente em desenvolvimento. Aos 14 dias após a polinização o arilo já cobre dois terços da semente, crescendo rapidamente até a semente ser recoberta totalmente, desde o funículo, até o polo calazal. O endosperma é nuclear e seu desenvolvimento se inicia logo após a fertilização, através de divisões sucessivas, formando um sincício ao redor do proembrião, simultaneamente à diminuição tamanho do nucelo. A celularização do endosperma, com a deposição de paredes celulares é observada aproximadamente 20 dias após a polinização. A embriogênese se inicia com a primeira divisão do zigoto, observada aos 7 dias após a polinização. Essa primeira divisão é transversal dividindo o zigoto em duas células, assimetricamente. A célula apical sofre sucessivas divisões que levam a estádios subsequentes de desenvolvimento do embrião, tais como, 4-8 células, globular, coração e torpedo. Aproximadamente 30 dias após a polinização o embrião atinge o estádio cotiledonar e a partir de então apenas aumenta em tamanho consumindo o endosperma e ocupando seu espaço na semente. Essas observações permitiram que fossem definidos dois estádios específicos do desenvolvimento do arilo para futura captura por microdissecção a laser. A caracterização anatômica do desenvolvimento do embrião e do arilo em ambas as espécies subsidia o estabelecimento de estádios específicos do desenvolvimento que podem servir como alvos para estudos moleculares nessas espécies de Passiflora / Passiflora is the largest genus in Passifloraceae and most of the commercially used species develop an aril around the seed, which is commercially important for fresh fruit consumption, and concentrate juice. Reproductive developmental studies associating morphoanatomical and molecular characteristics are essential for a better understanding of particularities of this genus. The present project aimed to characterize the development of Passiflora edulis Sims and Passiflora alata Curtis zygotic embryo and aril. Pollination of flowers were done manually, fruits and ovaries were collected at regular intervals after pollination and processed for scanning and light microscopy, for analysis of embryos and aril in different stages of development. Aril primordium is observed in pre-anthesis when the embryo sac is organized. Epidermic cells at the base of the funiculus undergo periclinal divisions forming a rim surrounding the raphe. Aril development is arrested until after fertilization when cell divisions are reactivated and the aril resume development into a multicellular structure surrounding the developing seed from the funicle towards the chalazal end. At approximately 14 days after pollination the aril already covers two thirds of the seed, and grows rapidly until the whole seed is covered. The endosperm is nuclear and starts developing soon after fertilization through successive divisions forming a syncytium mostly at the chalazal region, and around the developing embryo, replacing the nucellus. Cell walls are formed and the endosperm begins cellularization approximately 20 days after pollination. Embryogenesis initiates with the first division of the zygote, approximately 7 days after pollination. This first cell division is transversal and asymmetrical; the apical cell undergoes successive divisions leading to the subsequent stages of embryo development such as 4- and 8-celled, globular, heart-shaped, torpedo. Approximately 30 days after pollination, the embryo reaches the cotyledonary stage and thereafter grows only in size, consuming the endosperm and occupying its space in the seed. The first division of the zygote was observed around seven days after pollination (DAP), with the mature embryo formed approximately 30 DAP. Initial development of the aril primordium is observed at the ovule basal region, before anthesis/pollination. Embryo and aril development occurs simultaneously. These observations allowed for the definition of two specific stages of aril development for laser-capture-microdissection and further molecular analysis aiming at the evaluation of the molecular basis of aril differentiation in Passiflora. The morphoanatomical characterization of embryo and aril development in these species will serve as a source of information for the definition of specific developmental stages, which can be targets for molecular studies in Passiflora

Atualmente observa-se que a proporção de pessoas com 60 anos ou mais está crescendo mais rápido do que a de outras faixas etárias. Um dos resultados desta transição epidemiológica é o aumento das doenças cujo fator de risco é o envelhecimento, entre elas, a doença de Parkinson. Embora muitas regiões exibam os sinais neuropatológicos da doença de Parkinson, a degeneração dos neurônios, contendo neuromelanina, da substância negra é considerada como sendo uma característica importante, representando o critério cardinal para o diagnóstico. No entanto, ainda não está claro por que certas regiões do cérebro, como a substância negra, são vulneráveis em algumas doenças neurodegenerativas e alguns neurônios vizinhos, às vezes morfologicamente indistinguíveis, permanecem preservados. Análises moleculares de populações de neurônios podem conduzir a uma melhor compreensão sobre a fisiologia dos mesmos, bem como os mecanismos envolvidos nos processos de doença. Na era pós genômica, realizar análises proteômicas são de grande interesse científico, pois permitem avanços no conhecimento dos processos biológicos. A técnica de microdissecção e captura a laser tem sido uma ferramenta importante e cada vez mais utilizada para aquisição de populações puras de células a partir de secções histológicas, evitando que áreas não pertencentes ao tecido alvo sejam dissecadas. A união destes métodos pode contribuir de maneira relevante para o entendimento fisiopatológico dos neurônios contendo neuromelanina da substância negra. No entanto, para que a microdissecção e captura a laser e as análises proteômicas sejam eficazes, é imprescindível a aplicação de um protocolo bem estruturado. Dentro desse contexto, o presente trabalho tem como objetivo criar um protocolo de microdissecção a laser de neurônios contendo neuromelanina em indivíduos cognitivamente normais, para subsequente análise proteômica. Os casos utilizados neste estudo são provenientes do Banco de Encéfalos Humanos do Grupo de Estudos em Envelhecimento Cerebral. Para o desenvolvimento da nossa proposta, contamos com a colaboração do Centro de Proteômica Médica da Universidade de Bochum, Alemanha. O protocolo foi desenvolvido baseado em outros previamente descritos na literatura e otimizado de acordo com objetivos pretendidos. Analisamos o plano anatômico de amostragem do tecido, o método de congelamento, a espessura do corte para a microdissecção, a solução utilizada para a coleta do tecido durante a microdissecção e o método de digestão proteolítica para posteriores análises proteômicas. Através de ensaios comparativos, alcançamos os resultados desejados e os mesmos foram validados através de análises por espectrometria de massas. Consequentemente, também fomos capazes de reconhecer fatores técnicos que possivelmente impossibilitariam um efetivo estudo do proteoma / Currently the worldwide proportion of people aged 60 years and over is growing faster than any other age group. This strikingly epidemiological transition results in an increase of aging related diseases, including Parkinson\'s disease (PD). Although many brain areas exhibit the neuropathological signs of Parkinson\'s disease, the degeneration of neuromelanin containing cells in the substantia nigra is considered a hallmark feature, representing cardinal diagnostic criteria for PD. However, why certain brain regions -- such as the substantia nigra -- are vulnerable in some neurodegenerative diseases, while some neighboring morphologically indistinguishable neurons remain preserved, is still unclear. Molecular analysis of specific neuronal populations can lead us to a better understanding about the physiological role played by these neurons and mechanisms involved in disease\'s processes. In a post-genomic era, proteomic analyses are of great scientific interest since they allow a better understanding of the biological processes. The laser capture microdissection technique has also became an important tool in biological research, being increasingly used for acquisition of pure populations of cells from histological sections, preventing the dissection of areas outside the target tissue. The combination of these methods can significantly contribute to understand the pathophysiological role of the containing neuromelanin neurons of the substantia nigra. However, for an effective application of both techniques, laser capture microdissection and proteomic analysis, it is essential the application of an efficient protocol. In this context, this study aims to establish a protocol for laser microdissection of containing neuromelanin neurons in cognitively normal individuals for subsequent proteomic analyses. We selected cases from the Brain Bank of the Brazilian Aging Brain Study. A collaboration with the Medical Proteome Center, University of Bochum, Germany took part during the development of our proposal. Our protocol was developed based on previous published protocols and optimized according the intended aims. We analyzed anatomical planes for neuronal collection, freezing methods, thickness of tissue for microdissection sections, solution for tissue collection during laser microdissection and the proteolytic digestion methods. Through our comparative tests, we have achieved the desired results and validated them by mass spectrometry analyses. Consequently, we were also able to exclude technical factors that could possibly preclude one effective proteome analysis

Cromossomos sexuais evoluíram repetidas vezes independentemente nos grandes grupos de vertebrados. Sistemas sexuais altamente diferenciados e antigos são caracterizados por grandes diferenças morfológicas e de conteúdo gênico entre os dois cromossomos homólogos onde a recombinação é restrita a uma pequena região homóloga. Os sistemas recentes característicos de peixes caracterizam-se pela similaridade entre os cromossomos X e Y (ou Z e W), nos quais as diferenças observadas freqüentemente envolvem a presença de heterocromatina, translocações e inversões. A recombinação ocorre entre o par sexual na maior parte de sua extensão, sendo inibida apenas na região diretamente relacionada com a determinação sexual. Notavelmente, sistemas diferentes de determinação podem ser encontrados em espécies, ou mesmo populações. O gênero Eigenmannia compreende grupos de espécies crípticas do ponto de vista morfológico que exibem variação no número cromossômico e podem apresentar sistemas sexuais XY ou ZW, incluindo sistemas múltiplos (com translocação Y-autossomo). Estes sistemas estão entre os mais recentes descritos (<16ma) e estão dispostos de forma desordenada em árvores de relações filogenéticas, sugerindo origens múltiplas. No presente estudo, a técnicas de pintura cromossômica usando sondas obtidas por microdissecção de cromossomos sexuais foram empregadas para testar a homologia de dois sistemas XY encontrados nos citótipos (ou espécies) E. virescens e E. sp.2. Os resultados mostram que, de fato, ambos são não homólogos. A fusão Y-autossomo provavelmente ocorreu após a separação de E. sp.2 com sua espécie irmã, E. sp.1 uma vez que um evento de fusão independente, envolvendo um dos cromossomos homólogos ao Y, foi detectado em E. sp.1. A hibridação in sit&#956; do cromossomo X de E. virescens em sua população mais próxima (também com 38 cromossomos, mas sem cromossomos sexuais heteromórficos) mostrou que o cromossomo X é homólogo a um par de acrocêntricos, condizente com o modelo proposto de diferenciação por acúmulo de heterocromatina. Essa heterocromatina foi caracterizada e mostrou um padrão complexo de seqüências CG-ricas. Dois fragmentos de DNA repetitivo GC-ricos presentes no cromossomo X foram isolados e seqüenciados. Não foram detectadas similaridades em comparações com bases de dados e entre os fragmentos obtidos. Estes mostraram-se concentrados nas regiões cromomicina-positivas de E. virescens, incluindo regiões periteloméricas de sete pares e os dois maiores blocos heterocromáticos (nos cromossomos X e par n. 8), além de um cromossomo acrocêntrico, possivelmente o Y. Curiosamente, essas seqüências foram detectadas em apenas três pares cromossômicos na população mais próxima, incluindo um par acrocêntrico de morfologia semelhante à condição ancestral do X, sugerindo que processos dinâmicos de expansão e homogenização genômica ocorreram após a separação dessas populações / Sex chromosomes have evolved independently several times in all major groups of vertebrates. Highly differentiated sex chromosomes are characterized by extensive differences in morphology and gene content, whereas recombination is restricted to a small homologous region. Recent sex chromosomes are characteristic of fish, and display a high level of homology between X and Y (or Z and W) chromosomes, recombination is restricted only in a small sex determining region. Notably, different sex chromosome systems can be found in closely related groups, such as species or even populations. The genus Eigenmannia comprises a group of morphologically cryptic species that display a variety of diploid numbers and different sex chromosome systems, including XY, ZW and a multiple XY system (with a Y-autosome fusion). These systems are among the most recent known (<16ma) and occur with a lack of phylogenetic pattern, whereas frequently populations bearing heteromorphic sex chromosomes are closest related to populations displaying no sex chromosomes. In the present study, chromosome painting using probes derived from the microdissection of two different sex chromosomes where used to investigate the homology of both systems. Results show that, in fact, they are non-homologous and evolved independently. The Y-autosome hypothesis gained further support from the observation that a chromosome homologous to the Y in a close population is involved in yet a different fusion event. The X chromosome present in the E. virescens karyotype was found to be homologous to acrocentric chromosomes in all populations analyzed, thus supporting the notion that its differentiations is mainly due to the accumulation of heterochromatin. The X heterochromatic block was shown to form a complex pattern of GC-rich sequences, different from what was previously described. Two GC-rich fragments were isolated and sequenced; both showed no similarities to known sequences and to one another. These sequences were shown to be concentrated viii on the two largest heterochromatic blocks, those of the X and n.8 chromosomes besides peri-telomeric regions of seven additional pairs and the putative Y. Curiously, these sequences were detected in only three pairs in the closest population, including an acrocentric pair morphologically similar to undifferentiated sex pair. This suggests that dynamic evolutionary processes of expansion and genomic homogenization have occurred after the separation of these populations.

INTRODUÇÃO: A exposição prolongada às partículas ambientais está associada à mortalidade prematura devido às causas cárdio-respiratórias e ao câncer do pulmão. O tamanho e composição destas partículas estão relacionados à maior toxicidade, agravada pela retenção prolongada destas partículas no pulmão. Pode-se postular que partículas com diferentes composições elementares podem ter distribuição diferente ao longo da árvore traqueobrônquica. A captura por micro-dissecção a laser (CML) aparece neste cenário como uma alternativa rápida e eficaz para se obter amostras para estudo da distribuição destas partículas no pulmão. OBJETIVOS: Testar a eficácia da CML no estudo de partículas retidas no pulmão comparando com outra técnica de análise de cortes de parafina (P), já consagrada na literatura. Comparar também o perfil elementar de partículas retidas ao longo da árvore traqueobrônquica e linfonodos em duas cidades com perfis distintos de poluição, através da CML, associada à espectometria de raios-X por dispersão de energia (RX-DE) aliada à microscopia eletrônica de varredura (MEV). MÉTODOS: Vinte e quatro casos autopsiados foram obtidos em duas cidades com perfis distintos de poluição (São Paulo e São José do Rio Preto). As amostras de parênquima pulmonar obtidas do lobo médio do pulmão direito foram coletadas em três regiões: tecido peribrônquico, parênquima pulmonar periférico e linfonodos hilares. Para P, a análise foi feita em áreas visualizadas no MEV correspondentes às áreas de antracose. Estas áreas de antracose foram também micro-dissecadas, usando CML e analisadas através do RX-DE aliado ao MEV. RESULTADOS: Quando os dois métodos foram comparados, a maioria dos elementos encontrados, mostrando diferença significante, foi vista na CML, exceto pelo Ca e Mg (mais comumente encontrados em P). A análise elementar das partículas depositadas ao longo da árvore traqueobrônquica mostra dois grupos de distribuição dos elementos, com deposição predominante peribronquiolar ou com deposição predominante linfonodal. A análise elementar das áreas peribrônquicas descrimina melhor (95.8 %), o tipo de exposição à poluição, sem diferença significante para os outros locais estudados. CONCLUSÃO: Os perfis elementares das partículas retidas ao longo da árvore traqueobrônquica mostram dois grupos com padrão de distribuição distinta. A região proximal é o principal local para discriminação do tipo de exposição do indivíduo, sendo a antracose o carimbo da exposição à poluição. A CML se mostrou também uma ferramenta útil para discriminar áreas de interesse no estudo da análise elementar de partículas retidas no pulmão quando comparada com a análise nos cortes de parafina. / RATIONALE: Prolonged exposure to ambient particles is associated with premature mortality due to cardio respiratory diseases and lung cancer. Size and composition of these particles determine toxicity, aggravated by their long term retention in the lungs. In this context, it is plausible to postulate that different particles with different elemental composition must have distinct distribution patterns along the bronchial tree. Laser capture microdissection (LCM) appears as a rapid and efficient alternative for obtaining representative lung tissue for particle analysis. OBJECTIVES: To test laser capture microdissection (LCM) as a new tool for studying particle retention, comparing to a classical method using paraffin sections (PS). To compare the elemental profile of particles retained along the bronchial tree and lymph nodes in two cities with distinct pollution backgrounds by using LCM, through energy dispersive x-ray (EDX) and scanning electron microscopy (SEM). METHODS: Twenty-four right lung middle lobes from autopsied cases were obtained in two cities with different pollution backgrounds. Lung samples were collected from three distinct regions in the lungs at the time of autopsy: peribronchial tissue, peripheral parenchyma and hylar lymph nodes. For PS, analysis was performed in areas visualized in the SEM correspondent to anthracotic areas. These areas of anthracosis were also microdissected using LCM and analyzed for elemental composition through EDX allied to SEM. RESULTS: When the two methods were compared, the majority of the elements showing significant difference was predominantly found when LCM was used, except for Ca and Mg (more related to PS) Elemental analysis of particles deposited along the bronchial tree shows two groups of distribution: elements with preferable peribronchiolar or preferable lymph node deposition. Elemental profile of peribronchial areas discriminate accurately (95.8 %) the type of pollution exposure, with no statistical difference noted for the other sites. CONCLUSIONS: Elemental profiling of the particles retained along the bronchial tree shows two groups with distinct distribution patterns. The proximal bronchial tree is the main site for discrimination of pollution exposure, with an elemental finger print of anthracosis. LCM has also proven to be a useful tool in discriminating areas of interest for elemental analysis of particles retained in the lung when compared to analysis in PS.

Cromossomos sexuais evoluíram repetidas vezes independentemente nos grandes grupos de vertebrados. Sistemas sexuais altamente diferenciados e antigos são caracterizados por grandes diferenças morfológicas e de conteúdo gênico entre os dois cromossomos homólogos onde a recombinação é restrita a uma pequena região homóloga. Os sistemas recentes característicos de peixes caracterizam-se pela similaridade entre os cromossomos X e Y (ou Z e W), nos quais as diferenças observadas freqüentemente envolvem a presença de heterocromatina, translocações e inversões. A recombinação ocorre entre o par sexual na maior parte de sua extensão, sendo inibida apenas na região diretamente relacionada com a determinação sexual. Notavelmente, sistemas diferentes de determinação podem ser encontrados em espécies, ou mesmo populações. O gênero Eigenmannia compreende grupos de espécies crípticas do ponto de vista morfológico que exibem variação no número cromossômico e podem apresentar sistemas sexuais XY ou ZW, incluindo sistemas múltiplos (com translocação Y-autossomo). Estes sistemas estão entre os mais recentes descritos (<16ma) e estão dispostos de forma desordenada em árvores de relações filogenéticas, sugerindo origens múltiplas. No presente estudo, a técnicas de pintura cromossômica usando sondas obtidas por microdissecção de cromossomos sexuais foram empregadas para testar a homologia de dois sistemas XY encontrados nos citótipos (ou espécies) E. virescens e E. sp.2. Os resultados mostram que, de fato, ambos são não homólogos. A fusão Y-autossomo provavelmente ocorreu após a separação de E. sp.2 com sua espécie irmã, E. sp.1 uma vez que um evento de fusão independente, envolvendo um dos cromossomos homólogos ao Y, foi detectado em E. sp.1. A hibridação in sit&#956; do cromossomo X de E. virescens em sua população mais próxima (também com 38 cromossomos, mas sem cromossomos sexuais heteromórficos) mostrou que o cromossomo X é homólogo a um par de acrocêntricos, condizente com o modelo proposto de diferenciação por acúmulo de heterocromatina. Essa heterocromatina foi caracterizada e mostrou um padrão complexo de seqüências CG-ricas. Dois fragmentos de DNA repetitivo GC-ricos presentes no cromossomo X foram isolados e seqüenciados. Não foram detectadas similaridades em comparações com bases de dados e entre os fragmentos obtidos. Estes mostraram-se concentrados nas regiões cromomicina-positivas de E. virescens, incluindo regiões periteloméricas de sete pares e os dois maiores blocos heterocromáticos (nos cromossomos X e par n. 8), além de um cromossomo acrocêntrico, possivelmente o Y. Curiosamente, essas seqüências foram detectadas em apenas três pares cromossômicos na população mais próxima, incluindo um par acrocêntrico de morfologia semelhante à condição ancestral do X, sugerindo que processos dinâmicos de expansão e homogenização genômica ocorreram após a separação dessas populações / Sex chromosomes have evolved independently several times in all major groups of vertebrates. Highly differentiated sex chromosomes are characterized by extensive differences in morphology and gene content, whereas recombination is restricted to a small homologous region. Recent sex chromosomes are characteristic of fish, and display a high level of homology between X and Y (or Z and W) chromosomes, recombination is restricted only in a small sex determining region. Notably, different sex chromosome systems can be found in closely related groups, such as species or even populations. The genus Eigenmannia comprises a group of morphologically cryptic species that display a variety of diploid numbers and different sex chromosome systems, including XY, ZW and a multiple XY system (with a Y-autosome fusion). These systems are among the most recent known (<16ma) and occur with a lack of phylogenetic pattern, whereas frequently populations bearing heteromorphic sex chromosomes are closest related to populations displaying no sex chromosomes. In the present study, chromosome painting using probes derived from the microdissection of two different sex chromosomes where used to investigate the homology of both systems. Results show that, in fact, they are non-homologous and evolved independently. The Y-autosome hypothesis gained further support from the observation that a chromosome homologous to the Y in a close population is involved in yet a different fusion event. The X chromosome present in the E. virescens karyotype was found to be homologous to acrocentric chromosomes in all populations analyzed, thus supporting the notion that its differentiations is mainly due to the accumulation of heterochromatin. The X heterochromatic block was shown to form a complex pattern of GC-rich sequences, different from what was previously described. Two GC-rich fragments were isolated and sequenced; both showed no similarities to known sequences and to one another. These sequences were shown to be concentrated viii on the two largest heterochromatic blocks, those of the X and n.8 chromosomes besides peri-telomeric regions of seven additional pairs and the putative Y. Curiously, these sequences were detected in only three pairs in the closest population, including an acrocentric pair morphologically similar to undifferentiated sex pair. This suggests that dynamic evolutionary processes of expansion and genomic homogenization have occurred after the separation of these populations.

INTRODUÇÃO: A exposição prolongada às partículas ambientais está associada à mortalidade prematura devido às causas cárdio-respiratórias e ao câncer do pulmão. O tamanho e composição destas partículas estão relacionados à maior toxicidade, agravada pela retenção prolongada destas partículas no pulmão. Pode-se postular que partículas com diferentes composições elementares podem ter distribuição diferente ao longo da árvore traqueobrônquica. A captura por micro-dissecção a laser (CML) aparece neste cenário como uma alternativa rápida e eficaz para se obter amostras para estudo da distribuição destas partículas no pulmão. OBJETIVOS: Testar a eficácia da CML no estudo de partículas retidas no pulmão comparando com outra técnica de análise de cortes de parafina (P), já consagrada na literatura. Comparar também o perfil elementar de partículas retidas ao longo da árvore traqueobrônquica e linfonodos em duas cidades com perfis distintos de poluição, através da CML, associada à espectometria de raios-X por dispersão de energia (RX-DE) aliada à microscopia eletrônica de varredura (MEV). MÉTODOS: Vinte e quatro casos autopsiados foram obtidos em duas cidades com perfis distintos de poluição (São Paulo e São José do Rio Preto). As amostras de parênquima pulmonar obtidas do lobo médio do pulmão direito foram coletadas em três regiões: tecido peribrônquico, parênquima pulmonar periférico e linfonodos hilares. Para P, a análise foi feita em áreas visualizadas no MEV correspondentes às áreas de antracose. Estas áreas de antracose foram também micro-dissecadas, usando CML e analisadas através do RX-DE aliado ao MEV. RESULTADOS: Quando os dois métodos foram comparados, a maioria dos elementos encontrados, mostrando diferença significante, foi vista na CML, exceto pelo Ca e Mg (mais comumente encontrados em P). A análise elementar das partículas depositadas ao longo da árvore traqueobrônquica mostra dois grupos de distribuição dos elementos, com deposição predominante peribronquiolar ou com deposição predominante linfonodal. A análise elementar das áreas peribrônquicas descrimina melhor (95.8 %), o tipo de exposição à poluição, sem diferença significante para os outros locais estudados. CONCLUSÃO: Os perfis elementares das partículas retidas ao longo da árvore traqueobrônquica mostram dois grupos com padrão de distribuição distinta. A região proximal é o principal local para discriminação do tipo de exposição do indivíduo, sendo a antracose o carimbo da exposição à poluição. A CML se mostrou também uma ferramenta útil para discriminar áreas de interesse no estudo da análise elementar de partículas retidas no pulmão quando comparada com a análise nos cortes de parafina. / RATIONALE: Prolonged exposure to ambient particles is associated with premature mortality due to cardio respiratory diseases and lung cancer. Size and composition of these particles determine toxicity, aggravated by their long term retention in the lungs. In this context, it is plausible to postulate that different particles with different elemental composition must have distinct distribution patterns along the bronchial tree. Laser capture microdissection (LCM) appears as a rapid and efficient alternative for obtaining representative lung tissue for particle analysis. OBJECTIVES: To test laser capture microdissection (LCM) as a new tool for studying particle retention, comparing to a classical method using paraffin sections (PS). To compare the elemental profile of particles retained along the bronchial tree and lymph nodes in two cities with distinct pollution backgrounds by using LCM, through energy dispersive x-ray (EDX) and scanning electron microscopy (SEM). METHODS: Twenty-four right lung middle lobes from autopsied cases were obtained in two cities with different pollution backgrounds. Lung samples were collected from three distinct regions in the lungs at the time of autopsy: peribronchial tissue, peripheral parenchyma and hylar lymph nodes. For PS, analysis was performed in areas visualized in the SEM correspondent to anthracotic areas. These areas of anthracosis were also microdissected using LCM and analyzed for elemental composition through EDX allied to SEM. RESULTS: When the two methods were compared, the majority of the elements showing significant difference was predominantly found when LCM was used, except for Ca and Mg (more related to PS) Elemental analysis of particles deposited along the bronchial tree shows two groups of distribution: elements with preferable peribronchiolar or preferable lymph node deposition. Elemental profile of peribronchial areas discriminate accurately (95.8 %) the type of pollution exposure, with no statistical difference noted for the other sites. CONCLUSIONS: Elemental profiling of the particles retained along the bronchial tree shows two groups with distinct distribution patterns. The proximal bronchial tree is the main site for discrimination of pollution exposure, with an elemental finger print of anthracosis. LCM has also proven to be a useful tool in discriminating areas of interest for elemental analysis of particles retained in the lung when compared to analysis in PS.