L'optimisation du couplage lumière-matière requiert la connaissance de l'orientation du dipôle émetteur associé à une source de photons, ainsi que de la distribution de champ électrique du mode excité. Afin de maximiser le couplage entre des émetteurs fluorescents et des nanostructures, nous avons établi une méthode qui permet de déterminer l'orientation d'un dipôle d'émission. Les calculs en champ électrique, associés à une analyse en polarisation, constituent une modélisation complète, pouvant être généralisée à diverses situations expérimentales. Nous appliquons ensuite la méthode proposée à des nanocristaux colloïdaux de CdSe/CdS et CdSe/ZnS sphériques, ainsi qu'à des nanobâtonnets de CdSe/CdS. Nous avons déterminé, par une analyse en polarisation, l'orientation complète d'un dipôle émetteur individuel. Nous avons ensuite étudié le couplage de la lumière à des plasmons grâce à des réseaux périodiques métalliques. Des mesures de réflectivité spéculaire ont mis en évidence un couplage efficace de la lumière incidente à des plasmons de surface sur une large gamme de longueurs d'onde. Des mesures de microscopie électronique par photoémission (PEEM), basées sur la collection d'électrons photoémis à la surface du métal, ont permis d'étudier le couplage de la lumière aux modes plasmons de surface, avec une haute résolution spatiale (25 nm). L'excitation de l'échantillon par un laser, dont on varie la longueur d'onde et la polarisation, fournit une cartographie de la distribution du champ à la surface. Les échantillons étudiés ont mis en évidence différentes signatures de couplage du faisceau incident aux modes plasmoniques (franges d'interférences, points chauds). / The emission features of a single emitter embedded in a nanostructure are closely related to the local environment parameters, as well as to the orientation of the dipole itself. In order to maximize the coupling of fluorescent emitters to nanostructures, we established a model to determine the 3D-orientation of an emitting dipole. I developed an analytic description of a method which allows a measurement of a single dipole orientation to be performed, in various experimental configurations. I then applied this method to colloidal semiconductor nanocrystals (spherical CdSe/CdS and CdSe/ZnS nanocrystals and CdSe/CdS dot-in-rods). By using a polarization analysis, I determined the 3D-orientation of a single emitting dipole. This study led us to the particular conclusion that the emitting dipole associated to a dot-in-rod is not aligned with the elongated axis of the dot-in-rod. In a second part, I studied the coupling between light to surface plasmons modes using periodic metallic gratings. Specular reflectivity measurements highlighted an efficient coupling between the incident visible light and surface plasmons polaritons for a large range of wavelengths. Photoemission electron microscopy (PEEM) measurements, based on the collection of photo-emitted electrons on the surface of the sample, allowed the coupling of light to plasmonic modes to be investigated with a high spatial resolution (25 nm). The sample is excited by a laser tunable in polarization and wavelength, providing a map of the electric field on the surface. The samples showed two different signatures of a coupling to plasmonic modes (interference fringes and hot spots).

Ce projet de thèse s'inscrit dans une dynamique de développement des polyrotaxanes de cyclodextrines pour des applications biomédicales. L'objectif est d'obtenir, par une approche modulaire et convergente, des polyrotaxanes fonctionnalisés pour l'imagerie par microscopie optique dans le proche infrarouge et l'IRM. Une bibliothèque de cyclodextrines fonctionnalisées a été générée par CuAAC entre des fluorophores (BODIPY, Cyanine) ou un agent de contraste (monoamide-DOTA-Gd) et des ?-cyclodextrines mono- ou bis-azotures. Leurs propriétés d'auto-assemblage ont été étudiées sur un axe court et ont permis le développement de [3]rotaxanes fonctionnalisés pour l'IRM dont les expérimentations in vivo ont démontré l'apport bénéfique de la structure supramoléculaire pour les propriétés d'agent de contraste. L'extension de l'architecture aux polyrotaxanes multimodaux a été réalisée par l'utilisation d'un axe polyammonium. Une nouvelle classe d'axes anioniques a été développée avec l'étude cinétique et thermodynamique de l'enfilage sélectif d'une ou deux cyclodextrines sur des monomères diphosphates et montre l'intérêt des pseudo-bouchons phosphates pour le contrôle de la barrière d'activation par le pH. L'extension à une structure pseudopolyrotaxane est obtenue par la synthèse d'un poly(hexylène phosphate) et permet de valider l'utilisation du polymère pour la synthèse de composés fonctionnalisés. En perspective de ces développements, des voies de post-fonctionnalisation des polyrotaxanes, une nouvelle voie de synthèse par polymérisation de pseudo-rotaxanes et l'obtention d'une cyclodextrine pour le relargage contrôlé par stimuli acido-basiques sont abordées. / This PhD project is focused on the development of cyclodextrin-based polyrotaxanes for biomedical applications. The objective is to use a modular building-block approach to synthesize functionalized polyrotaxanes for NIR fluorescence and magnetic resonance imaging. A library of functionalized cyclodextrins was obtained by a versatile ‘click’ reaction between fluorescent probes (BODIPY, Cyanine) or contrast agent (GdDOTA-monoamide) and mono- or bis-azido α-cyclodextrins. Their self-assembly properties were first studied on short axles and allowed the development of functionalized [3]rotaxanes for MRI. In vitro and in vivo studies demonstrated the advantages of the supramolecular approach for the design of contrast agent with an enhancement of the relaxivities and better retention times in kidneys. The strategy was extended to obtain multimodal polyrotaxane architectures based on a poly(alkyl)ammonium thread. A new family of anionic threads based on alkylphosphate moieties was also developed. Thorough kinetic and thermodynamic studies revealed the ability of phosphates to act as pH-responsive stoppers enabling a selective threading of one or two cyclodextrins on small alkanediphosphate threads. Pseudopolyrotaxanes of α-CD were then obtained with poly(hexylene phosphate) and pave the way for the synthesis of functionalized ones. Finally, significant investigations in the post-functionalization of polyrotaxanes, polymerization of pseudo-rotaxanes as new synthetic pathway and pH-switchable rotaxane for controlled release were realized.

Ce mémoire rapporte deux approches de la synthèse des protéines à l'échelle de la molécule unique. Nous utilisons la microscopie de fluorescence en onde évanescente pour sonder l'activité traductionnelle de deux types de ribosomes. Les premiers, issus d'E. Coli (organisme procaryote), sont mutés afin de les marquer d'un nanocristal semiconducteur (QD). La fin de la traduction, qui correspond au décrochage du ribosome de l'ARNm lorsque celui-ci atteint le codon stop, est alors mise en évidence par la disparition du QD de la surface de l'échantillon. Le deuxième type de ribosome étudié est quant à lui extrait de cellules de lapins (organisme eucaryote) et est dit "sauvage", c'est à dire qu'il n'a pas subi de modification, tandis qu'un oligonucléotide marqué d'un fluorophore est hybridé à l'ARNm. L'activité hélicase du ribosome lui permettant de séparer deux brins complémentaires, l'oligonucléotide et donc le fluorophore disparaissent en même temps que le ribosome parcourt l'ARNm, permettant ainsi de sonder l'activité du ribosome. Nous donnons pour ces deux types de ribosomes une vitesse moyenne de la traduction dans des milieux contenant les facteurs de la traduction issus d'extraits cellulaires.La deuxième approche de la synthèse des protéines porte sur les propriétés de l'ARNm, support de l'information génétique codant pour la séquence des protéines. Nous avons développé un montage de pince optique permettant de manipuler et caractériser les propriétés mécaniques d'oligonucléotides, ainsi qu'une méthode originale de calibration de ce piège optique. La cohérence de nos mesures sur l'étirement d'un double brin d'ADN avec la littérature nous permettra de poursuivre notre étude sur la mesure des forces nécessaires pour ouvrir une structure secondaire de l'ARNm. / We hereby report two approaches of the protein synthesis at the single molecule level. We use total internal reflection fluorescence microscopy to study the translation kinetic of two different types of ribosomes. The first ones, extracted from E. Coli (prokaryotic organism), are mutated in order to label them with a quantum dot (QD). The end of translation, which corresponds to the dissociation of the ribosome from the mRNA when the stop codon has been reached, is highlighted by the disparition of the QD from the surface. The second type of ribosome is extracted from rabbit cells (eukaryotic organism) and has not been modified (wild type), while a labeled oligonucleotide is hybridized on the mRNA. The helicase activity of the ribosome allowing the dissociation of two complementary strands, the oligonucleotide and so the label disappear at the same time while the ribosome moves along the mRNA and thus inform us about its activity. For these two types of ribosomes we measure their average translation speed in cell extracts.The second approach focuses on the properties of the mRNA, carrying the genetic code for the protein sequence. We developped an optical tweezer setup in order to manipulate and characterize the mechanical properties of nucleotides, as well as an original method to calibrate this optical trap. The consistency of our measurements with the litterature on the properties of a double stranded DNA will allow us to study secondary structures of mRNA.

Des techniques variées de visualisation de molécules d’intérêt sur cellules vivantes ou fixées ont permis de suivre leur synthèse, localisation, dégradation et autres activités. Dans cette étude, nous avons développé deux outils de fluorescence pour étudier la synthèse des protéines sur bactéries vivantes. Le premier décrit l’utilisation du système Spinach pour l’imagerie du ribosome. Cette approche diffère des méthodes conventionnelles qui utilisent des protéines fluorescentes puisque l’ARN ribosomal 16S contient un aptamère qui rend fluorescent un composé fluorogène. Une étude comparative de la performance de différents aptamères Spinach a été réalisée. Un deuxième outil se focalise sur l’accumulation d’un antibiotique de la famille des aminoglycosides (ligand du ribosome) conjugué à un fluorophore. Ce nouveau conjugué, qui a conservé son activité bactéricide permet pour la première fois de visualiser l’accumulation de l’antibiotique sur bactérie vivante. Cela permet une analyse au niveau de la cellule unique d’une population bactérienne exposée à l’antibiotique. Nous avons également obtenu des données sur la localisation de l’antibiotique une fois qu’il a pénétré dans la bactérie à une résolution inégalée par microscopie super-résolutive. Nous espérons que ces deux méthodes vont maintenant permettre une meilleure compréhension de la synthèse des protéines et fournir une vue nouvelle de la pénétration des antibiotiques dans les bactéries pour y produire leur action bactéricide. / Various visualizing techniques have previously enabled monitoring the fate of molecules of interest: their expression, localization, degradation and other activities in live or fixed cells. In this study, we have developed two fluorescent tools to study protein synthesis in live bacterial cell. The first one describes the application of Spinach system to ribosomes imaging. This is different from conventional methods (that use fluorescent proteins) in that 16S rRNA contains an inserted RNA aptamer that elicits fluorescence of a fluorogenic compound. A comparative study of the performance of different Spinach aptamers was performed here. A second system focuses on the uptake of a fluorescently labeled ligand of the ribosome, an antibiotic of the class of aminoglycosides. This novel conjugate, which kept its bactericidal activity allows for the first time imaging of aminoglycoside uptake on live bacteria. This opened the door to a single cell analysis of bacterial cell populations. We also obtained data about the localization of the antibiotic once inside the bacteria to an unprecedented resolution using super resolution microscopy. We hope that both of these methods will contribute to a better understanding of protein synthesis as well as provide a novel view on the way antibiotics penetrate into cells and perform their bactericidal action.

Les cellules vivantes sont capables de réagir aux signaux mécaniques tels que la rigidité de la surface sur laquelle elles adhèrent, les forces de tractions ou compressions auxquelles elles sont soumises, le flux de liquide à la surface de leur membrane ou encore la géométrie de leurs adhésions ou de leur forme globale. Ces signaux influent sur des processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation, la migration et la mort cellulaire. Ces processus sont finement régulés par des réactions biochimiques qui forment un réseau de signalisation. La mécanotransduction est la traduction du signal mécanique en signal biochimique.C’est dans le but d’étudier la mécanotransduction que nous avons étudié l’utilisation d’ultrasons pour stimuler mécaniquement les cellules à des fréquences temporelles et spatiales relativement élevées. De nombreux montages expérimentaux et de nombreuses voies ont été considérées dans cette partie très exploratoire. Nous en retenons finalement des pistes prometteuses pour la continuation future de ce projet.Nous avons développé ce que nous nommons des substrats actifs, qui nous permettent de contrôler à la fois spatialement et temporellement la stimulation mécanique appliquée à des cellules vivantes. Ces substrats actifs consistent en des micropiliers de fer incrustés dans un élastomère peu rigide (PDMS) et manipulés par deux électroaimants. Nous pouvons contrôler dynamiquement le déplacement des piliers qui vont déformer localement et de manière continue la surface. Cette déformation va ensuite déformer en traction ou en compression les cellules vivantes étalées sur la surface à proximité. En employant des marqueurs fluorescents nous pouvons réaliser de la Microscopie de Forces de Traction et surveiller la contrainte appliquée par les piliers aux cellules à travers la surface de PDMS, et nous pouvons étudier la réponse mécanique des cellules. De plus, ces substrats sont compatibles avec la microscopie de fluorescence en cellule vivante, ce qui rend possible l’observation de la réponse cellulaire au niveau morphologique (forme des adhésions focales, activité protrusive, …) et surtout biochimique.En effet, pour étudier la réponse biochimique des cellules après une stimulation mécanique, nous observons par microscopie de fluorescence des biosenseurs portant des paires de fluorophores donneur/accepteur. Ces biosenseurs nous permettent d’observer l’activité de protéines impliquées dans la signalisation cellulaire en calculant l’efficacité de Transfert d’Énergie Résonnant de Förster (FRET) de ces biosenseurs. Pour ce faire, les échantillons sont illuminés alternativement aux longueurs d’ondes d’excitation des fluorophores donneurs puis accepteurs. Le signal de fluorescence est collecté simultanément dans un canal d’émission du donneur et un canal d’émission de l’accepteur. Une grande partie de ma thèse a été consacrée à la mise au point d’une méthode quantitative pour analyser les images de fluorescence afin de mesurer une efficacité de FRET qui ne dépende pas de facteurs expérimentaux ni de la quantité de biosenseurs présents dans les cellules. Nous évaluons alors les différentes méthodes pour déterminer les facteurs de correction répandus corrigeant le débordement de spectre du donneur dans le canal accepteur et l’excitation directe de l’accepteur à la longueur d’onde d’excitation du donneur. Pour obtenir des mesures plus quantitatives, nous avons mis au point une nouvelles méthode pour déterminer 2 facteurs de correction supplémentaires. Nous comparons cette méthode à la seule préexistante et évaluons l’influence des paramètres de traitement des images sur les valeurs d’efficacité de FRET mesurées. / Living cells can react to mechanical signals such as the rigidity of the surface they adhere on, the traction or compression forces applied on them, the liquid flow at their membrane surface or the geometry of their adhesions or of their overall shape. Those signals influence cellular processes such as proliferation, differentiation, migration or cell death. Those processes are tightly regulated by biochemical reactions that constitute a signaling network. Mechanotransduction is the translation of the mechanical signal into the biochemical one.In order to study mechanotransduction, we have considered the use of ultrasounds to mechanically stimulate cells at relatively high temporal and spatial frequencies. Numerous setups and options have been considered in this very exploratory project. Finally, we will retain some promising leads for the continuation of this project.We have developed what we call active substrates that allows us to control both spatially and temporally the mechanical stimulation on living cells. Those active substrates consist of iron micropillars embedded in a soft elastomer and actuated by 2 electromagnets. We can control dynamically the displacement of the pillar that will deform locally and continuously the surface. This deformation will then deform in traction or in compression the living cells spread on the surface nearby. Thanks to fluorescent trackers we can perform Traction Force Microscopy and monitor the stress applied by the pillars to the cells through the PDMS surface, and we can look at the mechanical response of the cells. Moreover, those substrates are compatible with live cell fluorescence microscopy, which makes possible the observation of the cellular response at the morphological level (focal adhesions, protrusive activity, …) and most importantly at the biochemical level.Indeed, in order to study the cellular biochemical response after a mechanical stimulation, we use fluorescence microscopy to observe biosensors containing pairs of donor/acceptor fluorophores. Those biosensors allow us to monitor the activity of proteins implied in cellular signaling by computing the Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiency of those biosensors. To do so, samples are alternatively excited at donor and acceptor excitation wavelengths. The fluorescence signal is then simultaneously measured in donor and acceptor emission channels. A substantial part of my thesis has been dedicated to the development of a quantitative method to analyze fluorescence images in order to measure FRET efficiencies that do not depend on experimental factors or biosensors concentration in cells. We assess different methods to compute standard correction factors that account for spectral bleed-through and direct excitation of acceptors at donor excitation wavelength. To obtain more quantitative measurements, we have developed a new method to compute 2 additional correction factors. We compare this method with the only one preexisting, and we assess the influence of image processing parameters on FRET efficiency values.

Ce mémoire rassemble les résultats des travaux de recherche que j'ai menés au cours des dix dernières années au laboratoire Kastler Brossel au sein de l'équipe ``Optique et Biologie''. Nos travaux s'articulent autour de la détection optique de molécules individuelles, notamment pour la biologie. Nous utilisons dans ce but des sondes fluorescentes aux propriétés optiques remarquables : les nanocristaux semi-conducteurs. Je me suis concentré sur la visualisation par microscopie de fluorescence des interactions ADN-protéines à l'échelle de la molécule unique. Notre approche consiste à étendre et à accrocher des molécules d'ADN à une surface en s'inspirant des techniques de peignage moléculaire. Notre but est de visualiser directement le mouvement le long de la molécule d'ADN d'une protéine marquée à l'aide de nanocristaux ou de colorants organiques. La proximité entre la surface et l'ADN nous permet de visualiser ce mouvement par microscopie en onde évanescente. Nous nous sommes concentrés sur l'enzyme de restriction EcoRV, et en particulier sur la ``diffusion facilitée'' de cette enzyme sur l'ADN étiré du bactériophage T7. Nous sommes parvenus à observer la diffusion d'EcoRV, marquée avec des nanocristaux, le long de l'ADN étiré. Nous avons montré que le glissement des protéines le long de la chaîne d'ADN est le mécanisme le plus probable qui sous-tend la diffusion facilitée d'EcoRV. Nous avons observé des sauts de l'enzyme le long de l'ADN sur des distances importantes. L'analyse de la distribution de ces sauts nous a permis de proposer une vision synthétique de la diffusion facilitée.

Certaines protéines qui interagissent avec l'ADN sont capables de trouver rapidement une séquence spécifique de quelques paires de bases. Pour expliquer ce phénomène connu des biologistes depuis longtemps, plusieurs mécanismes de localisation appelés diffusion facilitée ont été proposés. Tous supposent une association initiale à de l'ADN non spécifique, suivie d'une translocation le long de l'ADN jusqu'au site de reconnaissance. Le mécanisme qui sous-tend cette translocation est toujours discuté. Il pourrait impliquer une diffusion linéaire (sliding) et/ou une série de sauts (jumping). <br />Pour élucider ce mécanisme, nous avons utilisé la microscopie de fluorescence par onde évanescente pour visualiser l'interaction non spécifique de l'enzyme de restriction EcoRV. Dans nos expériences in vitro, l'ADN est étiré au dessus d'une surface et les enzymes sont couplées à des fluorophores. Nous avons ainsi visualisé les processus de sliding et de jumping et mesuré le coefficient de diffusion 1D des enzymes (D1 ~ 0,01 µm2.s-1) ainsi que le nombre de saut par interaction (~ 20). Un modèle simple a permis à partir des résultats expérimentaux de caractériser la diffusion facilitée d'EcoRV.

L'objectif de cette thèse est de définir la chorégraphie de ségrégation des deux chromosomes circulaires de Vibrio cholerae, c'est à dire le positionnement de l'information génétique au cours de la croissance de la cellule, ainsi que les mécanismes dirigeant ces ségrégations. Il a longtemps été supposé que les bactéries étaient trop petites pour avoir une organisation intra-cellulaire, et le manque de techniques appropriées ne permettait pas d'infirmer cette hypothèse. Or la taille des chromosomes comparée à celle de la bactérie impose une compaction et aujourd'hui, de nouvelles techniques de microscopie et d'analyse génétique permettent d'affirmer que les chromosomes bactériens étudiés jusqu'à maintenant ont tous une organisation et une chorégraphie de ségrégation précises et différentes selon les espèces. Toutes les espèces étudiées à ce jour ont un chromosome circulaire unique : la réplication du chromosome commence à une origine unique bidirectionnelle, les deux fourches de réplication se déplacent le long des deux bras de réplication (ou réplichores) et finissent la réplication au terminus, diamétralement à l'opposée de l'origine de réplication sur la carte du chromosome. Peu d'espèces ont été étudiées, et Vibrio cholerae émerge progressivement comme un nouveau modèle : son génome est réparti sur deux chromosomes, et la chorégraphie de plusieurs chromosomes dans une cellule n'a jamais été décrite. De plus, cette espèce semble être au croisement évolutif entre Caulobacter crescentus et Escherichia coli : Vibrio cholerae a d'une part une morphologie en croissant, des systèmes de partition aux origines et un positionnement de l'origine du chromosome I, semblables à C. crescentus, et d'autre part un système de compaction du terminus et un set de gènes impliqués dans la maintenance du chromosome ayant co-évolué, qu'on ne retrouve que dans peu d'espèces proches d'E. coli. Une autre caractéristique intéressante de V. cholerae est que le chromosome II semble avoir été acquis récemment et n'est donc peut être pas gouverné par les mêmes mécanismes que le chromosome I, comme en témoignent le positionnement de son origine et son terminus, inédits pour des chromosomes bactériens. Parmi les Vibrios (environ 60 espèces principalement retrouvées dans les environnements aquatiques), certaines espèces sont des pathogènes dévastateurs pour les poissons, le corail, les crustacés ou les fruits de mer. Mais la plus documentée est Vibrio cholerae, car elle provoque chez l'Humain une maladie provoquée par l'ingestion d'eau contaminée qui peut être mortelle si le patient n'est pas réhydraté à temps. Bien que facilement traitable, le choléra fait encore de nombreuses victimes dans les pays en développement où les structures de santé et les règles d'hygiène font parfois défaut. Ainsi l'étude de Vibrio cholerae présente un intérêt médical, mais également par extension aux autres Vibrios, un intérêt environnemental non négligeable.

Le trafic membranaire est un processus universel qui est essentiel pour la fonction neuronale dans un large spectre de fonctions. De la croissance neuronale et le développement morphologique à la libération des neurotransmetteurs et la plasticité synaptique, il prend en charge l'activité neuronale et donne d'innombrables questions qui animent la recherche sur la neurobiologie d'aujourd'hui. Notamment, l’exocytose des endosomes de recyclage (ER) dans les compartiments somatodendritiques participe à la transmission synaptique et à la potentialisation synaptique à long terme (PLT). Cependant la machine moléculaire sous-tendant l’exocytose des ER reste encore méconnue. Afin d’identifier les protéines SNAREs vésiculaires (v-SNARE) impliquées dans les différentes formes d’exocytose des ER postsynaptiques, nous avons d'abord imagé les protéines VAMP neuronales fusionnées avec la pHluorine, une GFP mutée sensible au pH dans les neurones de l’hippocampe en culture. Nous avons constaté que seulement VAMP2 et VAMP4, mais pas VAMP7, rapportaient des événements d’exocytose somatodendritique dans les neurones matures. Après avoir identifié ces deux protéines candidates, nous avons utilisé la combinaison de différentes techniques de régulation négative chronique ou aiguë pour désactiver leur fonction et observer les conséquences sur l’exocytose des ER, la transmission synaptique basale ou la PLT. Nos résultats suggèrent que VAMP2 est impliqué dans une forme d’exocytose régulée importante pour la PLT, mais pas l’exocytose constitutive des récepteurs AMPA, qui stabilise la transmission basale. VAMP4 est nécessaire pour l'exocytose constitutive d'une grande partie des endosomes, mais l'implication fonctionnelle de ces endosomes doit encore être explorée, car la régulation négative de VAMP4 ne modifie pas la transmission basale. / Membrane trafficking is a universal process that is essential for neuronal function in a wide spectrum of applications. From neuronal growth and morphological development to neurotransmitter release and synaptic plasticity, it supports neuronal activity and gives countless questions that drive today’s neurobiology research. Notably, the trafficking of recycling endosomes (REs) in somatodendritic compartments participates in synaptic transmission and plasticity, such as long-term synaptic potentiation (LTP). However, the fusion machinery mediating RE exocytosis is still unclear. To identify the vesicular SNAREs (v-SNAREs) involved in different forms of postsynaptic RE exocytosis, we first imaged neuronal VAMP proteins fused with pH-sensitive pHluorin in cultured hippocampal neurons, and found that only VAMP2 and VAMP4, but not VAMP7, underwent somatodendritic exocytosis in mature neurons. After identifying these two candidate proteins, we used a combination of different downregulation techniques to chronically or acutely deactivate their function and observe consequences on REs exocytosis, basal synaptic transmission and LTP. Our results suggest that VAMP2 is involved in activity-regulated exocytosis important for LTP, but not constitutive postsynaptic AMPARs exocytosis, supporting basal transmission. VAMP4 is required for constitutive exocytosis of at least a large proportion of REs, but the functional implication of these endosomes still need to be explored, as VAMP4 downregulation did not alter basal synaptic transmission.

Le moteur flagellaire bactérien (BFM) est un complexe moléculaire qui permet aux bactéries de nager dans un milieu liquide. La rotation du moteur est générée à l’interface entre deux éléments clés: les protéines formant le stator (MotA and MoB) et l’anneau C “switching complex” à la base du rotor. Les stators sont des modules du moteur structurellement et fonctionnellement différentiables du reste du moteur, et leurs association et dissociation dynamique autour du rotor contrôle la génération du couple. Quand une protéine fluorescente (PF) est fusionnée à MotB, le moteur est en état de marche mais une réduction générale de la mobilité de la cellule a été observée. La raison précise d’une telle réduction de mobilité n’a pas été étudiée.Le but de cette étude est de comprendre comment la fusion PF de la protéine du stator modifie la génération du couple et le sens de rotation du moteur. C’est particulièrement important car le tag FP se trouve à l’interface entre le stator et le rotor, là où le couple et le changement du sens de rotation sont produits. Trois différentes PFs (eGFP, YPet, Dendra2) ont été fusionnées à la protéine MotB. Malgré la haute similarité de leurs structures, notre analyse a montré que les trois stators fusionnés génèrent des couples différents. Les stators marqués avec YPet produisent un couple moyen similaire au WT (stators sans tag PF), alors que les stators marqués avec eGFP et Dendra2 produisent respectivement 70% et 40% du couple moyen du WT. De plus, les moteurs utilisant les stators fusionnés ont montré des capacités de changement de sens de rotation réduites. Lors d’un changement de sens de rotation, la valeur absolue de la vitesse des moteurs WT ne change pas. Cette “symétrie” de vitesse lors du changement n’apparaît pas avec les moteurs à stators fusionnés et le changement peut être accompagné d’une importante diminution (~30%) de la vitesse absolue.En observant par microcopie TIRF avec détection de molécules uniques, des stators marqués dans un moteur en état de marche, les signaux de fluorescence sont détectés à la membrane comme prévu pour ces protéines, montrant une population de stators diffusant dans celle-ci. Les clusters fluorescents étaient visibles au centre des cellules en rotation, attachés au couvre-glace par une seule flagelle, confirmant que le tag de fluorescence peut être visualisé dans des moteurs en état de marche. Dans un second projet développé dans le laboratoire Bertus Beaumont à TU Delft, en prenant le BFM en tant que système modèle d’évolution expérimentale, sa modularité et son « évolubilité » ont été explorés pour apprendre les détails au niveau moléculaire de l’évolution de ce type de machine. Les stators de E.coli ont été échangés par un set de 21 stators étrangers homologues. L’expérience a révélé que les protéines du stator peuvent être échangées entre espèces de bactéries distantes et certains stators non compatibles peuvent être modifiés positivement par un procédé d’évolution pour devenir fonctionnels. Au cours de cette évolution, les bactéries ont accumulé des mutations avantageuses dans leurs gènes MotA et MotB étrangers, tout particulièrement dans leur domaine fonctionnel. Des mutations identiques dans des stators différents ont été observées, indiquant que l’évolution peut se reproduire. L’analyse fonctionnelle au niveau d’un seul moteur a révélé que ces mutations avantageuses amélioraient la génération du couple et/ou la capacité du moteur à changer de sens. Les investigations détaillées du génotype et du phénotype du BFM modifié par évolution apportés par cette étude, pourraient donner une idée sur la façon dont des machines moléculaires comme le BFM ont évolué, et les effets fonctionnels des mutations bénéfiques qui facilitent l'intégration fonctionnelle. / The bacterial flagellar motor (BFM) is the macromolecular complex which allows bacteria to swim in liquid media. Located at the base of the flagellum, anchored in the cell membrane, this remarkably small (~45nm) yet powerful rotary motor rotates each flagellum of the cell switching between counterclockwise (CCW) and clockwise (CW) direction. The motor rotation is generated at the interface between the two key components of the motor: the stator protein complexes (each composed of 4 MotA and 2 MotB proteins) and the C- ring protein complex at the base of the rotor. The stator complexes are structurally and functionally discernible modules of the motor, and their dynamical association and dissociation around the rotor controls the generation of torque.The first project of this study aims to investigate how the FP tag on the stator protein modifies the torque generation and switching of the motor. This is particularly important because the fluorescent protein tag lies at the interface between stator and rotor, where torque and switching are produced. Three different FPs (eGFP, YPet, Dendra2) were fused to MotB. Interestingly, despite the high similarity of their structures, our analysis revealed that the three fusion stators generate different torque. Furthermore, in the presence of fusion stators, the motor showed significantly impaired switching abilities. When switching direction of the rotation, the absolute value of the speed of WT motors does not change, whereas this symmetry of speed upon switching is not observed in the fusion stator motors, and switching can be accompanied with a significant (~30%) decrease in absolute speed. Both the impaired torque generation and the switching ability were improved by introducing a rigid linker between the stator and the FP tag. Taken together, this study provides a further insight into the dynamics of the stator and rotor interaction at its interface.When the cells carrying the fluorescently labeled stators were observed in a custom made TIRF-fluorescence microscope with single molecule capability, the fluorescence signals were detected as concentrated clusters in the membrane as expected for these membrane proteins around the motors, together with a population of stators diffusing in the membrane. Fluorescent clusters were visible at the center of rotating cells tethered to the glass slide by a single flagellum, confirming that the fluorescent tags can be visualized in functioning motors.In a second project developed in Bertus Beaumont lab at TU Delft, taking BFM as an experimental evolutionary model system, its modularity and evolvability have been explored to learn the molecular details of the evolution of molecular machines. The stators of E.coli have been exchanged by a set of 21 homologue foreign stators. The experiments revealed that the stator proteins can be exchanged between distant bacteria species, and some of the non-compatible stators can be positively modified by evolution to become functional. Those evolved strains accumulated beneficial mutations in their foreign motA and motB genes, especially on their functional domains. Identical mutations in different stators were common, indicating that evolution is repeatable. The functional investigation at the single motor level revealed that those beneficial mutations improved the torque generation and/or the switching ability of the motor. The detailed genotype and phenotype investigations of the evolutionary modified BFM may bring an insight into how molecular machines such as BFM have evolved as well as the functional effects of the beneficial mutations that facilitate functional integration.