Cette thèse présente un travail d?élaboration et de caractérisation de surfaces hétérogènes contrôlées afin d?étudier l?effet des hétérogénéités sur les propriétés de mouillage. Ces surfaces sont obtenues par la technique de Langmuir-Blodgett à partir du mélange de deux molécules amphiphiles différentes. Ces molécules ont été choisies pour leurs propriétés de mouillage différentes : la première est un acide gras à longue chaîne tandis que la seconde est une molécule à chaîne hydrophobe partiellement fluorée.<br />Dans un premier temps, les films mixtes sont caractérisés à l?interface eau-air (films de Langmuir). Afin de déterminer la nature des interactions entre les constituants, les films mixtes ont été étudiés à différentes échelles en utilisant différentes techniques expérimentales. Les résultats montrent que le système présente une séparation de phase complète quelle que soit la fraction molaire de l?un des constituants et dès les basses pressions de surface. Des domaines circulaires d?acide sont mis en évidence.<br />Les films sont ensuite transférés sur substrat solide. Pour obtenir un bon ancrage des films, les paramètres de transfert ont été adaptés. L?arrangement moléculaire au sein des films a été déterminé de façon précise par diffraction X sous incidence rasante, notamment par variation de l?angle d?incidence des photons sur l?échantillon de façon à pénétrer plus ou moins dans le film. Les films ont également été imagés par microscopie à force atomique, ce qui permet de déterminer l?état des surfaces et notamment l?absence de défauts. De la même façon qu?à la surface de l?eau, des domaines circulaires d?acide sont observés. Ces domaines coexistent avec une phase continue qui présente une structure labyrinthique attribuée à une réorganisation moléculaire lors du transfert.<br />Nous avons ainsi obtenu un système bien adapté à l?étude des propriétés de mouillage de surfaces inhomogènes puisqu?il présente deux phases séparées possédant chacune des propriétés différentes.

Maîtriser l'impact des maladies sur les cultures est un défi majeur de l'agriculture moderne. Cette préoccupation est un aspect important de l'optimisation de la productivité, notamment en viticulture. En France, le mildiou de la vigne causé par Plasmopara viticola est une des maladies cryptogamiques responsable des épidémies les plus dévastatrices et les plus redoutées. Les traitements reposent sur l'utilisation préventive, systématique et onéreuse de composés chimiques antifongiques dont l'utilisation massive constitue un risque à la fois pour l'homme et l'environnement. La réduction de l'utilisation de fongicide implique le développement d'outils de diagnostic au champ, qui requiert la compréhension des interactions entre la plante et les agents pathogènes. Les travaux de cette thèse pluridisciplinaire ont porté sur le pathosystème Plasmopara viticola - Vitis vinifera, notamment pour répondre à l'intérêt croissant pour un outil de diagnostic en temps réel de la maladie utilisable au vignoble. Les stilbènes sont des phytoalexines impliqués dans la défense de certaines plantes supérieures vis-à-vis de stress biotiques et abiotiques. L'autofluorescence de ces composés phénoliques, dont la biosynthèse est induite dans les feuilles de vigne par P. viticola, en fait un potentiel marqueur naturel de l'infection. En effet, la faible autofluorescence bleu-verte des feuilles de vigne saines est considérablement renforcée par l'autofluorescence violet-bleue des stilbènes à la surface de feuilles de vigne infectée par P. viticola. Cette étude a montré que quelque soit le niveau de résistance du génotype, l'autofluorescence violet-bleue des stilbènes induit par l'infection est présente au niveau des parois des cellules de l'épiderme. En dehors de la concentration, la viscosité s'est révélé être la principale variable physico-chimique influençant l'intensité de l'autofluorescence des stilbènes dans les différents compartiments cellulaires des feuilles de vigne. Ceci explique la fluorescence intense des parois, particulièrement rigides, des cellules de garde (stomates) des feuilles infectées. Le suivi cinétique journalier a révélé la nature transitoire de l'autofluorescence des stilbènes lors de l'infection. La robustesse et l'intérêt de ce signal a également été validée par la mesure à différentes échelles (de la cellule à la feuille entière) et avec différentes méthodes fluorimétriques. Les résultats de ce travail ont permis des avancées sur la connaissance du rôle de composés phénoliques induits et constitutifs dans la défense contre P. viticola. En plus de la localisation de l'autofluorescence des stilbènes en surface des feuilles, la microscopie confocale couplée à la microspectrofluorimetrie a révélé différentes localisations de ces phytoalexines dans la profondeur des tissus en corrélation avec le niveau de résistance des génotypes. L'utilisation de l'autofluorescence des stilbènes comme marqueur de l'infection a permis de mettre en évidence : 1) le fait que les flavonols constitutifs des feuilles de V. vinifera retardent le développement de l'infection par P. viticola; et 2) le fait que les acides hydroxycinnamiques constitutifs ne semble pas participer à la défense contre P. viticola. Enfin, une nouvelle méthode de diagnostic non-destructive du mildiou sur feuille basée sur l'autofluorescence des stilbènes a été développée. Elle a montré une détection pré-symptomatique du mildiou sur les feuilles de vigne entières dès le premier jour après l'infection sur la face abaxiale et le troisième jour sur la face adaxiale. Cette méthode de diagnostic du mildiou a été validée au laboratoire notamment grâce à un prototype de capteur proximal développé en collaboration avec la société Force-A. La validation de la méthode au vignoble dans le cadre d'infection naturelle est la prochaine étape pour une utilisation de ce capteur optique dans le cadre de l'agriculture durable et de la sélection variétale.

L’adhésine impliquée dans l’adhérence diffuse (AIDA-I) est une adhésine bactérienne présente chez certaines souches d’Escherichia coli qui, associée aux toxines Stx2e ou STb, contribue à l’apparition de la maladie de l’œdème ou de la diarrhée post-sevrage chez les porcelets. AIDA-I est un autotransporteur qui confère des capacités d’autoaggrégation, de formation de biofilms et d’adhésion. L’objectif principal du projet de recherche consistait en la recherche de récepteur(s) potentiel(s) d’AIDA-I. Les bactéries pathogènes adhèrent aux cellules-cibles soit en liant directement des molécules à la surface cellulaire ou en utilisant des molécules intermédiaires qui permettent de diminuer la distance séparant la bactérie de la cellule-cible. Puisque le sérum est un fluide qui contient de nombreuses molécules, celui-ci a été utilisé comme matériel de départ pour l’isolement de récepteur(s) potentiels. Nous avons isolé un récepteur potentiel à partir du sérum porcin : l’apolipoprotéine A-I. L’interaction entre l’apolipoprotéine A-I et AIDA-I a été confirmée par ELISA et microscopie à fluorescence. La capacité à envahir les cellules épithéliales offre aux pathogènes la possibilité d’établir une niche intracellulaire qui les protègent contre les attaques du milieu extérieur. La présente étude a démontré que la présence d’AIDA-I en tant que seul facteur de virulence chez une souche de laboratoire permet de conférer la capacité d’envahir les cellules sans promouvoir la survie intracellulaire. L’étude de la souche sauvage 2787, exprimant AIDA-I en association avec d’autres facteurs de virulence, a démontré une différence significative pour les phénotypes d’invasion et de survie intracellulaire face à la souche de laboratoire exprimant AIDA-I. / The adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I) is a bacterial adhesin associated with some Escherichia coli strains that might, when associated with toxin Stx2e or STb, contribute to the development of edema disease or post-weaning diarrhea in piglets. AIDA-I is an autotransporter that mediates various phenotypes such as adhesion, autoaggregation and biofilm formation. The main aim of our project was to find potential receptor(s) for AIDA-I. Pathogens can either bind cell directly by targeting exposed cell surface molecules or use an intermediate molecule as a bridge to lessen the space separating them from their target cell. Serum is known to contain a wide range of molecules so it has been used as raw material for the isolation of a putative receptor for AIDA-I. We isolated a putative receptor for AIDA-I: the apolipoprotein A-I. The interaction between the apolipoprotein A-I and AIDA-I was confirmed by ELISA and fluorescent microscopy. The capacity to invade epithelial cell enables pathogens to create an intracellular niche that protects them against attacks from the extracellular environment. The present report has shown that the presence of AIDA-I as the sole virulence factor in a laboratory strain, enable bacteria to invade cultured cells but does not promote intracellular survival. Studies conducted on wild-type strain 2787, which express AIDA-I in association with other virulence factors, has shown a significant difference in invasion and intracellular survival phenotypes compared to the laboratory strain expressing AIDA-I.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Pour certaines problématiques biomédicales, notamment en neurobiologie, l'imagerie des échantillons exige des résolutions spatiale et temporelle élevées, et seules des techniques de microscopie optique innovantes vont permettre d'imager la cellule dans des conditions physiologiques. Pour répondre à ces contraintes nous avons développé en intégralité un dispositif de microscopie de fluorescence en réflexion totale interne et résolue en temps. En effet, l'imagerie de fluorescence résolue en temps (FLIM) permet, en complément des informations de localisation et de topologie apportées par la microscopie conventionnelle, une analyse dynamique de processus moléculaires et métaboliques au sein des cellules. Associée à la technique de microscopie en réflexion totale interne, qui confère au système d'imagerie une résolution axiale sub-longueur d'onde tout en acquérant des images en champ large, la technique FLIM permet d'analyser l'activité membranaire des cellules en s'affranchissant de la fluorescence des autres entités de la cellule.<br />Ce travail s'est articulé autour de trois axes principaux : l'étude et le développement d'un dispositif d'excitation de la fluorescence basé sur un oscillateur laser solide picoseconde dont le spectre est élargi par effets non linéaires dans des fibres optiques microstructurées ; le développement et la caractérisation d'un dispositif de microscopie de fluorescence par onde évanescente (TIRF) couplé à une détection résolue en temps en plein champ ; et l'application de ce dispositif à l'étude d'un précurseur membranaire du peptide amyloïde impliqué dans la maladie d'Alzheimer.

Ce mémoire rapporte deux approches de la synthèse des protéines à l'échelle de la molécule unique. Nous utilisons la microscopie de fluorescence en onde évanescente pour sonder l'activité traductionnelle de deux types de ribosomes. Les premiers, issus d'E. Coli (organisme procaryote), sont mutés afin de les marquer d'un nanocristal semiconducteur (QD). La fin de la traduction, qui correspond au décrochage du ribosome de l'ARNm lorsque celui-ci atteint le codon stop, est alors mise en évidence par la disparition du QD de la surface de l'échantillon. Le deuxième type de ribosome étudié est quant à lui extrait de cellules de lapins (organisme eucaryote) et est dit "sauvage", c'est à dire qu'il n'a pas subi de modification, tandis qu'un oligonucléotide marqué d'un fluorophore est hybridé à l'ARNm. L'activité hélicase du ribosome lui permettant de séparer deux brins complémentaires, l'oligonucléotide et donc le fluorophore disparaissent en même temps que le ribosome parcourt l'ARNm, permettant ainsi de sonder l'activité du ribosome. Nous donnons pour ces deux types de ribosomes une vitesse moyenne de la traduction dans des milieux contenant les facteurs de la traduction issus d'extraits cellulaires.La deuxième approche de la synthèse des protéines porte sur les propriétés de l'ARNm, support de l'information génétique codant pour la séquence des protéines. Nous avons développé un montage de pince optique permettant de manipuler et caractériser les propriétés mécaniques d'oligonucléotides, ainsi qu'une méthode originale de calibration de ce piège optique. La cohérence de nos mesures sur l'étirement d'un double brin d'ADN avec la littérature nous permettra de poursuivre notre étude sur la mesure des forces nécessaires pour ouvrir une structure secondaire de l'ARNm.

L’utilisation de chromophores absorbant à deux photons (ADP) pour des applications en photothérapie dynamique (PDT) et en imagerie de fluorescence présente de nombreux avantages. Les propriétés non-linéaires de ces chromophores permettent notamment d’améliorer la longueur de pénétration dans les organismes vivants ainsi que la résolution. Pour des applications in-vivo la biocompatibilité de ces chromophores lipophiles doit aussi se poser. Une étude d’ingénierie pour le développement de chromophores pour la PDT-ADP en utilisant des atomes de brome comme groupe générateur d’oxygène singulet est décrite. Différents paramètres dont le nombre et la position des atomes de brome sur la chaîne carbonée, la longueur de conjugaison, la géométrie des chromophores ont été étudiés. Cette étude permet de mettre en évidence l’importance de la position des substituants bromes et de la symétrie sur le rendement de croisement inter-système.Les observations spectroscopiques faites lors de l’étude d’ingénierie ont permis de développer des chromophores pour la microscopie de fluorescence à deux photons. La biocompatibilité est apportée grâce à un polymère d’(hydroxyethyl)acrylate. Ce polymère permet de créer une coquille hydrosolubilisante covalente. Ces chromophores ont été utilisés pour faire de l’imagerie de vascularisation cérébrale de haute résolution. Une observation particulière sur un chromophore, marquage des cellules endothéliales des parois des vaisseaux sanguins intravitaux ainsi que les applications en résultant sont présentées. Des stratégies visant l’amélioration de la sélectivité des systèmes polymères/chromophores pour des applications intravitales, comme le traitement des tumeurs cancéreuses sont décrites. Une stratégie de modification des fonctions hydroxy des chaînes polymères par des groupements imidazoliums est présentée. L’étude de complexation des polymères avec l’ADN et les études spectroscopiques in-cellulo ont été réalisées. / The use of two-photon absorbing (TPA) chromophore for applications in photodynamic therapy (PDT) and fluorescence imaging provides many advantages. The non-linear properties make it possible to increase both observation depth in animals and 3D resolution. Nevertheless, for in-vivo applications, improving bio-compatibility of these inherently lipophilic chromophore is a challenge. The development of new chromophores for PDT-TPA using a molecular engineering approach using bromide substituents as singlet oxygen generators is described. Parameters like position and number of bromide, the conjugated length and chromophore symmetry are studied. The study shows the importance of bromide atom position and of the symmetry on the inter system crossing efficiency. During the engineering study, spectroscopic observation and rationalization permit to envision the design of new chromophores for two photon laser scanning fluorescent microscopy. Bio-compatibility of these chromophores is provided by (hydroxyethyl)acrylate polymer, which provides a covalent water-soluble shell. These chromophores are used to make high resolution image of cerebral vascularization. One of these chromophores shows intravital specific interaction with endothelial cells in blood vessels. Some applications of the chromophore are described. Strategies to increase the intravital selectivity of polymer/chromophores units towards cancer cells and tumor are presented. A modification of hydroxyl function by imidazolium group is described. This new chromophore is evaluated towards its complexation properties with DNA and in cellulo spectroscopic studies.

La microscopie SEEC (Surface Enhanced Ellipsometric Contrast) est une technique inventée au mans, il y a une dizaine d’années. Elle permet de visualiser des objets de taille nanoscopique entre polariseur et analyseur croisés en utilisant les propriétés non dépolarisantes de surfaces multicouches. Jusqu’au début de la thèse, seules des observations à l’air étaient possibles. Le but de cette thèse a consisté à adapter cette technique à l’observation in-situ d’objets en immersion dans l’eau.Pour cela, il a fallu inventer de nouvelles surfaces propres à ce nouveau milieu. Les calculs ont montrés que des surfaces fines d’or révélaient un bon contraste pour des objets de 1 nm en immersion dans l’eau. Expérimentalement, nous avons montré que pour exploiter au maximum le contraste SEEC, il est nécessaire de modifier l’éclairage. En parallèle de ces travaux expérimentaux, de nouveaux calculs ont montrés que l’utilisation d’épaisseurs encore plus fines permettait de visualiser ces objets avec un bon contraste et sans aucune modification de l’éclairage. Nous avons appelé cette nouvelle technique : la microscopie CONE. Nous avons découvert deux modes de mesure. Après avoir réalisé des fonctionnalisations homogènes et hétérogènes des surfaces d’or. Ces surfaces ont été utilisées en résonance plasmonique de surface (SPR) pour l’étude de fixation de protéine (adsorption et immobilisation) puis d’interaction protéine/protéine. Ces expériences ont ensuite servies de référence pour évaluer les microscopies SEEC et CONE. Par cela, nous avons prouvé que ces microscopies présentent de forts intérêts pour la détection in-situ de protéines avec un faible coût. / This thesis was supported by National Agency for Research with the project: ANR PNANO-07 SEEC. The Surface Enhanced Ellipsometric Contrast (SEEC) microscopy has invented in 2000 at Le Mans (France). This technique allows the visualization of nanoscopic object between crossed analyzer and polarizer. It’s possible if some special multilayer surfaces are used. There surfaces must have the particularity to not change the polarization of light during the reflection. Until the beginning of the project the SEEC microscopy was useful only for air observations. The goal of the thesis was to adapt this technique to observe on gold surfaces immerged in water and to compare the performance of the SEEC microscopy with Surface Plasmonique Resonance (SPR) in that configuration. The SPR is a biomolecular interaction study reference technique. SEEC microscopy lateral resolution was evaluate by fluorescence microscopy. Next, we realize two model experiments monitor in parallel by SEEC microscopy and by SPR: BSA immobilization and biotinylated IgG fixation by immobilized streptavidine. To compare measurements efficiently we did a huge preparation work (surface functionalizations and microfluidic) to have exactly same conditions in both techniques.Our results show SEEC microscopy cannot replace SPR for biomolecular interaction studies but it can be used as cheap immunological diagnostic technique. This work gives the path to follow on that direction.

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Nous nous intéressons à la détection et au suivi d'objets biologiques divers (cellules, noyaux, etc.) dans des images et séquences tri-dimensionnelles acquises en microscopie par fluorescence. L'observation de phénomènes biologiques in situ étant de plus en plus cruciale pour les experts, il est nécessaire, en plus de l'analyse quantitative, d'effectuer un rendu volumique 3D de la scène et des objets qui y évoluent. De plus, l'automatisation des techniques d'acquisition d'images requiert un haut niveau de reproductibilité des algorithmes et induit souvent des contraintes de temps de calcul que nous nous efforçons de prendre en compte.<br /><br />Les modèles déformables, également connus sous le nom de contours actifs, font actuellement partie des méthodes de pointe en analyse d'images pour la segmentation et le suivi d'objets grâce à leur robustesse, leur flexibilité et leur représentation à haut niveau sémantique des entités recherchées. Afin de les adapter à notre problématique, nous devons faire face à diverses difficultés. Tout d'abord, les méthodes existantes se réfèrent souvent aux variations locales d'intensité (ou gradients) de l'image pour détecter le contour des objets recherchés. Cette approche est inefficace en microscopie tridimensionnelle par fluorescence, où les gradients sont très peu prononcés selon l'axe de profondeur de l'image. Ensuite, nous devons gérer le suivi d'objets multiples susceptibles d'entrer en contact en évitant leur confusion. Enfin, nous devons mettre en place un système permettant de visualiser efficacement les contours durant leur déformation sans altérer les temps de calcul.<br /><br />Dans la première partie de ce travail, nous pallions à ces problèmes en proposant un modèle de segmentation et de suivi multi-objets basé sur le formalisme des lignes de niveaux (ou level sets) et exploitant la fonctionnelle de Mumford et Shah. La méthode obtenue donne des résultats quantitatifs satisfaisants, mais ne se prête pas efficacement au rendu 3D de la scène, pour lequel nous sommes tributaires d'algorithmes dédiés à la reconstruction 3D (e.g. la méthode des "Marching Cubes"), souvent coûteux en mémoire et en temps de calcul. De plus, ces algorithmes peuvent induire des erreurs d'approximation et ainsi entraîner une mauvaise interprétation des résultats.<br /><br />Dans la seconde partie, nous proposons une variation de la méthode précédente en remplaçant le formalisme des lignes de niveaux par celui des maillages triangulaires, très populaire dans le domaine de la conception assistée par ordinateur (CAO) pour leur rendu 3D rapide et précis. Cette nouvelle approche produit des résultats quantitatifs équivalents, en revanche le formalisme des maillages permet d'une part de réduire considérablement la complexité du problème et autorise d'autre part à effectuer un rendu 3D précis de la scène parallèlement au processus de segmentation, réduisant d'autant plus les temps de calculs.<br /><br />Les performances des deux méthodes proposées sont d'abord évaluées puis comparées sur un jeu de données simulées reproduisant le mieux possible les caractéristiques des images réelles. Ensuite, nous nous intéressons plus particulièrement à l'évaluation de la méthode par maillages sur des données réelles, en évaluant la robustesse et la stabilité de quelques descripteurs de forme simples sur des expériences d'imagerie haut-débit. Enfin, nous présentons des applications concrètes de la méthode à des problématiques biologiques réelles, réalisées en collaboration avec d'autres équipes de l'Institut Pasteur de Corée.