Bei der vorliegenden Arbeit handelt es sich um eine experimentell durchgeführte Charakterisierung von CD11c-positiven Zellen des Gehirns im direkten Vergleich zu CD11c-positiven Zellen aus Lunge, Leber und Milz. Mittels Konfokal- und Fluoreszenzmikroskopie wurde die Existenz von intraparenchymalen Zellen nachgewiesen, welche den Zellmarker für Dendritische Zellen CD11c exprimieren. Durch die Etablierung einer einheitlichen Isolierungsmethode von CD11c-positiven mononukleären Zellen aus dem Gehirn, Milz, Lunge und Leber, war es uns möglich, diese mittels Durchflusszytometrie, auf die Expression wichtiger Marker für mononukleäre Zellen zu untersuchen und phänotypisch miteinander zu vergleichen. Durch diese Zellanalysen zeigten wir, dass CD11c-positive Zellen des Gehirns sowohl aufgrund ihrer spezifischen CD45-Expression, als auch durch die Expression von CD11b einen Mikrogliaphänotyp aufwiesen. Dabei konnten wir beobachten, dass CD11c-positive Zellen aus dem Gehirn einzigartig in der Eigenschaft ihrer geringen Major Histocompatibility Complex (MHC)-II-Expression sind. Mit Hilfe einer transgenen Mauslinie, welche unter dem Promotor von MHC-II das grün-fluoreszierende Protein (GFP) exprimiert, konnten wir nachweisen, dass Mikroglia selbst in der Umgebung von MHC-II-positiven Zellen, kultiviert auf Schnittkulturen der Milz, ihre MHC-II-Negativität behalten. Im Vergleich dazu adaptierten sich MHC-II-positive Splenozyten, kultiviert auf Schnittkulturen vom Hippocampus, an die neue Umgebung und verringerten die Expression von MHC-II. Unsere Daten lassen also die Schlussfolgerung zu, dass sich CD11c-positive Mikroglia hinsichtlich ihrer Expression von MHC-II intrinsisch von CD11c-positiven Zellen anderer Organe unterscheiden. Ebenso scheinen auch lokale Faktoren im Gehirn dazu beizutragen, die Expression von MHC-II unter physiologischen Bedingungen wirkungsvoll zu unterdrücken.

Die Glutaminylzyklase QC und ihr Isoenzym isoQC katalysieren die Umwandlung N-terminaler Glutaminylreste an einer Reihe von Neuropeptiden, Peptidhormonen und Chemokinen in Pyroglutamat. Diese post-translationale Modifikation schützt Proteine vor proteolytischem Abbau und trägt auch zu ihrer biologischen Aktivität bei. Im Falle der Alzheimerschen Erkrankung führt QC/isoQC-Aktivität allerdings zur Stabilisierung des Aβ-Peptids und begünstigt damit dessen Akkumulation und Aggregation in Amyloid-Plaques. Beide Enzyme unterscheiden sich in ihrer zelltypspezifischen Expression und ihrer Substratspezifität in vivo. Die QC kommt eher in neuronalen Geweben als sekretorisches Enzym vor, während die isoQC ubiquitär exprimiert wird und im Golgi-Apparat verankert ist. Im Gegensatz zur QC ist die isoQC beispielsweise in der Lage, das proinflammatorische monocyte chemoattractant protein 1 (MCP1, auch CCL2 genannt) in seinen aktiven Zustand zu überführen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb untersucht werden, inwieweit beide Isoenzyme in chronische Entzündungsprozesse involviert sind. Als Modell für diese Untersuchungen wurde die systemische Cuprizon-Applikation als tierexperimenteller Ansatz für die nicht-invasive Induktion einer Entzündungsreaktion im Gehirn gewählt, um folgende Fragestellungen zu beantworten: 1. Lässt sich die Entzündungsreaktion, die durch Cuprizongabe ausgelöst wird, mittels Iba1-, GFAP- und Hitzeschockprotein 27 (Hsp27)-Immunhistochemie nachweisen? 2. Sind QC und isoQC an durch Cuprizon ausgelösten entzündlichen Prozessen beteiligt? 3. Unterscheiden sich QC- und isoQC-knock-out (ko)-Mäuse hinsichtlich der Entzündungsreaktion unter Cuprizongabe? Dazu wurden Wildtyp (WT)-Mäuse (n = 6), QC-ko (n = 3) und isoQC-ko (n = 3) Mäuse einer sechswöchigen Gabe von 0,3 % Cuprizon im Futter unterzogen, was Tagesdosierungen von 12,9–13,5 mg Cuprizon pro Tier entspricht. Das Cuprizon als Kupferchelator löst einen Demyelinisierungsprozess ähnlich der histopathologischen Veränderungen bei Multipler Sklerose aus, der mit Chemotaxis von Immunzellen und Aktivierung von Gliazellen einhergeht. Als Kontrollgruppe wurden je vier unbehandelte Geschwistertiere der Genotypen WT, QC- und isoQC-ko-Mäuse herangezogen. In der Arbeit wurden folgende Ergebnisse erzielt: 1. Die Gliazellaktivierung wurde mit einer immunhistochemischen Färbung von Iba-1, einem Marker für Mikroglia, saurem Gliafaserprotein (GFAP) als Astrozytenmarker und dem Nachweis von Hitzeschockprotein 27 untersucht. Die Mikroglia- und Astrozytenaktivierung wurde durch Ermittlung des prozentualen Gliaanteils pro Fläche der jeweiligen Hirnregion erfasst, Hsp27-exprimierende Gliazellen wurden in jeder untersuchten Hirnregion an standardisierten mikroskopischen Aufnahmen des BZ-9000 Mikroskops der Firma Keyence unter Zuhilfenahme der BZ-II-Analyzer-Software manuell ausgezählt. Die ermittelten Flächen und Zellzahlen wurden mit der Graph-Pad-Prism 6-Software mittels ungepaarter t-Tests statistisch ausgewertet. Zu den Hirnstrukturen, die auf eine Entzündungsreaktion hin untersucht wurden, gehören das Corpus callosum, das Cingulum, die externe Kapsel, das Septum, das Striatum und dessen Faserbündel, der Cortex, die anteriore Kommissur, das ventrale Pallidum sowie der Hippocampus. Sowohl in Iba-1-, GFAP- und Hsp27-Färbung konnte bei den WT-Tieren in nahezu allen untersuchten Hirnregionen eine signifikante Erhöhung des Mikro- und Astroglia-Gewebeanteils sowie der Hsp27-Expression in Astrozyten nach Cuprizongabe gezeigt werden. Mikro- und Astrogliaaktivierung wurden bereits in früheren Studien mit Cuprizon-Applikation nachgewiesen, die Übereinstimmung der Ergebnisse zeigt die Wirksamkeit der Cuprizongabe und verdeutlicht die Entzündungsantwort auf zellulärer Ebene. Die Hsp27-Expression in Astrozyten konnte in dieser Arbeit erstmalig im Cuprizonmodell nachgewiesen werden und stellt eine neue, zelluläre Komponente der Entzündungsreaktion dar. 2. Mit Nachweis des Einflusses der isoQC auf die Aktivierung von CCL2 in peripheren Entzündungsmodellen vermutete man eine Beteiligung der Glutaminylzyklasen auch bei entzündlichen Prozessen im Gehirn. Es zeigte sich, dass QC-ko- und isoQC-ko-Tiere ohne Cuprizongabe im Mittel höhere gliäre Gewebeanteile und Hsp27-Expression aufwiesen als die unbehandelten WT-Geschwistertiere. In der hier stichprobenartig untersuchten Kohorte deutet dies auf eine Funktion der Glutaminylzyclasen für die Aktivierung von Gliazellen und eine teilweise Grundaktivierung in nativen QC-/ isoQC-ko-Tieren hin. Auf die Cuprizonbehandlung reagierten die ko-Tiere weniger stark als WT-Tiere mit Steigerung der Mikro- und Astrogliaaktivität oder erhöhter Hsp27-Expression. Das Fehlen der Glutaminylzyclasen führt somit möglicherweise zur Dämpfung einer chronischen Entzündungsantwort. 3. Inwiefern beide Glutaminylzyklasen zur vermuteten Entzündungshemmung beitragen, war ein weiterer Teil der Promotionsarbeit. Betrachtete man die Mikroglia in unbehandelten Tieren, zeigte sich in isoQC-ko-Mäusen eine höhere Grundaktivität als in WT- und QC-ko-Genotyp. Die dadurch im Verhältnis geringere Steigerung der Mikrogliaaktivität nach Cuprizongabe bei den isoQC-ko-Tieren im Vergleich zu Tieren des WT oder QC-ko-Genotyps könnte auf die fehlende Aktivierung des CCL2 zurückgeführt werden. Der isoQC-ko-Genotyp zeigte auch bei der Hsp27-Färbung unter den drei untersuchten Genotypen die geringste Steigerung der Hsp27-Expression nach Cuprizongabe, sodass die isoQC möglicherweise bei der Stimulation zur Expression dieses Hitzeschockproteins beteiligt ist. In den Iba-1-Färbungen zeigte sich auch, dass bei den QC-ko-Tieren unter Cuprizonapplikation Mikroglia in geringerem Maße aktiviert wird als bei WT- und isoQC-ko-Mäusen. Außerdem ergab die Auswertung der Hsp27-Expression von Astrozyten eine im Vergleich stark erhöhte Hsp27-Expression vor Cuprizongabe bei den QC-ko-Tieren. Das Fehlen der vorwiegend neuronal vorkommenden QC in den hier untersuchten zentralnervösen Strukturen hat möglicherweise gravierendere Auswirkungen auf zelluläre entzündliche Prozesse als das Fehlen der isoQC, die, ubiquitär vorkommend, weniger spezifische Aufgaben in Neuronen innehaben könnte. Die Arbeit zeigt, dass sich das Cuprizon-Modell eignet, einen chronischen Entzündungsprozess im Gehirn nachzustellen, um nachgeschaltete inflammatorische zelluläre Reaktionen eines Organismus zu untersuchen. Die Betrachtung von Mikrogliaaktivierung und Hsp27-Expression scheint für die Untersuchung des Cuprizon-Modells besser geeignet zu sein als die Auswertung der Astrogliaaktivität, da die fein nuancierten Unterschiede zwischen den betrachteten Glutaminylzyklasen in den GFAP-Färbungen weniger gut nachweisbar waren. Um die oben dargelegten Ergebnisse besser statistisch untermauern zu können, sollte in fortführenden Untersuchungen eine höhere Anzahl an Tieren pro Versuchsgruppe angestrebt werden.:Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis III Abbildungsverzeichnis V Tabellenverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Glutaminylzyklasen 1 1.2 Das Cuprizon-Modell 3 1.2.1 Einführung in das Demyelinisierungsmodell 3 1.2.2 Aktivierung von Gliazellen 4 1.3 Mechanismen von Entzündungsreaktionen 5 1.3.1 Mikroglia 6 1.3.2 Astroglia 7 1.3.3 Hsp27 8 1.4 Zielstellung 9 2 Material und Methoden 10 2.1 Vorgehen bei der Cuprizonbehandlung 10 2.2 Versuchstiere 10 2.3 Präparation und Aufarbeitung des Hirngewebes 11 2.4 Auswahl der Schnittebenen 12 2.5 Durchführung der immunhistochemischen Färbungen 16 2.6 Durchführung der Fluoreszenz-Färbungen 19 2.7 Geräte 20 2.8 Hard- und Software 20 2.9 Auswahl von Färbungen und Hirnregionen für die Auswertung 21 2.9.1 Auswahl und Auswertung der Iba1-Färbung 21 2.9.2 Auswahl und Auswertung der GFAP-Färbung 23 2.9.3 Auswahl und Auswertung der Hsp27-Färbung 24 3 Ergebnisse 25 3.1 Nachweis der Mikroglia-Aktivierung mittels Iba1-Färbung 26 3.1.1 Vergleich der unbehandelten Genotypen hinsichtlich des Gewebeanteils von Mikroglia 30 3.1.2 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Mikrogliaaktivierung bei Wildtyp-Mäusen 33 3.1.3 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Mikrogliaaktivierung bei QC-ko-Mäusen 35 3.1.4 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Mikrogliaaktivierung bei isoQC-ko-Mäusen 36 3.1.5 Vergleich der behandelten Genotypen hinsichtlich der Mikrogliaaktivität nach Cuprizonbehandlung 38 3.2 Nachweis der Astroglia-Aktivierung mittels GFAP-Färbung 40 3.2.1 Vergleich der unbehandelten Genotypen hinsichtlich des Gewebeanteils von Astroglia 44 3.2.2 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Astrogliaaktivierung bei Wildtyp-Mäusen 46 3.2.3 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Astrogliaaktivierung bei QC-ko-Mäusen 48 3.2.4 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Astrogliaaktivierung bei isoQC-ko-Mäusen 49 3.2.5 Vergleich der behandelten Genotypen hinsichtlich der Astrogliaaktivität nach Cuprizonbehandlung 50 3.3 Nachweis von Hsp27-Expression nach Cuprizonbehandlung 51 3.3.1 Vergleich der unbehandelten Genotypen hinsichtlich des Gewebeanteils von Hsp27-exprimierenden Astrozyten 53 3.3.2 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Hsp27-Expression in Astrozyten bei Wildtyp-Mäusen 56 3.3.3 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Hsp27-Expression in Astrozyten bei QC-ko-Mäusen 57 3.3.4 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Hsp27-Expression in Astrozyten bei isoQC-ko-Mäusen 58 3.3.5 Vergleich der behandelten Genotypen hinsichtlich der Hsp27-Expression in Astrozyten nach Cuprizonbehandlung 59 4 Diskussion 61 Verweise X Zusammenfassung der Arbeit XXII Persönlicher und wissenschaftlicher Werdegang XXIV Eigenständigkeitserklärung XXV Danksagung XXVII

Das Chemokin SDF-1 spielt eine wichtige Rolle bei der Hämatopoese, bei Immunreaktionen sowie bei der Entwicklung des Herzens, der Extremitätenmuskulatur und des zentralen und peripheren Nervensystems. Lange Zeit galt CXCR4 als der einzige Chemokinrezeptor für SDF-1, bis vor wenigen Jahren CXCR7 als ein alternativer Rezeptor für SDF-1 identifiziert wurde. Da alle Zelltypen des zentralen Nervensystems (ZNS) sensitiv für SDF-1 sind, sollte in dieser Arbeit die Funktion der beiden Rezeptoren in primärer Mikroglia und primären Astrozyten untersucht werden. Bisher konnte CXCR7 nur als Scavenger-Rezeptor für SDF-1 oder als atypischer Chemokinrezeptor nachgewiesen werden. Die Untersuchungen ergaben einen mitogenen und chemotaktischen Effekt von SDF-1 auf primäre Mikroglia, wobei sowohl CXCR4 als auch CXCR7 für das SDF-1-Signalverhalten essentiell sind. Nach Aktivierung von Mikroglia in vitro und in vivo wurden beide Rezeptoren verstärkt expremiert. In primären Astrozyten ergab sich ein ligandenabhängiges Signalverhalten von CXCR7. So führte die Bindung von SDF-1 an CXCR7 zu einer Aktivierung von G-Proteinen, während die Kopplung von interferon-inducible T cell alpha chemoattractant (I-TAC), als zweiten Liganden von CXCR7, eine Signalweiterleitung über ß-Arrestin2 zur Folge hatte. Zudem konnte die G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase (Grk)2 als ein positiver Regulator des SDF-1-CXCR7-Signalverhaltens in Astrozyten identifiziert werden.

Die Invasion von Leukozyten in das zentrale Nervensystem (ZNS) ist ein wesentlicher Bestandteil bei der Pathogenese von Hirnverletzungen sowie akuten und chronischen Entzündungsvorgängen im Gehirn. Mikrogliazellen, die überwiegende Population immunkompetenter Zellen des ZNS, stellen die erste Verteidigungslinie im Hinblick auf Verletzungen und Erkrankungen des Gehirns dar. Im Rahmen vieler neurodegenerativer Erkrankungen wird die Zerstörung von Neuronen, aber auch die kollaterale Gewebsschädigung auf die Aktivierung der Mikrogliazellen zurückgeführt. Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmalig einen regulatorischen Aktivierungszustand der Mikroglia (CD40dimCD86dimIL-10high), der zur Induktion regulatorischer Foxp3+ T-Zellen (Treg) führt. Die Stabilität und funktionelle Aktivität Mikroglia-induzierter Treg konnte sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt werden. In vitro inhibierten sie die Proliferation antigen-spezifischer Effektorzellen, in vivo führte ein adoptiver Transfer der regulatorischen T-Zellen zur Abmilderung des Krankheitsverlaufes experimentell induzierter, autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE). Mikrogliazellen unterstützten sowohl die Proliferation bereits ausgebildeter regulatorischer T-Zellen als auch deren Differenzierung aus naiven T-Zellen. Die Induktion regulatorischer T-Zellen durch Mikroglia war Major Histocompatibility Complex (MHC)-II-abhängig und antigenspezifisch. Für Untersuchungen zur in vivo Relevanz wurden MHC-II-chimäre Mäuse generiert und eine Läsion im entorhinalen Kortex gesetzt. Fehlte MHC-II in ZNS-residenten Zellen, wurden weniger regulatorische T-Zellen pro Leukozyt in die lädierten Hemispheren rekrutiert. Zusammenfassend demonstrieren diese Ergebnisse das Modulationspotential von Mikrogliazellen auf die CD4+ T-Zellantwort. Die Mikroglia-induzierte Differenzierung und Proliferation von Foxp3+ regulatorischen T-Zellen ist ein möglicher Mechanismus der Regulation von Entzündungsvorgängen im ZNS durch Mikrogliazellen. / The invasion of leukocytes into the central nervous system (CNS) is a key event in the pathogenesis of CNS injury and acute or chronic inflammatory neurological diseases. However, regulatory mechanisms of local innate immune responses that limit CNS inflammation are only poorly understood. Microglia are the predominant innate immune cells of the brain and present the first line of defence in CNS injury or disease. In the context of neurodegenerative disease, microglia activation accounts for collateral tissue damage and neurodestruction. This thesis for the first time describes a regulatory microglia phenotype (MHCII+CD40dimCD86dimIL-10high) that induced a strong Foxp3+ regulatory T cell (Treg) response. Microglia-induced Treg cells were stable and functionally active in vitro by inhibiting antigen-specific proliferation of effector T cells and in vivo, by attenuating experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) disease course after adoptive transfer. The data also suggested that regulatory microglia can mediate both, proliferation of Foxp3+ Treg cells and de novo differentiation from naive CD4+ T cells. Microglia-mediated Treg induction was proven to be MHCII and antigen-dependent. Using entorhinal cortex lesion (ECL) as a brain injury mouse model, diminished Foxp3+ Treg cell recruitment per infiltrated leukocyte in chimeric mice lacking MHCII specifically in the CNS was demonstrated, indicating in vivo relevance of antigen presentation by brain resident cells. Taken together, these findings demonstrate that microglial cells can directly modulate CD4+ T cell responses by regulating molecule levels for efficient antigen presentation and levels of secreted cytokines and chemokines. Microglia-mediated differentiation and proliferation of Foxp3+ Treg cells can be one of the mechanisms how microglia contribute to local immune homeostasis and limit CNS inflammation.

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Clinical findings have linked multiple risk factors and associated pathologies to Alzheimer\'s disease (AD). Amongst them are vascular risk factors such as hypertension and pathologies such as stroke. Coexistence of AD and these associated pathologies worsenes dementia, the clinical hallmark of the disease, as compared to pure AD. One general common denominator of these associated pathologies is the presence of hypoxic tissue conditions. It was asked the question, whether there exists a mutual, causal interaction between hypoxia and AD pathology, that could explain the clinical observations. Alternatively, the worsened clinical state of multiple brain pathologies could \"simply\" be the consequence of multimorbidity, i.e. accumulated disease load, without any causal interaction between the constituents. To approach this question whether hypoxia influences AD progression, use was made of a murine animal model of AD (transgenic mice: APPswe, PSEN1dE). Animals of two ages (8 and 14 months, \"young\" and \"old\" respectively) and two genotypes (transgenic and wild- type) were either treated under hypoxia or normoxia, corresponding to 8% and 21% oxygen, for 20 consecutive days. The resulting changes in the brain were assessed with a variety of techniques, namely by histology, ELISA, dot and Western blotting. Additional experiments in primary cell cultures were performed. Animals exposed to hypoxia showed an increased hematocrit (HCT), weight loss, reactive angiogenesis, but no infarctions. This illustrates that our hypoxic treatment put significant stress on the animals, without causing major pathologies. A large number of variables exists that could potentially be measured to assess the effect of hypoxia on AD. The focus was put on three of them: First, there is the Abeta1-42- protein, known to be the Abeta- isoform associated with the most detrimental disease progression. In AD, the self-combinatory Amyloid- beta peptide (Abeta) accumulates in the brain in so- called plaques, which is a main histologic finding of the disease. Its quantity was determined through histology and ELISA. Secondly, it was attempted to estimate the structural quality of the Abeta- protein by assessing the amount of A!- oligomers present. Abeta- protein does self- accumulate in various grades of complexity, i.e. as monomer, oligomer or fibril. Since oligomers are known to be the most neurotoxic \"species\" of the Abeta- protein, it was hypothesized that under hypoxic treatment their quantity could increase. And third, the organism\'s response to the Abeta- protein stimulus was investigated. Microglial cells have been described as the first cells to encounter the Abeta- protein \"threat\" in the shape of plaques, i.e. Abeta- protein aggregates. They then try to encapsulate and subsequently degrade them. Therefore, the attention was put on this cellular population. It was asked whether hypoxia could change the Abeta- protein quantity in the brain. This was assessed in two ways: First histologically, by staining for Abeta- protein depositions and quantifying them. Second, an ELISA was performed. Our findings state that hypoxic treatment does not alter the Abeta1-42 protein load in the brain, neither in young nor old animals, as assessed by histology and by total ELISA quantification of Abeta1-42 protein. Since hypoxia did not alter the quantity of the Abeta- protein, it was asked whether it influenced it qualitatively? If hypoxia increased oligomer formation, this change in the spectrum of the Abeta- species could, without any change in total Abeta- protein load, lead to increased neurotoxicity in animals under hypoxia. Initial experiments showed that oligomer formation in the brain seems to increase. However, this was not statistically significant and future experiments are necessary to evaluate this hypothesis further. It was then asked, whether hypoxia alters the cellular response to the protein. The total number of microglia in the hippocampal dentate gyrus, our structure of interest for practical purposes, and, it can be argued, by extension the brain, changes dynamically with various factors. First, transgenic animals present an increase in microglia. Second, microglia increase with age. Third, microglia decrease under hypoxia, but only do so significantly in old animals. Next, a parameter called \"plaque occupancy\" was coined to assess the microglia function to confront Abeta- plaques. Plaque occupancy is defined as the number of microglia in spatial proximity to one square millimeter of Abeta- plaque. This means, that microglia restricting one plaque are counted, and then normalized to this plaque\'s area. It was hypothesized that hypoxia would decrease plaque occupancy. Indeed, plaque occupancy roughly halved under hypoxia. Summarizing, our results demonstrate that long- term exposure to hypoxia significantly reduces the number of microglia. The reduced number results in significantly reduced plaque occupancy and compromizes the function of microglia to confront Abeta- plaques. The Abeta1-42 load, however, is not affected. On the other hand, Abeta shows an increased trend towards oligomer formation. A variety of possible explanations to these phenomena have been presented, that in our opinion deserve further investigation.

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Die Alzheimer-Demenz drängt immer mehr in den Fokus unserer Gesellschaft, doch ihre Pathophysiologie ist bisher nicht vollständig verstanden. Seit einigen Jahren ist das Enzym Glutaminylzyklase (QC) als wichtiger Katalysator der Bildung von Pyroglutamat-ß-Amyloid Inhalt intensiver Forschung. Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Expression der QC, welche bisher nur in Neuronen nachgewiesen wurde, in Astrozyten und Mikrogliazellen zu untersuchen. Da Gliazellen einen wichtigen Faktor der pathologischen Veränderungen neurodegenerativer Erkrankungen ausmachen, stellt sich die Frage nach ihrer kausalen Beteiligung an Prozessen, die zur Entstehung der Alzheimer-Demenz beitragen können. Für diese Studie wurden zwei Modelle gewählt, die zu einer spezifischen Aktivierung von Astrozyten und Mikrogliazellen als Reaktion auf eine Schädigung von Neuronen führten, zum einen nach Schädigung cholinerger Neurone durch das Neurotoxin 192-IgG-Saporin, zum anderen nach temporärer Okklusion der Arteria cerebri media. Die aktivierten Astrozyten zeigten eine deutliche Expression der QC, welche hingegen bei ruhenden Astrozyten im gesunden Gewebe nicht nachweisbar war, so dass von einer Hochregulation der Expression bei Aktivierung der Zellen ausgegangen werden kann. Weiterhin konnte die QC in Mikrogliazellen, die sich im phagozytierenden Stadium befinden, dargestellt werden. Diese Arbeit soll dazu beitragen die Zusammenhänge zwischen einer Aktivierung von Gliazellen nach einem Schädigungsereignis, wie zum Beispiel einer Ischämie bei Verschluss eines cerebralen Gefäßes, und der Entwicklung einer Alzheimer-Demenz aufzuklären.

Die vorliegende Arbeit beinhaltet experimentelle Untersuchungen zur neuroprotektiven Wirkung des körpereigenen Lipids L-alpha-Lysophosphatidylinositol (LPI). Die Vermittlung dieser Wirkung soll durch den zentralnervös exprimierten G-Protein-gekoppelten Rezeptor 55 (GPR55) erfolgen. Als Modelsystem diente die organotypische hippocampale Schnittkultur (OHSC) der Ratte, welche exzitotoxisch mittels N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) geschädigt wurde, um Neurodegeneration zu initiieren. Die Inkubation mit LPI nach NMDA-Schädigung reduzierte die Anzahl toter Neurone und die der Mikroglia in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus. Ein Clodronat-induzierter Verlust der Mikroglia und die siRNA-vermittelte Herabregulation von Gpr55 hoben jeweils den neuroprotektiven Effekt von LPI in der OHSC auf. Diese Beobachtungen wiesen auf eine Mikroglia- und GPR55 abhängige Neuroprotektion hin. LPI wirkte zudem synergistisch und verstärkte die (bekannter Maßen) durch Cannabinoide induzierte und über den Cannabinoid Typ 1 Rezeptor vermittelte Neuroprotektion. Ferner wurde Gpr55 mittels qPCR in Mikroglia und Astrozyten nachgewiesen. LPI steuerte außerdem die Expression von Gpr55 in Mikroglia und beeinflusste deren Migrationsverhalten. Die vorliegenden Ergebnisse machen deutlich, dass LPI in einem in vitro Modellsystem zur Untersuchung des sekundären neuronalen Schadens protektiv wirkt und für die Vermittlung dieser Neuroprotektion Mikroglia und GPR55 in Frage kommen.

Zur langfristigen Markierung von hämatogenen Zellen wurde Knochenmark mit dem Gen für das grüne fluoreszierende Protein (GFP) transduziert und in bestrahlte Empfängermäuse transplantiert. Die GFP-Expression im peripheren Blut dieser Tiere war über den untersuchten Zeitraum von vier Monaten stabil. Die Hirne der Empfängertiere wurden zu den Zeitpunkten zwei, vier, acht und fünfzehn Wochen nach Knochenmarktransplantation auf die Präsenz von GFP-exprimierenden Zellen untersucht. Es fand sich eine im Zeitverlauf zunehmende Einwanderung und Differenzierung von GFP-exprimierenden hämatogenen Zellen zu ramifizierten Mikrogliazellen in der grauen und weißen Substanz. Nach vier Monaten stammten bis zu ein Viertel aller regionalen Mikrogliazellen aus dem transplantierten Knochenmark. Nach fokaler cerebraler Ischämie wanderten deutlich mehr GFP-positive Zellen aus dem Blut in das ischämische Areal ein und differenzierten zu ramifizierten Mikrogliazellen. Diese Ergebnisse implizieren einen Weg für den Transfer des humanen Immunodefizienzvirus in das Zentralnervensystem und offerieren einen nichtinvasiven Weg, genetisch manipulierte Zellen in das adulte Hirnparenchym einzuschleusen. / In order to stably label hematogenous cells, bone marrow was transduced with the gene for the green fluorescent protein (GFP) and transplanted into irradiated recipient mice. The GFP- expression in peripheral blood cells of these animals was stable within the examined time frame of four months. Brains of recipient animals were examined for the presence of GFP- expressing cells at two, four, eight and fifteen weeks after bone marrow transplantation. An increasing migration and differentiation of hematogenous GFP-expressing cells into ramified parenchymal microglia within the white and grey matter was found. After four months, up to quarter of regional microglia were bone-marrow derived. Following focal cerebral ischemia, an increased influx of GFP-positive blood-borne cells differentiating into ramified microglia was observed. These results imply a route for the human immunodeficiency virus into the central nervous system, and they offer a noninvasive approach for the transfer of genetically manipulated cells into the adult brain parenchyma.