Bicarbonato é uma importante espécie química para os seres vivos, sendo o principal tampão celular, alem de apresentar uma negligenciada atividade redox. Isquemia é um evento no qual existe inibição do aporte de nutrientes e oxigênio, sendo a reperfusão o retorno do fluxo de nutrientes e oxigênio, que é acompanhada por alta produção de radicais livres e morte celular. Nessa tese estudamos o efeito da presença de bicarbonato durante a isquemia-reperfusão. Em nosso modelo nós mantivemos o pH constante e modulamos a quantidade de bicarbonato enquanto células, órgãos e animais foram submetidos a isquemia-reperfusão. Utilizamos condições sem a presença de bicarbonato, a concentração basal sanguínea e uma concentração mais alta simulando o acúmulo de bicarbonato em condições isquêmicas. Nesses diversos modelos mostramos que a presença de bicarbonato aumenta o dano provocado por isquemia-reperfusão e provoca um aumento do acúmulo de proteínas oxidadas. A presença do bicarbonato não modifica a respiração, produção de espécies reativas de oxigênio, ou a morfologia mitocondrial, também não detectamos mudança na atividade do proteassoma e nos indicadores de autofagia geral. Entretanto detectamos um acúmulo de marcadores autofágicos na fração mitocondrial indicando inibição da mitofagia. Essa inibição foi confirmada ao detectarmos o acúmulo de uma proteína degradada especificamente por mitofagia enquanto não houve mudança em outra degradada pelo proteassoma. Além disso, ao inibirmos farmacologicamente a autofagia, reproduzimos o fenótipo causado pelo bicarbonato mesmo na sua ausência. Em conclusão, a presença de bicarbonato é deletéria em condições de isquemia/reperfusão devido a inibição da mitofagia / Bicarbonate is an important molecule in all living being, acting as the main cellular buffer. However, its biological and redox activity has been mostly neglected to date. Ischemia is an event in which an inhibition of nutrient availablity and oxygen flow occurs, while reperfusion is the return of nutrients and oxygen, accompanied of a burst of reactive oxygen species production and cell death. Here, we studied the effects of bicarbonate during cardiac ischemia-reperfusion. In our model, we kept the pH stable and changed the concentration of the bicarbonate. We then subjected cells, organs and animals to ischemia-reperfusion under conditions where there was no presence, basal blood concentration or a higher concentration of bicarbonate. In these diverse models, we found that the presence of bicarbonate increased damage after a ischemia-reperfusion, and promoted the accumulation of oxidized proteins. Bicarbonate did not change respiration, production of reactive oxygen species or the morphology of the mitochondria. There were also no changes in proteasome activity and in global autophagy markers, although there was an accumulation of mitophagy markers. We also found that mitophagy was responsible for the increased damage observed, since pharmacological inhibiting of autophagy abolished the increased damage caused by the presence of bicarbonate. In conclusion the presence of bicarbonate is deleterious in ischemia-reperfusion due mitophagy inhibition

O Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso e saprofítico, encontrado em todas as regiões do mundo, desempenhando um importante papel na reciclagem de carbono e nitrogênio do solo. A principal forma de infecção ocorre através da inalação dos conídios com predominância de infecções no trato respiratório, principalmente em pacientes imunocomprometidos. A mitocôndria de A. fumigatus foi caracterizada em nosso laboratório, que revelou a presença de uma respiração resistente a cianeto mediada pela oxidase alternativa. A clonagem e sequenciamento deste gene foram realizadas através de screening de uma biblioteca de DNA genômico. O alinhamento das sequências genômica e de cDNA mostrou a presença de dois introns, que após splicing codifica uma proteína contendo 352 aminoácidos, possuindo uma massa molecular estimada de 40,84 kDa e um pI teórico de 9,51. Além disso, foram identificados domínios altamente conservados (LET, NERMHL, LEEA e RADEH) que interagem com átomos de ferro e estão contidos em -hélices propostas como responsáveis pela organização estrutural da enzima. A fim de caracterizar bioquimicamente esta proteína, a sequência de cDNA do gene foi clonada em plasmídeo pYES2 e expressa em S. cerevisiae INVSc1 como um modelo eucarioto. Após expressão, a proteína encontrou-se de forma ativa, conferindo à levedura uma respiração resistente a cianeto. Esta característica herdada provocou uma discreta diminuição na taxa de crescimento em meio não-fermentativo e uma capacidade de sobrevivência na presença de KCN. Acredita-se que a atividade das AOXs esteja diretamente relacionada com a presença de diferentes espécies reativas de oxigênio (ERO). Neste contexto, a avaliação do efeito de diferentes agentes pró-oxidantes provocou um aumento na atividade e na expressão da enzima. Paralelamente, a caracterização funcional do gene foi realizada através da técnica de interferência por RNA, utilizando o vetor de expressão pALB1. Em meio contendo maltose, as cepas pALB1/aoxAf apresentaram coloração branca devido ao silenciamento do gene alb1. Os níveis de mRNA do gene aoxAf foram determinados por Real time RT-PCR, mostrando o eficiente silenciamento do gene alvo com a construção utilizada. Devido à relação já descrita entre ERO e a atividade das AOXs, avaliou-se a produção de espécies reativas de oxigênio nas cepas silenciadas utilizando-se a sonda CM-H2DCFDA, observando maior produção na cepa pALB1/aoxAf. Além disso, a viabilidade destas cepas foi determinada por citometria de fluxo após a exposição com agentes pró-oxidantes, a qual indicou maior letalidade na cepa pALB1/aoxAf, quando comparada com CEA e pALB1. Da mesma forma, após a incubação dos conídios das cepas silenciadas com macrófagos de camundongos foi verificada uma maior atividade microbicida dos macrófagos na cepa duplamente silenciada pALB1/aoxAf, quando comparada com as outras cepas. Com estes resultados podemos concluir que a oxidase alternativa apresenta uma importante atividade antioxidante, além de contribuir nos mecanismos de defesa durante o processo de infecção de A. fumigatus. / The saprophytic species Aspergillus fumigatus is a deuteromycete fungus found worldwide, which has an essential role in recycling carbon and nitrogen. Following inhalation of conidia by the immunocompetent host, the innate cellular immune system is responsible for killing the conidia, exposing them to reactive oxygen. However, A. fumigatus is capable of surviving and replicating within the phagolysosomal compartment of immunocompromised macrophages. It was previously demonstrated that A. fumigatus mitochondria possess an alternative oxidase (aoxAf) wich is a cyanide-resistant protein. A partial genomic DNA library was screened to cloning an aoxAf gene. The alignment between the cDNA and genomic DNA sequences revealed the existence of two introns which after splicing encodes a 352 amino acid sequence with a calculated molecular mass of 40 kDa and a theoretical pI of 9.51. The deduced amino acid sequence revealed four regions completely conserved among the AOXs sequences (LET, NERMHL, LEEA and RADE-H), where six conserved amino acids residues are proposed to be a metal ligand site. To characterize the AOX protein, a cDNA of aoxAf gene was cloned into pYES2 plasmid and transformed in S. cerevisiae INVSc1. After the incubation of the cells in a nonfermentable medium in the presence of KCN, S. cerevisiae expressing AOX was able to grow, while it was lethal for the control yeast. These results suggest that the recombinant AOXAf is properly targeted to the S. cerevisiae mitochondria where it has functional activity. Studies with different species demonstrated that AOX is induced by a variety of treatments usually labeled as stresses. To verify the function of AOX in A. fumigatus under oxidative stress conditions, conidia were treated with different donors of ROS. These treatments caused an increase in aoxAf activity and transcription levels. To identify genetically attributes of virulence and oxidative defense in A. fumigatus, we construct a RNA interference plasmid. Two inverted repeated sequences of conserved region of an interest gene were amplified and cloned in pALB1 plasmid. In maltose medium pALB1 and pALB1/aoxAf transformants demonstrated white colonies, attributable to the reduction of alb1 gene expression. The aoxAf mRNA levels were analyzed by Real time RT-PCR, showing an efficient alternative oxidase gene silencing in pALB1 plasmid construction. It was previously demonstrated that ROS can stimulate the AOXs activity, so, we used the dye CM-H2DCFDA to measure ROS production in RNAi transformants, showing that the decrease in aoxAf gene expression caused an increase in ROS production. After incubation with ROS donors the viability of these strains was determined by flow cytometry analysis. The pALB1/aoxAf strain showed higher lethality, when compared with CEA and pALB1, suggesting the involvement of AOX in antioxidant defense in A. fumigatus. Besides, ROS produced by alveolar macrophages play an essential role in the killing of A. fumigatus conidia. In the same way, phagocytosis assay revealed that pALB1/aoxAf strain was more lethal than CEA and pALB1. With these results, we concluded that alternative oxidase is an efficient antioxidant system and might contribute with defense mechanism of A. fumigatus.

O DNA é um alvo constante de modificações químicas, as quais resultam na ativação dos programas de reparo de danos no DNA. O DNA mitocondrial (DNAmt), uma molécula circular contendo aproximadamente 16,6 kb de extensão, é constantemente exposto às espécies reativas de oxigênio (EROs) devido a sua proximidade da cadeia transportadora de elétrons, presente na membrana mitocondrial interna. Quase todas as vias de reparo de DNA presentes no núcleo atuam também na mitocôndria, entretanto, a regulação das vias mitocondriais não é bem compreendida. As proteínas p53, ATM, mTOR e PGC1α participam, dentre outros papéis, do controle do metabolismo energético e das respostas a lesões no DNA nuclear. Dessa forma, decidimos gerar linhagens celulares com níveis reduzidos dessas proteínas como uma ferramenta para o estudo dos seus papéis na manutenção do DNAmt. Para isso, foram geradas linhagens celulares de HEK293 expressando constitutivamente shRNAs alvo-específicos, cuja diminuição da expressão das proteínas alvo foi confirmada através de western blotting. Neste trabalho, também foi estudado o papel de p53 na resposta ao estresse oxidativo mitocondrial provocado por azul de metileno (AM). O AM é um corante fotoativo capaz de atravessar membranas biológicas e, em células de mamíferos, se acumula em organelas, tais como a mitocôndria. Uma vez que p53 participa de diversas funções celulares e transloca para a mitocôndria sob condições de estresse, onde pode induzir apoptose ou modular o reparo de DNAmt, nós investigamos se p53 está envolvido na indução de morte celular após tratamento com AM fotoativado. Para isso, foram utilizados 2 clones com níveis reduzidos de p53 obtidos na primeira etapa deste trabalho. Sob condições normais, foi demonstrado que o silenciamento de p53 induziu uma forte redução do número de cópias de DNAmt e estimulou a proliferação celular quando fornecemos glicose ou galactose como substratos energéticos. A depleção de p53, ou a sua inibição farmacológica, resultaram em uma ligeira proteção quando as células foram submetidas ao tratamento com AM. Também foi demonstrado que AM provoca morte celular apoptótica de uma maneira dependente de p53, uma vez que a depleção dessa proteína protegeu a população do acúmulo de células em sub-G1. Portanto, nossos resultados sugerem que AM induz morte celular apoptótica em células HEK293, de uma maneira dependente de p53. Esse efeito pode ser mediado diretamente por p53, ou ainda, pelo seu papel na manutenção do número de cópias do DNAmt. / DNA is constantly being chemically modified, which results in activation of the DNA damage response program. The mitochondrial DNA (mtDNA), a circular molecule of 16.6 kb in length, is primary target of reactive oxygen species (ROS) due its proximity to the electron transport chain, in the mitochondrial inner membrane. Almost all known DNA damage repair pathways operating in the nucleus were also found in the mitochondrion; however, their regulation remains not well understood. The proteins p53, ATM, mTOR e PGC1α have many cellular functions, including control of energy metabolism and cell fate after stress. Thus, we hypothesized that those proteins could participate in maintaining of mtDNA, through direct or indirect roles. To test this hypothesis, we generated isogenic knockdown cell lines to further use them to study their role in the mtDNA damage response. For that, were generated HEK293 knockdown cell lines that stably express target-specific shRNAs. Efficient knockdown was checked using western blotting. Here, we also studied the role of p53 in the cellular response to mitochondrial oxidative stress induced by methylene blue (MB). MB is a photoactive dye that crosses biological membranes due to its lypophylic character and, in mammalian cells, accumulates in organelles such as mitochondria; however, its cytotoxic mechanism is not well understood. As the p53 protein participates in several cellular functions and translocates to mitochondria under stress conditions, where it can induce apoptosis or modulate mtDNA repair, we investigated whether p53 was involved in MB + light-induced cell death using p53 knockdown clones selected from the cell lines generated in the first phase of this work. Under normal conditions, p53 knockdown caused a decrease in mtDNA copy number and stimulated cellular growth supported by either glucose or galactose. After MB treatment, p53-kd cells showed a slight decrease in cell death compared to scrambled shRNA controls. Evaluation of cell death after MB treatment, using flow cytometry analysis, indicated that MB was able to induce significant levels of apoptotic cell death, which was dependent on p53 levels. Taken together, our results suggest that MB induces cell death, probably via apoptosis, in a p53 dependent manner. This effect may be mediated by p53 directly or by its role in mtDNA copy number maintenance.

Em animais, dietas cetogênicas induzem o Browning de tecidos adiposos brancos, fenômeno caracterizado pelo de aumento de adipócitos capazes de expressar a proteína desacopladora 1 (UCP1) e outros marcadores de gordura marrom em meio a gordura branca. Estudo anterior demonstrou que o β-hidroxibutirato (βHB), principal corpo cetônico, aumenta marcadores do processo de browning em adipócitos brancos (in vitro) após 24 horas de incubação. No entanto, as doses testadas foram suprafisiológicas (50 mM) ou apenas encontradas durante a cetoacidose (25 mM). As dietas cetogênicas aumentam a cetonemia em torno de 1-3 mM. O jejum prolongado pode aumentá-lo para 4-7 mM. Uma vez que poderia ser provocada in vivo através de intervenções dietéticas, estudamos o impacto de concentrações fisiológicas de βHB no metabolismo e marcadores de Browning em adipócitos brancos / tecido adiposo em diferentes modelos: adipócitos isolados de ratos Wistar, células 3T3 -L1 e in vivo, através da suplementação de sais de βHB em ratos Wistar. Demostramos que o βHB: não induz o aparecimento diferentes marcadores de Browning (tais como o incremento: da capacidade oxidativa, da atividade de citrato sintase e de genes relacionados ao Browning) em adipócitos isolados após 24 ou 48 horas de tratamento; não exerce efeito permissivo no browning induzido por agonismo β-adrenérgico. Além disso, os adipócitos 3T3-L1 diferenciados com βHB (4mM) tiveram diminuição de 52% na expressão de Ucp1, resultado que foi reproduzido no tecido adiposo inguinal subcutâneo de ratos Wistar após a ingestão de sais DL- βHB, onde a expressão gênica de Ucp1 foi indetectável. Em conclusão, embora as causas de browning do tecido adiposo branco induzido por dietas cetogênicas permaneçam inconclusivas, nosso estudo demonstra a incapacidade de, em concentrações fisiológicas, os corpos cetônicos serem, por si, responsáveis por esse fenômeno. Pelo contrário, em algumas situações, o βHB pode prejudicar a expressão da Ucp1. / In animals, ketogenic diets induce browning of white adipose tissue, a phenomenon characterized by the increase of adipocytes capable of expressing the uncoupling protein 1 (UCP1) and other markers of brown fat in among white fat. A previous study demonstrated that β-hydroxybutyrate (βHB), the major ketone body, increases markers of the browning process in white adipocytes (in vitro) after 24 hours of incubation. However, the doses tested were supraphysiological (50 mM) or only found during ketoacidosis (25 mM). Ketogenic diets increase ketonemia by about 1-3 mM. Prolonged fasting can increase it to 4-7 mM. Since it could be elicited in vivo through dietary interventions, we studied the impact of physiological concentrations of βHB on metabolism and browning markers on white adipocytes/adipose tissue in different models: adipocytes isolated from Wistar rats, 3T3-L1 cells and in vivo, through the supplementation of βHB salts in Wistar rats. We demonstrate that βHB does not increase any browning markers (such as: oxidative capacity, citrate synthase activity, and browning related genes expression) in isolated adipocytes after 24 or 48 hours of treatment; does not exert a permissive effect on browning induced by β-adrenergic agonism. In addition, 3T3-L1 adipocytes differentiated with βHB (4mM) had a 52% decrease in Ucp1 expression, a result that was reproduced in the subcutaneous inguinal adipose tissue of Wistar rats after ingestion of DL-βHB salts, where Ucp1 expression was undetectable. In conclusion, although the causes of browning of white adipose tissue during ketogenic diets remain inconclusive, our study demonstrates the inability, in physiological concentrations, of ketone bodies themselves to be responsible for this phenomenon. In contrast, in some situations, βHB may impair the expression of Ucp1.

O câncer de mama ocupa o primeiro lugar em mortalidade dentre todos os tipos de câncer. O subtipo triplo-negativo (triple-negative breast cancer - TNBC) representa 15-20% de todos os tipos de câncer de mama com alta prevalência em mulheres pré-menopausa e destaca-se pelo seu grande tamanho tumoral e agressividade no estabelecimento de metástases, com impacto direto na redução da sobrevida dos pacientes. Apesar das evidências sobre os efeitos anti-tumorigênicos do exercício físico, tanto na prevenção como durante a carcinogênese, é comum que pacientes alterem sua rotina após o diagnóstico de câncer, frequentemente reduzindo as atividades físicas durante e após o tratamento. Em adição, os mecanismos pelos quais o exercício físico exerce papel anti-tumoral são pouco compreendidos. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do exercício físico aeróbico moderado em modelo experimental de câncer de mama de tipo triplo-negativo, com ênfase na modulação do metabolismo energético tumoral. Foram utilizados camundongos fêmeas BALB/c em desenho experimental de 12 semanas, cuja inoculação de 1x104 células 4T1 foi realizada após 8 semanas de treinamento. Após protocolo de exercício aeróbico moderado em esteira, foram realizadas análises do metabolismo mitocondrial tumoral, composição lipídica e expressão de genes relacionados à bioenergética e proliferação celular. Os resultados mostraram que o exercício aeróbico moderado reduziu 54,5% do volume e 42% da massa tumoral de animais que foram treinados antes e após a inoculação tumoral. Animais treinados apresentaram fosforilação oxidativa mais próxima ao seu limite máximo respiratório e menor respiração mitocondrial no tecido tumoral quando comparados ao grupo sedentário. O treinamento ocasionou redução no conteúdo de ácido fosfatídico e fosfatidilcolina. Enquanto a análise de expressão relativa de mRNA demonstrou aumento na expressão de genes relacionados à via metabólica glicolítica, como Hif1a, Glut-1, HKII, Ldha e Pdk, além dos supressores tumorais p53 e Lats2. Nossos resultados sugerem que a redução na velocidade de crescimento tumoral proporcionada pelo exercício físico aeróbico de carga moderada seja devida, pelo menos em parte, à modulação do metabolismo energético tumoral. Em conjunto, os dados do nosso estudo abrem novas perspectivas para a identificação de vias metabólicas sensíveis ao exercício físico, permitindo o melhor o entendimento de seus efeitos antitumorigênicos / Breast cancer ranks first in mortality among all types of cancer. The triple-negative breast cancer (TNBC) accounts for 15-20% of all types of breast cancer with a high prevalence in premenopausal women and is notable for its large tumor size and aggressiveness in the establishment of metastasis, with a direct impact on the reduction of patients\' survival. Altough evidence highlight the anti-tumorigenic effects of physical exercise both on the prevention as well as during carcinogenesis, patients commonly change their routine after cancer diagnostic, usually reducing physical activity during and after treatment. Moreover, the mechanisms underlying the anti-tumor role of physical exercise remain poorly understood. The objective of this study was to evaluate the effects of moderate aerobic physical exercise in an experimental model of triple-negative breast cancer, with emphasis on the modulation of tumor energy metabolism. Female BALB / c mice were used in a 12-week experimental design, whose inoculation of 1x104 4T1 cells was performed after 8 weeks of training. After the protocol of moderate aerobic exercise was carried out on the treadmill, analyzes of mitochondrial tumor metabolism, lipid content and qPCR of genes related to bioenergetics and tumorigenic process were performed. The results showed that moderate aerobic exercise reduced 54.5% of the volume and 42% the tumor mass of animals trained before and after tumor inoculation. Trained animals showed oxidative phosphorylation closest to the maximum respiratory limit and lower mitochondrial respiration in tumor tissue when compared to the sedentary group. The training resulted in a reduction in the content of phosphatidic acid and phosphatidylcholine. In the trained group, relative mRNA quantification analysis showed increased expression of genes related to the glycolytic metabolic pathway, such as Hif1a, Glut-1, HKII, Ldha, and Pdk, as well as of the tumor suppressors p53 and Lats2. Our results suggest that the reduction in tumor growth velocity provided by moderate-intensity aerobic physical exercise is due, at least in part, to the modulation of tumor energy metabolism. Together, data from our study open new perspectives for the identification of metabolic pathways sensitive to exercise, allowing better understanding of its anti-tumorigenic effects

Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso e saprofítico encontrado em todas as regiões do mundo. A principal forma de infecção ocorre através da inalação de conídios do fungo com predominância de infecções no trato respiratório, principalmente em pacientes imunocomprometidos. Foi caracterizada a função mitocondrial de A. fumigatus e sugeriu-se a presença de vias alternativas, dentre elas, a presença da NADH desidrogenase alternativa. A fim de colaborar com estudos para elucidação do papel desta enzima, foi realizada a clonagem dos genes das NADH desidrogenase alternativa interna e externa de A. fumigatus. A análise da seqüência de aminoácidos revelou um perfil de hidropaticidade com a presença de quatro regiões hidrofóbicas, semelhante às outras seqüências já descritas. Além disso, foram identificados dois motivos (GXGXXG) altamente conservados para ligações a nucleotídeos, dentro de um domínio os quais estão relacionados com a estrutura e atividade da enzima. A seqüência de cDNA do gene ndhiAf foi clonada em plasmídeo pYES2 e expressa em S. cerevisiae cepa CEN.PK873-2B; a expressão da NDHIAf foi verificada por técnica de Western-blot. A proteína foi expressa de forma ativa, conferindo à levedura uma respiração e a formação de um potencial de membrana resultantes da oxidação de substratos clássicos do complexo I, sugerindo sua localização na membrana mitocondrial interna. Além disso, as cepas expressando essa proteína foram capazes de crescer em meio contendo apenas lactato como fonte de carbono, uma característica atribuída à presença da NADH desidrogenase alternativa interna (NDHi). Considerando que a atividade das NDHIAf e NDHEAf estão sob controle metabólico, nos avaliamos o efeito de diferentes concentrações de glucose como única fonte de carbono no meio de cultura. Durante a germinação conidial, não foi observada expressão da NDHIAf e NDHEAf na presença de baixas concentrações de glucose. Entretanto, durante a fase de hifas foi observado um aumento na expressão de NDHIAf e NDHEAf. Por outro lado, em alta concentrações de glucose, durante a germinação conidial, foi observado expressão da NDHIAf mas nenhuma expressão da NDHEAf. Na fase de hifas observou-se um aumento da expressão da NDHIAf e uma diminuição da NDHEAf. / Aspergillus fumigatus is a filamentous and saprophytic fungus found in all regions of the world. The main form of infection occurs through inhalation of fungi conidial, with predominance of infections in the respiratory treat, mainly in immunocompromised host. It was characterized the mitochondrial function of A. fumigatus and suggested the presence of alternative pathways, including the alternative NADH dehydrogenase. In order to elucidate its role, genes of the external and internal enzymes were cloned. Analysis of the amino acid sequence and hydropathy plot revealed a profile with four hydrophobic regions, similar to other already described sequences. Moreover, two highly conserved motifs (GXGXXG) for the nucleotides interaction, related with the structure and activity of the enzyme, were identified inside the a domain. The sequence of DNA of the ndhiAf gene was cloned in an expression plasmid pYES2 and expressed in CEN.PK873-2B S. cerevisiae strain; the expression was confirmed by Western-blot analysis. The protein was expressed in an active form, providing to the yeast an oxygen consumption and a potential membrane formation due to oxidation of the complex I substract, suggesting its localization in the inner mitochondrial membrane. Moreover, strains expressing this protein were capable of growing in medium with only lactate as a carbon source, a characteristic associated with the presence of internal alternative NADH dehydrogenase (NDHI). Considering that NDHI and NDHE activities are under metabolic control, we evaluated the effect of different concentrations of glucose as the only carbon source in the medium of culture. During conidia germination, it was not observed neither an expression of NDHI nor NDHE in the presence of low concentrations of glucose. However, in hyphae phase was observed an increase an expression of NDHI and NDHE. On the other hand, in high concentration of glucose, during conidia germination was observed an expression of NDHI and not expression of NDHE. In hyphae phase was observed a decrease an expression of NDHI and an increase of NDHE.

Submitted by Bruno Rossitto de Marchi (bruno_dmarchi@hotmail.com) on 2018-08-08T18:14:08Z No. of bitstreams: 1 Bruno De Marchi Tese Definitivo.pdf: 5408910 bytes, checksum: 6c7b13538e592fdcfc85ae1e3eb12212 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Lucia Martins Frederico null (mlucia@fca.unesp.br) on 2018-08-08T18:50:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 de marchi_ br_dr_botfca.pdf: 5386545 bytes, checksum: 8a0580cd031695c504bc6270ee8317c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-08T18:50:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 de marchi_ br_dr_botfca.pdf: 5386545 bytes, checksum: 8a0580cd031695c504bc6270ee8317c9 (MD5) Previous issue date: 2018-07-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A mosca-branca, Bemisia tabaci (Gennadius) é uma praga de distribuição global que afeta centenas de diferentes plantas hospedeiras incluindo grandes culturas, olerícolas e ornamentais. B. tabaci causa danos principalmente através da transmissão de vírus de plantas como os begomovirus, crinivirus, ipomovirus, torradovirus e carlavirus. Atualmente, B. tabaci é considerada um complexo de pelo menos 40 espécies crípticas que apresentam diversidade genética, biológica e diferentes composições de bactérias endossimbiontes facultativas. No Brasil, tanto espécies nativas quanto exóticas de mosca-branca são encontradas e ainda há uma escassez de dados genômicos destas populações e das bactérias endossimbiontes. Na África Oriental, altas populações de moscas-brancas estão disseminando diferentes vírus de plantas que causam epidemias na cultura da mandioca (Manihot esculenta) e com perdas na produtividade. A principal forma de manejo desses vírus na África é através da utilização de variedades tolerantes. Portanto, é essencial a identificação de novos genes de resistência para o desenvolvimento de variedades e um manejo eficiente das doenças. O sequenciamento de transcriptomas é uma ferramenta que possibilita uma análise genômica da mosca-branca, dos vírus transmitidos por ela, das bactérias endossimbiontes e das plantas hospedeiras dessa praga. Portanto, os dados genômicos obtidos dão suporte para o desenvolvimento de novas técnicas que podem se tornar futuras alternativas de controle de mosca-branca e dos vírus associados. No Capítulo 1, dados de transcriptomas foram obtidos das diferentes espécies de B. tabaci encontradas no Brasil, tendo sido possível a obtenção de genomas mitocondriais completos de espécies exóticas e nativas de mosca-branca, além de genomas parciais do endossimbionte facultativo Hamiltonella. A análise filogenética revelou que as diferenças genéticas presentes no gene mtCOI entre as espécies nativas e as espécies exóticas se estendem ao genoma mitocondrial e ao endossimbionte facultativo Hamiltonella. Além disso, foi possível verificar uma deleção de aminoácidos somente no gene GroEL de Hamiltonella que está presente em populações de moscas-brancas nativas. Esse gene é conhecido por estar associado a transmissão de vírus de plantas. No Capítulo 2, foram sequenciados transcriptomas de plantas de mandioca naturalmente infectadas com vírus coletadas no campo em diferentes países da África. A partir desses dados, foi avaliada a diversidade de genes do cloroplasto e a relação com diferentes espécies de vírus. Há uma baixa diversidade dentre as cultivares de mandioca atualmente plantadas na África e não foi possível verificar nenhuma relação entre os genes de cloroplastos avaliados e as espécies de vírus detectadas ocorrendo naturalmente no campo. Os dados obtidos reforçam a necessidade da introdução de novos materiais genéticos para aumentar a diversidade genética das cultivares de mandioca plantadas nesses países, a fim de melhorar as alternativas de manejo das epidemias de vírus. / The whitefly, Bemisia tabaci (Gennadius) is a global pest that affects hundreds of different plant hosts including vegetable, fiber and ornamental crops. B. tabaci causes damage mainly by the transmission of plant viruses such as begomoviruses, criniviruses, ipomoviruses, torradoviruses, and carlaviruses. Currently, B. tabaci is known as a complex of at least 40 putative cryptic species that shows genetic and biological diversity and a different composition of bacterial facultative endosymbionts. In Brazil, both exotic and indigenous species of whiteflies are found and there is still a lack of genomic data available among these populations and also their bacterial endosymbionts. In East Africa, high populations of whiteflies are transmitting different plant viruses that are causing epidemics in cassava crops (Manihot esculenta) and leading to great yield losses. Currently, the management of these viral diseases in Africa is carried out mainly by growing cassava tolerant varieties. Therefore, is essential to identify new target genes for the development of new varieties for an efficient management of viral diseases. Transcriptome sequencing is a tool that allows a genomic analysis of the whitefly, whitefly-transmitted viruses, bacterial endosymbionts and plant hosts. Therefore, the genomic data obtained gives support for the development of new technics that might aid for future management alternatives of whiteflies and their associated viruses. In Chapter 1, transcriptome data were obtained from different B. tabaci species found in Brazil which allowed to obtain complete mitochondrial genomes from different whitefly species and draft genomes of the facultative endosymbiont Hamiltonella. The phylogenetic analysis revealed that the genetic differences among exotic and native populations present in the mtCOI gene extends to the mitochondrial genome and to the facultative endosymbiont Hamiltonella. In addition, it was verified an amino acid deletion in the GroEL gene from Hamiltonella present only in native populations of whiteflies. This gene is known to be associated with the transmission of plant viruses. In Chapter 2, transcriptome data were obtained from virus-infected cassava plants collected in the field in different African countries. The data allowed to evaluate the diversity of chloroplast genes and their relationship with different virus species. The data revealed a low genetic diversity among cassava currently grow in East Africa. In addition, there was no direct relationship between the evaluated chloroplast genes and the virus species detected. The obtained data reinforce the need of introduction of new genetic accession to increase the genetic diversity of the currently grown cassava in Africa in order to improve the alternatives of management of viral diseases. / CNPq 131324/2015-5 / CNPq 200826/2015-8

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-08-14T17:52:05Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1240116 bytes, checksum: 2827eceaa6ac52c3f08054f9679e6b8b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-14T17:52:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1240116 bytes, checksum: 2827eceaa6ac52c3f08054f9679e6b8b (MD5) Previous issue date: 2016-08-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A família de transportadores mitocondriais (MCF) catalisam transportes específicos de vários substratos, tais como nucleotídeos, aminoácidos e cofatores. Embora alguns dos transportadores tenham sido identificados, muitas destas proteínas ainda não foram completamente caracterizadas. Do mesmo modo, o metabolismo mitocondrial sob estresse ainda não é completamente conhecido. Neste contexto, este trabalho apresenta inicialmente um estudo de um transportador mitocondrial previamente identificado e ainda não caracterizado, designado como AtSFC1, um potencial transportador de succinato/fumarato. Assim, para identificar a especificidade de substrato, a proteína AtSFC1 foi integrada em liposomas e ensaios bioquímicos foram realizados e para investigar a função fisiológica deste transportador, foram utilizadas plantas transgênicas de Arabidospis thaliana para o gene AtSFC1, cuja expressão foi reduzida pela técnica antisenso. Brevemente, a integração funcional do AtSFC1 na membrana citoplasmática de células de Escherichia coli revelou uma especificidade para citrato/isocitrato do tipo antiporte. Além disso, discutimos o potencial papel para AtSFC1 no fornecimento de intermediários para o ciclo ácido dos tricarboxílicos para suportar o crescimento nos tecidos heterotróficos. Na segunda parte desta tese, investigou-se a função de doadores de elétrons alternativos para a cadeia mitocondrial transportadora de elétrons (mCTE) sob deficiência de carbono, bem como após o fornecimento de aminoácidos. Os produtos de degradação de aminoácidos de cadeia ramificada podem doar elétrons para o mCTE através do complexo ETF/ETFQO (electron transfer flavoprotein: flavoprotein ubiquinone oxidoreductase). Este sistema está localizado na mitocôndria e induzido ao nível de transcrição em situações de estresse. Assim, a fim de obter um design detalhado de como essa via interage com outras e como ela se ajusta a diferentes requisitos celulares e metabólicas, foram realizadas abordagens metabólicas e fisiológicas utilizando cultura de células de Arabidopsis mutantes com inserção de T-DNA na região codificante do gene ETFQO. Os resultados são aqui discutidos, confirmam que o sistema ETF/ETFQO é uma via essencial capaz de doar elétrons para o pool de ubiquinona. Além disso, o comportamento dos complexos respiratórios sugere novos pontos de entrada de elétrons, os quais devem ser elucidados. / Mitochondrial carrier family (MCF) proteins catalyze the specific transport of various substrates, such as nucleotides, amino acids and cofactors. Although some of the mitochondrial transporters have been identified, many of these proteins have not yet been completely characterized. Likewise, the proteic machinery and mechanisms involved in the mitochondrial alternative respiration is still not well known. In this context, this work first presents a study of a previously identified but uncharacterized mitochondrial transporter AtSFC1, a potential succinate/fumarate carrier. Hence, to obtain the biochemical role of AtSFC1, we carried out substrate specificity and investigated its physiological function using 35S antisense transgenic lines in Arabidopsis thaliana. Briefly, the functional integration of AtSFC1 in the cytoplasmic membrane of intact Escherichia coli cells reveals a high specificity for a citrate/isocitrate in a counter exchange mode. Additionally, we discussed the potential role for AtSFC1 in the provision of intermediates of tricarboxylic acid cycle to provide carbon and energy to support growth in heterotrophic tissues. In the second part of this thesis, we investigated the function of alternative electron donors to the mitochondrial electron transport chain (mETC) during carbon deprivation as well as after the supply of amino acids. The breakdown products of branched chain amino acids can provide electrons to the mETC via the ETF/ETFQO (electron transfer flavoprotein: flavoprotein ubiquinone oxidoreductase) complex. This system is located in the mitochondria and induced at the level of transcription during stress situations. Thus, in order to obtain a comprehensive picture of how alternative respiration pathway interacts with other pathways and adjust to different cellular and metabolic requirements, we performed metabolic and physiological approaches using Arabidopsis cell culture ETFQO T-DNA insertion mutants. The results discussed here support that the ETF/ETFQO system is an essential pathway able to donate electrons to the ubiquinone pool. In addition, the behavior of the respiratory complexes suggest new electrons entry points, which must be elucidated.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-05-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:51Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10921a.pdf: 1592777 bytes, checksum: 7d854c386b05884268c8e4a74b23d1dd (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:51Z : No. of bitstreams: 2 Publico-10921a.pdf: 1592777 bytes, checksum: 7d854c386b05884268c8e4a74b23d1dd (MD5) Publico-10921b.pdf: 1890621 bytes, checksum: 9a2c7c7f503afda64c4ccccb296a2193 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:51Z : No. of bitstreams: 3 Publico-10921a.pdf: 1592777 bytes, checksum: 7d854c386b05884268c8e4a74b23d1dd (MD5) Publico-10921b.pdf: 1890621 bytes, checksum: 9a2c7c7f503afda64c4ccccb296a2193 (MD5) Publico-10921c.pdf: 1802078 bytes, checksum: abe7bcfbf5434d049fa4830000c4afab (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:51Z : No. of bitstreams: 4 Publico-10921a.pdf: 1592777 bytes, checksum: 7d854c386b05884268c8e4a74b23d1dd (MD5) Publico-10921b.pdf: 1890621 bytes, checksum: 9a2c7c7f503afda64c4ccccb296a2193 (MD5) Publico-10921c.pdf: 1802078 bytes, checksum: abe7bcfbf5434d049fa4830000c4afab (MD5) Publico-10921d.pdf: 1224466 bytes, checksum: f4c12de814a5b8f7d7e0b7dec3980e89 (MD5) / Introdução: Alterações no tamponamento do cálcio citosólico (Ca+2 c) podem levar à desordens neurodegenerativas como a Doença de Huntington (DH). Vários mecanismos estão relacionados esses processos tais como a excitotoxicidade, o estresse oxidativo e as interações da proteína huntintina mutante (mhtt) com outras proteínas como a transglutaminase 2 (TG2). Essas alterações podem estar relacionadas com a ativação de mecanismos de morte celular ou autofagia. Objetivo: O objetivo deste projeto foi investigar os mecanismos celulares e moleculares envolvidos no processo de neurodegeneração da DH tais como alterações dos níveis de Ca+2 c relacionados com o transporte de Ca+2 mitocondrial (Ca+2 m) e reticular (Ca+2 RE), disfunção mitocondrial e morte celular, em três modelos experimentais: a) animais transgênicos da linhagem R6/1; b) linfoblastos provenientes de pacientes com DH; c) células MEFs (fibroblastos) normais e knock-outs para a TG2, na presença ou ausência da mhtt. Resultados e Conclusões: Nos camundongos transgênicos R6/1 houve um aumento significante do Ca+2 c em relação aos controles aos 9 meses de idade. Essa alteração parece ser devido a um aumento da liberação do Ca+2 m, do estresse oxidativo, do potencial de membrana mitocondrial (DYm) e do consumo de oxigênio. Os transgênicos não apresentaram diferença quanto à SDH, muito embora haja um aumento desta com o envelhecimento. Além disso, os linfoblastos de pacientes com DH apresentaram alterações do Ca+2 m e do Ca+2 RE, bem como um aumento na taxa de células autofágicas. Por outro lado, nas células de fibroblastos de camundongos embrionários (MEFs), a presença de mhtt parece não afetar a homeostase celular de Ca2+. A ausência da TG2 nestas células, influenciou não somente os níveis de Ca2+ c como também protegeu as células contra autofagia, mesmo na presença de mhtt. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-09-04T17:57:43Z No. of bitstreams: 1 Viviane Rocha. Estratégia para reduzir a cardiotoxicidade da doxorrubicina...pdf: 3422258 bytes, checksum: 5da22d5d62cd5934fc79f23c2445b6c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-04T17:57:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Viviane Rocha. Estratégia para reduzir a cardiotoxicidade da doxorrubicina...pdf: 3422258 bytes, checksum: 5da22d5d62cd5934fc79f23c2445b6c3 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A Dox é um quimioterápico da classe das antraciclinas amplamente utilizado no tratamento de tumores malignos sólidos e hematológicos. Apesar de sua eficácia no tratamento antineoplásico, a cardiotoxicidade é o principal fator limitante para o uso da Dox na clínica médica. Embora o dano cardíaco induzido pela Dox pareça ser multifatorial, uma das hipóteses mais prevalentes é a de que o dano celular seja induzido por radicais livres, e há muitas evidências apontando para as mitocôndrias cardíacas como principais alvos da toxicidade da Dox. Esse dano oxidativo pode ser potencialmente limitado com o uso de antioxidantes. No presente trabalho, foi avaliada a eficácia protetora do ácido lipoico, um antioxidante universal, sobre a cardiotoxicidade induzida pela Dox em camundongos in vivo, e sua interferência nos efeitos anticâncer foi investigada in vitro em células de melanoma de camundongo B16F10. A toxicidade da Dox induzida por uma dose única intraperitoneal (i.p.) de 20 mg/kg foi verificada por redução significativa do peso após cinco dias (p<0,001), aumento da atividade sérica de CK total após 48 horas (p<0,05) e elevação da concentração de malondialdeído após 24 horas em mitocôndrias cardíacas (p<0,05) e tecido cardíaco (p<0,001). O pré-tratamento com ácido lipoico (200 mg/kg, i.p., por dois dias, 72 horas antes da Dox) reduziu significativamente a peroxidação lipídica das mitocôndrias cardíacas, sugerindo o potencial antioxidante do ácido lipoico em reduzir a cardiotoxicidade induzida pela Dox. Além disso, o ácido lipoico não interferiu significativamente na atividade antitumoral da Dox sobre células de melanoma B16F10 in vitro. / Doxorubicin is a chemotherapeutic of the anthracycline class widely used in the treatment of solid and haematopoietic malignancies. Despite their efficacy in the antineoplastic treatment, cardiotoxicity is the main limiting factor to the use of Dox at the medical clinic. Although doxorubicin-induced cardiac damage appears to be multifactorial, one of the most prevalent assumptions is that cellular damage is induced by free radicals, and there is much evidence pointing to cardiac mitochondria as primary targets of the toxicity of Dox. This oxidative injury may be potentially limited by the use of antioxidants. In this study, the protective efficacy of lipoic acid, a universal antioxidant, on Dox-induced cardiotoxicity was evaluated in mice in vivo, and its interference in anticancer effects was investigated in vitro in mouse B16F10 melanoma cells. The Dox-induced toxicity by a single intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg body weight was verified by a significant reduction in body weight after five days (p<0.001), increased serum activity of total creatine kinase after 48 hours (p<0.05) and increase in malondialdehyde levels after 24 hours in cardiac mitochondria (p<0.05) and cardiac tissue (p<0.001). Pretreatment with lipoic acid (200 mg/kg body weight, i.p., for two days, 72 hours prior to Dox) significantly reduced the lipid peroxidation of cardiac mitochondria, suggesting the antioxidant potential of lipoic acid in reducing the cardiotoxicity induced by Dox. In addition, lipoic acid did not significantly affect the antitumor activity of Dox on B16F10 melanoma cells in vitro