O envelhecimento da população mundial no último século elevou significativamente o número de casos da doença de Alzheimer (DA), bem como os custos para os sistemas de saúde pública. Apesar de avanços significativos no entendimento da fisiopatologia da doença, pouco se sabe a respeito dos mecanismos moleculares que desencadeiam a perda de memória e a morte neuronal. Resultados recentes sugerem que o acúmulo de bases oxidadas no DNA mitocondrial e alterações nas vias que removem essas lesões desempenham um papel importante na morte neuronal observada em DA. A maioria das lesões em DNA induzidas oxidativamente são removidas pela via de reparo por excisão de bases (BER, do inglês Base Excision Repair). Resultados da literatura mostraram que a atividade da via BER está reduzida no lóbulo parietal e no cerebelo de pacientes com DA, quando comparadas com amostras de indivíduos com cognição normal da mesma faixa etária. Entretanto, esse trabalho mediu a atividade de BER apenas em extratos celulares totais. No presente estudo, foram medidas as atividades de BER em extratos mitocondriais de cérebros de indivíduos com DA, uma vez que lesões no DNA mitocondrial acumulam mais significativamente nos pacientes. Para testar a hipótese que alterações em BER mitocondrial estão associadas ao desenvolvimento da doença, foram analisadas atividades de BER em mitocôndrias em duas regiões cerebrais de indivíduos normais, indivíduos com DA e um grupo de indivíduos que apresentam alterações neuropatológicas de DA (agregados proteicos), porém que se mantiveram cognitivamente normais, nomeados DA assintomático. A atividade da enzima AP endonuclease apresentou-se elevada no cerebelo do grupo DA assintomático, enquanto que não apresentou variação no córtex temporal. Esses resultados sugerem que a preservação de APE1 no grupo DA assintomático pode exercer um papel protetor às lesões neuropatológicas, bem como indicar que as regiões cerebrais apresentam suscetibilidade distinta aos danos. Já a atividade de uracil DNA glicosilase está reduzida no cerebelo tanto em indivíduos com DA quanto com DA assintomático, quando comparados ao grupo controle, enquanto que, no córtex temporal, a redução é verificada somente no grupo DA. Além disso, observou-se que a atividade de UDG e o critério Braak apresentam uma correlação negativa. Os resultados referentes à enzima UDG sugerem que a redução da sua atividade compromete a viabilidade neuronal tornando as células mais propensas às lesões da DA. Assim, o comprometimento da via BER em mitocôndriais de cérebros humanos pode contribuir para os eventos moleculares que ocasionam a morte neuronal associada ao desenvolvimento de DA. / The number of Alzheimer\'s disease cases (AD) has increased steadly over the last century, paralleling a sharp rise in mean Iife expectancy. Consequently, AD- associated public health costs have also increased. Despite several important findings in AD physiopathology, a clear understanding of the molecular events leading to memory loss and neuronal death is still lacking. Recent results show that oxidized DNA lesions accumulate in mitochondrial DNA in neurodegenerative diseases, including AD. Moreover, alterations in DNA repair may also play a causative role in neuronal death. Most oxidized lesions are repaired by the Base Excision Repair (BER) pathway. It has been recently shown that BER activities are reduced in whole cell extracts from parietal lobule and cerebellum from AD patients, when compared with age-matched controls. As accumulation of oxidized bases is seen more prominently in mitochondrial DNA, here we investigated whether changes in BER activities in mitochondria are associated with the development of AD. Thus, we measured BER activities in mitochondria from two brain regions from age-matched normal individuais, AD patients and a group of individuais that show AD-like neuropathological alterations but remained cognitively normal, thus called asymptomatic AD. AP endonuclease activity is elevated in asymptomatic AD cerebellum, while not changed in temporal cortex. Theses results suggest that APE1 activity in asymptomatic AD may play a protective role against neuropatological lesions, and indicate that brain regions show different susceptibility to damage. On the other hand, uracil DNA glycosylase activity is reduced in cerebellum in both AD and asymptomatic individuais, when compared to controls. In temporal cortex, this reduction is observed only in AD group. In addition, UDG activity and Braak stage showed a significant negative correlation. These results indicate that decreased UDG activity may compromise neuronal viability, making the cells more prone to AD lesions. Thus, impairtment of BER in human brain mitochondria may contribute to the molecular events that cause neuronal death during the development of this disease.

Moniliophthora perniciosa é um fungo basidiomiceto causador da doença vassoura de bruxa do cacaueiro. Um conjunto de técnicas para controle da doença vem sendo testado e aplicado, incluindo o uso de fungicidas a base de inibidores da cadeia respiratória principal, específicos para fungos. No entanto, M. perniciosa tem se mostrado resistente a estas drogas e uma possível explicação para tal resistência é a atividade de uma oxidase alternativa (AOXp), cuja expressão e atividade já vêm sendo caracterizadas. A análise funcional deste gene de M. perniciosa não foi realizada, pois uma técnica efetiva para produção de mutantes do fungo ainda não foi estabelecida. Assim, este projeto visou testar a hipótese de que a expressão do gene AOX de M. perniciosa (Mp-AOX) previne o estresse oxidativo devido à diminuição na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) pela cadeia respiratória. Para isso realizamos a caracterização do gene Mp-AOX por clonagem e expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae. O vetor de expressão em levedura pYES2/CT com o gene Mp-AOX foi montado e a linhagem de levedura W303-1b transformada. Foram realizadas análises de medição de formação de massa celular, geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) mitocondrial, testes de viabilidade na presença de inibidores da cadeia respiratória principal Antimicina A e azoxistrobina e do inibidor específico de AOXp - ácido salicil hidroxâmico (SHAM). Nossos resultados indicam que quando o gene Mp-AOX é expresso em S. cerevisiae há diminuição da geração de biomassa celular, menor proliferação celular e decaimento na produção de ROS, sugerindo que nossa hipótese inicial de que Mp-AOXp causa alívio no estresse oxidativo estar correta. A levedura recombinante expressando o gene Mp-AOX mostrou-se viável para utilização como modelo para estudos de novos análogos químicos para o combate da vassoura de bruxa, auxiliando a agricultura e promovendo novos entendimentos para o combate desse fungo. / Moniliophthora pernicious is a basidiomycete fungus that causes witches\' broom of cacao disease. A number of techniques for disease control has been applied and tested, including the use of the fungicides that inhibits the main respiratory chain, specific to fungi. However, M. pernicious has proven to be resistant to these drugs and one possible explanation to this resistance would be the activity of an alternative oxidase activity (AOXp), whose expression and activity have already been characterized. Functional analysis of this gene in M. pernicious was not performed because an effective technique for producing mutants of the fungus has not yet been established. This project aimed to test the hypothesis that the expression of Mp-AOX gene prevents oxidative stress due to decreased production of reactive oxygen species (ROS) by the respiratory chain. To perform this characterization, Mp- AOX gene was cloned and heterologous expressed in Saccharomyces cerevisiae. The yeast expression vector pYES2/CT with Mp-AOX gene was constructed and the yeast strain W303 - 1b transformed. Analyses measuring cell mass formation, generation of mitochondrial reactive oxygen species (ROS), viability tests challenging the cells against inhibitors of the main respiratory chain, Antimycin A and azoxystrobin, and against the specific inhibitor of the AOXp - salicylaldehyde hydroxamic acid (SHAM) were performed. Our results indicate that the Mp-AOX gene expression in S. cerevisiae causes decreased generation of cellular biomass, less cell proliferation and the decay in the production of ROS, suggesting that our initial hypothesis that Mp-AOXp reliefs the oxidative stress is correct. The recombinant yeast expressing Mp- AOX gene was feasible for use as a model for studies of new chemical to fight witches\' broom, helping with agriculture and promoting new understandings to combat this fungus.

Aspergillus fumigatus é um fungo oportunista, sendo uma importante causa de morbidade e mortalidade entre os pacientes imunossuprimidos, acometidos com aspergilose invasiva. O sistema de defesa antioxidante do fungo atua como fator primordial de sua patogenicidade, mitigando os efeitos deletérios de espécies reativas produzidas pelo hospedeiro. Este trabalho teve o objetivo de avaliar o nível de transcrição relativo dos genes associados às proteínas mitocondriais e antioxidantes na presença de diferentes agentes pró-oxidantes para hifas e germinantes de cepas controle (CEA17) e nocaute para oxidase alternativa (?aoxA) de A. fumigatus. Utilizando qPCR, foram analisados 23 genes para as cepas CEA17 e mutante, dentre os quais, 5 associados à cadeia de transporte de elétrons (CTE), 4 relacionados aos componentes alternativos mitocondriais e 14 associados às proteínas antioxidantes. Os resultados foram obtidos através da normalização com o gene constitutivo gapdh utilizando a cepa CEA17 sem tratamento de cada fase de desenvolvimento celular como calibrador. As diferenças de transcrição da maioria dos genes estudados variaram com o pró-oxidante utilizado e com a fase de desenvolvimento celular (germinantes e hifas). A CTE em germinantes apresentou maiores níveis de transcritos dos complexos II e III em CEA17 do que em ?aoxA tratadas com menadiona. Com os demais complexos e atpase não foram observadas diferenças significativas quando comparados os resultados de ambas as cepas. Entretanto, os níveis de transcritos de atpase não foram superiores ao controle em nenhuma das cepas, sugerindo sua regulação na presença de ucp. ucp-like teve seus níveis de transcritos aumentados no mutante, sugerindo o desacoplamento da CTE em relação ao controle e à CEA17, que apresentou alto nível de transcritos de nde. Nesta cepa, os níveis de aoxA e ucp não foram significativamente diferentes. Esse fato, associado a níveis menores de ndiA e transcritos dos complexos I e II, sugerem manutenção do fluxo de elétrons na mitocôndria. Em relação às enzimas antioxidantes, houve aumento significativo nos níveis de cat2, catA, prx1, trx1 e grx1, indicando provável resposta à ausência de AOX. Os transcritos relacionados à CTE em hifas não apresentou diferença significativa nos níveis de complexo III e atpase em CEA17 e ?aoxA. No entanto, complexo IV se mostrou superior no mutante. Nesta fase de desenvolvimento, o aumento dos níveis de ucp-like está relacionado ao tratamento com menadiona e não com a presença de aoxA, explicando os mesmos níveis de transcritos em CEA17 e ?aoxA. Os níveis de nde sugerem atividade coordenada de sua proteína com AOX, por seus níveis estarem modulados pela presença de aoxA. A participação da Nde e da AOX na detoxificação das espécies reativas de oxigênio é sugerida ao se obter altos níveis de seus transcritos em hifas tratadas com menadiona. Diferentemente de germinantes, transcritos de sod3 foram predominantes em hifas de CEA17, enquanto transcritos de sod2 foram maiores em ?aoxA. Entre as catalases, os níveis de catA foram maiores no mutante, bem como a atividade das catalases como um todo. prx1 e trx1 foram maiores em CEA17 e ii grx1 em ?aoxA. Porém, trx1 atingiu os mais altos níveis de transcritos em germinantes, indicando possível redução de proteínas tiólicas e ribonucleotídeos por diferentes vias, de acordo com a fase de desenvolvimento do fungo. As enzimas antioxidantes clássicas, como superóxido dismutase, catalase e enzimas tiólicas, apresentaram aumento de transcrição na maioria das condições estudadas. No entanto, menadiona e paraquat promoveram maiores variações nos transcritos do que o observado com peróxido de hidrogênio gerado pelo sistema glicose/glicose oxidase. / Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungus which has been referred to as a major cause of morbidity and mortality in imunosupressed patients affected with invasive aspergillosis. The antioxidant defense system of the fungus plays an important role in its pathogenicity by overcoming the negative effects of the oxygen reactive species produced by host. This work aims evaluating the transcription of genes associated to mitochondrial and antioxidant proteins in the presence of different prooxidants for hyphae and germinants of control (CEA17) and alternative oxidase knockout (?aoxA) strains. Using qPCR, 23 genes have been analyzed, 5 of which are electron transport chain (ETC), 4 are related to alternative components of the mitochondria, and 14 are associated to antioxidant proteins. The results were obtained via normalization with the constitutive gene gapdh using untreated CEA17 strain in each developmental phase as calibrator. The differences in the transcription of most analyzed genes varied with the prooxidant and the developmental phase (germinants and hyphae). The ETC in germinants presented higher amounts of transcripts of the complex II and III in CEA17 than in ?aoxA treated with menadione. With other complexes and the atpase no significant difference has been noted between both strains. However, the transcript levels of ATP synthase were not higher than control in any strain, which is related to its regulation in the presence of UCP. UCP-like had increased transcription in mutant, suggesting uncoupling from the ETC, relative to control and CEA17, which showed high levels of nde. In this strain, aoxA and ucp-like transcripts were not significantly different. This fact associated the lower levels of ndiA and transcripts of the complexes I and II suggest the maintenance of the electron flow in the mitochondria. Concerning the antioxidant enzymes, there was significant increase in the transcript production of cat2, catA, prx1, Ttrx1 and Ggrx1, suggesting a response to the absence of AOX. The ETC transcripts in hyphae did not present significant difference in the levels of complex III and atpase in CEA17 and ?aoxA. Yet the complex IV has shown higher in mutant than in CEA17. In this developmental phase, the increase of ucp-like is related to the treatment with menadione and not with the presence of aoxA, what explains the equivalent amount of transcripts in CEA17 and ?aoxA. The levels of nde suggest coordinated action of the protein with AOX, because it is modulated by the presence of aoxA. The role of Nde and AOX in the detoxification of reactive oxygen species is suggested by their high levels of transcripts in hyphae treated with menadione. Different from germinants, transcripts of sod3 was predominant in CEA17 hyphae, whereas transcripts of sod2 were higher for ?aoxA. Among catalases, levels of catA were higher in mutant, as was the activity of catalase as a whole. prx1 and trx1 transcripts were higher in CEA17 and grx1 in ?aoxA. Yet, trx1 reached the highest levels of transcripts in germinants, indicating a possible reduction of thiol proteins and ribonucleotides through different ways, according to the developmental phase of the fungus. The classical antioxidant enzymes, as superoxide dismutase, catalase and thiol enzymes showed increase in the transcripts in most of the analyzed situations. iv However, menadione and paraquat promoted higher variation in the transcripts than that observed with hydrogen peroxide generated by the system glucose/glucose oxidase.

O produto comercial CI Disperse Blue 291 (CI DB291) é amplamente utilizado pela industria têxtil. Estudos mostram que corantes dinitrofenilazo são genotóxicos no ensaio de Ames/Salmonella, mas há poucos estudos sobre seus efeitos em células eucariontes. Este trabalho teve como objetivo investigar a genotoxicidade e citotoxicidade do corante DB291 em células humanas em cultura, bem como vias pelas quais o corante atua levando aos efeitos tóxicos. O corante comercial foi purificado por HPLC-DAD e utilizado para incubação com células HepG2 (5-100 µM por 3-72 h). A citotoxicidade foi avaliada pelos ensaios de XTT, corante cristal violeta, lactato desidrogenase extracelular e consumo de glicose. A geração de ROS intracelular foi verificada pela emissão de fluorescência da 2\',7\'-diclorofluoresceína. Análises de ciclo celular, fragmentação do DNA, potencial de membrana mitocondrial (Ψ) e cálcio intracelular foram realizadas por citometria de fluxo. A produção de ATP foi mensurada por quimiluminescência. Níveis de 8-oxodG e 5-mdC foram avaliados por HPLC-ESI-MS/MS e HPLC-UV, respectivamente. A expressão da enzima DNMT1 foi avaliada por western blot. Um produto de biotransformação foi identificado e caracterizado estruturalmente por MS/MS e 1H-RMN. A exposição ao corante DB291 diminuiu significativamente a sobrevivência das células em um modo tempo- e dose-dependente (IC50 = 74 µM), com a concomitante formação de um produto de biotransformação reduzido. A morte celular ocorreu sem lise da membrana plasmática. Nas células expostas, foi observado aumento da atividade enzimática mitocondrial, acompanhado por um aumento da taxa de consumo de glicose. Índices elevados de ATP, Ψ e cálcio foram verificados após a incubação das células com concentrações crescentes do corante. Alterações mitocondriais e o processo de biotransformação impeliram a aumento na produção de ROS intracelular, 8-oxodG e fragmentação do DNA. O dano ao DNA induziu a parada no ciclo celular e super-expressão de DNMT1, seguido por hipometilação global do DNA no ciclo celular subsequente. Os resultados obtidos apontam pela primeira vez para a toxicidade do corante DB291 via biotransformação, com alterações mitocondriais e indução de estresse oxidativo. / The commercial CI Disperse Blue 291 (CI DB291) is widely used by textile industry. It is mutagenic in the Ames/S. typhimurium assay, but there are few studies showing its effects in eukaryotic cells. We evaluated here the toxicity of CI DB291 in the human HepG2 cell line. The commercial dye was purified by HPLC-DAD and used for incubation with HepG2 cells (5-100 µM for 3-72 h). Cytotoxicity was assessed by the XTT, crystal violet dye, extracellular lactate dehydrogenase and glucose consumption assays. ROS formation was assessed by 2\',7\'-dichlorofluorescein fluorescence. Analyses of cell cycle, DNA fragmentation, mitochondrial membrane potential (Ψ) and intracellular calcium were analyzed by flow cytometry. ATP level was measured by chemiluminescence. Levels of 8-oxodG and 5-mdC were evaluated by HPLCESI-MS/MS and HPLC-UV, respectively. DNMT1 expression was assessed by western blot. A biotransformation product was identified and structurally characterized by MS/MS and 1H-NMR. DB291 significantly decreased cell survival in a time- and dose-dependent manner (IC50 = 74 µM), with concomitant formation of a reduced biotransformation product. Plasma membrane lysis did not occur. Increased mitochondrial enzymatic activity, accompanied by increase in glucose consumption rate, was observed in cells incubated with DB291. Elevated ATP, Ψ, and intracellular calcium was verified after cell incubation with increasing dye concentrations. Mitochondrial changes and the biotransformation process accounted for the observed raise in intracellular ROS, 8-oxodG, and DNA fragmentation. DNA damage induced cell cycle arrest and DNMT1 overexpression, followed by DNA hypomethylation in the subsequent cell cycle. Results point for the first time to toxicity of the dye through biotransformation, mitochondrial changes, and oxidative stress.

O A. fumigatus é um fungo saprofítico e tornou-se um dos principais agente patogênico oportunista em pacientes imunossuprimidos. Estudos prévios em nosso laboratório foi demonstrado que em mitocôndrias de P. brasiliensis e de A. fumigatus, o NAD+ era capaz de induzir a formação de potencial de membrana mitocondrial, o qual podia ser dissipado por FCCP, sugerindo a presença de um transportador de NAD+/NADH, conforme havia sido descrito em S. cerevisiae. Através de ferramentas de bioinformática, foi identificado no Aspergillus Gene Database, uma sequência com 32% de identidade com o gene ndt1p de S. cerevisiae. A sequência de cDNA, contendo 1.194 pb foi obtida usando PCR-Overlaping e clonada em vetor pGEM®-T Easy. Em seguida, a sequência foi subclonada em vetor de expressão pET28-a(+) e expressa em E. coli BL21(DE3). A proteína recombinante foi purificada a partir dos corpos de inclusão e sua identidade confirmada por espectrometria de massas e por Western Blotting usando anticorpo anti-His-tag. A proteína recombinante foi utilizada para produção de anticorpo policlonal anti-Ndt1 em coelho. Para expressão em levedura, o cDNA do gene ndt1 de A. fumigatus foi subclonado em vetor pYES2 e as leveduras S. cerevisiae ?ndt1?ndt2 foram transformadas. Foi realizada a curva de crescimento e indução da expressão da proteína recombinante Ndt1, a presença da proteína foi detectada utilizando anticorpo policlonal anti-Ndt1 após 16 horas de expressão. Nesse período foi verificado que as leveduras estavam em fase de crescimento exponencial. A cepa duplo mutante apresenta uma taxa de crescimento menor quando comparada com a cepa expressando a proteína recombinante quando crescidas em meio fermentável. As mitocôndrias isoladas de ambas as cepas foram submetidas à medida do potencial de membrana onde apresentavam acoplamento entre a oxidação de substratos e a fosforilação oxidativa. Além disso, ficou evidenciado que na cepa expressando a proteína recombinante, NAD+ induziu a formação de um potencial de membrana maior que na cepa controle. O transporte de NAD+ foi realizado e demonstrou que a cepa expressando a proteína Ndt1 tinha um aumento na fluorescência de NADH, mostrando que NAD+ foi capaz de entrar na matriz mitocondrial e posteriormente ser reduzido a NADH por enzimas da matriz mitocondrial. A determinação da produção de espécies reativas de oxigênio foi realizada utilizando as sondas fluorescentes CM-H2DCFDA e MitoSox Red em esferoplastos da levedura S. cerevisiae. Ambos experimentos não houve diferença significativa entre a cepa expressando a proteína Ndt1 e a cepa controle. As proteínas carboniladas foram determinadas utilizando anticorpo anti-DNP, após a reação com dinitrofenilhidrazona e não há diferença significativa entre as cepas. Finalmente, para confirmação da localização celular da proteína Ndt1, os esferoplastos de S. cerevisiae foram submetidos à microscopia confocal, onde ficou evidenciado a co-localização da proteína Ndt1 com as mitocôndrias na cepa de S. cerevisiae transformada com a construção pYES/ndt1, o mesmo perfil não foi observado na cepa ?ndt1?ndt2. / The A. fumigatus is a saprophytic fungus and is a major opportunistic pathogen in immunosuppressed patients. Previous studies in our lab has showed that mitochondrias of the P. brasiliensis and A. fumigatus, NAD+ is able to induce the formation of mitochondrial membrane potential, which could be dissipated by FCCP, suggesting the presence of a NAD+/NADH carrier as described in S. cerevisiae. Using bioinformatics tools, it was identified in Aspergillus Gene database a sequence containing 32% of identity with the gene ndt1p of S. cerevisiae. A fragment of cDNA was obtained from the ndt1p mRNA sequence, containing 1194 bp by using PCR-overlaping and cloned in pGEM®-T Easy vector. Then, the sequence was subcloned in pET28-a(+) vector and expressed in E. coli BL21 (DE3). The recombinant protein was purified from inclusion bodies and the identity confirmed by mass spectrometry and by Western Blotting using anti-His-tag antibody. The recombinant protein was used to produce polyclonal antibody anti-Ndt1 in rabbit. For expression in yeast, the ndt1 cDNA of A. fumigatus was subcloned into pYES2 vector and the yeast S. cerevisiae ?ndt1?ndt2 were transformed. Growth curve and induction of the recombinant protein expression Ndt1 was performed and the protein was detected using a polyclonal anti-Ndt1 antibody after 16 hours of expression. During this period it was found that the yeast were in exponential growth phase. The double mutant strain shows a slower growth rate compared to the strain expressing the recombinant protein growth rate when grown in fermentable medium. The isolated mitochondria from both strains were subjected to measurement of the membrane potential which showed coupling between substrate oxidation and oxidative phosphorylation. Furthermore, these measurements evidenced that the strain expressing the recombinant protein NAD+ induced the formation of a membrane potential larger than the control strain. The transport NAD+ was evaluated and showed that the strain expressing the protein Ndt1 has an increase in NADH fluorescence, indicating that NAD+ was able to enter into the mitochondrial matrix and then reduced to NADH by enzymes from the matrix. The determination of the production of reactive oxygen species was performed using the fluorescent probe CM-H2DCFDA and MitoSox Red in spheroplasts of the yeast S. cerevisiae. Both experiments showed no significant difference between the strain expressing Ndt1 protein and strain control. The carbonylated proteins levels were checked using anti-DNP, after the reaction with dinitrophenylhydrazone and there is no significant difference between the strains. Finally, to confirm the cellular localization of the protein Ndt1, spheroplasts of S. cerevisiae were subjected to confocal microscopy, which evidenced the co-location of Ndt1 protein with mitochondria in S. cerevisiae strain transformed with the construction pYES/ndt1. This same profile was not observed in strain ?ndt1?ndt2.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2018-09-26T14:13:20Z No. of bitstreams: 1 Ana Thalita Soares.pdf: 894559 bytes, checksum: 0be887f2c20f60f2861f46e074b8733b (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2018-09-26T14:13:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Ana Thalita Soares.pdf: 894559 bytes, checksum: 0be887f2c20f60f2861f46e074b8733b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-26T14:13:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Thalita Soares.pdf: 894559 bytes, checksum: 0be887f2c20f60f2861f46e074b8733b (MD5) Previous issue date: 2017-12-21 / Compostos orgânicos de Selênio possuem diversas atividades farmacológicas já descritas, como atividade anti-inflamatória e antitumoral, principalmente devido aos seus efeitos antioxidantes. Por serem promissores na farmacologia, as sínteses desses compostos tem aumentado significativamente. Como muitas novas moléculas são sintetizadas o uso de um modelo simples como Caenorhabditis elegans é altamente vantajoso para avaliação inicial da toxicidade e do potencial terapêutico destas moléculas. O objetivo desse estudo foi avaliar a toxicidade e o potencial antioxidante de três compostos Arilselanil-alquil-1,2,3-triazois em C. elegans. Os animais foram expostos aos compostos em meio liquido por apenas 30 minutos no primeiro estagio larval (L1). Os compostos testados não apresentaram efeitos tóxicos nas concentrações testadas (1μM-1000 μM) em C. elegans. O tratamento com os Arilselanil-alquil-1,2,3-triazois (10 μM) reverteu parcialmente o estresse induzido pelo pesticida paraquat (1 mM), uma toxina mitocondrial. Apenas o composto SeTz-2 (10 μM) aumentou parcialmente a sobrevivência dos vermes tratados com H2O2 (0,5 mM). Os compostos também aumentaram a longevidade dos vermes mutantes mev-1, que possuem um reduzido tempo de vida pela produção em excesso de EROs na mitocôndria causada por uma alteração no complexo 2 da cadeia transportadora de elétrons. Além disso, os compostos reduziram os níveis de espécies reativas de oxigênio determinados pelo probe fluorescente H2DCF-DA bem como também reduziram a atividade da enzima catalase nesses animais mutantes. Baseado nos resultados encontrados é possível concluir que os compostos Arilselanil-alquil-1,2,3-triazois possuem atividade antioxidante principalmente em condição de estresse oxidativo mitocondrial em C. elegans. / Organic selenium molecules have many described pharmacological activities, such as anti-inflammatory and anti-tumoral, which are mainly due to their antioxidant effects. As they are promising pharmacological agents, their synthesis has grown significantly. Once many new molecules synthesized every day, the use of a simple animal model, such as the Caenorhabditis elegans, is highly valuable for initial toxicity and pharmacological potential evaluation of these molecules. The goal of this study was to evaluate the toxicity and the antioxidant capacity of three arylselanyl-alkyl-1,2,3-triazoles in C. elegans. The animals were exposed to the molecules in liquid media for 30 minutes at the first larval stage (L1). There were no toxic effects over animals’ viability within the range of tested concentrations (1μM-1000 μM). Exposure to 10 μM of arylselanyl-alkyl-1,2,3-triazoles has partially reversed the stress induced by the pesticide paraquat (1 mM), which is a mitochondrial toxin. Only SeTz-2 (10 μM) improved the viability of the animals exposed to H2O2 (0,5 mM). The arylselanyl-alkyl-1,2,3-triazoles also improved mev-1 mutants’ lifespan, which is normally decreased by excessive mitochondrial ROS production due to an alteration in a subunit of their mitochondrial complex 2. Also, the molecules were able to reduce ROS levels measured by the fluorescent probe H2DCF-DA, as well as they also reduced catalase enzyme’ activity. Based on our findings, it is possible to suggest that these molecules have antioxidant activity in C. elegans, mainly when facing mitochondrial oxidative stress.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:50:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Marcelo Garcia Jun-2007.pdf: 1765034 bytes, checksum: ccb95f7d696b4361f3d25db96fd2d70a (MD5) Previous issue date: 2007-06-01 / Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior / Inferring the evolutive relations between the animal phyla has been a formidable challenge to Science. The animal phyla represent quite distinct baupläne (body architectures) and are, therefore, difficult to compare. At the same time, their fossil record converges mostly to the same period on the geological scale. The recent availability of molecular data has, however, inaugurated a new front in animal phylogeny. The present work explores this opportunity by inferring a phylogeny with distance and maximum likelihood methods, employing all animal mitochondrial genomes ever sequenced. The results present only a few bigger groups with strong statistical support, like Diploblastica, Bilasteria, Protostomia and Deutorostomia, and many smaller groups of animals belonging to the same order or family. These results seems to confirm that the phyla radiated in such a short time interval that the phylogenetic signal did not hold out to produce a satisfactory resolution of the animal tree to date. Some limits may have yet to be tested, through models of evolution more fit to this scenario. For example was only recovered with the use of gamma distances for site-to-site substitution rate variability, at the expense of compressing the smaller branches throughout the tree. Nematodes and Platyhelminthes reveal a bias in GC and AT skew that cannot be adequately mapped by any reversible substitution pattern. Nevertheless, even if corrections are found for these issues, it is well possible that the hope of a better resolution in the animal tree will lie further on, by a better understanding of the evolutive process in a genomic scale. / Discernir as relações evolutivas entre os grandes grupos animais tem representado um formidável desafio para a Ciência. Os filos animais possuem arquiteturas corporais bastante distintas e por isso difíceis de serem comparadas. Ao mesmo tempo, seu registro fóssil converge aproximadamente para um mesmo intervalo na escala geológica, dificultando uma reconstrução filogenética com caracteres morfológicos. A disponibilidade de dados moleculares sobre os organismos abriu, contudo, novas possibilidades na filogenia animal. Esta dissertação buscou explorar essas possibilidades inferindo uma filogenia com métodos de distância e máxima verossimilhança, a partir de todos os genomas mitocondriais, completamente seqüenciados até o momento. No entanto, apenas alguns grandes agrupamentos como Diploblastica, Bilateria, Deuterostomia e Protostomia foram recuperados com forte suporte estatístico, além de pequenos agrupamentos de animais de mesma ordem ou família, indicando que os efeitos da rápida radiação no Cambriano se estenderam também ao registro molecular. Os resultados também indicam a necessidade de buscar modelos de evolução mais aderentes a este cenário. Deuterostomia, por exemplo, só foi recuperado monofileticamente assumindo-se a distribuição gama para variabilidade entre-sítios, ao custo, entretanto, da perda de definição nos ramos menores. Nematóides e Platelmintos, por sua vez, revelam um possível viés no skew (desvio) do conteúdo GC e AT de seus genes mitocondriais, que não é adequadamente mapeado por modelos de substituição reversíveis. Os indícios são de que a resolução da filogenia animal depende ainda de uma melhor compreensão da evolução molecular em escala genômica.

O quadro de resistência à insulina em humanos está fortemente relacionado ao acumulo de lipídeos intracelulares, a inatividade física e ao aumento de espécies reativas de oxigênio (ERO). O objetivo deste estudo foi verificar se o aumento na oferta de nutrientes incluindo glicose e ácido graxo palmítico pode alterar o potencial de membrana mitocondrial, a respiração, a produção de espécies reativas de oxigênio e a resposta a insulina em células do tecido muscular. Nossos resultados mostram que a exposição de células musculares a elevada disponibilidade de substratos resultou em diminuição do potencial de membrana mitocondrial, e aumento da respiração no estado IV e da expressão do RNAm da proteína desacopladora mitocondrial UCP-3. Mostrando a existência de um mecanismo de desacoplamento intrínseco em células do músculo esquelético ativado em situações de elevada oferta de nutrientes. Nessas condições observamos redução do acoplamento e da eficiência termodinâmica mitocondrial. Interessantemente, essa capacidade de desacoplamento parece ser perdida cronicamente como indicado pelos nossos resultados de consumo de oxigênio no período de 48h favorecendo uma menor atividade mitocondrial, aumento de EROs e redução da razão GSH/GSSG. Imagens de microscopia eletrônica em cultura primária e expressão gênica do PGC1-, um reconhecido gene regulador da biogênese mitocondrial, não demonstraram diferença entre controle e tratamento com palmitato. O ácido palmito resultou na redução da fosforilação de Akt, bem como, na captação de glicose estimulada por insulina. Nossos achados, portanto, sugerem que uma redução do acoplamento termodinâmico mitocondrial e do sistema antioxidante, juntamente com aumento do peróxido de hidrogênio, estão fortemente relacionados a redução da resposta a insulina. Deste modo, nosso estudo sugere um papel importante da mitocôndria na resposta a insulina. / The insulin resistance in human framework is strongly related to the accumulation of intracellular lipids, physical inactivity and increased reactive oxygen species (ROS). The aim of this study was to determine whether the increase in nutrient supply including glucose and palmitic fatty acid can change the mitochondrial membrane potential, respiration, production of reactive oxygen species and the insulin response in muscle tissue cells. Our results show that exposure of muscle cells to high availability of the substrate resulted in decreased mitochondrial membrane potential, in increased respiration in the state IV and mRNA expression of mitochondrial uncoupling protein UCP-3. Showing the existence of an intrinsic uncoupling mechanism of skeletal muscle cells activated in situations of high supply of nutrients. However, under these conditions we observed a reduction of the coupling and mitochondrial thermodynamic efficiency. Interestingly, this decoupling capacity was chronically lost as indicated by our results in the 48 hours period favoring a lower mitochondrial activity, increase of ROS and reduced GSH / GSSG ratio. Images from electron microscopy and gene expression of PGC1-, a recognized regulatory gene of mitochondrial biogenesis, showed no difference between control and treatment with palmitate. The palm acid resulted in reduced phosphorylation of Akt, as well as glucose uptake stimulated by insulin. Our findings thus suggest that a reduction in mitochondrial antioxidant and thermodynamic coupling system, along with increase in the hydrogen peroxide, are closely related to reducing insulin response. Thus, our findings suggest a role of mitochondria in insulin response.

A relação entre nutrição e fenótipo é uma questão especialmente desafiadora em casos de polifenismo facultativo, como no caso das castas de insetos sociais, por exemplo, a abelha melífera Apis mellifera. Após estudos de vias de sensoriamento de nutrientes, modificações inesperadas nestas vias de sinalização revelaram a resposta à hipóxia como um possível mecanismo subjacente à regulação do tamanho corporal e crescimento de órgãos. Uma vez que essa resposta está intimamente ligada a condições metabólicas das células, o presente estudo foi concebido para investigar possíveis alterações no metabolismo mitocondrial e oxidativo no processo de diferenciação de castas em A. melífera na fase larval, com foco no corpo gorduroso, que é o centro metabólico dos insetos. Partindo da hipótese de que rainhas e operárias são criadas em células de cria abertas sob condições iguais de disponibilidade de oxigênio, nós investigamos o número e a distribuição mitocondrial, bem como as taxas de consumo de oxigênio em mitocondrias de células de corpo gorduroso durante estágios larvais críticos. Por meio de análises de imunofluorescência e microscopia eletrônica encontramos maior densidade de mitocôndrias no corpo gorduroso larval da rainha, dado corroborado pela quantificação de unidades funcionais mitocondriais por ensaio de citrato sintase. Medições de consumo de oxigênio por respirometria de alta resolução revelaram que as larvas de rainha têm capacidades máximas mais altas de produção de ATP, com menor demanda fisiológica, mas com mesma eficiência mitocondrial que operárias. A análise da expressão de fatores relacionados à mitogênese mostrou que os homólogos dos genes codificadores dos fatores de transcrição TFB1 e TFB2 e de um regulador nutricional, ERR, estão mais expressos em larvas de rainha. Apesar das diferenças encontradas na respiração mitocondrial entre as duas castas, as mesmas apresentaram níveis similares de produção de lactato e peróxido de hidrogênio, sem grandes alterações referentes à condições de estresse oxidativo e ao estado redox das célula. Encontramos altos níveis de expressão de genes codificadores das enzimas do sistema antioxidante MnSOD e catalase em células do corpo gorduroso larval de rainha, que garantem a redução de eventuais danos oxidativos. Estes resultados são fortes evidências de que a nutrição diferencial das larvas pelas operárias adultas, como estímulo externo da indução do desenvolvimento das castas, diferencialmente afeta a dinâmica e funcionalidade mitocondrial como elemento intrínseca da plasticidade fenotípica neste inseto social. / The connection between nutrition and phenotype is a particularly challenging issue in cases of facultative polyphenism, as for instance in the honeybee Apis mellifera. After studies on nutrient sensing pathways found unexpected modifications in these signaling pathways, a response to hypoxia was revealed as a possible mechanism underlying regulation of body size and organ growth. Since this response is closely linked to the metabolic conditions of the cells, the present study was designed to investigate the role of the mitochondrial and oxidative metabolism in the fat body of honeybee larvae, which is the metabolic center in insects, in the context of the caste differentiation process in A. mellifera. Based on the fact that honey bee larvae are reared in open brood cells, the queen and worker larvae should be exposed to equal oxygen diffusion conditions, and hence we investigated mitochondrial number and intracellular distribution, as well as rates of mitochondrial oxygen consumption in fat body cells during the larval stages critical for caste differentiation. By means of immunofluorescence and electron microscopy we found a higher density of mitochondria in the fat body of queen larvae. This result was corroborated by the quantification of mitochondrial functional units using a citrate synthase assay. Measurements of oxygen consumption obtained by high resolution respirometry revealed that queen larvae have higher maximum capacities of ATP production, with less physiological demand and higher mitochondrial efficiency than workers. Analysis of the expression of genes related to mitogenesis showed that Apis homologs of the transcription factors TFB1 and TFB2 and of the nutritional regulator, ERR are higher expressed in queen larvae. Despite differences in mitochondrial respiration, the two castes presented similar levels of lactate and hydrogen peroxide production, and without major chang in oxidative stress and cellular redox status. The high transcriptional levels of genes encoding enzymes of the antioxidant system, MnSOD and catalase observed in fat body cells of queen larvae guarantee that oxidative damage is reduced during larval development. These results are strong evidence that the differential nutrition of honey bee larvae by the adult worker, as the external stimulus for caste induction, differentially affects mitochondrial dynamics and functionality as an intrinsic element of phenotypic plasticity in this social insect.

O lobo-marinho-do-sul pertencente à ordem Carnivora, subordem Pinnipedia e família Otariidae habita ambientes aquáticos e terrestres e, desta forma, apresentando alterações morfofisiológicas adaptativas importantes, entre elas o sistema cardíaco. O coração é o órgão muscular central do sistema circulatório que tem como função o transporte de oxigênio e nutrientes para os tecidos, assim como o transporte de dióxido de carbono. Considerando a importância deste órgão para o funcionamento geral dos demais sistemas corpóreos, este trabalho teve por objetivo descrever a morfologia e aspectos morfométricos do coração a fim de estabelecer comparações entre o coração do lobo-marinho-do-sul com outros pinípedes e carnívoros terrestres. Para tanto, foram utilizados corações de lobo-marinho-do-sul (Arctocephalus australis) que vierem a óbito por causas naturais. Após análise macroscópica e realização de mensurações, os corações foram analisados em nível de microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura, por meio de crio fratura em nitrogênio líquido, e microscopia eletrônica de transmissão. As características topográficas e morfológicas do coração do lobo-marinho-do-sul são descritas. O órgão é quase totalmente envolto pelo pulmão e revestido pelo pericárdio tendo uma forma alongada e achatada. Os aspectos ultra-estruturais apresentaram a disposição de fibras musculares dos átrios e ventrículos com as características típicas de fibras cardíacas revelando os feixes de miofibrilas, mitocôndrias com as cristas mitocondriais nítidas, junções em forma de placas, anastosmoses entre os feixes de miofibrilas e grânulos elétron-densos, nátrio-uréticos, próximo ao núcleo das células musculares ou ao longo da disposição de mitocôndrias das fibras musculares de átrios. / The southern-fur-seal belongs to the order Carnivora, suborder Pinnipedia and Otariidae family lives in aquatic and terrestrial environments and thus presenting important adaptive morpho-physiological changes, between then the cardiovascular system. The heart is the central muscular organ of the circulatory system whose function is to transport oxygen and nutrients to tissues, as well as the transport of carbon dioxide. Considering the importance of this organ to the overall functioning of other body systems, this study was to aim to describe the morphology and morphometric aspects of the heart in order to establish comparisons between the heart of the southern-fur-seals with other pinnipeds and terrestrial carnivores. Therefore, hearts of southern-fur-seals (Arctocephalus australis) were used that come to death by natural pathologies. After macroscopic analysis and execution of measurements, the hearts were analyzed at the level of light microscopy, scanning electron microscopy, using cryo fracture in liquid nitrogen, and transmission electron microscopy. The heart of the fur seal-of-south is surrounded almost entirely by the lung and covered by the pericardium, having long, flat in shape. The ultrastructural aspects presented the dispositive of muscle fibers of the atrium and ventricles under the typical cardiac fibers revelry the myofibrils bundles, mitochondria with mitochondrial cristal, junction in form of plates, anastomosis between the myofibrils bundles, and electron dense granules like natriun-uretriz near to nuclear of muscle cells or along the disposal of mitochondria of the muscle fibers of atrium.