Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES.

Orientador: Ione Salgado / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campoinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T04:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_HalleyCaixetade_D.pdf: 3949471 bytes, checksum: cf24197fabcb7bb0a920baa1ef786e63 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O controle da homeostase do óxido nítrico (NO), determinada pelo balanço entre os processos de síntese e degradação, é essencial para suas funções sinalizadoras. O presente estudo teve como objetivo geral buscar um melhor entendimento da homeostase do NO em plantas, enfocando a importância dessa molécula na bioenergética mitocondrial e na resposta de defesa vegetal ao ataque de patógenos. Inicialmente, foi realizada a caracterização de uma atividade de degradação de NO por mitocôndrias isoladas de tubérculos de batata, observando-se um consumo mitocondrial dependente de sua reação com o ânion superóxido, estimulado na presença de NAD(P)H. Ensaios com diferentes substratos e inibidores respiratórios evidenciaram as NAD(P)H desidrogenases externas, além do complexo III, como os principais sítios de geração de ânion superóxido para o consumo de NO. Por outro lado, numa análise comparativa com mitocôndrias isoladas de fígado de rato, uma atividade NAD(P)H oxidase mitocondrial não associada à cadeia respiratória foi detectada como uma fonte de superóxido, em adição ao vazamento de elétrons nos complexos I e III, para o consumo de NO. Em ambos os casos, a existência de mecanismos mitocondriais de degradação de NO mostrou-se importante para o controle de seus efeitos inibitórios sobre a atividade respiratória. Adicionalmente, a importância da síntese de NO para a defesa vegetal foi analisada utilizando-se como modelo a interação Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae. Trabalhos anteriores já haviam demonstrado que o mutante de A. thaliana duplo-deficiente para a nitrato redutase (nia1 nia2) apresenta reduzida produção de NO e susceptibilidade à P. syringae, o que poderia resultar de sua prejudicada assimilação de nitrogênio. No presente estudo, plantas nia1 nia2 foram cultivadas com glutamina ou arginina para aumentar os níveis foliares de aminoácidos. Entretanto, esse mutante continuou a desenvolver uma baixa emissão de NO e permaneceu susceptível à infecção bacteriana, indicando que a susceptibilidade não resulta do reduzido conteúdo de aminoácidos. Por outro lado, a fumigação com baixas concentrações do gás NO de plantas nia1 nia2 com os níveis de aminoácidos recuperados restabeleceu a resposta de resistência. Coerentemente, uma análise do perfil transcriptômico utilizando microarranjos de DNA mostrou que o tratamento com NO induziu diversos genes relacionados à defesa em folhas nia1 nia2 infectadas, como aqueles relacionados às vias de sinalização do ácido salicílico e do cálcio, as proteínas relacionadas à patogênese, a reorganização da parede celular e a síntese de compostos com atividade antimicrobiana. Ainda, essa análise indicou novos genes como potenciais alvos do NO, sugerindo aspectos até então desconhecidos do papel dessa molécula sinalizadora na interação fitopatogênica e na fisiologia vegetal. Em especial, destacou-se o possível envolvimento do NO na alteração de transcritos relacionados à sinalização hormonal de forma a permitir um controle atenuador de mecanismos da resposta de defesa. / Abstract: The control of nitric oxide (NO) homeostasis, determined by a balance between the rate of synthesis and degradation, is essential for its signaling functions. The present study aimed a better understanding of NO homeostasis in plants, focusing on the importance of this molecule in mitochondrial bioenergetics and in plant defense response to pathogen attack. Initially, we carried out a characterization of an NO degradation activity by mitochondria isolated from potato tubers, observing a superoxide-dependent NO consumption, that was stimulated in the presence of NAD(P)H. Assays with different respiratory substrates and inhibitors evidenced the external NAD(P)H dehydrogenases, in addition to complex III, as the main sites of superoxide anion generation for NO consumption. On the other hand, in a comparative analysis with mitochondria isolated from rat liver, a mitochondrial NAD(P)H oxidase activity, non-associated to the respiratory chain, emerged as a superoxide source, in addition to the electron leakage from complexes I and III, for NO consumption. In both cases, the existence of mitochondrial mechanisms of NO degradation was important for the control of its inhibitory effects on respiratory activity. Additionally, the importance of NO synthesis for plant defense was analyzed using the interaction Arabidopsis thaliana- Pseudomonas syringae as a model. Previous works have shown that the nitrate reductase double-deficient mutant of A. thaliana (nia1 nia2) presents reduced NO production and susceptibility to P. syringae, that could result from its impaired nitrogen assimilation. Here, nia1 nia2 plants were cultivated with glutamine or arginine to increase the leaf amino acid content. Despite this, this mutant continued to develop a low NO emission and remained susceptible to bacterial infection, indicating that the susceptibility does not result from reduced amino acid levels. On the other hand, the fumigation of amino acid-recovered nia1 nia2 plants with low concentrations of NO gas reestablished the resistance response. Accordingly, a transcriptomic analysis using DNA microarrays showed that NO treatment induced diverse defense-related genes in infected nia1 nia2 leaves, as those associated to salicylic acid and calcium signaling pathways, pathogenesis-related proteins, cell wall reorganization and synthesis of antimicrobial compounds. Additionally, this analysis indicated new genes as potential targets of NO action, suggesting previously unknown aspects about the role of this signaling molecule in phytopathogenic interactions. In special, we can highlight the possible involvement of NO in the modulation of transcripts related to hormonal signaling in order to allow an attenuating control of certain mechanisms of the defense response. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Denise Vaz de Macedo, Rodrigo Hohl / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T09:57:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferraresso_RodrigoLuizPerroni_M.pdf: 3766463 bytes, checksum: 4e6cf849a52ef6607e6e4aec1bcbae01 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O overtraining e um processo continuo de treinamento intenso que pode gerar um declínio curto no desempenho, denominado de overreaching funcional (FOR), o qual conduz eventualmente a uma melhoria no desempenho apos um breve período de recuperação (dias-semanas); ou um declínio mais prolongado no desempenho, caracterizado como overreaching nao funcional (NFOR), que somente e revertido por um período regenerativo mais longo (semanas-meses). Nos desenvolvemos um protocolo de treino-overtraining para ratos que induz aos estados FOR e NFOR apos um período de adaptação ao treinamento e aumento de desempenho (Tr). O desempenho dos animais foi avaliado através de 6 testes ao longo do protocolo, testes estes que serviram para separarmos nossos grupos experimentais. Nosso objetivo foi investigar a hipótese do estresse oxidativo, relacionado com alterações na atividade mitocondrial, como uma das possíveis causas desencadeadoras da queda de desempenho durante a instalação do overtraining. Para isso analisamos a atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT), glutationa redutase (GR) e superóxido dismutase (SOD), dos marcadores de produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), xantina oxidase (XO) e ataque oxidativo por meio da analise das substâncias que reagem ao acido tiubarbiturico (TBARs), alem da atividade da enzima citrato sintase (CS) e dos complexos mitocondriais da cadeia de transporte de elétrons, complexo I e IV. Analisamos ainda, em busca de possíveis biomarcadores, a capacidade antioxidante sanguínea por meio das analises do FRAP (ferric reducing ability of plasma), albumina e acido úrico. A peroxidação lipídica no plasma foi obtida por meio da analise do malondialdeido (MDA) e o marcador de lesão muscular utilizado foi a creatina quinase sanguínea (CK). Os resultados estão apresentados por meio de boxplots com seus respectivos intervalos de confiança (95%) que dão a significância ou não de diferenças entre as analises. Os resultados encontrados apontaram para diminuições significativas na atividade do complexo IV e CS somada a atividades aumentadas das enzimas antioxidantes CAT e SOD no grupo NFOR, quando em comparação aos grupos Tr e FOR, respectivamente. Alem disso, os marcadores de peroxidação lipídica TBARs e MDA encontraram-se significativamente aumentados no grupo NFOR quando em comparação aos grupos CO, Tr e FOR. Estes dados sugerem, que a queda de desempenho no estado NFOR pode estar relacionada a diminuição da capacidade oxidativa devido a instalação de um quadro de estresse oxidativo mitocondrial, entretanto os mecanismos que causam este processo ainda precisam ser esclarecidos. / Abstract Overtraining is a continuous process with possible outcomes of functional-overreaching (FOR) and nonfunctional-overreaching (NFOR). FOR is characterized by a short-term decline in performance that leads eventually to an improvement in performance after a short recovery (daysweeks). NFOR is a decline in performance that can be reversed by a longer regenerative period (weeks-months). We developed an animal model of training-overtraining that led Wistar rats to FOR and NFOR states after a training adaptation period where they achieved increased performance (Tr group). The animal performance was evaluated through six tests during the protocol. These tests have served to separate our experimental groups. Our objective was to investigate the oxidative stress-related changes in mitochondrial activity hypothesis as a possible cause of the performance drop during the overtraining installation. We analyzed the antioxidant enzymes catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione reductase (GR) activity, ROS generator xanthine oxidase (XO) activity and oxidative damage indicator through the analysis of substances which react to thiubarbituric acid (TBARS) production. In addiction we analyzed citrate syntase (CS) enzyme activity and mitochondrial complexes of the electron transport chain (complex I and IV) activity. We also analyzed, for potencial biomarkers, the antioxidant capacity of blood through the FRAP (ferric reducing ability of plasma), albumin and uric acid analysis. Lipid peroxidation in plasma was obtained by malondialdehyde (MDA) and the muscle damage marker used was blood creatine kinase (CK). The results are presented by boxplots with their respective confidence intervals (95%) giving a significance or not of differences between analysis. The results pointed to significant decreases in complex IV and CS activity plus an increased of antioxidant enzymes SOD and CAT activities in NFOR group when compared to Tr and FOR groups respectively. Furthermore, the lipid peroxidation TBARS and MDA markers were found significantly increased in NFOR group when compared to CO, Tr and FOR. These data suggest that the performance drop in the NFOR state may be related to decreased oxidative capacity due to a mitochondrial oxidative stress installation. However the mechanisms involved in this process yet to be clarified. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Roger Frigério Castilho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Medicina / Made available in DSpace on 2018-08-17T17:12:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Benevento_CarlosEduardo_M.pdf: 1259377 bytes, checksum: 4da710918dbc27454a7d2a62e9299598 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: É proposto que a neurodegeneração que ocorre na doença de Alzheimer seja decorrente do acúmulo intra e extracelular de peptídeos beta-amilóide (A?), num processo que envolve comprometimento do metabolismo oxidativo mitocondrial. O objetivo do presente trabalho foi investigar e comparar os efeitos das formas agregada (oligomérica e fibrilar) de A?42 e da forma não agregada (monomérica) de A?40 na função mitocondrial. Mostrou-se, em eletroforese em gel de poliacrilamida, que o protocolo de preparo das formas agregadas e não agregada dos peptídeos estava de acordo com o perfil de agregação descrito na literatura. Estimou-se o consumo de oxigênio por mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos, na presença ou ausência de peptídeos A?, utilizando como substratos malato e glutamato. Não houve efeito significativo de 12 µM dos peptídeos A? na respiração mitocondrial em estado de repouso (estado 4) ou durante a fosforilação oxidativa (estado 3), porém observou-se um estímulo do estado 4 quando os peptídeos foram utilizados na concentração de 24 µM. O estímulo mais significativo na respiração mitocondrial em estado 4 foi observado com o A?40 (39%), quando comparado aos estímulos observados na presença das formas oligomérica (31%) e fibrilar (29%) de A?42. O maior efeito de A?40 pode ser devido a sua característica hidrofóbica, permitindo sua maior interação na membrana mitocondrial. A partir destes resultados, avaliou-se o efeito de A?40 (24 µM) na razão ADP/O, sendo observada uma redução de 11% neste parâmetro. Ao se comparar o efeito de A?40 (24 µM) em mitocôndrias cerebrais sinápticas e não-sinápticas, observou-se que as organelas sinápticas foram mais suscetíveis ao peptídeo, apresentando um estímulo do estado 4 de 38%, enquanto que as não-sinápticas apresentaram um estímulo de apenas 15%. Quando o meio de reação contendo A?40 foi ultrafiltrado (corte > 3 kDa) o estímulo da respiração mitocondrial foi abolido. Observou-se uma redução de 71% na produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) no estado 4 da respiração na presença de A?40 (24 µM) e quando o peptídeo A?42 oligomérico foi testado a redução foi de 29%. A redução observada na produção de EROs pode ser explicada pelo desacoplamento parcial da respiração mitocondrial provocada pelos peptídeos A?. Não houve diferença na capacidade de retenção de Ca2+ por mitocôndrias na presença de peptídeos A?. Por fim, verificou-se que o peptídeo A?40 leva a uma diminuição da fluidez das membranas mitocondriais. Conclui-se que peptídeos A? podem ser diretamente tóxicos a mitocôndrias neuronais, o que pode ter um papel na fisiopatologia da doença de Alzheimer. / Abstract: Neurodegeneration in Alzheimer¿s disease involves intra- and extracellular accumulation of betaamyloid peptides (A?) in a process leading to impairment of mitochondrial oxidative metabolism. The aim of the present study was to investigate and compare the effects of the aggregated forms of A?42 (oligomers and fibrils) and the unaggregated form of A?40 (monomers) on mitochondrial function. Polyacrylamide gel electrophoresis was run as a control and showed that our preparation protocols generated aggregated and unaggregated forms of the peptides in agreement with the patterns reported in the literature. Oxygen consumption by isolated rat brain mitochondria was measured in the presence or absence of A? peptides, using malate and glutamate as substrates. A? peptides at 12 µM did not have a significant effect on respiratory state 4 (resting respiration) or state 3 (ADP-stimulated respiration). However, a higher state 4 respiration was observed when the peptides were used at a concentration of 24 µM. The most significant increase in mitochondrial state 4 respiration was observed with A?40 (39%) followed by A?42 oligomers (31%) and fibrils (29%). The bigger effect found with A?40 may be due to its hydrophobicity, which enables greater interaction with the inner mitochondrial membrane. We then evaluated the effect of A?40 (24 µM) on the ADP/O ratio and found an 11% reduction in this parameter. Comparing the effect of A?40 (24 µM) on synaptic and non-synaptic mitochondria, we observed that the former were more susceptible to A?40, with an increase in the state 4 respiration of 38%, while the latter showed only a 15% increase. After ultrafiltration (3 kDa cutoff) of the reaction medium containing A?40, no effect on mitochondrial respiration was observed. We found 71% and 29% inhibition of mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production in state 4 in the presence of the A?40 monomer and A?42 oligomer at 24 µM, respectively. The inhibition of ROS production may be explained by the partial mitochondrial respiratory uncoupling caused by the A? peptides. These peptides were not observed to have any effect on mitochondrial Ca2+ uptake or retention. Lastly, our results indicated that A?40 leads to a decrease in mitochondrial membrane fluidity. We conclude that A? peptides may be directly toxic to neuronal mitochondria, this may play an important role in the pathophysiology of Alzheimer¿s disease. / Mestrado / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Otávio Rizzi Coelho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T21:29:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tornatore_ThaisFranchini_D.pdf: 5344920 bytes, checksum: 13bb7f4ae7264a0aca117131579c9b8e (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Estudamos o gene da FAK (focal adhesion kinase) na mitocondriogênese cardíaca induzida por estresse mecânico. O estresse prolongado (2-12 hs) de miócitos do ventrículo esquerdo de ratos neonatos(NRVM) aumentou a expressão do regulador transcricional mitocondrial PGC-1? (peroxisome proliferator activated receptor coactivator-1), NRF-1 (nuclear respiratory factor) e o Tfam (mitochondrial transcription factor A). A ativação da cascata transcricional mitocondrial em cardiomiócitos estirados foi acompanhada pelo aumento da mitocondriogênese (aumento da densidade mitocondrial e número de cópias do DNA - mtDNA) e hipertrofia(tamanho da célula e transcrição do ANP). Estresse mecânico também aumentou a fosforilação da FAK, a localização nuclear e associação com PGC1-?. FAK C-terminal Recombinante, mas não a N-terminal ou domínio kinase, precipitaram PGC-1? em extratos nucleares de NRVMs. Além disso, a inibição da expressão da FAK por RNA de interferência suprimiu a hiper regulação do PGC-1? e NRF-1, e atenuou o aumento da mitocondriogênese e hipertrofia em cardiomiócitos. Ao mesmo tempo, a inibição da FAK reduziu os níveis de ATP em cardiomiócitos estirados. Estudos complementares em ventrículos esquerdo de camundongos adultos revelaram aumento da expressão de PGC-1?, NRF-1 e mtDNA em resposta à sobrecarga pressórica. In vivo o silenciamento da FAK atenuou a hiper regulação do PGC-1?, NRF-1, mtDNA e a hipertrofia do ventrículo esquerdo induzida por sobrecarga pressórica. A ativação da sinalização da FAK parece ter importante relação no aumento da mitocondriogênese paralelamente à resposta do aumento hipertrófico relacionado ao estresse mecânico dos cardiomiócitos / Abstract: We studied the implication of FAK (focal adhesion kinase) in cardiac mitochondriogenesis induced by mechanical stress. Prolonged stretching (2-12 hs) of neonatal rat ventricular myocytes (NRVM) enhanced the expression of mitochondria transcriptional regulator PGC-1? (peroxisome proliferator activated receptor coactivator-1), NRF-1 (nuclear respiratory factor) and transcripts of Tfam (mitochondrial transcription factor A). The activation of the mitochondria transcriptional cascade in stretched NRVM was accompanied by enhanced mitochondriogenesis (increases in mitochondrial density and DNA copy number - mtDNA) and hypertrophy (cell size and ANP transcripts). Cell stretching also enhanced FAK phosphorylation, nuclear localization and association with PGC1?. Recombinant FAK C-terminal, but not the N-terminal or kinase domain, precipitated PGC-1? from NRVM nuclear extracts. Moreover, depletion of FAK by RNA interference suppressed the upregulation of PGC-1? and NRF-1, and markedly attenuated the enhanced mitochondriogenesis and hypertrophy of stretched NRVMs. Concomitantly, FAK depletion induced a marked reduction of ATP levels of stretched NRVM. Complementary studies in adult mice left ventricle revealed enhanced expression of PGC-1?, NRF-1 and mtDNA in response to pressure overload. In vivo FAK silencing attenuated the upregulation of PGC-1?, NRF-1, mtDNA and left ventricular hypertrophy induced by pressure overload. Activation of FAK signaling seems to be important for conferring enhanced mitochondriogenesis coupled to the hypertrophying growth response to mechanical stress in cardiomyocytes / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Maria Alice da Cruz-Hofling, Anibal Eugenio Vercesi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T03:04:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freitas_ErikaMariaSilva_D.pdf: 24578708 bytes, checksum: bf9367ecdbc315a07f58411feea40089 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A veratrina, uma mistura de alcalóides obtidos da espécie de planta Shoenocaulon officinale, é uma toxina lipossolúvel que possui como sítio de ação primária os canais de sódiodependentes de voltagem. Recentemente, nossos estudos mostraram que a veratrina pode causar mionecrose e as evidências sugerem que as mitocôndrias e o retículo sarcoplasmático (RS) possam ser os alvos intracelulares da ação da veratrina. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos tóxicos induzidos por diferentes concentrações de veratrina sobre o consumo de oxigênio, a atividade dos complexos da cadeia respiratória e a ultraestrutura das mitocôndrias através de análises bioquímicas, citoquímicas e morfométricas e de microscopia eletrônica de transmissão...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The veratrine, a mixture of alkaloids obtained from plant Schoenocaulon officinale, is a lipid soluble toxin, which target voltage-gated Na+ channels for their primary action site. Recently, our studies showed that the veratrine may cause myonecrosis and evidences suggested mitochondria and sarcoplasmic reticuIum (SR) as intracellular cell targets. The aim of this work was to investigate the effects caused by variabIe concentration of veratrine on mitochondrial oxygen consumption, respiratory chain enzymes activities and ultrastructure, combining electron microscopy with biochemical, cytochemical and morphometrical analysis. Moreover, we investigated whether the interference on physiology of sodium channels by veratrine it alters the ultrastructure of SR on different types of muscles. Ultrastructural changes were observed on skeletal muscle mitochondria after intramuscular injection or incubation with veratrine...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Anibal Eugenio Vercesi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T17:46:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Inada_NataliaMayumi_D.pdf: 2015643 bytes, checksum: 46616bc6e9a94ab575e17060c6ed0645 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A ação das meso-porfirinas catiônica Fe(III)TMPyP e aniônica Fe(III)TPPS4 sobre a função mitocondrial e viabilidade de células de tumor de próstata LNCaP foi investigada. O tratamento das suspensões mitocondriais com 1 µM de Fe(III)TMPyP por 2 minutos e 45 segundos no escuro diminuiu o controle respiratório mitocondrial (C.R.) em 3%. A irradiação potencializou este efeito, induzindo uma queda no C.R. em 28%. A porfirina aniônica Fe(III)TPPS4, nas mesmas condições experimentais, não provocou efeito significativo algum. Ambas porfirinas aumentaram a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) na presença de Ca2+; o efeito de Fe(III)TMPyP foi significativamente maior. Esta porfirina catiônica, porém não a aniônica, promoveu o fenômeno de transição de permeabilidade mitocondrial (TPM), sensível à ciclosporina A (CsA). Além disso, Fe(III)TMPyP apresentou uma constante de associação (Kb) com mitocôndrias 11 vezes maior que Fe(III)TPPS4, provavelmente devido às interações eletroestáticas entre a porfirina catiônica e a membrana mitocondrial interna, carregada negativamente. Observou-se também que ambas porfirinas diminuíram a viabilidade de células tumorais de maneira dose-dependente, apresentando um IC50 de aproximadamente 15 µM, após 48 h de incubação no escuro. Tratando as células com a dose de 10 µM para cada porfirina e um tempo menor de exposição no escuro (1 h), observou-se efeito significativo após a irradiação das amostras. Nas condições experimentais testadas, a morte celular predominante foi a necrose (26% das células tratadas com a porfirina aniônica e 29%, com a catiônica). A apoptose ocorreu após irradiação, sendo o efeito da Fe(III)TMPyP duas vezes maior (14%) que o efeito da Fe(III)TPPS4 (7%). Ambas porfirinas aumentaram de maneira significativa a concentração intracelular do íon Ca2+ ([Ca2+]cit) após a irradiação. Tanto a necrose, como a apoptose foram mediadas pelo aumento da [Ca2+]cit, uma vez que ambas foram inibidas pelo quelante de Ca2+ citosólico BAPTA/AM. A CsA preveniu as mortes necrótica e apoptótica das células LNCaP tratadas e irradiadas na presença de ambos compostos / Abstract: The action of irradiated cationic Fe(III)TMPyP and anionic Fe(III)TPPS4 forms of mesoporphyrins on mitochondrial functions was investigated using experimental conditions that caused minimal effects on mitochondria in the dark. Treatment of mitochondria with 1 µM Fe(III)TMPyP for 2 min decreased the respiratory control by 3% in the dark and 28% after irradiation. Fe(III)TPPS4 (1 µM) had no significant effect on respiratory control under any of the above conditions. Both porphyrins increased mitochondrial production of reactive oxygen species in the presence of Ca2+; however, the effect of Fe(III)TMPyP was significantly stronger. Fe(III)TMPyP but not Fe(III)TPPS4 promoted cyclosporin A-sensitive mitochondrial permeability transition. It was also observed that the association constant of Fe(III)TMPyP with mitochondria was 11 times higher than Fe(III)TPPS4. In conclusion, the damage to isolated mitochondria induced by Fe(III)TMPyP under illumination was larger than by Fe(III)TPPS4, probably because its cationic charge favors association with the mitochondrial membrane. The citotoxic effect of both porphyrins, prior the irradiation and upon the cell viability were dose-dependent and the IC50 were approximatly 15 µM, after 48 hours of incubation. No significantly cytotoxic effect was observed when the tumor cells were treated with 10 µM for each porphyrin, in a time of incubation in the dark of one hour. This was significant only after the photoactivation of the samples. In these conditions, the irradiation of the tumor cells induced cell death both via necrose and apoptose. Cell death via necrose was higher for both porphyrins. Irradiation of both porphyrins significantly increased the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]cit) of the LNCaP cells, which mediated cell death, once BAPTA/AM (an intracellular Ca2+ chelator) protected against cell death. Mitochondrial permeability transition (MPT) was probably participating in these mechanisms since cyclosporin A prevented cell death / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientador: Jose Camillo Novello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T20:39:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caetano_HugoTakeda_M.pdf: 2768082 bytes, checksum: 642bc9cfafd5a35858bee1896b5da5df (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A proteômica tem-se tomado ao longo dos últimos anos uma área de estudo cada vez mais essencial para o melhor entendimento dos mecanismos efetores e regulatórios das células e suas interações em sistemas biológicos. Patologias de origem genética como a hipertrigliceridemia, que geralmente modificam o perfil lipídico com o aumento dos níveis de triglicérides e colesterol, estão fortemente relacionadas com diversas doenças cardiovasculares. Estudos com animais e humanos têm sido realizados em busca do entendimento dos mecanismos celulares e moleculares implicados nestas patologias para potenciais intervenções terapêuticas e preventivas. Estudos em camundongos geneticamente hipertrigliceridêmicos para super expressarem a apolipoproteína C-III humana demonstraram que elevadas concentrações plasmáticas de triglicérides e ácidos graxas livres constituem uma condição metabólica que altera a funcionalidade mitocondrial. Essas mudanças no controle respiratório das mitocôndrias transgênicas representam uma adaptação atribuída a diferenças estruturais ou funcionais das membranas internas da mitocôndria transgênica. Assim, foi feito o estudo comparativo do proteoma de mitocôndria obtido destes animais transgênicos hipertrigliceridêmicos com o proteoma de camundongos controles não transgênicos. Para tanto, após o isolamento das mitocôndrias normais e transgênicas, foram utilizadas técnicas de eletroforese bidimensional (2DE) e espectrometria de massas do tipo MALDI-ToF e Q-ToF para a identificação das proteínas diferencialmente expressas. Dentre elas foram identificadas as proteínas Hidroximetilglutaril-CoA sintase, Carbamoil-fosfato sintetase e Flavoproteína transferidora de elétrons. Estas e outras proteínas podem representar interessantes alvos moleculares para o estudo da funcionalidade mitocondrial, visando futuras aplicações clínicas para o tratamento de determinadas condições patológicas como a hipertrigliceridemia. / Abstract: Along the last years, Proteomics has become an area of study each more essential to the better understanding of the effective and regulatory mechanisms of the cells and their interactions inside biological systems. Pathologies of genetic origin like the hypertriglyceridemia, that usually modify the lipid profile with the increase in the triglycerides and cholesterol levels, are strongly related to various cardiovascular diseases. Studies with animals and humans have been made in search of the understanding of 0011 and molecular mechanisms implied in these pathologies for potential therapeutic and preventive interventions. Studies in genetically hypertriglyceridemic mice to over expressing the human apolipoprotein C-III showed that high plasmatic concentrations of triglycerides and free fatty acids constitute a metabolic condition that changes the mitochondrial functionality. These changes in the breathing control of the transgenic mitochondria represent an adaptation attributed to structural or functional differences on the inner membrane of transgenic mitochondria. This way, we made the comparative study of the mitochondrial proteome obtained from these hypertriglyceridemic transgenic animals with the proteome from non transgenic control mice. For such, after the isolation of the normal and transgenic mitochondria, we used two-dimensional gel electrophoresis (2DE) and MALDI-ToF and Q-ToF mass spectrometry techniques to identify the differentially expressed proteins. Among them we identified the proteins Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, Carbamoyl-phosphate synthase and Electron transfer flavoprotein. These and other proteins can represent interesting molecular targets for the study of the mitochondrial functionality, aiming future clinical applications for the treatment of certain pathological conditions like hypertriglyceridemia. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Anibal Eugenio Vercesi, Helena Coutinho Franco Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-08T02:32:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alberici_LucianeCarla_D.pdf: 5846392 bytes, checksum: a41c4e31bbe1d1fa3a670c7a9956806e (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Alterações no metabolismo energético mitocondrial promovidas por proteínas desacopladoras (UCPs) são frequentemente encontradas em desordens metabólicas. Recentemente demonstramos que camundongos hipertrigliceridêmicos (HTG) apresentam uma respiração mitocondrial de repouso elevada, não relacionada a UCPs. Neste trabalho, nós elucidamos o mecanismo responsável por esta elevação da respiração de repouso e demonstramos algumas conseqüências dessa resposta mitocondrial à hiperlipidemia no fígado e no metabolismo corporal total. Resultados: Mitocôndrias isoladas de fígados e de células mononucleares de baço de camundongos HTG apresentaram velocidades respiratórias elevadas comparadas aos camundongos controles. Mudanças no consumo de oxigênio em mitocôndrias de fígados de camundongos HTG foram sensíveis a ATP, diazóxido e ácido 5-hidroxidecanóico (5-HD) indicando que o consumo pode ser atribuído à atividade dos canais de K+ sensíveis a ATP (mitoKATP). Do mesmo modo, as mitocôndrias HTG apresentaram um maior inchamento na presença de íons K+, sensível aos agonistas e antagonistas do mitoKATP. Além disso, a ligação de glibenclamida marcada às mitocôndrias indica que os camundongos HTG expressaram maiores quantidades de receptores de sulfoniluréias, um componente os mitoKATP. Aumento da velocidade de metabolismo foi evidenciado por um aumento no consumo de oxigênio no fígado (sensível ao tratamento agudo in vivo pela administração de 5-HD), elevada temperatura retal e maior produção corporal de CO2 nesses camundongos. De acordo com a velocidade metabólica elevada, a ingestão alimentar foi significantemente maior em camundongos HTG, sem concomitante aumento de peso. Assim como verificado em camundongos HTG, mitocôndrias de fígados de animais submetidos à dietas ricas em substratos energéticos apresentaram também elevação da respiração mitocondrial de repouso. Conclusões: Esses resultados demonstram que a hiperlipidemia primária leva ao aumento da atividade dos mitoKATP em fígados, o que pode representar uma adaptação regulada para oxidar o excesso de ácidos graxos em camundongos HTG. Além disso, nossos resultados indicam que os mitoKATP, além das UCPs, podem estar envolvidos no controle do metabolismo energético e do peso corporal / Abstract: Changes in mitochondrial energy metabolism promoted by uncoupling proteins (UCPs) are often found in metabolic disorders. We have recently shown that hypertriglyceridemic (HTG) mice present higher mitochondrial resting respiration unrelated to UCPs. Here, we disclose the underlying mechanism and consequences, in tissue and whole body metabolism, of this mitochondrial response to hyperlipidemia. Results: As observed in HTG mice, liver mitochondria from animals submitted to the rich energy diets presented high resting respiration. Mitochondria isolated from the livers and spleen mononuclear cells of HTG mice presented enhanced respiratory rates compared to those from wild-type mice. Changes in oxygen consumption of liver mitochondria from HTG mice were sensitive to ATP, diazoxide and 5-hydroxydecanoate (5-HD), indicating they can be attributable to mitochondrial ATP-sensitive K+ channel (mitoKATP) activity. Indeed, mitochondria from HTG mice presented enhanced swelling in the presence of K+ ions, sensitive to mitoKATP agonists and antagonists. Furthermore, mitochondrial binding to fluorescent glibenclamide indicates that HTG mice expressed higher quantities of sulfonylurea receptors, a component of mitoKATP. An overall faster metabolic state was evidenced by increased liver oxygen consumption (sensitive to acute in vivo 5-HD administration), higher body CO2 release and temperature in these mice. In agreement with higher metabolic rates, food ingestion was significantly larger in HTG mice, without enhanced weight gain. Liver mitochondria isolated from rats fed glucose rich diet or from mice fed fat rich diet also presented higher resting respiration rates. Conclusions: These results demonstrate that primary hyperlipidemia leads to an elevation in liver mitoKATP activity, which may represent a regulated adaptation to oxidize excess fatty acids in HTG mice. Furthermore, our data indicate that mitoKATP, in addition to UCPs, may be involved in the control of energy metabolism and body weight / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientadores: Anibal Eugenio Vercesi, Mariana Pinheiro Fernandes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T13:38:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_RuteAlvesPereirae_M.pdf: 1931770 bytes, checksum: c11c3126a7042737485a72a01e8020a7 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Estatinas são fármacos amplamente utilizadas no tratamento das hipercolesterolemias. Elas são inibidores competitivos da 3-hidroxi 3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) redutase impedindo, dessa forma, a síntese do colesterol. L-carnitina é sintetizada a partir dos aminoácidos essenciais lisina e metionina no fígado e no rim. Desempenha função importante na célula onde está envolvida na oxidação dos ácidos graxos agindo como um cofator no transporte de grupos acil através da membrana mitocondrial interna. Piracetam é uma droga nootropica cuja função é melhorar o desempenho cognitivo, e as funções envolvidas nos processos de aprendizagem, memória, atenção e consciência. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a ação protetora da Lcarnitina ou piracetam contra a morte por necrose de células PC-3 induzida por sinvastatina 60 µM ou tert-butyl-hidroperóxido (t-BOOH) 500 µM. Tanto a sinvastatina quanto o t-BOOH causam transição de permeabilidade mitocondrial (TPM), seguida de morte celular por necrose. L-carnitina e piracetam protegeram contra a morte celular induzida por sinvastatina ou t-BOOH por meio de um mecanismo dose-dependente (1- 12 µM). Na avaliação da disfunção mitocondrial causada por sinvastatina ou t-BOOH, tanto a L-carnitina quanto o piracetam protegeram contra a perda de potencial de membrana mitocondrial de forma semelhante à ciclosporina A. As quedas nas velocidades de respiração de estado III e estado IV, (fosforilação e repouso), também foram prevenidas por L-carnitina, piracetam e ciclosporina A. Quando linhagens de células não tumorais (GN16-P6 e HaCaT) foram analisadas, observou-se que tanto Lcarnitina quanto o piracetam também protegeram contra a morte celular induzida por sinvastatina. Podemos concluir que nas células PC-3, estes compostos protegem contra necrose celular através da inibição da TPM e que em linhagens não tumorais estes compostos apresentam efeitos semelhantes. / Abstract: Statins are drugs widely used in the treatment of hypercholesterolemia. They are competitive inhibitors of 3-hydroxy 3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase preventing in this way, the synthesis of cholesterol. L-carnitine is synthesized from the essential aminoacids lysine and methionine in liver and kidney and plays na important role in the cell, where it is involved in fatty acid oxidation by acting as a cofactor in the transport of acyl groups across the inner mitochondrial membrane. Piracetam is a nootropic drug which function is to improve cognitive performance, and the functions involved in the processes of learning, memory, attention and consciousness. This study aimed to evaluate the protective action of L-carnitine or piracetam against necrosis in PC-3 cells induced by 60 µM simvastatin or 500 µM tertbutyl- hydroperoxide (t-BOOH). Both simvastatin and t-BOOH causes mitochondrial permeability transition (MPT) followed by necrosis. L-carnitine and piracetam protected against cell death induced by simvastatin or t-BOOH by a dose-dependent mechanism (1-12 µM). In the assessment of mitochondrial dysfunction caused by simvastatin or t- BOOH, L-carnitine or piracetam similarly to cyclosporin A protected against the loss of mitochondrial membrane potential. The decrease in state III or state IV respiration rates, were also prevented. When non-tumor cell lines (GN16-P6 and HaCaT) were analyzed, it was observed that both L-carnitine and piracetam also protected against cell death induced by simvastatin. We can conclude that these compounds protected against cell necrosis by inhibiting MPT in both tumor or non tumor cell lines. / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica