Introdução e objetivos: Tem sido demonstrado que um moderado desacoplamento mitocondrial em células hepáticas pode reverter a hipertrigliceridemia, a doença de fígado gorduroso e a resistência à insulina. A dissipação da energia conservada no espaço intermembranas mitocontrial, como ocorre no desacoplamento, aumenta o uso de substratos energéticos e também podem reduzir a geração mitocondrial de espécies reativas de O2 (EROs). Duas estratégias de desacoplamento mitocondrial foram estudadas neste trabalho: a primeira consistiu em reduzir a velocidade da via de síntese de triacilgliceróis por meio da triacsin C (inibidor da Acil CoA Sintetase - ACS), e dessa forma aumentar os ácidos graxos livres (AGL) como substratos das proteínas desacopladoras; a segunda foi verificar se clusianona (composto natural das raízes de Clusia congestiflora), análogo estrutural do desacoplador químico nemorosoma, é capaz de promover o desacoplamento químico. Resutados e discussão: A triacsin C, em concentrações até 1 ?M, não apresentou efeito tóxico em mitocôndrias isoladas de fígado e nem em hepatócitos primários. Nesses últimos, aumentou o consumo de oxigênio nos estados de respiração basal e de máxima velocidade respiratória. Além disso, foi verificado um aumento da expressão do fator de transcrição PGC1- alfa e de ?-hidroxiacil CoA desidrogenase (HAD), uma enzima da beta-oxidação de ácidos graxos. A clusianona aumentou o consumo de O2 no estado de repouso, diminuiu o potencial de membrana, reduziu a produção de EROs e preveniu o inchamento mitocondrial induzido por Ca2+ de forma dose dependente, porém menos potente que a nemorosona. Conclusões: Nossos resultados indicam que a triacsin C acelerou o metabolismo mitocondrial, a oxidação de ácidos graxos e a biogênese mitocondrial; a clusianona foi caracterizada como um desacoplador eficaz da fosforilação oxidativa mitocondrial, provavelmente envolvendo um mecanismo protonofórico devido as suas propriedades químicas. Dessa forma, ambas as estratégias estudadas se mostram com potencial terapêutico no tratamento de doenças como esteatose hepática, hipertrigliceridemia e obesidade. / Introduction and Objectives: It has been shown that a mild mitochondrial uncoupling in livers can reverse hypertriglyceridemia, fatty liver disease and insulin resistance. The dissipation of energy stored in mitochondrial intermembrane space as heat, as in uncoupling, increases the use of energy substrates and may also reduce the mitochondrial generation of reactive O2 species (ROS). Two strategies to induce mitochondrial uncoupling were studied in this work: the first consisted of slowing down the route of triacylglycerols synthesis by triacsin C (acyl CoA synthetase inhibitor), and thus increasing the free fatty acids (FFA) as substrates for uncoupling proteins; the second was to determine whether clusianone (natural compound from the roots of Clusia congestiflora), a structural analogue of chemical uncoupler nemorosoma, is capable of promoting the chemical uncoupling. Results and discussion: The triacsin C, in concentrations up to 1 ?M, showed no toxic effect on liver mitochondria and primary hepatocytes. In hepatocytes triacsin C increased oxygen consumption in the states of basal respiration and maximum respiratory rate. In addition, there was an increase in the expression of the transcription factor PGC1 - ? and ? - hydroxyacyl CoA dehydrogenase (ADH), an enzyme of ?- oxidation of fatty acids. The clusianone increased O2 consumption in resting state, decreased membrane potential, reduced the production of ROS and prevented the mitochondrial swelling induced by Ca2+ in a dose dependent manner, but less potent than nemorosone. Conclusions: Our results indicate that triacsin C accelerated mitochondrial metabolism, fatty acid oxidation and mitochondrial biogenesis; the clusianone was characterized as an effective uncoupler of mitochondrial oxidative phosphorylation, probably involving a protonoforic mechanism due to its chemical properties. Therefore, both strategies have therapeutic potential in the treatment of diseases such as liver steatosis, hypertriglyceridemia and obesity.

As mitocôndrias são os principais locais de geração de espécies reativas de oxigênio (ERO), que são produzidos como subprodutos da cadeia de transporte de elétrons. O ferro livre e as ERO podem se envolver em processos potencialmente nocivos, sendo que a desregulação do metabolismo do ferro nessa organela tem sido associada a várias doenças, como a Ataxia de Friedreich (FA). O transporte seletivo de quelantes de ferro a esta organela é proposto como um meio de melhorar sintomas de FA. A desferrioxamina (DFO) é um sideróforo bacteriano com grande afinidade ao ferro, mas baixa penetração celular. Já os peptídeos altamente catiônicos TAT49-57 (Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg), 1A (Fx-Arg-Fx-Lys-Fx-Arg-Fx -Lys), SS02 (Dmt-(D)-Arg-Phe-Lys) e SS20 (Phe-(D)-Arg-Phe-Lys) são conhecidos por permear as membranas citossólicas e mitocondriais. Nós preparamos conjugados de DFO com peptídeos que penetram as mitocôndrias e estudamos suas características de ligação ao ferro in vitro. Eles foram preparados e conjugados em fase sólida com DFO (produzindo quatro mtDFO), que em seguida foram purificados e caracterizados por meio de LC/MS e análise de aminoácidos. Os mtDFO de alta pureza exibiram capacidade de ligação de ferro idêntica à do quelante livre DFO. Os mtDFO também foram capazes de suprimir a oxidação catalisada pelo sistema ferro-ascorbato. A fim de avaliar a localização intracelular dos mtDFO, estes foram marcados com TAMRA (mtDFO-TAMRA). Frente a uma linhagem de carcinoma de ovario, os mtDFO foram em geral pouco tóxicos e altamente localizados nas mitocôndrias. Não foram observados níveis expressivos de danos a DNA, indução de apoptose, geração de ERO na mitocôndria, arraste de ciclo celular ou de apoptose. Resultados preliminares da aplicação dos mtDFO a cardiomiócitos murínicos com baixo nível de frataxina (modelo de FA) indicam um restabelecimento de aproximadamente 60% na morfologia mitocondrial, o que pode ser interpretado como uma melhora nas funções dessa organela. Estes resultados indicam que os mtDFO produzidos podem ser uma parte importante no arsenal terapêutico para FA. / Mitochondria are the main site for the generation of reactive oxygen species (ROS) as sub products of electron transport chain. Free iron and ROS may interact to generate potentially harmful species, and iron homeostasis in this organelle has been linked to several diseases, such as Friedreich Ataxia (FA). Selective targeting of iron chelators to mitochondria has been proposed as a means of alleviating FA symptoms. Desferrioxamine (DFO) is a bacterial siderophore with high affinity for iron, however low cell penetration. Highly charged peptides TAT49-57 Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg), 1A (Fx-Arg-Fx-Lys-Fx-Arg-Fx -Lys), SS02 (Dmt-(D)-Arg-Phe-Lys) and SS20 (Phe-(D)-Arg-Phe-Lys) are known as both cell- and mitochondria-permeant. We prepared conjugates of DFO with mitochondria-penetrating peptides and studied their iron binding characteristics in vitro. They were prepared in solid phase and conjugated to DFO (generating four mtDFO), which were then purified and characterized by LC/MS and Amino acid analysis. MtDFO exhibited iron binding ability identical to free DFO. The mtDFO of high purity were also able to quench the oxidation catalyzed by the iron-ascorbate system. Cell localization studies were performed by tagging mtDFO with TAMRA. In A2780 cells, mtDFO displayed in general low toxicity and high levels of mitochondrial location. No expressive levels of DNA damage, apoptosis, mitochondrial ERO generation or cell cycle arresting were observed. Preliminary results of the application of mtDFO on mouse cardiomiocytes with low levels of frataxin (animal model of FA) indicate a recovery of ca. 60% of mitochondrial morphology. This is interpreted as an improvement of the functions of the organelle. These results indicate that mtDFO may be important allies in the therapy of FA.

As mitocôndrias são organelas semiautonômicas, portadoras do próprio DNA, o mtDNA e responsáveis pela produção de energia celular na forma de ATP, através do processo de fosforilação oxidativa. Atualmente, diferentes tipos de doenças, como distrofias musculares e diversos tipos de câncer, estão associadas à alteração nas moléculas de mtDNA. Na década de 70 um modelo a partir do cultivo celular com brometo de etídio (EtBr) foi desenvolvido com o objetivo de se criar uma linhagem celular depletada de cópias de mtDNA. Desde então os mais variados estudos foram realizados e diversos tipos celulares foram submetidos à depleção do mtDNA. Este projeto teve como objetivos criar um modelo de cultivo celular somático na espécie bovina com depleção de cópias de mtDNA para investigar a resposta da célula a esta condição; avaliar como as células depletadas se comportam na ausência de EtBr, além da utilização destas células no processo de reprogramação celular por indução gênica na tentativa de avaliar o efeito do numero de cópias de mtDNA na indução na espécie bovina. Para tanto foram desenvolvidos três experimentos; Experimento 1- Depleção de mtDNA a partir da utilização do brometo de etídeo; Experimento 2 Repleção do mtDNA; e Experimento 3 Utilização de células bovinas depletadas no sistema de reprogramação nuclear. Todos os experimentos foram avaliados quanto a quantidade de cópias de mtDNA e expressão gênica para os genes Bax, Bcl2 e Tfam. Ademais, os experimentos 1 e 2 foram avaliados quanto a viabilidade celular e apenas o experimento 1 foi avaliado quanto ao crescimento e morfologia celular. O experimento 1 foi avaliado durante o cultivo celular nos períodos D0, D4, D7, D10 e D13, com os grupos experimentais controle (EtBr-C) e tratado com 100 ng/mL de brometo de etídio (EtBr-T), quanto a núero de cópias do mtDNA, o grupo EtBr-T diferiu do grupo EtBr-C (P=0,0459), apresentando menor número de cópias de mtDNA; menor taxa crescimento celular (P<0,05), porém sem alteração na morfologia celular, e na expressão dos genes descritos acima. No experimento da repleção, não houve diferença no número de cópias de mtDNA, entre os grupos EtBr-T e EtBr-R, indicativo de que as células atingiram o estado rho 0 ou que necessitam de mais tempo para ativar a replicação do mtDNA; quanto a viabilidade celular, houve diferença entres os grupos, quanto a expressão gênica, com aumento do Bax e do Bcl-2 para o grupo EtBr-T; O grupo EtBr-R apresentou queda do Bcl-2; para o Tfam houve aumento para o grupo EtBr-T e uma queda para o grupo EtBr-R. Quanto ao experimento 3, não foi possível observar sinais de pluripotência, porém foi detectada uma queda na quantidade de mtDNA dos dois grupos tratados por EtBr (EtBr com e sem Stemcca) e o grupo controle com Stemcca. Para analise de expressão gênica, não houve diferenças entre os grupos em relação ao Tfam. Quanto ao Bax, os grupos controle com Stemcca, controle sem Stemcca e EtBr sem Stemcca não diferiram, e o ultimo também não apresentou diferença quando comparado ao grupo EtBr com Stemcca. Para o Bcl-2, os grupos controle sem Stemcca e EtBr com Stemcca não apresentaram diferenças entre si; o grupo controle sem Stemcca não apresentou diferença quando comparado aos grupos controle com Stemcca e EtBr sem Stemcca. Concluindo, este trabalho no nosso conhecimento, descreve pela primeira vez a produção de células bovinas Rho 0 e discute sobre a relação da função mitocondrial e o processo de reprogramação celular. / Mitochondria are semi autonomic organelles which present their own DNA (mtDNA); are in charge of cell energy production as ATP through oxidative phosphorylation. Currently, different types of diseases like muscular distrofy; different types of cancer are associated to alterations of mtDNA molecules. In the 70\'s a model based on cell culture with ethidium bromide (EtBr) was developed in order to create a cell line depleted of mtDNA. Since then, a variety of studies were realized; diverse cell types were submited to mtDNA depletion. This project had as objective creating a model of somatic cell culture in bovine species with depletion of mtDNA copies, in order to investigate cell response to this condition; to analyze depleted cell behavior in the absence of EtBr, besides using this depleteded cell in a reprogramming cell process by genic induction in order evaluate the effect of the number of mtDNA copies during induction in bovine species. Therefore three experiments were developed: Experiment-1 Depletion of mtDNA using ethidium bromide. Experiment-2 repletion of mtDNA; Experiment-3 usage of depleted bovine cells in reprogramming nuclear system. Cell experiments were analyzed according to the quantity of mtDNA copies; genic expression for Bax, BCl2; Tfam genes. Also, experiments 1; 2 were analyzed on cell viability; only experiment 1 was analyzed regarding cell morphology; growth. Experiment-1 was analyzed during cell culture on periods D0, D4, D7, D10, D13, with control experimental groups (EtBr-C),; treated with 100 ng/mL ethidium bromide (EtBr-T); relating to mtDNA quantification the EtBr-T group differed from EtBr-C (P=0,0459) presenting a smaller number of mtDNA copies; smaller growth rate (P<0,05); although there was no differences on cell morphology as there was also no difference related to genic expression of the previous stated genes. Repletion experiment showed no differences about the number of mtDNA copies between EtBr-T; EtBr-R groups, indicating this cells reached Rho0 state or that they need more time to activate mtDNA replication; about cell viability, there were no differences among the groups; relating to genic expression there was an increase of Bax; BCl-2 for EtBt-T group; EtBr-R group showed decrease of BCl-2; for Tfam there was an increase for EtBr-T group; a decrease for EtBr-R. Relating to Experiment-3 it was impossible to notice signs of pluripotency, but we could see a decrease in the amount of mtDNA in both groups treated with EtBr (EtBr with; without STEMCCA) as in control group with STEMCCA. Genic expression analysis didn\'t show differences related to Tfam. Regarding to BAX, both control groups (with; without STEMCCA); EtBr without STEMCCA didn\'t differ from each other,; the last one also didn\'t show any difference when compared to EtBt with STEMCCA group. For BCl-2, control group without STEMCCA; EtBr with STEMCCA didn\'t show differences among each other; control group without SEMCCA didn\'t show differences when compared to control group with STEMCCA; EtBr without STEMCCA. Concluding, this work, regarding our knowledge, describes for the first time, production of bovine Rho0 cells; debates about the relationship among mitochondrial function; the process of cell reprogramation.

Introdução e objetivos: Tem sido demonstrado que um moderado desacoplamento mitocondrial em células hepáticas pode reverter a hipertrigliceridemia, a doença de fígado gorduroso e a resistência à insulina. A dissipação da energia conservada no espaço intermembranas mitocontrial, como ocorre no desacoplamento, aumenta o uso de substratos energéticos e também podem reduzir a geração mitocondrial de espécies reativas de O2 (EROs). Duas estratégias de desacoplamento mitocondrial foram estudadas neste trabalho: a primeira consistiu em reduzir a velocidade da via de síntese de triacilgliceróis por meio da triacsin C (inibidor da Acil CoA Sintetase - ACS), e dessa forma aumentar os ácidos graxos livres (AGL) como substratos das proteínas desacopladoras; a segunda foi verificar se clusianona (composto natural das raízes de Clusia congestiflora), análogo estrutural do desacoplador químico nemorosoma, é capaz de promover o desacoplamento químico. Resutados e discussão: A triacsin C, em concentrações até 1 ?M, não apresentou efeito tóxico em mitocôndrias isoladas de fígado e nem em hepatócitos primários. Nesses últimos, aumentou o consumo de oxigênio nos estados de respiração basal e de máxima velocidade respiratória. Além disso, foi verificado um aumento da expressão do fator de transcrição PGC1- alfa e de ?-hidroxiacil CoA desidrogenase (HAD), uma enzima da beta-oxidação de ácidos graxos. A clusianona aumentou o consumo de O2 no estado de repouso, diminuiu o potencial de membrana, reduziu a produção de EROs e preveniu o inchamento mitocondrial induzido por Ca2+ de forma dose dependente, porém menos potente que a nemorosona. Conclusões: Nossos resultados indicam que a triacsin C acelerou o metabolismo mitocondrial, a oxidação de ácidos graxos e a biogênese mitocondrial; a clusianona foi caracterizada como um desacoplador eficaz da fosforilação oxidativa mitocondrial, provavelmente envolvendo um mecanismo protonofórico devido as suas propriedades químicas. Dessa forma, ambas as estratégias estudadas se mostram com potencial terapêutico no tratamento de doenças como esteatose hepática, hipertrigliceridemia e obesidade. / Introduction and Objectives: It has been shown that a mild mitochondrial uncoupling in livers can reverse hypertriglyceridemia, fatty liver disease and insulin resistance. The dissipation of energy stored in mitochondrial intermembrane space as heat, as in uncoupling, increases the use of energy substrates and may also reduce the mitochondrial generation of reactive O2 species (ROS). Two strategies to induce mitochondrial uncoupling were studied in this work: the first consisted of slowing down the route of triacylglycerols synthesis by triacsin C (acyl CoA synthetase inhibitor), and thus increasing the free fatty acids (FFA) as substrates for uncoupling proteins; the second was to determine whether clusianone (natural compound from the roots of Clusia congestiflora), a structural analogue of chemical uncoupler nemorosoma, is capable of promoting the chemical uncoupling. Results and discussion: The triacsin C, in concentrations up to 1 ?M, showed no toxic effect on liver mitochondria and primary hepatocytes. In hepatocytes triacsin C increased oxygen consumption in the states of basal respiration and maximum respiratory rate. In addition, there was an increase in the expression of the transcription factor PGC1 - ? and ? - hydroxyacyl CoA dehydrogenase (ADH), an enzyme of ?- oxidation of fatty acids. The clusianone increased O2 consumption in resting state, decreased membrane potential, reduced the production of ROS and prevented the mitochondrial swelling induced by Ca2+ in a dose dependent manner, but less potent than nemorosone. Conclusions: Our results indicate that triacsin C accelerated mitochondrial metabolism, fatty acid oxidation and mitochondrial biogenesis; the clusianone was characterized as an effective uncoupler of mitochondrial oxidative phosphorylation, probably involving a protonoforic mechanism due to its chemical properties. Therefore, both strategies have therapeutic potential in the treatment of diseases such as liver steatosis, hypertriglyceridemia and obesity.

SARAIVA, Luis Flávio Mendes. Avaliação molecular da biossíntese de ácido ascórbico e possível participação da Oxidase alternativa em dois clones de aceroleira (Malpighia emarginata DC). 2011. 128 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-20T17:07:55Z No. of bitstreams: 1 2011_tese_lfmsaraiva.pdf: 11676061 bytes, checksum: a4b2ae06988f2e8feb11ebae7bf0d662 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T17:55:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tese_lfmsaraiva.pdf: 11676061 bytes, checksum: a4b2ae06988f2e8feb11ebae7bf0d662 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T17:55:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tese_lfmsaraiva.pdf: 11676061 bytes, checksum: a4b2ae06988f2e8feb11ebae7bf0d662 (MD5) Previous issue date: 2011 / The acerola, Malpiguia emarginata DC is a fruit small endowed with enviable nutritional qualities, being consumed both fresh and processed. The mail feature that stands out from other species is its enormous capacity to synthesize ascorbic acid. In this sense, Embrapa has developed four commercial clones with phenotypic and genetic characteristics well defined. The clones BRS 235 (Apodi), BRS 236 (Cereja), BRS 237 (Roxinha) e BRS 238 (Frutacor) have characteristics fully standardized. This study aimed to evaluate the clones BRS 236 (Cereja) and BRS 237 (Roxinha) were selected because of huge amount of ascorbic acid synthesized between then, approximately 50% in Cereja clone. For this study we analyzed the gene expression of enzymes of the way Wheeler /Smirnoff as well as the Alternative Oxidase (AOX). The last step this of this pathway ends in the inner mitochondrial membrane, due to the presence of transmembrane enzyme L-Galactono-1,4- Lactone dehydrogenase (L-GalLdh), located between the complex III and IV. Since the alternative oxidase is an enzyme uncoupling, no phosphorylating and insensitive to cyanide, among the complexes II and III of the inner mitochondrial membrane, responsible for alternative pathway of electrons. This study aimed to identify the enzymes that are crucial in this process and generate the difference between the clones, as well as the probable relationship between the biosynthesis of ascorbic acid and the role that the AOX could play. Acerola five years of age were harvested four tissues (flowers, unripe, semi mature and mature fruits). The first step of this work was the determination of ascorbic acid in unripe, semi mature and mature fruits of the two clones by titration of Tillman. Then, we performed the characterization of the AOX gene to define its isoforms. After isolation of DNA and carried out the reactions of PCR with degenerate primers the amplicons were purified and subjected to cloning, transformation and sequencing. The results revealed sequences that correspond to one AOX1 and one AOX2. The next step of work was the study of gene expression of enzymes to the Wheeler/Smirnoff path, AOX1 and AOX2 newly characterized. After the design of pairs of degenerate and specific primers for all the enzymes of the route beyond the AOX1 and AOX2 they were used in semiquantitative PCR reactions, using the elongation factor alpha as a constitutive elemento of reference. The results showed that both clones decrease their levels of ascorbic acid as the fruits develop, revealing that in all three stages of development, the Cereja clone has higher amounts of ascorbic acid that Roxinha clone. However, when comparing the levels of ascorbic acid between green and ripe fruits of both clones is evident that the Roxinha clone has a lower difference between these two stages. The gene expression of three enzymes stood out from others, these showed a synergism with the expression levels of vitamin C contained in each tissue. In addition, gene expression in two clones showed differences in tissues that favor of Cereja clone. They are: Mannose pyrophsphorylase, GDP-Mannose 3’5’ epimerase and GDP-Galactose phosphorylase. With greater emphasis on GDP-Mannose 3’5’ epimerase and GDP-Galactose phosphorylase. The enzymes that stood out showed a higher gene expression in tissues where exactly had more ascorbic acid accumulated, gradually reducing the expression with the degree of fruit development, revealing that the difference occurs not only between clones, but also in tissues clones. There were no differences in gene expression of other enzymes of the route Wheeler/Smirnoff to justfy the levels of ascorbic acid present in the tissues and also between clones. The analysis of gene expression of isoforms of AOX revealed that in both clones the AOX1 gene expression increases as the fruit ripens. However, the clone Roxinha has a higher gene expression than the clone Cereja, in all three stages of development. The analysis of transcripts of AOX2 revealed that in Cereja clone the gene expression decreased with fruit ripening, since in Roxinha clone the expression xx elevated in three developmental stages. The results cearly showed that three enzymes are essential for biosyntesis of ascorbic acid highlighting the GDP-Mannose 3’5’epimerase and GDP-Galactose phosphrylase. Another important conclusion was that the AOX may be owner a function not previously reported in the literature, that of assisting in the biosyntesis of vitamin C. This may be due uncoupling promoted by the activity of AOX causing a gradual rise of the relationship oxidized cytochrome C/rediced cytochrome C, where the cytochrome C oxidized acts of a GalLdh substrates in the syntesis of ascorbic acid. This fact may be explained by not only the highest levels of AOX1 transcripts present in Roxinha clone, but the increasing pattern of gene expression in AOX2 exatly in clone that produces less ascorbic acid and which has the smallest difference between the stages of fruit Green and ripe fruit. In the clone Cereja, one that synthesizes more ascorbic acid and has a huge difference in the levels between the stages of green fruit and ripe fruit of gene expression of AOX2 shown decresing during ripening. Thus, the concentration of products the Wheeler / Smirnoff path is still determining the amount of ascorbic acid produced, and in parallel, the increase in the AOX gene expression appears to contribute at some point to establish the total levels of vitamin C synthesized. / A acerola Malpiguia emarginata DC é uma fruta dotada de qualidades nutricionais invejáveis, sendo consumida tanto in natura quanto processada. A principal característica que destaca a acerola é sua enorme capacidade em sintetizar o ácido ascórbico. A Embrapa desenvolveu quatro clones comerciais com características fenotípicas e genéticas bem definidas denominado BRS 235 (Apodi), BRS 236 (Cereja), BRS 237 (Roxinha) e BRS 238 (Frutacor). Os clones BRS 236 (Cereja) e BRS 237 (Roxinha) foram escolhidos devido a enorme diferença de ácido ascórbico sintetizada entre eles, aproximadamente 50% a mais no clone Cereja. Para esse estudo foi analisada a expressão gênica das enzimas pertencentes a via Wheeler/Smirnoff, reconhecida como a principal via biossintética do ácido ascórbico em plantas bem como a Oxidase alternativa (AOX) uma enzima desacopladora, não fosforilante e insensível ao cianeto, presente entre os complexos II e III da membrana mitocondrial interna, responsável pela via alternativa de elétrons. O objetivo desse trabalho foi identificar quais enzimas são determinantes na diferença do conteúdo de vitamina C entre os clones, bem como avaliar a expressão da AOX nos diferentes tecidos. De aceroleiras com cinco anos de idade foram colhidos quatro tecidos (Flores, Frutos verdes, Frutos semimaduros e Frutos maduros. Inicialmente os teores de ácido ascórbico foram dosados nos frutos verdes, semimaduros e maduros dos dois clones por titulometria de Tillman. Em seguida foi realizada a caracterização gênica da AOX para definição de suas isoformas. Após o isolamento do DNA e executadas as reações de PCR com um par de primers degenerados os amplicons foram purificados e submetidos a clonagem, transformação e seqüenciamento. As dosagens de ácido ascórbico mostraram que ambos os clones decrescem seus níveis de ácido ascórbico a medida que os frutos se desenvolvem, além do que em todos os três estádios de desenvolvimento o clone Cereja apresenta quantidades de ácido ascórbico superiores ao clone Roxinha. Os níveis de ácido ascórbico entre os frutos verdes e maduros de ambos os clones revelaram que o clone Roxinha possui uma menor diferença entre esses dois estádios de desenvolvimento. As análises de expressão gênica revelaram que três enzimas possuem sua expressão destacada das demais, sendo que essas mostraram um sinergismo de expressão com o padrão decrescente dos níveis de vitamina C contida no tecido, apresentando ainda diferenças de expressão favoráveis ao clone Cereja. São elas: Manose pirofosforilase, GDP-Manose 3’5’ epimerase e GDP Galactose fosforilase. Com maior destaque para a GDP-Manose 3’5’ epimerase e GDP Galactose fosforilase. Não existiam diferenças nas expressões gênicas das demais enzimas da via Wheeler/Smirnoff que justificassem as diferenças nos teores de ácido ascórbico presentes nos tecidos e também entre os clones. Quanto a AOX os resultados revelaram duas seqüências, uma relativa a uma AOX1 e outra a uma AOX2. A análise da expressão gênica das isoformas da AOX demonstrou que a AOX1 eleva sua expressão gênica em ambos os clones a medida que os frutos amadurecem entretanto, o clone Roxinha possui uma expressão gênica mais elevada que o clone Cereja, em todos os três estádios de desenvolvimento. A AOX2 possui diferenças de expressão gênica onde no clone Cereja ela se mostrou decrescente, já no clone Roxinha ocorreu a elevação da expressão nos três estádios de desenvolvimento. Três enzimas são essenciais a biossíntese do ácido ascórbico em Malpiguia emarginata DC, a Manose pirofosforilase, GDP-Manose 3’5’ epimerase e GDP Galactose fosforilase, sendo a via Wheeler/Smirnoff determinante na quantidade de ácido ascórbico produzido. As expressões gênicas da AOX1 e AOX2 favorecem o clone Roxinha, aparentemente como um mecanismo compensatório por esse clone sintetizar menos ácido ascórbico que o clone Cereja.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Paracoccidioides brasiliensis (Pb), é uma micose sistêmica grave com formas aguda e crônica. As proteases ou peptidases são enzimas proteolíticas que ocorrem em todos os organismos e correspondem a 1-5% de seus conteúdos genéticos. Estas enzimas estão envolvidas em processos biológicos essenciais, como a coagulação sanguínea, morte celular e diferenciação de tecidos. Várias etapas proteolíticas importantes ocorrem durante a invasão metastática de tumores, assim como no ciclo de infecção de um grande número de vírus e microrganismos patogênicos. Um número reduzido de proteases do Pb já foram isoladas e caracterizadas, tampouco sua atividade durante o desenvolvimento da doença foi determinado, e até o momento, nenhuma atividade oligopeptidásica foi descrita nesse fungo. No presente trabalho foi demonstrada a presença de uma atividade metalo-peptidásica thimet oligopeptidase (TOP)-like no extrato citosólico de leveduras de P. brasiliensis, isolado 18 (Pb18). Nossos resultados mostraram a hidrólise do peptídeo com supressão intramolecular de fluorescência Abz-GFSPFRQ-EDDnp pelo extrato citosólico de leveduras de P. brasiliensis. Esse substrato é clivado preferencialmente pela TOP de mamíferos, e corroborando esse resultado, observou-se a inibição da hidrólise desse peptídeo por ο-fenantrolina e JA-2, inibidores seletivos de metalo-proteases e TOP, respectivamente. Utilizando-se peptídeos e inibidores seletivos para diferentes proteases, não se detectou a presença de atividade neurolisina-like ou neprilisina-like, e também se descartou a presença de serino-peptidases, cisteíno-peptidases e enzima conversora da angiotensina I. A maior atividade enzimática do extrato citosólico sobre os outros preparados (membrana/parede celular ou lisado total das leveduras) pode indicar uma localização citosólica dessa enzima. Não foi observada a secreção da peptidase no sobrenadante de cultura in vitro, mesmo após adição de soro fetal bovino. Todavia, a peptidase com atividade TOP-like de Pb parece ser secretada in vivo, ou liberada após lise do fungo por componentes efetores da resposta imune, uma vez que anticorpos capazes de inibir a atividade peptidásica são encontrados em soros de pacientes com paracoccidioidomicose, e soros com maior título em imunodifusão contém maiores concentrações de anticorpos enzima-específicos. Várias enzimas da família M3 clivam bradicinina, importante mediador inflamatório in vivo. A hidrólise da bradicinina e do substrato Abz-GFSPFRQEDDnp pelo extrato citosólico de P. brasiliensis, gera os mesmos fragmentos observados após clivagem pela TOP de mamíferos, que são diferentes dos gerados pela clivagem com MIP de mamíferos e OpdA bacteriana, sendo mais um indicador da presença majoritária de uma peptidase com atividade TOP-like em P. brasiliensis. A clivagem da bradicinina pela metalooligopeptidase com atividade TOP-like de Pb, poderia ocorrer no sítio inflamatório e poderia estar envolvida na inibição da indução de uma resposta imune protetora contra o fungo, favorecendo a permanência do mesmo no hospedeiro. Observamos ainda que o gene homólogo de TOP em P. brasiliensis é quase duas vezes mais expresso no virulento em comparação ao não virulento. O aumento da hidrólise do substrato Abz-GFSPFRQ-EDDnp também foi observado no isolado de maior virulência quando comparado ao de menor virulência. A possível relação entre a expressão da metalooligopeptidase com a virulência do fungo sugere que essa peptidase possa ser classificada como um fator de virulência fúngica, no entanto experimentos complementares são necessários para sua confirmação. A expressão da gp43 também foi analisada no isolado virulento e não virulento e observou-se uma expressão aumentada em até treze vezes no primeiro. Para melhor caracterização dessas metalo-oligopeptidases é necessária a obtenção da proteína recombinante, ou da proteína purificada nativa, isolada do lisado fúngico. Não obtivemos sucesso na expressão das proteínas recombinantes, tampouco no isolamento da peptidase nativa por métodos cromatográficos. Nossos resultados sugerem a presença de uma atividade metalooligopeptidásica TOP-like na fração citosólica de leveduras de P. brasiliensis. Liberação in vivo dessa enzima após a lise de fungos ou secreção estimulada por fatores do hospedeiro, pode ter um papel na inflamação e desenvolvimento da micose. / Paracoccidioidomycosis (PCM), caused by the pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb) is a systemic mycosis with severe acute and chronic forms. Proteases or peptidases are proteolytic enzymes that occur in all organisms and constitute 1-5% of their genetic contents. These enzymes are involved in biological processes such as blood clotting, cell death and tissue differentiation. Several important proteolytic steps occur during the invasion of metastatic tumors, as well as in the infection of a large number of viruses and pathogens. To date, a small number of Pb proteases were isolated and characterized, also, their activities during the development of the disease was not determined, and an oligopeptidase activity was not detected in this fungus. In the present work, we demonstrated a metallopeptidase thimet oligopeptidase (TOP)-like activity in the cytosolic extract of Pb18 yeasts. Our results shown a major hydrolysis of the fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptide Abz-GFSPFRQ-EDDnp, preferentially cleaved by TOP from mammals, and the inhibition of the hydrolysis of this peptide by orthophenantrolin and JA-2, selective inhibitors of metalloproteases and TOP, respectively. The presence of neurolysin- like and neprilysin-like, serinepeptidases, cysteine-peptidases and angiotensin converting enzyme I was discarded by analyzing selective FRET peptides and inhibitors. The higher peptidase activity of cytosolic extracts over the membrane/cell wall and total yeast lysate preparations may indicate that this enzyme is localized in the yeast cytosol. The metallo-oligopeptidase activity was not detected on in vitro culture supernatants, even after addition of fetal calf serum. However, the peptidase with TOP-like activity of P. brasiliensis seems to be secreted in vivo, or released after fungal lysis by immune factors, since antibodies that can inhibit this enzymatic activity were found in sera from paracoccidioidomycosis patients, and serum with highest titer in immunodiffusion contains higher concentrations of enzymespecific antibodies. Bradykinin, an important inflammatory mediator in vivo, is cleaved by several enzymes from the M3 family. The same fragments observed after hydrolysis by TOP were observed after cytosolic extract hydrolysis of bradykinin and the substrate Abz-GFSPFRQ-EDDnp. MIP and bacterial OpdA hydrolysis of these peptides generate different fragments, and this is an additional indicator of a major TOP-like activity in P. brasiliensis yeast cells Bradykinin hydrolysis by the TOP-like metallopeptidase of P. brasiliensis may occur in inflammatory processes and this suggests that the enzyme may be involved in the inhibition of a protective anti-fungal response induction, limiting fungal elimination. We also observed that the expression of the TOP homologous gene in P. brasiliensis has almost a two-fold increased in the virulent isolate 18 compared to the non-virulent isolate. Increased hydrolysis of the substrate Abz-GFSPFRQ-EDDnp was also observed in the most virulent isolate compared to the non-virulent. The possible correlation between TOP-like peptidase expression and fungal virulence suggests that this peptidase could be classified as a fungal virulence factor, however, additional experiments are needed to confirm this hypothesis. Gp43 expression was also analyzed in both isolates, and it was observed a thirteen-fold increase in the expression on the virulent isolate. In order to better characterize the P. brasiliensis TOP-like activity, we attempted to obtain the purified recombinant or the native protein, isolated from fungal lysate. However, we were not successful in the expression of recombinant proteins and neither on the isolation of the native protein using chromatographic methods. Our results suggest the presence of a TOP-like activity in the cytosolic fraction of P. brasiliensis yeasts. In vivo release of this enzyme after fungal lysis, or host factors-stimulated secretion, may have a role in inflammation and development of the disease. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2016-08-09T18:51:15Z No. of bitstreams: 2 Dissertacao Gabriela Gambato.pdf: 173743 bytes, checksum: 3d03614fd3d84333f7eea1512c2d5ee5 (MD5) Dissertacao Gabriela Gambato.pdf: 2016668 bytes, checksum: 8c9651175f3e3ad77018d9086bb05784 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-09T18:51:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao Gabriela Gambato.pdf: 173743 bytes, checksum: 3d03614fd3d84333f7eea1512c2d5ee5 (MD5) Dissertacao Gabriela Gambato.pdf: 2016668 bytes, checksum: 8c9651175f3e3ad77018d9086bb05784 (MD5) Previous issue date: 2016-08-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES.

Lipofuscin is an autofluorescent pigment progressively accumulated during cellular aging, in several tissues, such as heart, muscle and retina, especially in the postmitotic period. That phenomenon may result from oxidative stress, when biomolecules and organelles (mainly mitochondria) are damaged, generating non-degradable products inside lysosomes. Lipofuscin can be photosensitized, promoting photoxidative processes in cellular components. Many studies on lipofuscin were made using the human retinal pigment epithelial cells, but very little is known about lipofuscin from human skin. In this work we investigated the photoinduced formation (UVA and visible light) of lipofuscin and the consequence of its photosensitization by visible light. We also established an efficient protocol for the induction of lipofuscinogenesis, through specific damage in mitochondria and lysosomes. Cells that accumulated lipofuscin, after exposure to UVA and blue light, became sensitive to visible light (400-750 nm). We characterized the absorption and fluorescence emission of lipofuscin, as well as its fluorescence lifetime through the time resolved fluorescence microscopy (FLIM). We observed that lipofuscin in keratinocytes has absorption maximum in the blue region of light spectrum (420-450 nm), and maximum emission in the red. When photosensitized at 466 nm, lipofuscinloaded HaCaT cells had reduced cell viability, which was related with singlet oxygen generation, accumulated 8-oxo-dG premutagenic lesions and breaks in the DNA strand. Besides, we investigated the efficiency of different wavelengthsin visible light spectrum (408, 466, 522 and 650 nm) to promote lipofuscin formation due to damages in both mitochondria and lysosomes. Blue (408 and 466 nm) and green light (522 nm), but not red light (650 nm), promoted damage in mitochondria (membrane and DNA integrity) and lysosomes (membrane integrity and autophagic activity), effectively inducing lipofuscinogenesis. Thus, in addition to UVA, visible spectrum itself increases the sensitivity of keratinocytes to the visible light, through the generation of lipofuscin. Finally, we tested the carcinogenic potential of high-energy blue light (408 nm), by chronically irradiating HaCaT cells. For the first time in the literature, the formation of pyrimidine cyclobutane (CPD) dimers in the nuclear DNA of HaCaT cells was observed immediately or after several cycles of irradiation at 408 nm. We identified four major changes involved with the process of malignant transformation: genomic instability, decrease in the expression of tumor suppressor protein p16INK4a, increase in the proliferation rate and resistance to UVA-induced apoptosis / A lipofuscina é um pigmento autofluorescente acumulado progressivamente durante o envelhecimento celular em diversos tecidos, como o músculo cardíaco e retina, principalmente no período pós-mitótico. Esse fenômeno pode ocorrer em decorrência do estresse oxidativo, quando biomoléculas e organelas (principalmente mitocôndrias) sofrem danos, gerando produtos não degradáveis no interior dos lisossomos. A lipofuscina pode ser fotossensibilizada promovendo processos fotoxidativos nos componentes celulares. Muitos estudos de lipofuscina foram feitos em células do epitélio pigmentar da retina de olho humano, mas conhece-se muito pouco sobre a lipofuscina de pele humana. Neste trabalho nós investigamos a formação fotoinduzida (UVA e luz visível) de lipofuscina e as consequências da sua fotossensibilização pela luz visível. Nós também estabelecemos protocolos eficazes na indução de lipofuscinogênese, por meio de dano específico em mitocôndrias e lisossomos. Células que acumularam lipofuscina, após exposição à UVA ou luz azul, tornaram-se sensíveis à luz visível (400-750 nm). Caracterizamos as propriedades de absorção e de emissão da lipofuscina e seu tempo de vida de fluorescência, utilizando a microscopia de fluorescência resolvida no tempo (FLIM). Observamos que lipofuscina em queratinócitos tem máximo de absorção na região do azul (420-450 nm), com emissão máxima de fluorescência no vermelho. As células HaCaT carregadas com lipofuscina efotossensibilizadas no visível, tiveram redução da viabilidade celular, que foi relacionada com a geração de oxigênio singlete, bem como acumularam lesões pré-mutagênicas 8-oxo-dG e quebras na fita de DNA. Também, investigamos a eficiência de diferentes comprimentos de onda da luz visível (408, 466, 522 e 650 nm) em promover a formação de lipofuscina em consequência de lesões em mitocôndrias e lisossomos. Tanto a luz azul (408 e 466 nm) quanto a luz verde (522 nm), mas não vermelha (650 nm) promoveram dano em mitocôndrias (integridade de membrana e DNA) e lisossomos (integridade de membrana e atividade autofágica), induzindo eficientemente lipofuscinogênese. Logo, além de UVA, o próprio espectro do visível aumenta a sensibilidade de queratinócitos à luz visível, através da geração de lipofuscina. Por fim, testamos o potencial carcinogênico da luz azul de alta energia (408 nm), irradiando células HaCaT cronicamente. Identificamos quatro mudanças principais envolvidas com o processo de transformação maligna: instabilidade genômica, redução da expressão de proteína supressora de tumor p16INK4a, aumento da taxa de proliferação, e resistência à apoptose. Além disso, a formação de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPD) no DNA nuclear de células HaCaT logo após ou depois de vários ciclos de irradiação com 408 nm foi observada pela primeira vez na literatura.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES.

Orientadores: Aníbal Eugênio Vercesi, Róger Frigerio Castilho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T07:09:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ronchi_JulianaAparecida_M.pdf: 2592293 bytes, checksum: f14b83c15cfc0b7b79f5b89218adf498 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A transição de permeabilidade mitocondrial (TPM) é caracterizada pela abertura de um poro protéico não seletivo na membrana mitocondrial interna, o qual é induzido por Ca2+ e sensível à ciclosporina A. Trabalhos anteriores do nosso laboratório demonstram que o poro de transição de permeabilidade ocorre devido a ligações entre tióis (S-S) de proteínas, ocasionando a agregação de proteínas de membrana interna. Contrariamente, dados da literatura propõem a participação de proteínas da membrana mitocondrial externa na composição do poro, como o canal aniônico voltagem dependente (VDAC), hexoquinase e receptor benzodiazepínico. Para verificar a participação de proteínas da membrana externa no poro TPM, realizamos experimentos utilizando mitocôndrias desprovidas de membrana externa (mitoplastos). Mitoplastos de fígado e rim de rato foram obtidos através do tratamento de mitocôndrias com o detergente digitonina (seletivo para colesterol) para eliminar a membrana externa. Esses mitoplastos de fígado apresentaram menos que 5% e 10% dos marcadores de membrana externa monoamino oxidase e VDAC, respectivamente. Os mitoplastos de rim apresentaram depleção parcial de hexoquinase (73%). Os mitoplastos tiveram redução de 70% na velocidade de fosforilação do ADP, o que foi parcialmente recuperado pela adição de citocromo c exógeno. Estes mitoplastos foram capazes de gerar e sustentar potencial elétrico de membrana suficiente para fosforilar ADP. Como previsto, os mitoplastos sofreram TPM induzido por Ca2+ de modo semelhante às mitocôndrias. Os mitoplastos foram sensíveis a conhecidos indutores de TPM como Ca2+ e tert-butil hidroperóxido ou inibidores como ciclosporina A, quelantes de Ca2+, ADP, redutor ditiol e ainda catalase. Conjuntamente, nossos resultados indicam que a membrana mitocondrial externa não é necessária para a formação/abertura do poro de TPM. / Abstract: Mitochondrial permeability transition (MPT) is a Ca2+-induced opening of a nonselective proteinaceous membrane pore sensitive to cyclosporin A in the inner membrane. Data from our laboratory provided evidence that MPT is assembled by the aggregation of inner membrane proteins due to the formation of thiol cross-linking. Alternatively, literature data propose the participation of a number of other outer membrane proteins in the composition of the MPT pore, such as, voltage-dependent anion channel (VDAC), hexokinase and the benzodiazepine receptor. In order to ascertain the independence of outer membrane proteins to generate the MPT we performed experiments with mitochondria devoid of outer membrane (mitoplasts). Liver and kidney mitoplasts were obtained by use of cholesterol-specific detergent digitonin to eliminate the outer membrane. Compared with the mitochondria, liver mitoplasts retained less than 5% and 10% of the markers of the outer membrane monoamine oxidase and VDAC, respectively. Kidney mitoplasts also showed a partial depletion of hexokinase (~73%). Mitoplasts presented with a 70% lower oxygen consumption rate during ADP phosphorylation ,which was partially reverted by the addition of exogenous cytochrome c. Mitoplasts were able to generate and sustain a membrane potential high enough to phosphorylate ADP. As hypothesized, these mitoplasts undergo Ca2+ induced MTP with similar properties as compared to intact mitochondria. Mitoplast MPT was sensitive to known permeability transition inducers such as Ca2+ and tert-butyl hydroperoxide and to inhibitors such as cyclosporin A, Ca2+ chelators, ADP, dithiol reductant and catalase. Altogether, the data indicate that the outer membrane is not necessary for MPT assembling or opening. / Mestrado / Mestre em Fisiopatologia Médica