Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:33:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013Bitstream added on 2014-09-24T20:21:05Z : No. of bitstreams: 1 317556.pdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Na atualidade as doenças cardiovasculares representam a principal causa de mortes no mundo, sendo esta situação reflexo do estilo de vida populacional. A aterosclerose, uma das principais causa das doenças cardiovasculares, inter-relaciona diversos fatores de risco que convergem em um ponto: a produção anormal de espécies reativas de oxigênio (EROs). O aumento de EROs, e a subsequente queda na biodisponibilidade de óxido nítrico (oNO) têm sido proposto como o mecanismo patogênico da disfunção endotelial. Superóxido (O2o-) produzido principalmente pela mitocôndria endotelial reage rapidamente com oNO produzindo peroxinitrito, uma espécie reativa de nitrogênio (ERNs) que causa alterações profundas na mitocôndria, superprodução de EROs, conduzindo a disfunção endotelial e morte celular. Estes fenômenos têm sido implicados no início e na progressão do processo aterosclerótico. Este estudo teve por objetivo principal a determinação do efeito de um fluxo de peroxinitrito promovido por 1,3-morfolinosidnonimina (SIN-1), sobre a função mitocondrial e endotelial de células endoteliais de aorta bovina (BAEC). Além disso, investigamos se o disseleneto de difenila (PhSe)2, um simples composto orgânico de selênio, poderia ser utilizado como uma estratégia farmacológica para proteção contra os danos causados pelo peroxinitrito, tendo em vista as importantes propriedades antioxidantes descritas para este composto. Nossos resultados experimentais mostraram que a exposição à SIN-1 (250 ?M) causou um profundo comprometimento no consumo de oxigênio, na geração de energia e na capacidade de reserva mitocondrial nas BAEC. A disfunção mitocondrial resultou em produção adicional de peroxinitrito, amplificando o fenômeno e levando a disfunção endotelial. Além disso, observamos um extensivo declínio no potencial de membrana mitocondrial ( m), induzido pelo peroxinitrito, e este evento foi associado à morte celular apoptótica. Por outro lado, o pré-tratamento das BAEC com (PhSe)2, foi capaz de prevenir os danos celulares mediados pelo peroxinitrito possivelmente por promover um aumento na expressão de duas diferentes isoformas da enzima peroxirredoxina (Prx). O aumento na expressão da Prx em conjunto com a melhora no sistema antioxidante vinculado à glutationa (GSH), já demonstrado anteriormente por nosso grupo, contribui para a melhoria do sistema antioxidante nas células endoteliais, tornando-as mais resistentes ao dano oxidativo.<br> / Abstract : Nowadays cardiovascular diseases are the leading cause of death worldwide, and this situation reflects the lifestyle of the population. Atherosclerosis, one of the main causes of cardiovascular disease, interrelates several risk factors that converge on one point: the abnormal production of reactive oxygen species (EROs). The increase in EROs and the subsequent decrease in the bioavailability of nitric oxide (oNO) have been proposed as the pathogenic mechanism of endothelial dysfunction. Superoxide (O2o-) mainly produced by endothelial mitochondria rapidly reacts with oNO producing peroxynitrite, a reactive nitrogen species (ERNs) which causes profound changes in the mitochondria, overproduction of EROs, leading to endothelial dysfunction and cell death. These phenomena have been implicated in the onset and progression of the atherosclerotic process. This study was designed to determine the effect of a flow of peroxynitrite promoted by 1,3-morpholinylsydnonimine (SIN-1), in mitochondrial and endothelial function of bovine aortic endothelial cells (BAEC). Furthermore, we investigated whether diphenyl diselenide (PhSe)2 , a simple organic selenium compound, could be used as a pharmacological strategy for protection against peroxynitrite-mediated damage, taking into account the significant antioxidant properties described for this compound. Experimental results showed that overnight exposure to SIN-1 (250 µM) caused a profound impairment on oxygen consumption, energy generation and reserve capacity in mitochondria of BAEC. Mitochondrial dysfunction resulted in an additional intracellular production of peroxynitrite, amplifying the phenomenon and leading to endothelial dysfunction. Moreover, we observed an extensive decline in mitochondrial membrane potential (??m), induced by peroxinytrite, and this event was associated with apoptotic-type cell death. In another hand, pretreatment of BAEC with (PhSe)2, was capable to prevent peroxynitrite-mediated cell damage possibly by promoting an increase in the expression of two different isoforms of peroxiredoxin (Prx) enzyme. The increase in the expression of Prx together with the amelioration of the glutathione (GSH) antioxidant system, previously demonstrated by our group, contributes to the improvement of the antioxidant system in endothelial cells, making them more resistant to oxidative damage.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-31Bitstream added on 2014-06-13T20:33:36Z : No. of bitstreams: 1 morales_mja_me_botib.pdf: 825355 bytes, checksum: 4a475b18f35e03371b78505d759221e5 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As populações de tubarões têm sofrido um acentuado declínio nas últimas décadas principalmente devido à pressão da pesca para provisão de alimento e à valorização das nadadeiras no mercado asiático. Como as espécies deste grupo se caracterizam por sua suscetibilidade aos efeitos da sobre-pesca, questões relacionadas ao status populacional são essenciais para o manejo correto dos estoques pesqueiros. Para a identificação destes estoques, ferramentas genéticas que acessam a variabilidade das espécies são eficientes e têm sido amplamente utilizadas. Considerando os fortes indícios de esgotamento populacional do tubarão-raposa Alopias superciliosus e a falta de informações que permitem viabilizar planos de conservação, o presente estudo buscou abordar questões relacionadas à dinâmica populacional da espécie no Oceano Atlântico utilizando a região controle do DNA mitocondrial como marcador molecular. Assim, 114 indivíduos de A. superciliosus foram analisados utilizando sequências nucleotídicas da região controle (D-loop) do DNA mitocondrial. Os 913 pares de bases analisáveis desta região do genoma permitiram a caracterização de apenas oito haplótipos em todas as amostras analisadas, sendo um único destes haplótipos compartilhado por 91,5% dos indivíduos. Os resultados indicam a ocorrência de uma baixa variabilidade genética (π = 0,00140 e h=0,152 ± 0,0046), a ausência de estruturação populacional (valores de FST e ΦST não significativos) e a caracterização de um único estoque pesqueiro na região abrangida pela amostragem no Oceano Atlântico. As análises também revelaram a existência de duas linhagens de DNAmt distintas, separadas por um mínimo de 9 mutações e com aproximadamente 1,2% de diferença genética, sendo uma delas composta por apenas 6 indivíduos, originando... / Populations of several shark species have decreased in the last decades, especially because of the fishing pressure and Asian demand for their fins. Since this group is susceptible to overfishing due to its biological traits, studies regarding its populations distribution are necessary for the appropriate management of their fish stocks. Genetic tools addressing species variability are efficient and widely used to the identification of fisheries stocks. Considering the lack of information about A. superciliosus populations, the remarkable decline in the abundance of this species around the world, and the lack of information management and conservation strategies, the aim of this study was solve issues about the populational dynamic of the species in the Atlantic Ocean. Using mitochondrial DNA control region (D-loop) sequences with 913 bp from 114 individuals of Alopias superciliosus, only eight haplotypes were found, which just one was shared by 91.5% of the analyzed sharks. The results suggest a low genetic variability (π = 0.00140 and h=0.152 ± 0.0046), no populational structure (FST values and ΦST no significant), and the characterization of a single A. superciliosus stock in the Atlantic Ocean. In addition, it was found two distinct mtDNA lineages, separated by a minimum of nine mutational steps and about 1.2% genetic difference, one of which consists of only six individuals, resulting in five distinct haplotypes. Thus, this lineage showing rare haplotypes could be related to recent migration events from the Indian Ocean, which would have occurred right after the last glaciations, in warming periods at the region of the Benguela Upwelling. At the other hand, migration processes also can be happening nowadays, with intermittent transference of warm waters from the Indian Ocean to the South Atlantic region. Such events could be... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-23Bitstream added on 2014-06-13T19:12:56Z : No. of bitstreams: 1 orrego_leo_me_botib.pdf: 1487561 bytes, checksum: 90a7f6e8635b374d9485785d05ccddfa (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Brachyplatystoma platynemum é uma espécie de bagre amplamente distribuída no eixo Amazonas/Solimões e muitos de seus tributários e, apesar de ser considerado de baixo valor comercial, o declive do estoque de outras espécies de grandes bagres de interesse comercial tem levado ao incremento na captura desta espécie. Por outro lado, o estado atual da estrutura e variabilidade genética das populações desta espécie são desconhecidos. Neste sentido foi realizada uma análise filogeográfica através do sequenciamento de dois genes do DNA mitocondrial (região controle e o gene citocromo b) e de marcadores nucleares microssatélites, com o objetivo de determinar se a espécie esta composta de um único estoque geneticamente homogêneo ou se existe algum tipo de segregação genética associada com o espaço e o tempo, que possa ser relacionada com o comportamento de homing. Foi analisado um total de 216 indivíduos para a região controle, 140 para o gene citocromo b e 169 para seis locus microssatélites, em sete localidades. Os resultados indicam altos níveis de diversidade haplotípica e evidenciam estrutura genética dos indivíduos desta espécie em duas populações: rio Madeira e demais pontos de coleta, no entanto, a estrutura observada não constitui suficiente evidencia para ser associada ao comportamento de homing. Estimativas do tempo de divergência baseadas no mtDNA indicam que as populações divergiram entre 1,0 a 1,5 Ma, tempo durante o qual a influencia das mudanças climáticas podem ter contribuído para a estrutura atual das populações de B. platynemum. Embora o padrão filogeográfico concorde com as predições da hipótese dos refúgios do Pleistoceno, a influência de eventos paleogeográficos e hidrológicos não pode ser descartada. Nossos resultados mostram a interação das mudanças... / Brachyplatystoma platynemum is a catfish species widely distributed in the Amazonas / Solimões basin, despite being considered of little commercial interest, the decline of fish stock of other species has contributed to the increase in the catch of this species. However, the current state of the structure and genetic variability of populations of this species are unknown. In this sense a phylogeographic analysis was performed through sequencing of two mitochondrial molecular markers (control region and cytochrome b gene) and nuclear microsatellites. In order to determine whether the species is composed of a single genetic unit, or if there is any genetic segregation associated with space and time, which may be related to homing behavior. It was analyzed a total of 216 individuals in the control region, 140 for the gene cytochrome b and 169 individuals for six microsatellite loci in seven locations in the Amazon/Solimões basin. The results show high levels of haplotype diversity and evidence genetic structure in two populations (Amazon river channel and the Madeira River). However, the observed structure is not indicated of homing behavior. Divergence time estimates based on mtDNA indicated that the populations diverged between 1.5 to 1.0 Ma, during this time the influence of climate change may have contributed to the current structure of populations of B. platynemum. Although the phylogeographic patterns is consistent with the hypothesis of Pleistocene refuges, the influence of paleogeographic and hydrological events as a result of geological process in the Plio-Pleistocene, are important in the diversification of populations. Our results show the interaction of climate change as a result of hydrological and geological processes in the Plio-Pleistocene in the diversification of fish populations in the Amazon region. Finally... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-11-22. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:48:29Z : No. of bitstreams: 1 000842326.pdf: 1568778 bytes, checksum: 44ee70fd5854d8be4d8c71d1f4d50503 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A subfamila Triatominae compreende 146 espécies, agrupadas em 18 gêneros e cinco tribos. O gênero Triatoma é o mais representativo da subfamília com 80 espécies descritas, as quais estão agrupadas em oito complexos e oito subcomplexos, sendo essa classificação baseada principalmente em características morfológicas. Triatoma rubravaria é considerado um importante vetor na transmissão da doença de Chagas no Estado do Rio Grande do Sul, uma vez que houve um aumento de sua captura e encontros de colônias intradomiciliares após o programa de combate ao T. infestans. Possui hábitos rupestres e é encontrado em buracos e fendas de locais pedregosos, juntamente com T. carcavalloi, T. circummaculata e T.klugi, os quais mostram semelhanças morfológicas. Marcadores moleculares pertencentes ao DNA nuclear, como os espaçadores internos transcritos (ITS) apresentam uma evolução mais rápida, permitindo estabelecer relações recentes ao passo que a grande subunidade ribossomal 28S (D2), por ser bem conservado, permite estabelecer relação entre organismos distantemente relacionados. Marcadores mitocondriais (Citocromo B - CytB e Citocromo Oxidase I - COI) apresentam taxa de mudança dez vezes mais rápida que aquelas apresentadas pelo DNA nuclear, sendo, portanto, úteis para estabelecer relações filogenéticas entre organismos que divergiram recentemente. A análise Bayesiana por meio de sequencias pertecentes ao mtDNA (CytB e COI) reafirmam o posicionamento de espécies no subcomplexo rubrovaria e indica T. carcavalloi como espécie irmã do grupo formado por T. klugi + T. rubrovaria + T. circummaculata. A análise bayesiana de seis populações de T. rubrovaria mostrou a população coletada em Canguçu isolada das demais, sugerindo que se trata de espécie críptica. / The subfamily Triatominae comprises 146 species grouped in 18 genera and five tribes. The genus Triatoma is the most representative subfamily with 80 described species, which are grouped into eight complex and eight subcomplexes and this classification being based primarily on morphological characteristics. Triatoma rubravaria is considered an important vector in the transmission of Chagas disease in the state of Rio Grande do Sul since it was detected an increase of their capture and meetings colonies household after the program to combat of T. infestans. T. rubrovaria is found in groves and crevices of rocky areas within T. carcavalloi, T. circummaculata and T.klugi, which show morphological similarities. Molecular markers belonging to the nuclear DNA, as the internal transcribed spacers (ITS) have more rapid evolution, establishing recent relationships while the large ribosomal subunit 28S (D2), being well maintained, allows establishing the relationship between distantly related organisms. Mitochondrial markers (Cytochrome B - CytB and Cytochrome Oxidase I - COI) present a rate of change ten times faster than those presented by nuclear DNA, and are therefore useful for establishing phylogenetic relationships between organisms that diverged recently. A Bayesian analysis using mtDNA sequences belonging to (CytB and COI) reaffirmed the positioning of the species and indicates subcomplex rubrovaria and indicates T. carcavalloi as sister species from the group of T. klugi + T. rubrovaria + T. circummaculata. A Bayesian analysis of six populations of T. rubrovaria showed the population collected in Canguçu isolated from the others, suggesting that they are cryptic species. / FAPESP: 09/52236-2

Orientador: Fabio Erminio Mingatto / Banca: Flavia Thomaz Verechia Pereira / Banca: Tiago Rodrigues / Resumo: Abamectina é uma lactona macrocíclica pertencente à família das avermectinas, utilizada mundialmente como agente antiparasitário em animais de criação e estimação, além do emprego agrícola como princípio ativo dos inseticidas e nematicidas. Mitocôndrias são responsáveis pela conversão da energia liberada pelo transporte de elétrons e armazenamento como energia de ligação na molécula de ATP, um componente metabólico essencial. Interferências em sua síntese ou utilização caracterizam mecanismos pelos quais os xenobióticos podem expressar toxicidade aguda ou crônica. Neste trabalho, os efeitos da abamectina na bioenergética de mitocôndrias isoladas de fígado de rato foram avaliados. Nas concentrações utilizadas (5 a 25 µM), abamectina causou inibição da cadeia respiratória, sem afetar a atividade das enzimas NADH desidrogenase, succinato desidrogenase e o potencial de membrana, comportando-se de maneira semelhante à oligomicina e ao atractilosídeo. A principal atuação da abamectina foi reduzir o potencial mitocondrial de fosforilação oxidativa, diminuindo os níveis de ATP provavelmente como resultado de sua ação direta sobre a FoF1-ATPase, uma vez que inibiu a atividade desta enzima, e/ou sobre o translocador de ADP/ATP. A inibição mais acentuada da atividade fosfohidrolase em mitocôndrias intactas desacopladas do que em mitocôndrias rompidas juntamente com a inibição da despolarização do potencial de membrana induzida pelo ADP sugerem que a abamectina atuou inibindo mais especificamente o translocador de ADP/ATP do que a FoF1-ATPase / Abstract: Abamectin is a macrocyclic lactone belonging to the avermectin family, used worldwide as antiparasitic agent in farm animals and pets, and agricultural employment as the active ingredient of insecticides and nematicides. Mitochondria are responsible for converting the energy released by electron transport and storage as the binding energy molecule ATP, an essential metabolic component. Interference in its synthesis or utilization characterize mechanisms by which xenobiotics can express acute or chronic toxicity. In this study, the effects of abamectin in the bioenergetics of mitochondria isolated from rat liver were evaluated. At the concentrations used (5-25 mM), abamectin caused inhibition of the respiratory chain without affecting the activity of enzymes NADH dehydrogenase, succinate dehydrogenase and the membrane potential, behaving similarly to oligomycin and Atractyloside. The main activity of abamectin was to reduce the potential of mitochondrial oxidative phosphorylation, decreasing ATP levels probably as a result of its direct action on the Fo-F1 ATPase, since it inhibited the activity of this enzyme, and/or the ADP/ATP translocator. The more pronounced inhibition of the fosfohydrolase activity in intact uncoupled mitochondria than in disrupted mitochondria, in addition to the inhibition of the ADP-stimulated depolarization of mitochondrial membrane potential suggest that abamectin acted more specifically by inhibiting the ADP/ATP translocator than the FoF1-ATPase / Mestre

Orientador : João Aristeu da Rosa / Banca: Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira / Banca: José Clóvis do Prado Júnior / Banca: Marcos Takashi Obara / Banca: Carlos Eduardo de Almeida / Resumo: A subfamila Triatominae compreende 146 espécies, agrupadas em 18 gêneros e cinco tribos. O gênero Triatoma é o mais representativo da subfamília com 80 espécies descritas, as quais estão agrupadas em oito complexos e oito subcomplexos, sendo essa classificação baseada principalmente em características morfológicas. Triatoma rubravaria é considerado um importante vetor na transmissão da doença de Chagas no Estado do Rio Grande do Sul, uma vez que houve um aumento de sua captura e encontros de colônias intradomiciliares após o programa de combate ao T. infestans. Possui hábitos rupestres e é encontrado em buracos e fendas de locais pedregosos, juntamente com T. carcavalloi, T. circummaculata e T.klugi, os quais mostram semelhanças morfológicas. Marcadores moleculares pertencentes ao DNA nuclear, como os espaçadores internos transcritos (ITS) apresentam uma evolução mais rápida, permitindo estabelecer relações recentes ao passo que a grande subunidade ribossomal 28S (D2), por ser bem conservado, permite estabelecer relação entre organismos distantemente relacionados. Marcadores mitocondriais (Citocromo B - CytB e Citocromo Oxidase I - COI) apresentam taxa de mudança dez vezes mais rápida que aquelas apresentadas pelo DNA nuclear, sendo, portanto, úteis para estabelecer relações filogenéticas entre organismos que divergiram recentemente. A análise Bayesiana por meio de sequencias pertecentes ao mtDNA (CytB e COI) reafirmam o posicionamento de espécies no subcomplexo rubrovaria e indica T. carcavalloi como espécie irmã do grupo formado por T. klugi + T. rubrovaria + T. circummaculata. A análise bayesiana de seis populações de T. rubrovaria mostrou a população coletada em Canguçu isolada das demais, sugerindo que se trata de espécie críptica. / Abstract: The subfamily Triatominae comprises 146 species grouped in 18 genera and five tribes. The genus Triatoma is the most representative subfamily with 80 described species, which are grouped into eight complex and eight subcomplexes and this classification being based primarily on morphological characteristics. Triatoma rubravaria is considered an important vector in the transmission of Chagas disease in the state of Rio Grande do Sul since it was detected an increase of their capture and meetings colonies household after the program to combat of T. infestans. T. rubrovaria is found in groves and crevices of rocky areas within T. carcavalloi, T. circummaculata and T.klugi, which show morphological similarities. Molecular markers belonging to the nuclear DNA, as the internal transcribed spacers (ITS) have more rapid evolution, establishing recent relationships while the large ribosomal subunit 28S (D2), being well maintained, allows establishing the relationship between distantly related organisms. Mitochondrial markers (Cytochrome B - CytB and Cytochrome Oxidase I - COI) present a rate of change ten times faster than those presented by nuclear DNA, and are therefore useful for establishing phylogenetic relationships between organisms that diverged recently. A Bayesian analysis using mtDNA sequences belonging to (CytB and COI) reaffirmed the positioning of the species and indicates subcomplex rubrovaria and indicates T. carcavalloi as sister species from the group of T. klugi + T. rubrovaria + T. circummaculata. A Bayesian analysis of six populations of T. rubrovaria showed the population collected in Canguçu isolated from the others, suggesting that they are cryptic species. / Doutor

Orientador: Claudio de Oliveira / Banca: Fernanda Simões de Almeida / Banca: Daniela Calcagnotto / Resumo: Brachyplatystoma platynemum é uma espécie de bagre amplamente distribuída no eixo Amazonas/Solimões e muitos de seus tributários e, apesar de ser considerado de baixo valor comercial, o declive do estoque de outras espécies de grandes bagres de interesse comercial tem levado ao incremento na captura desta espécie. Por outro lado, o estado atual da estrutura e variabilidade genética das populações desta espécie são desconhecidos. Neste sentido foi realizada uma análise filogeográfica através do sequenciamento de dois genes do DNA mitocondrial (região controle e o gene citocromo b) e de marcadores nucleares microssatélites, com o objetivo de determinar se a espécie esta composta de um único estoque geneticamente homogêneo ou se existe algum tipo de segregação genética associada com o espaço e o tempo, que possa ser relacionada com o comportamento de homing. Foi analisado um total de 216 indivíduos para a região controle, 140 para o gene citocromo b e 169 para seis locus microssatélites, em sete localidades. Os resultados indicam altos níveis de diversidade haplotípica e evidenciam estrutura genética dos indivíduos desta espécie em duas populações: rio Madeira e demais pontos de coleta, no entanto, a estrutura observada não constitui suficiente evidencia para ser associada ao comportamento de homing. Estimativas do tempo de divergência baseadas no mtDNA indicam que as populações divergiram entre 1,0 a 1,5 Ma, tempo durante o qual a influencia das mudanças climáticas podem ter contribuído para a estrutura atual das populações de B. platynemum. Embora o padrão filogeográfico concorde com as predições da hipótese dos refúgios do Pleistoceno, a influência de eventos paleogeográficos e hidrológicos não pode ser descartada. Nossos resultados mostram a interação das mudanças... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Brachyplatystoma platynemum is a catfish species widely distributed in the Amazonas / Solimões basin, despite being considered of little commercial interest, the decline of fish stock of other species has contributed to the increase in the catch of this species. However, the current state of the structure and genetic variability of populations of this species are unknown. In this sense a phylogeographic analysis was performed through sequencing of two mitochondrial molecular markers (control region and cytochrome b gene) and nuclear microsatellites. In order to determine whether the species is composed of a single genetic unit, or if there is any genetic segregation associated with space and time, which may be related to homing behavior. It was analyzed a total of 216 individuals in the control region, 140 for the gene cytochrome b and 169 individuals for six microsatellite loci in seven locations in the Amazon/Solimões basin. The results show high levels of haplotype diversity and evidence genetic structure in two populations (Amazon river channel and the Madeira River). However, the observed structure is not indicated of homing behavior. Divergence time estimates based on mtDNA indicated that the populations diverged between 1.5 to 1.0 Ma, during this time the influence of climate change may have contributed to the current structure of populations of B. platynemum. Although the phylogeographic patterns is consistent with the hypothesis of Pleistocene refuges, the influence of paleogeographic and hydrological events as a result of geological process in the Plio-Pleistocene, are important in the diversification of populations. Our results show the interaction of climate change as a result of hydrological and geological processes in the Plio-Pleistocene in the diversification of fish populations in the Amazon region. Finally... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El sistema renina-angiotensina (RAS) forma parte de un eje de control homeostático de procesos tan importantes como el mantenimiento del tono vascular, el balance hidroeléctrico y la contractilidad cardíaca. Su sobre-activación se relaciona con el desarrollo de hipertensión arterial, la que con el paso del tiempo desencadena una serie de procesos deletéreos de remodelado que cursan con hipertrofia del cardiomiocito, lo que puede llevar finalmente a la insuficiencia cardíaca. Adicionalmente, se ha mostrado que la sola desregulación de este sistema puede desencadenar hipertrofia y remodelado cardíaco. Para la compleja regulación del RAS, el organismo hace uso de distintos efectores o agonistas dentro de los que para nuestra investigación, destacamos al péptido angiotensina 1-9 que cada vez toma más importancia por su efecto fisiológico, descrito y corroborado por distintos investigadores, de contrarrestar y prevenir la señalización hipertrófica en cardiomiocitos originada por distintos estímulos, tanto in vitro como in vivo. En el presente trabajo se investigó el mecanismo anti-hipertrófico de Angiotensina 1-9, para lo que valiéndonos de previas investigaciones de nuestro laboratorio y de otros grupos de investigación, nos centramos en la señalización mediada por calcio que tiene un papel principal en la contracción, control del metabolismo energético celular y expresión génica en el corazón, siendo además uno de los principales actores en la hipertrofia cardiaca. Los resultados mostraron que la preincubación de angiotensina 1-9 no tuvo efectos directo sobre los movimientos de calcio; ya sea citoplasmático o mitocondriales, pero sí disminuyó la respuesta de calcio citoplasmático frente a un estímulo pro-hipertrófico, como la Norepinefrina e incrementó los transitorios mitocondriales de calcio evocados tanto por norepinefrina como histamina (esta última se ha descrito como gatillante de la salida de calcio desde el retículo endoplásmico hacia la mitocondria a través de los canales sensibles a IP3. Finalmente al investigar mediante inmunohistoquímica si los aumentos de calcio en la mitocondria se debían a un acercamiento entre el retículo y la mitocondria producido por la preincubación de Ang 1-9, evidenciamos que no se produce un acercamiento entre estos organelos, pero interesantemente si se evita el alejamiento de estos inducidos por estímulos prohipertróficos. Como conclusión de nuestro estudio Ang 1-9 corrige los niveles de Ca2+ citoplasmático inducidos por estímulos prohipertróficos, posiblemente por una mejora en la eficiencia en la entrada de Ca2+ a la mitocondria, lo que no se debe a una modulación de cercanía entre el retículo y la mitocondria / The renin-angiotensin system (RAS) is part of a homeostatic control shaft of important processes such as the maintenance of vascular tone, the electrolyte balance and cardiac contractility. The over-activation of this system has been associated with the development of high blood pressure, which over time triggers a series of deleterious remodeling processes that occur through cardiomyocyte hypertrophy and that can possible end in heart failure. Additionally it has been demonstrated that dysregulation of this system, by itself, can trigger cardiac hypertrophy and remodeling. To achieve the regulation of RAS, the organism uses different effectors or agonists, among them the peptide Angiotensin 1-9 that we highlight to our investigation, who has becoming increasingly more important for its physiological effect described and corroborated by other investigators to counteract and prevent hypertrophic signaling in cardiomyocytes caused by various stimuli in vitro and in vivo. In the present work we wanted to delve into the hypertrophic mechanism of Angiotensin 1-9, and availing ourselves of previous research in our and other laboratories, we focus on calcium signaling, in order to get to understand a little more of this process, coupling to the fact that this plays a major role in contraction, control of cellular energy metabolism and gene expression in the heart. In our results we first found that the pre-incubation of Angiotensin 1-9 itself had no direct effect on cytoplasmic or mitochondrial calcium movements, but decreased the cytoplasmic calcium response of the pro-hypertrophic agent Norepinephrine, and increased the mitochondrial calcium transients evoked by both, norepinephrine and histamine (which has been described that triggers output of calcium from the endoplasmic reticulum into mitochondria trough the IP3 calcium channels). Finally, using immunohistochemistry to investigate whether increases in calcium in mitochondria were due to a closer approach between the reticulum and the mitochondria induced by the Angiotensin 1-9 pre-incubation, we saw no differences in the proximity between these organelles, but interestingly the pre-incubation avoid the estrangement induced by the Norepinephrine pro-hypertrophic stimuli. As conclusion to our study we found that Angiotensin 1-9 is able to correct the cytoplasmic Ca2+ levels induced by a pro-hypertrophic stimuli, possibly by an improvement in the efficiency of Ca2+ entry into the mitochondria, which is not due to a modulation of the closeness between reticulum and mitochondria / Fondecyt, Fondef, Mecesup

Memoria para optar el título de Bioquímico / La mitocondria y el retículo endoplasmático (ER) se encuentran física y funcionalmente acoplados. Los receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) son los principales canales de Ca2+ responsables de la liberación de este ión desde el ER y de la comunicación con la mitocondria. En la mitocondria, el encargado de permitir la entrada de Ca2+ es el unitransportador de Ca2+mitocondrial (MCU), que regula el paso del ion desde el espacio intermembrana hacia la matriz mitocondrial, permitiendo el funcionamiento de varias enzimas y transportadores fundamentales para mantener la bioenergética celular. La disrupción de la comunicación ERmitocondria genera una crisis bioenergética que activa una respuesta autofágica dependiente de la kinasa activada por AMP (AMPK). En cáncer se ha asumido que la glicólisis es capaz de suministrar toda la energía que las células requieren. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que la mitocondria juega un papel fundamental en tumorigénesis. La migración e invasión son dos propiedades de las células tumorales que son parte de la cascada invasión-metástasis, que le permitirán a las células dejar el tumor primario para colonizar otros tejidos. Estas propiedades requieren altos niveles de energía. Sin embargo, el papel del metabolismo mitocondrial en estos fenómenos se ha estudiado muy poco. De acuerdo a esto, nosotros hipotetizamos que una interrupción en la comunicación vía Ca2+ entre el ER y la mitocondria producirá una desregulación bioenergética que disminuirá la capacidad de migración e invasión de las células tumorales. Utilizando un inhibidor competitivo especifico del receptor de IP3 y el silenciamiento de este a través de siRNA interrumpimos la comunicación ER-mitocondria y encontramos una disminución de la función mitocondrial, que se correlaciona con una disminución en la migración e invasión in vitro de líneas celulares tumorales altamente metastásicas. Los resultados de este trabajo abren nuevas oportunidades terapéuticas para tratar la generación de metástasis las que hasta el día de hoy son consideradas intratables / Mitochondria and the Endoplasmatic Reticulum (ER) are physically and functionally coupled. Inositol 1,4,5-triphosphate Receptors (IP3R) are responsible for the Ca2+ release from the ER to the cytoplasm and command mitochondria-ER communication. Mitochondrial Calcium Uniporter (MCU) is responsible for allowing Ca2+ entry from the intermembrane space to the mitochondrial lumen. Ca2+ in the mitochondria activates several Kreb’s cycle’s enzymes helping to maintain cell bioenergetics. Disruptions in ER-Mitochondrial communication generate a bioenergetic crisis characterized by an AMPK-dependent autophagic response. Migration and invasion of tumor cells are high energy demanding process. Glycolysis has been assumed to being able to supply as much energy cancer cells need. However, it has been recently proven that mitochondria play a crucial role in tumorigenesis. Accordingly we hypothesize that a disrupted Ca2+ communication between the ER and mitochondria will lead to a bioenergetic crisis that will decrease migration and invasive capacity of tumor cells. Thus, we interrupted the ERmitochondrial communication by inhibiting the IP3R pharmacologically with Xestospongin B and molecularly by silencing isoforms 1 and 3 of IP3R with siRNA. We found a decrease in mitochondrial function that correlates with a decrease in vitro migration and invasion of highly metastatic tumor cell lines. The results obtained in this work open new therapeutic opportunities to treat metastasis which are currently considered untreatable / Fondecyt

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Farmacología / La hipertrofia cardíaca es una respuesta adaptativa desencadenada por una mayor demanda de trabajo contráctil por parte del cardiomiocito, su desarrollo es el resultado de múltiples factores, existiendo una hipertrofia cardíaca de tipo fisiológica, reversible, sin signos histológicos de fibrosis, generada por factores de crecimiento como el factor de crecimiento análogo a insulina tipo 1 (IGF-1) y otra de tipo patológico, irreversible, cuya progresión genera insuficiencia cardíaca y cardiomiopatía dilatada, asociada a la acción de agonistas de receptores acoplados a proteína G como norepinefrina (NE), entre otros. Un aspecto importante a considerar es el metabolismo energético del corazón y su participación en el proceso hipertrófico, puesto que es uno de los órganos con mayor tasa de consumo de ATP y una disminución en la disponibilidad energética se traduce en alteraciones de la actividad contráctil y en el desarrollo de distintas patologías cardíacas. La mitocondria es el organelo responsable de la generación de energía en la célula, en el cardiomiocito se encuentran ubicadas entre las miofibrillas y ocupan sobre el 50% del volumen citoplasmático en el músculo cardíaco. Actualmente se reconoce la existencia de un retículo mitocondrial, donde estos organelos forman verdaderos “cables energéticos” cuya morfología y función dependen del equilibrio entre los procesos de fisión y fusión mitocondrial. Diversas proteínas, entre ellas OPA-1 y Mfn1/2 se relacionan con fusión mitocondrial mientras que Drp-1 y Fis-1 se asocian al proceso inverso. Tomando en cuenta la relación entre metabolismo e hipertrofia cardíaca, resulta evidente la importancia que adquieren los procesos de dinámica mitocondrial al regular la función de este organelo. Hasta la fecha se desconoce qué tipo de proceso de dinámica mitocondrial predomina en hipertrofia cardíaca, ni en qué forma la fusión/fisión de la mitocondria afecta el desarrollo del proceso hipertrófico en el cardiomiocito. Por esta razón, el objetivo principal del presente trabajo consistió en determinar si los estímulos prohipertróficos IGF-1 o NE, alteran la morfología y actividad mitocondrial. Para este fin, cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas se trataron con IGF-1 (10 nM) o NE (10 M) entre 0 - 48 h. La red mitocondrial se visualizó mediante microscopía confocal y tinción con mitotracker Green. Los resultados muestran que desde las 24 h, NE produjo fisión de la red mitocondrial, identificada por un incremento en el porcentaje de células con fragmentación mitocondrial (+26 %, p<0,05 y +39 %, p<0,001), en el número relativo de mitocondrias por célula (+42 %, p<0,005 y +65 %, p<0,001) y disminución en el volumen mitocondrial promedio (-24 %, p<0,005 y -47 %, p<0,001, para las 24 y 48 h, respectivamente. Además, luego de los cambios morfológicos se observó una disminución del potencial de membrana mitocondrial (-23 %, p<0,05), del contenido intracelular de ATP (-27 %, p<0,05) y de la velocidad de consumo de oxígeno (-24 %, p<0,05), después de 48 h de exposición a NE. No se observaron cambios morfológicos ni metabólicos en la red mitocondrial de cardiomiocitos tratados con IGF-1. Igualmente se observó que la fisión mitocondrial inducida por NE se asoció con un incremento en la migración de Drp-1 a mitocondria, evaluado a través de un incremento en los niveles de Drp-1 en fracción mitocondrial y aumento en la colocalización entre Drp-1 y Fis-1. Calcineurina es una de las proteínas transduccionales de mayor relevancia en la respuesta hipertrófica inducida por NE, describiéndose que participa en la modulación de la dinámica mitocondrial mediante desfosforilación de Drp-1, incrementando su actividad. Para evaluar su participación, cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas se transducieron con un adenovirus que expresa la subunidad catalítica de calcineurina constitutivamente activa (AdCN) o con uno que codifica un péptido inhibitorio para calcineurina (CAIN), observándose que su inhibición redujo significativamente los cambios morfológicos en la red mitocondrial inducidos por NE y que su sobreexpresión es suficiente para producir fisión mitocondrial. Además, el uso de herramientas adenovirales, también permitió determinar que una disminución en los niveles de Mfn2 produce fisión mitocondrial e induce la respuesta hipertrófica en el cardiomiocito, determinada como un incremento en el área celular, la sarcomerización y la reexpresión de biomarcadores asociados al proceso, mientras que la disminución en la actividad de Drp-1 fusiona la red mitocondrial y previene la hipertrofia cardíaca en los cardiomiocitos tratados con ambos estímulos. En base a estos resultados, se puede concluir que durante el desarrollo del proceso hipertrófico patológico del cardiomiocito se produce fragmentación de la red mitocondrial, a través de un mecanismo que involucra el incremento en la migración de Drp-1 amembrana mitocondrial y la participación de la fosfatasa calcineurina, todo esto asociado a una disminución en diversos parámetros metabólicos. Por otro lado, la modulación en los niveles o actividad de proteínas asociadas a los procesos de fusión y fisión mitocondrial, modificó significativamente el desarrollo del proceso hipertrófico, por lo que colectivamente, estos resultados revelan la importancia de los procesos de dinámica mitocondrial en el desarrollo de hipertrofia cardíaca. / Cardiac hypertrophy is an adaptive response induced by an increased contractile work. Physiological cardiac hypertrophy is reversible, without histological signs of fibrosis, generated by growth factors such as insulin like growth factor 1 (IGF-1). In contrast, pathological cardiac hypertrophy is irreversible, progress to heart failure and dilated cardiomyopathy and it has been associated with the action of G protein-coupled receptors agonists such as norepinephrine. An important aspect to consider is the heart’s energy metabolism and its role in the hypertrophic process, since myocardial tissue is one of the organs with the highest rate of ATP consumption. A decrease in energy availability results in detrimental changes in contractile activity and the development of distinct cardiac diseases. Mitochondria have a key role in energy generation in the cardiomyocyte are located between the myofibrils and occupy over 50% of cytoplasmic volume. The existence of a mitochondrial reticulum is recognized now and these organelles are true "power-transmitting cables" whose morphology and function depend on the balance between mitochondrial fission and fusion. Several proteins like OPA-1 and Mfn1/2 have been linked to mitochondrial fusion while Drp-1 and Fis-1 are associated with mitochondrial fission. Taking into account the relationship between metabolism and cardiac hypertrophy, the role of mitochondrial dynamics in the developrment of hypertrophyc growth must be relevant. However, the mitochondrial morphology in the hypertrophic cardiomyocyte, or how the mitochondrial fusion/fission events affect the development of the cardiomyocyte hypertrophic process is unknown. For this reason, our main objective was to investigate whether IGF-1 or NE stimulation produces changes in morphology and mitochondrial activity. For this goal, primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes were treated with IGF-1 (10 nM) or NE (10 M) for 0 - 48 h. The mitochondrial network was visualized by confocal microscopy and Mitotracker Green staining. The results show that NE triggered mitochondrial fission after 24 hours of exposure, identified by an increase in the percentage of cells with mitochondrial fragmentation (+26 %, p <0.05 and +39 %, p <0.001), increase in the relative number of mitochondria per cell (+42 %, p <0.005 and +65 %, p <0.001) and decrease in the average mitochondrial volume (-24 %, p <0.005 and -47 %, p < 0.001, for the 24 and 48 h respectively). In addition to these, morphological changes, decreases in mitochondrial membrane potential (-23 %, p <0.05), intracellular ATP content (-27 %, p <0.05) and oxygen consumption rate (-24 %, p <0.05) were also observed after 48 h of exposure to NE. No morphological or metabolic changes in the mitochondrial network were detected in cardiomyocytes treated with IGF-1. NEinduced mitochondrial fission was associated with an increase in the migration of Drp-1 to mitochondria, evaluated by increase in levels of Drp-1 in mitochondrial fraction and by Drp-1 and Fis-1 colocalization. Calcineurin is one of the most important signaling molecules in the hypertrophic response induced by NE. This phosphatase is also involved in the modulation of mitochondrial dynamics by dephosphorylation of Drp-1, increasing its activity. To evaluate its role, culture neonatal rat cardiomyocytes were transduced with an adenovirus expressesing the calcineurin catalytic subunit constitutively active (AdCN) an inhibitory peptide (CAIN). Inhibition of calcineurin significantly decreased morphological changes in the mitochondrial network triggered by NE and AdCN overexpression being sufficient to cause mitochondrial fission. Using other adenoviral tools, we show that a decrease in Mfn2 levels causes mitochondrial fission, and induces the cardiomyocyte hypertrophic response, determined by increases in cell area, sarcomerización and biomarkers associated with hypertrophic response. The decrease in Drp-1 activity, stimulated mitochondrial fusion and prevented cardiac hypertrophy induced by NE and IGF-1. Collectively our results suggest, that mitochondrial network is fragmented during the development of pathological cardiomyocyte hypertrophy, through a mechanism involving the migration of Drp1 to the mitochondria and the phosphatase calcineurin activation, associated with decreases in several metabolic parameters. In addition, the modulation in the activity of proteins associated with mitochondrial fusion/fission, produced significant changes in the development of hypertrophy. Collectively these results demonstrate the importance of mitochondrial dynamics in the development of cardiac hypertrophy. / CONICYT; FONDAP; FONDECYT; MECESUP