Memoria para optar al título de Bioquímico / El metabolismo y la función fisiológica cardíaca se mantienen gracias a la actividad mitocondrial. Estas últimas son estructuras fundamentales en la fisiología de las células eucariontes dado que participan en una amplia gama de procesos, entre los que se incluyen la generación de energía, tamponamiento del ion Ca+2 y la regulación de la apoptosis. La mitocondria sufre procesos regulados de fusión y fisión, siendo cada uno de estos eventos mediados por complejos de proteínas GTPasas como Fis-1 y la proteína de la familia de las dinaminas Drp-1. Fis-1 se encuentra difusamente asociada a la membrana mitocondrial externa (MME) y recluta a Drp-1 dfesde el citosol a focos específicos de la membrana mitocondrial durante el proceso de fisión. La pérdida del balance entre los procesos de fisión y fusión se asocia a alteraciones en la función mitocondrial y ciertas condiciones patológicas. A nivel celular, la fisión mitocondrial se ha relacionado con la muerte celular por apoptosis, la cual depende a su vez del estímulo utilizado. La pérdida de la integridad de la membrana mitocondrial y fragmentación de estos organelos ocurren durante la apoptosis, eventos que tienen lugar en forma concomitante con la activación de proteínas pro-apoptóticas de la familia Bcl-2 y caspasas. Sin embargo, existen algunos modelos donde la fisión de la red mitocondrial no se presenta durante el proceso de muerte. La maquinaria de la fisión mitocondrial no ha sido estudiada en cardiomiocitos bajo condiciones de integridad de la red mitocondrial. El objetivo de este trabajo consistió en evaluar los cambios inducidos en las proteínas Fis-1 y Drp-1 al desencadenar la fragmentación de la red mitocondrial por ceramidas en cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas. Nuestros principales resultados mostraron que Drp-1 y Fis-1 están presentes en cardiomiocitos con características similares a otros modelos celulares. C2-ceramida desencadenó un descenso rápido en el potencial mitocondrial de membrana, fragmentación de la red de estos organelos en forma dependiente del tiempo y concentración de C2-ceramida y modificación del patrón de distribución y expresión de las proteínas Drp-1 y Fis-1 alcanzando un 20% de colocalización entre ambas. La exposición de los cardiomiocitos durante 6 h a C2-ceramida 40 μM gatilló la salida del citocromo C desde la mitocondria al citosol y produjo un 35% de muerte. La disminución de los niveles de mitofusina-2 mediante la sobrexpresión de un adenovirus antisentido contra la proteína de la fusión mitocondrial Mfn-2 (AsMfn-2) cambió por si sola la morfología mitocondrial, el patrón de distribución de Drp-1 y Fis-1 y alteró las cinéticas de la caída del potencial de membrana mitocondrial, pero no la salida del citocromo C desencadenada por C2-ceramida. En conclusión, los resultados indican que los componentes de la maquinaria de la fisión mitocondrial se encuentran presentes en cardiomiocitos y que C2-ceramida gatilla su muerte por medio un proceso apoptótico que involucra la disrupción y fisión de la red mitocondrial / Cardiac metabolism and physiological function are supported by mitochondria activity. They are main players in the physiology of eukaryotes; they provide a myriad of services to the cell, including energy production, Ca+2 buffering and regulation of apoptosis. Mitochondria undergo regulated fusion and fission and each of these events are mediated by GTPase protein complexes such as Fis-1 and the dynamin-related protein Drp-1. Fis-1 is diffusely located throughout the outer mitochondrial membrane (OMM) and recruit Drp-1 from the cytoplasm to punctuate foci on the OMM during the fission process. The loss of balance between fusion and fission events has been associated with mitochondria loss of function and pathological conditions. At cellular level, mitochondria fission has been associated with apoptotic cell death in a stimulus dependent manner. Loss of mitochondria integrity and activation of fission proteins occurred concomitant with proapoptotic Bcl-2 and caspase cascade activation, even when there are some models where mitochondria fission is not present in the apoptotic process. Mitochondria fission machinery has not been studied in cardiomyocytes under loss of mitochondria network integrity conditions. We evaluated here Fis-1 and Drp- 1 changes when we induce mitochondrial network fragmentation by ceramides treatment in cultures neonatal cardiomyocytes. The main findings of this work was that Drp-1 and Fis-1 are present in cardiomyocytes with similar distribution pattern that other cell types. C2-ceramides promoted a rapid decrease in mitochondrial membrane potential, mitochondria network fragmentation in a dose and time dependent manner with both Drp-1 and Fis1 modification of expression and distribution pattern reaching a 20% of colocalization between both proteins. We also found that the exposure of cardiac myoctes for 6 h to C2-ceramide 40 μM induced the release of cytocrome C from mitochondria to cytosol and triggered 35% death. The overexpression of AsMfn-2 (mitofusin-2 antisense, a mitochondrial fusion inhibitor) changed mitochondrial cardiomyocyte morphology, the distribution pattern of Drp-1 and Fis-1 and altered the kinetic of the decrease in mitochondrial membrane potential, but not the release of citochrome C promoted by C2-ceramide. In conclusion, the results indicate that the components of fission mitochondrial machinery are in cardiomyocytes and C2-ceramide triggers their death by an apoptotic process that involves the disruption and fission of the mitochondrial network

Magíster en Bioquímica, área de especialización Bioquímica de Proteínas Recombinantes / Memoria de Título de Bioquímico / La hormona GLP-1 es una reguladora importante de la homeostasis de la glucosa, favoreciendo su metabolismo en varios tejidos a través de la activación de la vía del AMP cíclico-proteína kinasa A. En las células de músculo liso vascular (VSMC), el control del metabolismo de la glucosa es esencial para la mantención de la función y el fenotipo celular, ya que al favorecer su oxidación en las mitocondrias, se previene la aparición de un fenotipo desdiferenciado, característico de patologías cardiovasculares. Un mecanismo que promueve la actividad mitocondrial es su acoplamiento con el retículo endoplásmico (RE), pues se favorece el traspaso de metabolitos y Ca2+ desde el RE a la mitocondria. Estructuralmente, el acoplamiento entre ambos organelos depende de Mitofusina-2 (Mfn-2). Existe evidencia de que una disminución en el acoplamiento entre RE y mitocondrias en VSMC conduce a la aparición de un fenotipo proliferativo, mientras que el uso de GLP-1 previene el desarrollo de este fenotipo. Además, datos de nuestro grupo de trabajo sugieren que esta hormona potencia la actividad mitocondrial. Basados en estos antecedentes, quisimos estudiar si GLP-1 era capaz de promover el acoplamiento entre RE y mitocondrias en la línea celular vascular A7r5, y evaluar el posible rol de PKA y de Mfn-2 en el fenómeno. A través de inmunofluorescencia indirecta con marcación de RE y mitocondrias, se observó un aumento en la colocalización entre ambos organelos en células estimuladas con GLP-1 (100 nM, 3 h). Además, mediante el uso de la sonda fluorescente Rhod-FF, sensible a Ca2+ mitocondrial, se determinó que la pre-incubación de estas células con GLP-1 favorecía la entrada de Ca2+ reticular a la mitocondria. En forma paralela, se determinó que el tratamiento por 3 h con GLP-1 aumentó los niveles de Mfn-2, efecto que se perdió cuando las células se pre-incubaron con el inhibidor de PKA, H-89. Finalmente, se determinó que el incremento en la colocalización entre RE y mitocondrias y el aumento en la entrada de Ca2+ reticular a las mitocondrias en respuesta al tratamiento con GLP-1, se inhibían en células pre-tratadas con H-89. Así, concluimos que la incretina GLP-1 promueve el acoplamiento funcional entre RE y mitocondrias en células de la musculatura lisa vascular, a través de un mecanismo que requiere de la activación de PKA, y presumiblemente, del aumento de la proteína Mfn-2. / The hormone GLP-1 is an important regulator of glucose homeostasis that promotes its metabolism on several tissues through a cyclic AMP-protein kinase A pathway. In vascular smooth muscle cells (VSMC) glucose metabolism is involved in the control of both cellular function and phenotype, given that promoting its oxidation in the mitochondria prevents the appearance of VSMC undifferentiated phenotype, a hallmark of cardiovascular pathologies. Mitochondrial activity is activated by their coupling with the endoplasmic reticulum (ER), which enhances metabolite and Ca2+ transfer from the ER to the mitochondria. Structurally, the coupling between these organelles depends on Mitofusin-2 (Mfn-2). A decrease on ER-mitochondria coupling in VSMC leads to a proliferative phenotype, while GLP-1 treatment prevents its appearance. Besides, data from our work group suggests that this hormone enhances mitochondrial activity. Based on this background, we evaluated whether GLP-1 modulated functional coupling between ER and mitochondria in the vascular cell line A7r5, and the involvement of PKA and Mfn-2 on this phenomenon. Inmunofluorescence analysis of ER and mitochondria stained cells revealed that GLP-1 (3 h, 100 nM) treatment increased colocalization of these two organelles. Furthermore, by using the mitochondrial Ca2+ sensitive fluorescence probe, Rhod-FF, we determined that pre-incubation of these cells with GLP-1 enhanced reticular Ca2+ entry into the mitochondria. Moreover, the treatment with GLP-1 by 3 h increased Mfn-2 levels, an effect that was prevented by the pre-incubation with the PKA inhibitor, H-89. Finally, the increment of ER and mitochondria colocalization and the increase on reticular Ca2+ entry into the mitochondria in response to GLP-1 stimulation were both abolished in H-89 pre-treated cells. Therefore, we concluded that the hormone GLP-1 promotes ER and mitochondria coupling in VSMC, through a mechanism that requires PKA activation, and presumably, an increment of Mfn-2 levels. / Fondecyt

Doctor en Bioquímica / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo hasta diciembre de 2015, en el Portal de Tesis Electrónicas / El péptido similar a glucagón-1 (GLP-1) es una incretina secretada por las células intestinales. Su acción clásica es regular la respuesta secretoria de insulina por el páncreas. Sin embargo, recientemente se ha descrito que GLP-1 posee acciones extrapancreáticas muy similares a la insulina, con mecanismos de señalización tejido-específicos. Por sus muchas acciones fisiológicas, y la mayoría relacionadas con los efectos insulinotrópicos de esta incretina, derivados peptidomiméticos de GLP-1 se utilizan actualmente para controlar la hiperglicemia en individuos con diabetes mellitus tipo 2. Debido a esto se hace muy interesante investigar su acción específica sobre distintos tipos celulares que sufren alteraciones en patologías relacionadas con alteraciones metabólicas asociadas a la diabetes mellitus. En particular, se hace muy interesante estudiar el efecto de GLP-1 sobre las células vasculares musculares lisas (VSMC). Estas células responden a variadas señales ambientales fisiopatológicas o bioquímicas, regulando su función y su fenotipo. Sin embargo, aún no se comprende la totalidad de mecanismos involucrados en los cambios fenotípicos que ocurren en estas células en patologías como la diabetes. Evidencias recientes han involucrado a las alteraciones metabólicas que sufren las VSMC con la mayor incidencia de aterosclerosis en pacientes diabéticos. Las mitocondrias son los principales organelos asociados con el control del metabolismo energético dentro de una célula. Actualmente, se sabe que procesos subcelulares tales como la interacción mitocondria-retículo endoplásmico y los fenómenos de fusión y fisión mitocondrial, conocido como dinámica mitocondrial, son capaces de regular la función y el metabolismo mitocondrial. La dinámica mitocondrial está finamente regulada por las proteínas Mitofusinas 1/2 y OPA-1 para el caso del proceso de fusión, y Drp-1 y Fis-1 para el caso del proceso de fisión mitocondrial. Se ha descrito un papel trascendental para la proteína Drp-1 en la regulación del proceso de fisión, ya que puede sufrir modificaciones postraduccionales que modulan su interacción con la mitocondria generando cambios en el proceso de fisión. Dentro de las modificaciones postraduccionales de Drp-1 se destaca una fosforilación inhibitoria por PKA. Debido a que el receptor clásico de GLP-1 es una proteína de siete dominios de transmembrana acoplada a proteína Gs, la activación por GLP-1 de este receptor aumentaría los niveles intracelulares de cAMP activando PKA, pudiendo regular potencialmente el proceso de fisión mitocondrial vía Drp-1. Esta regulación podría ser un nuevo mecanismo por el cual GLP-1 podría regular, vía el control de la dinámica, el metabolismo mitocondrial y por ende el metabolismo celular. Con todos estos antecedentes se propuso como hipótesis que GLP 1 inhibe el proceso de fisión mitocondrial, incrementando el metabolismo mitocondrial a través de la fosforilación de Drp 1, en células de la línea A7r5. Para probar esta hipótesis, células A7r5 correspondientes a células embrionarias de VSMC de aorta de rata se trataron con GLP-1 (100 nM) por 0 – 24 h y se incubaron con la sonda Mitotracker Orange en los últimos 30 min de exposición a la hormona. Posteriormente, las células se visualizaron en un microscopio confocal, la red mitocondrial se reconstruyó tridimensionalmente a partir de las imágenes obtenidas, determinándose el número, volumen promedio y área promedio de las mitocondrias. Los resultados muestran que GLP-1 inhibió el proceso de fisión de la red mitocondrial a las 3 h de tratamiento, lo cual se evidenció por un aumento del volumen y el área mitocondrial promedio. Además, en estas condiciones, los niveles de la proteína constitutiva mitocondrial mtHsp70 no se modificaron en relación a los controles, descartando que GLP-1 induzca biogénesis mitocondrial. El metabolismo mitocondrial se evaluó mediante la determinación de potencial de membrana mitocondrial, usando la sonda JC1; producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), usando la sonda dihidrocloro fluoresceína; niveles intracelulares de ATP, usando lucifenina/luciferasa; y tasa de respiración, medido por oxigrafía. GLP-1 (100 nM) aumentó el potencial de la membrana mitocondrial, los niveles de ROS, los niveles intracelulares de ATP y el consumo de oxígeno. Se demostró que en células A7r5, GLP-1 activa a la vía transduccional dependiente de PKA. Además, mediante inmunoprecipitación de Drp-1 y posterior detección de la fosforilación de Drp-1 por Western blot se determinó que GLP-1 induce la fosforilación de Drp-1 de una manera similar a la inducida por forskolina. Además, mediante inmunofluorecencia se observó que GLP-1 previene la translocación de Drp-1 a la mitocondria. Utilizando H-89, un inhibidor específico de PKA, se demostró que la inhibición del proceso de fisión mitocondrial es dependiente de la activación de PKA. Posteriormente, se analizó la dependencia de la vía PKA para la acción de GLP-1 sobre el metabolismo mitocondrial. H-89 revertió el efecto de GLP-1 sobre el potencial de membrana mitocondrial y el incremento de los niveles de ROS. En resumen, los datos obtenidos permite sugerir que GLP-1 aumenta el metabolismo mitocondrial en las células A7r5 por un mecanismo que involucra la inhibición del proceso de fisión mitocondrial y la fosforilación de Drp-1 a través de una vía transduccional dependiente de PKA / Glucagon like peptide-1 (GLP-1) is an incretin hormone secreted by intestinal cells. Its classical action is to regulate insulin secretion in the pancreas. However, recently extrapancreatic insulinotropic actions of GLP-1 were described involving tissue-specific signaling pathways. Because GLP-1 have a variety of physiological actions mainly related with its insulinotropic actions, currently GLP-1 peptide mimetics are used to treat hyperglycemia in diabetes mellitus type 2 patients. For this reason, GLP-1 actions on different cell types that undergo pathological metabolic alterations related with diabetes mellitus are very interesting to explore. Particularly, we have focused on GLP-1 effects on vascular smooth muscle cells (VSMC). These cells can regulate both function and phenotype depending on biochemical and physiopathological environmental signals. However, mechanisms involved in VSMC phenotypic change in diseases such as diabetes are just beginning to be understood. Recent evidences have associated the existence of metabolic alterations in VSMC with an increase of atherosclerosis in diabetic patients. Mitochondria are the main organelle that controls energetic metabolism within cells. Specifically, subcellular events such as the interaction between mitochondria and endoplasmic reticulum and mitochondrial fusion and fission (i.e. mitochondrial dynamics) regulate mitochondrial function and metabolism. Mitochondrial dynamics is regulated by proteins, Mitofusins 1/2 and OPA-1 control fusion, and Drp-1 and Fis-1 control fission. Drp-1 has an important role in fission control, because it can be post-translationally modified, changing its interaction with mitochondria and affecting the mitochondrial fission rate. The most important post-translational modification is an inhibitory phosphorylation by PKA. The classical GLP-1 receptor (GLP-1R) is a seven transmembrane Gs-protein coupled receptor, and its activation causes an increase of cAMP levels activating PKA. Because this PKA activations GLP-1R could potentially regulates mitochondrial fission by Drp-1 phosphorylation. This regulation could be a novel GLP-1-dependent mechanism to control mitochondrial dynamics, mitochondrial metabolism and cellular metabolism. Consequently, we hypothesized that GLP-1 decreases mitochondrial fission and increases metabolism through Drp-1 phosphorylation in the A7r5 cell line. To test this hypothesis, A7r5 cells (rat embryonary aortic VSMC) were exposed to GLP-1 (100 nM) for 0 – 24 h and incubated with Mitotracker Orange dye in the last 30 min of “the hormone treatment”. Later, cells were observed under confocal microscope, mitochondrial network was reconstructed from images obtained, and number, average volume and area were determined. Our findings showed that GLP-1 decreased mitochondrial fission at 3 h, evidenced by the increase in mitochondrial volume average and area. These events did not affect mitochondrial constitutive mtHsp70 protein levels, discarding mitochondrial biogenesis induced by GLP-1. Mitochondrial metabolism was evaluated by measuring mitochondrial membrane potential, using JC1 dye; reactive oxygen species (ROS), by dihydrochloro fluorescein dye; intracellular ATP level, using luciferin/luciferase; and respiration rate, by oxygraphy. GLP-1 (100 nM) increased mitochondrial membrane potential, ROS levels, ATP content and oxygen consumption. We demonstrated that GLP-1 activates PKA signaling pathway in A7r5 cells. Moreover, through Drp-1 immunoprecipitation and phospho-Drp-1 detection by Western blot, we showed that GLP-1, as well as forskolin, induced Drp-1 phosphorylation. Consequently, Drp-1 translocation to the mitochondria was prevented by GLP-1, as determined by immunofluorescence. Using the PKA specific inhibitor, H-89, it was demonstrated that GLP-1 decreased mitochondrial fission depends on PKA activation. Subsequently, PKA dependence on GLP-1-induced mitochondrial metabolism was explored. We determined that H-89 prevented GLP-1 effects on both mitochondrial membrane potential and ROS production. In summary, our data suggest that GLP-1 increases mitochondrial metabolism in A7r5 cells by a mechanism involving mitochondrial fission and Drp-1 phosphorylation through a PKA-dependent signaling pathway / FONDECYT FONDAP ANILLO ACT1111

Orientador: Patrícia Monteiro Seraphim / Banca: Luiz Carlos Marques Vanderlei / Banca: Gisele Alborghetti Nai / Resumo: Introdução: A obesidade está ligada a progressão de doenças crônicas associadas à disfunção mitocondrial. O treinamento de resistência pode ser considerado uma abordagem válida para reversão desses fatores ainda pouco explorados na população obesa. Objetivo: Investigar o efeito do treinamento resistido sobre a composição corporal, colesterol e glicose circulantes, alterações cardiovasculares e hepáticas e sobre a expressão de genes do metabolismo mitocondrial de ratos obesos induzidos por dieta hipercalórica. Métodos: Foram utilizados 36 ratos machos Wistar, aleatoriamente separados em Controle Sedentário (CS), Controle Exercitado (CE), Obeso Sedentário (OS) e Obeso Exercitado (OE). Para os animais obesos foi ofertada uma dieta hipercalórica (D.H). O treinamento resistido (T.R) foi progressivo durante 12 semanas com base na Repetição Máxima (RM), com carga a partir de 50% até 100% PC. Os tecidos, coração, pulmão e fígado foram coletados para análise histológica, sangue para análises séricas, músculo esquelético gastrocnêmio para análise da expressão de genes pela técnica de RT-PCR e tecido adiposo para mensuração da adiposidade. Foram utilizados os testes de Anova- One Way e Kruskall Wallis. Resultados: O Grupo OS se destacou pela quantidade de triglicerídeos (p<0,0001) e glicose circulantes (p<0,001). Foi detectado aumento na espessura da artéria pulmonar e ventrículo direito (VD) no grupo OS (p<0,0001). Na análise Fractal o VD apresentou diferença entre OS e CE (p=0,04). Na... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Introduction: Obesity is linked to the progression of chronic diseases associated to mitochondrial dysfunction. Resistance training can be considered a valid approach to reverse these factors that are still poorly explored in obese. Objective: To address the effect of resistive training on body composition, circulating cholesterol and glucose, cardiovascular and hepatic alterations, and on mitochondrial gene expression. Noting the role of resistance training in preventing, maintaining or increasing these factors. Methods: Thirty - six male Wistar rats were divided in Control Sedentary (CS), Control Exercised (CE), Obese Sedentary (OS) and Obese Exercised (OE) groups. Obese animals were offered a hypercaloric diet (HD). Resistance training (RT) was progressive for 12 weeks based on Maximum Repetition (MR), with load from 50% to 100% of BW. The tissues, heart, lung and liver were collected for histological analysis, blood for serum analysis, gastrocnemius skeletal muscle for analysis of gene expression by the RT-PCR and periepidydimal adipose tissue was removed to measure adiposity level. Anova-One Way and Kruskall Wallis tests were used. Results: OS group was distinguished by the amount of circulating triglycerides (p <0.0001) and glucose (p <0.001). Increased thickness of the pulmonary artery and right ventricle (RV) in the OS group was detected (p <0.0001). In the Fractal analysis the RV presented difference between OS and CE (p = 0.04). In hepatic analysis, the OS group had... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Este trabajo, pretende ofrecer nuevos conocimientos acerca de los mecanismos moleculares que provocan afectación celular en los desordenes mitocondriales provocados por las mutaciones m.14487T>C, m.8993T>G, m.3243A>G y m.8344A>G del ADN mitocondrial. Para conseguir nuestro objetivo, como modelo de estudio se obtuvieron líneas de cíbridos transmitocondriales para las diferentes mutaciones de estudio, las cuales fueron cultivadas en unas condiciones de cultivo que permitiesen manifestar el defecto en el sistema OXPHOS (sistema de fosforilación oxidativa) manteniendo la viabilidad, incluso en aquellas mutaciones que afectan a ARNt. En estas condiciones de cultivo, se estudiaron parámetros que nos permitieron valorar la función mitocondrial como la concentración de lactato, succinato, ATP, ADP, AMP, Adenosina y el potencial de membrana mitocondrial, evidenciando el gran defecto en el sistema OXPHOS causado por las mutaciones que afectan a ARNt no siendo tan evidente en aquellas mutaciones que afectan a subunidades del sistema OXPHOS. Además los estudios de expresión génica realizados nos permitieron identificar la posible activación de procesos autofágicos y apoptóticos como posibles mecanismos moleculares responsables de los desordenes mitocondriales causados por las mutaciones m.3243A>G y m.8344A>G. Así como, evidenciar la no inducción de biogénesis mitocondrial en ninguna de las cuatro mutaciones estudiadas, incluso en aquellas mutaciones que afectan a ARNt con una mayor depleción en el contenido de ATP. Toda la información que se derivó de los estudios de expresión génica, no solo mostró una respuesta transcripcional diferencial entre mutaciones que afectan a ARNt y subunidades sino que además se observó una respuesta nuclear específica para cada una de las mutaciones del ADNmt estudiadas. Poniendo de manifiesto la complejidad de la fisiopatología de las enfermedades mitocondriales. Nosotros en este estudio intentamos poner de manifiesto esta complejidad y a la vez intentar esclarecer los mecanismos fisiopatológicos implicados en las mutaciones estudiadas, en algunos casos, como en las mutaciones en ARNt (gracias a las condiciones de cultivo utilizadas) hemos propuesto posibles mecanismos (que deben ser ratificados) que podrían explicar la degeneración celular causada por estas mutaciones y en otros, como en las mutaciones que afectan a subunidades hemos identificado aspectos a tener en cuenta en la fisiopatología de estas mutaciones. / This work aims to provide new insights into the molecular mechanisms that cause cell involvement in mitochondrial disorders caused by mutations m.14487T>C, m.8993T>G, m.3243A>G and m.8344A>G in mitochondrial DNA. To achieve our goal, as a study model lines cybrids were obtained to study the different mutations, which were grown in culture conditions that allowed the defect state in the OXPHOS system (oxidative phosphorylation system) maintaining the viability, even in those mutations that affect tRNA. In these culture conditions were studied parameters were allowed assess mitochondrial function as the lactate concentration, succinate, ATP, ADP, AMP, adenosine and mitochondrial membrane potential, demonstrating the great defect in the OXPHOS system caused by mutations tRNA affecting not be so apparent in those subunits mutations affecting OXPHOS system. Furthermore gene expression studies allowed us to identify made possible activation of apoptotic and autophagic processes as potential molecular mechanisms responsible for mitochondrial disorders caused by mutations m.3243A>G and m.8344A>G. So as not show the induction of mitochondrial biogenesis in any of the four mutations studied, even those mutations that affect tRNA in a greater depletion of ATP content. All information derived from studies of gene expression, not only showed a differential transcriptional response mutations that affect tRNA and subunits but also showed a specific nuclear response to each of the mitochondrial DNA mutations studied. Noting the complexity of the pathophysiology of mitochondrial diseases. We in this study we manifest this complexity while trying to clarify the pathophysiological mechanisms involved in the mutations studied, in some cases, such as mutations in tRNA (thanks to the culture conditions used) have proposed possible mechanisms (which should be ratified) that may explain the cellular degeneration caused by these and other mutations, such as mutations affecting subunits have identified aspects to consider in the pathophysiology of these mutations.

Orientador: Fausto Foresti / Coorientador: Fernando Fernandes Mendonça / Banca: Maria Iracilda da Cunha Sampaio / Banca: Alexandre Wagner Silva Hilsdorf / Resumo: As populações de tubarões têm sofrido um acentuado declínio nas últimas décadas principalmente devido à pressão da pesca para provisão de alimento e à valorização das nadadeiras no mercado asiático. Como as espécies deste grupo se caracterizam por sua suscetibilidade aos efeitos da sobre-pesca, questões relacionadas ao status populacional são essenciais para o manejo correto dos estoques pesqueiros. Para a identificação destes estoques, ferramentas genéticas que acessam a variabilidade das espécies são eficientes e têm sido amplamente utilizadas. Considerando os fortes indícios de esgotamento populacional do tubarão-raposa Alopias superciliosus e a falta de informações que permitem viabilizar planos de conservação, o presente estudo buscou abordar questões relacionadas à dinâmica populacional da espécie no Oceano Atlântico utilizando a região controle do DNA mitocondrial como marcador molecular. Assim, 114 indivíduos de A. superciliosus foram analisados utilizando sequências nucleotídicas da região controle (D-loop) do DNA mitocondrial. Os 913 pares de bases analisáveis desta região do genoma permitiram a caracterização de apenas oito haplótipos em todas as amostras analisadas, sendo um único destes haplótipos compartilhado por 91,5% dos indivíduos. Os resultados indicam a ocorrência de uma baixa variabilidade genética (π = 0,00140 e h=0,152 ± 0,0046), a ausência de estruturação populacional (valores de FST e ΦST não significativos) e a caracterização de um único estoque pesqueiro na região abrangida pela amostragem no Oceano Atlântico. As análises também revelaram a existência de duas linhagens de DNAmt distintas, separadas por um mínimo de 9 mutações e com aproximadamente 1,2% de diferença genética, sendo uma delas composta por apenas 6 indivíduos, originando... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Populations of several shark species have decreased in the last decades, especially because of the fishing pressure and Asian demand for their fins. Since this group is susceptible to overfishing due to its biological traits, studies regarding its populations distribution are necessary for the appropriate management of their fish stocks. Genetic tools addressing species variability are efficient and widely used to the identification of fisheries stocks. Considering the lack of information about A. superciliosus populations, the remarkable decline in the abundance of this species around the world, and the lack of information management and conservation strategies, the aim of this study was solve issues about the populational dynamic of the species in the Atlantic Ocean. Using mitochondrial DNA control region (D-loop) sequences with 913 bp from 114 individuals of Alopias superciliosus, only eight haplotypes were found, which just one was shared by 91.5% of the analyzed sharks. The results suggest a low genetic variability (π = 0.00140 and h=0.152 ± 0.0046), no populational structure (FST values and ΦST no significant), and the characterization of a single A. superciliosus stock in the Atlantic Ocean. In addition, it was found two distinct mtDNA lineages, separated by a minimum of nine mutational steps and about 1.2% genetic difference, one of which consists of only six individuals, resulting in five distinct haplotypes. Thus, this lineage showing rare haplotypes could be related to recent migration events from the Indian Ocean, which would have occurred right after the last glaciations, in warming periods at the region of the Benguela Upwelling. At the other hand, migration processes also can be happening nowadays, with intermittent transference of warm waters from the Indian Ocean to the South Atlantic region. Such events could be... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Magíster en Bioquímica, área de especialización Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular / Memoria para optar al Título de Bioquímica / La obesidad y la diabetes son condiciones altamente prevalentes que representan un importante factor de riesgo para el desarrollo de patologías cardiovasculares, principal causa de muerte entre los pacientes diabéticos. La lipotoxicidad y las alteraciones metabólicas juegan un papel fundamental en la resistencia a la hormona insulina y el daño cardiaco en estos pacientes. Los cardiomiocitos son las unidades funcionales del corazón y poseen un alto requerimiento energético que depende en su mayor parte de la función mitocondrial. Las mitocondrias forman una red dinámica que se remodela constantemente por eventos de fisión y fusión. La mantención de una morfología mitocondrial balanceada es fundamental para mantener una funcionalidad adecuada de este organelo. El objetivo de este trabajo fue investigar el efecto de las ceramidas, que derivan del metabolismo lipídico, en la señalización de la insulina y la dinámica mitocondrial en cultivos primarios de cardiomiocitos de rata. La señalización de insulina se evaluó mediante Western blot para Akt fosforilada y la morfología mitocondrial por microscopía confocal en células teñidas con Mitotracker Green. El tratamiento de los cardiomiocitos con C2-ceramida (40 μM, 3 h) disminuyó la fosforilación de Akt basalmente y en respuesta a insulina y favoreció la fisión mitocondrial, aumentando la translocación de la proteína de fisión Drp-1 hacia este organelo. Para evaluar si ambos efectos estaban relacionados, se inhibió la actividad de Drp-1 mediante el uso de un dominante negativo y de un inhibidor químico, antes del tratamiento con C2-ceramida. La inhibición de Drp-1 mediante ambas herramientas previno la fisión mitocondrial causada por C2-ceramida y rescató la fosforilación de Akt en respuesta a insulina. Trabajos previos de nuestro laboratorio muestran que el tratamiento de los cardiomiocitos con palmitato 500 μM durante 3 h también induce fisión de la red mitocondrial. En este trabajo se mostró que al inhibir la síntesis de ceramidas a partir de palmitato se previene, en parte, los efectos de este ácido graso sobre la dinámica mitocondrial de los cardiomiocitos. En conclusión, la fragmentación de la red mitocondrial inducida por ceramidas es necesaria para la disminución de la señalización de insulina en los cardiomiocitos. Además, la fisión mitocondrial inducida por palmitato en este modelo depende en parte de la generación de ceramidas. / Obesity and diabetes are highly prevalent conditions that represent an important risk factor for the development of cardiovascular diseases, the main cause of death in diabetic patients. Lipotoxicity and metabolic alterations take part in insulin resistance and heart damage in these patients. Cardiomyocytes are the functional basic units of the heart and have a high energy requirement that depends largely on mitochondrial function. Mitochondria form a dynamic network that is constantly remodelled by fission and fusion events. The maintenance of a balanced mitochondrial morphology is critical to maintain a proper functionality of this organelle. The aim of this study was to investigate the effect of ceramides, derived from lipid metabolism, in insulin signalling and mitochondrial dynamics in primary cultures of rat cardiomyocytes. Insulin signalling was assessed by Western blot for phosphorylated Akt and mitochondrial morphology by confocal microscopy in Mitotracker Green-stained cells. Treatment of cardiomyocytes with C2-ceramide (40 μM, 3 h) decreased the phosphorylation of Akt at baseline and in response to insulin and induced mitochondrial fission, increasing the translocation of the fission protein Drp-1 to this organelle. To assess whether both effects were related, Drp-1 activity was inhibited by using a dominant negative and a chemical inhibitor, before treatment with C2-ceramide. The inhibition of Drp-1 by both tools prevented mitochondrial fission caused by C2-ceramide and rescued Akt phosphorylation in response to insulin. Previous work in our laboratory showed that treatment of cardiomyocytes with palmitate 500 μM for 3 h also induces mitochondrial fission. We showed that inhibiting the synthesis of ceramides from palmitate prevented in part the effects of this fatty acid on mitochondrial dynamics in cardiomyocytes. In conclusion, the mitochondrial network fragmentation induced by ceramides is required for the decrease of insulin signalling in cardiomyocytes. Furthermore, palmitate-induced mitochondrial fission in this model depends in part on the generation of ceramides. / Fondap, Fondecyt

Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización Toxicología y Diagnóstico Molecular, y Memoria para optar al Título de Bioquímico / El estrés en el retículo endoplásmico (RE) genera señales hacia el núcleo y citoplasma, reorganizando la homeostasis proteica e interviniendo en la decisión de vida o muerte celular. A pesar de ser ampliamente estudiada, aún se desconocen los mecanismos adaptativos iniciados en la mitocondria ante esta condición. En este trabajo se evaluó si el estrés de RE modula el acoplamiento entre la red mitocondrial y el RE, y si el cambio en esta interacción tiene repercusiones sobre el estado metabólico energético celular. Para inducir estrés de RE, células HeLa se trataron con tunicamicina (inhibidor de la glicosilación en el RE) por 1, 4 y 20 h. El contenido de ATP intracelular, el poder reductor, el potencial mitocondrial y el consumo de oxígeno se midieron para determinar el estado metabólico celular. La red mitocondrial y el RE se marcaron fluorescentemente y a las imágenes de microscopía confocal se les analizó la colocalización mediante los coeficientes de Manders. Para analizar la participación del citoesqueleto se utilizaron los agentes despolimerizadores nocodazol (microtúbulos) y citocalasina B (microfilamentos de actina). Tras 4 h, el estrés de RE aumentó los niveles intracelulares de ATP, el poder reductor, el potencial mitocondrial y el consumo de oxígeno en las células HeLa. Esta estimulación metabólica resultó transitoria, dado que el ATP, poder reductor y potencial mitocondrial disminuyeron después de 20 h de estrés. A las 4 h se observó también una redistribución mitocondrial y reticular hacia la región perinuclear, que llevó a un aumento en el acoplamiento entre ambos organelos. Esta mayor cercanía, así como la estimulación metabólica no se previnieron por citocalasina, pero sí por nocodazol. Se puede concluir entonces que el estrés de RE, en sus etapas tempranas indujo una mayor capacidad funcional de la mitocondria, asociada a su mayor cercanía con el RE. Estos cambios se llevan a cabo a través del movimiento de los organelos a lo largo de la red de microtúbulos / Endoplasmic reticulum (ER) stress triggers signals to the nucleus and cytoplasm, reorganizing protein homeostasis and intervening in the decision of life or death. Despite being highly studied nowadays, the adaptative mechanisms initiated by mitochondria upon this condition remain unknown. This work studies whether ER stress modulates the spatial coupling between the mitochondrial network and the ER, and the consequences of this interaction on the energetic cell state. To induce ER stress in HeLa cells, they were treated with tunicamycin (inhibitor of protein glycosylation at the ER) for 1, 4 and 20 h. Intracellular ATP content, intracellular reducing level, mitochondrial potential and oxygen consumption were measured to determine the metabolic cell state. The mitochondrial network and the ER were stained with fluorescent markers. Images were taken with a confocal microscope, and colocalization was analyzed with Manders’ coefficients. To determine cytoskeleton participation, two depolymerizing agents were used: nocodazole (for microtubules) and cytochalasin B (for actin microfilaments). Upon 4 h of ER stress, ATP, reducing power, mitochondrial potential and oxygen consumption increased in HeLa cells. This metabolic stimulation was transient due to ATP, reducing power and mitochondrial potential diminished upon 20 h of stress. At 4 h there was a mitochondrial and reticular redistribution towards the perinuclear region, which lead to an increase in organelle coupling. Both enhanced interaction and metabolic stimulation were prevented by nocodazole, but not by cytochalasin. In conclusion, mitochondrial function is enhanced in early states of ER stress, which is associated with enhanced spatial coupling with the ER. These changes take place by the movement of organelles along the microtubule network

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-05T12:51:06Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 209715 bytes, checksum: 7f4e02ffbc08a0fcea79911c2a849ff2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-05T12:51:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 209715 bytes, checksum: 7f4e02ffbc08a0fcea79911c2a849ff2 (MD5) Previous issue date: 2002-03-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Neste trabalho, investigaram-se os efeitos da baixa temperatura sobre a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), peroxidase (POX) e catalase (CAT), em mitocôndrias captadoras de Ca 2+ (isoladas de hipocótilos de soja e coleóptilos de milho) em comparação com mitocôndrias incapazes de captar Ca 2+ (isoladas de tubérculos de batata e raízes de beterraba). Adicionalmente, compararam-se as atividades dessas enzimas mitocondriais com suas isoenzimas presentes em outras frações celulares. Os tubérculos de batata e as raízes de beterraba foram mantidos à temperatura ambiente (controle) e a 5°C por dez dias. Para as plântulas de soja e milho, o tratamento controle correspondeu à sua manutenção à temperatura de 28°C, durante quatro dias após o plantio. O tratamento com frio consistiu em manter outro grupo de plântulas por mais dois dias, transferindo-as para temperatura de 5°C. A atividade da SOD, nas diversas espécies, foi maior na fração solúvel do que nas organelas isoladas. Na fração solúvel, a atividade da SOD foi reduzida pela baixa temperatura, apenas em beterraba, milho e soja, não apresentando diferença significativa em batata. Não foi detectada atividade de SOD nos peroxissomas na maioria das espécies estudadas, à exceção da beterraba. O frio não alterou a atividade da POX nas mitocôndrias e nos proplastídeos de todas as espécies estudadas, porém houve redução na atividade dessa enzima em peroxissomas de batata e beterraba. O frio reduziu a atividade da CAT em mitocôndrias de batata e aumentou em soja, sem alterações significativas nas outras espécies. Nos tratamentos com baixa temperatura, não houve alterações significativas na atividade da CAT em proplastídeos. Em peroxissomas, houve redução em beterraba e milho. Esses resultados não permitem estabelecer um padrão de comportamento das enzimas estudadas em resposta ao frio, nem estabelecer uma relação direta entre a capacidade mitocondrial de captação de cálcio e a atividade das enzimas avaliadas. / The effects of low temperatures on the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POX) and catalase (CAT) were investigated in mitochondria capable of capturing Ca 2+ (isolated from soybean hypocotyls and corn coleoptiles) as compared with non-capturing Ca 2+ mitochondria (from potato tubers and beet roots). Activities of the enzymes were also studied in other fractions such as soluble fraction, peroxisomes and proplastids. Potato tubers and beet roots were stored at room temperature (control) or under 5 oC during ten days. Soybean and corn seedlings were kept at 28 oC during four days after sowing, followed by more two days at 28 oC (control) or 5 oC. In general, SOD activity was higher in soluble fraction than in the fractions containing isolated organelles. SOD activity was diminished by low temperature in beet, corn and soybean, but not in potato. Except for beet, SOD activity in peroxissomes of the species studied was not detected. Chilling treatments did not change POX activity in mitochondria and proplastids fractions in the species studied, but activity of this enzyme was decreased in potato and beet peroxisome fractions. CAT activity was reduced by cold in mitochondria fractions from potato, but was enhanced in soybean, while in the other species no change was detected. As for proplastids, low temperature treatments did not affect CAT activity. Cold decreased CAT activity only in peroxisomes from beet roots and corn coleoptiles. No general pattern for the behavior of the enzymes studied could be established by taking into account the chilling treatments and the groups of plants with and without mitochondria ability to capturing Ca 2+ . / Dissertação importada do Alexandria

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Florianópolis, 2015 / Made available in DSpace on 2016-04-15T13:15:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337874.pdf: 1944270 bytes, checksum: c709b7290458a8082e6d02d0f2f51df6 (MD5) Previous issue date: 2015 / Introdução: Glicocorticoides são amplamente utilizados na prática clínica. Fisiologicamente há um ritmo circadiano bem definido de secreção de cortisol e um envolvimento na resposta aguda ao estresse. Possuem também, importante papel na autopreservação e na homeostasia do sistema nervoso central. O cérebro possui alta taxa metabólica e as funções neuronais são particularmente sensíveis às disfunções mitocondriais. Há uma falta de estudos do efeito dos glicorticoide sobre a atividade das enzimas da cadeia respiratória mitocondrial (ECRM) em estruturas corticais e límbicas em humanos adultos. A atividade destas enzimas pode ser avaliada com sucesso em amostras congeladas. A cirurgia de epilepsia refratária ao tratamento medicamentoso oferece uma oportunidade ética para estudar o tecido cerebral humano. Cirurgias de epilepsia são realizadas sob parâmetros hemodinâmicos e laboratoriais próximos ao fisiológico, mas não há estudos que analisaram a associação entre esses parâmetros e a atividade das enzimas envolvidas na cadeia respiratória mitocondrial. Métodos: Estudo de 24 indivíduos adultos com diagnóstico de epilepsia do lobo temporal mesial associado à esclerose do hipocampo (ELTM-EH)refratários ao tratamento medicamentoso. Todos foram submetidos a neurocirurgia para controle da doença e durante o ato cirúrgico foram removidas amostras do córtex temporal, da amigdala e do hipocampo. Foram obtidos a história clínica e os parâmetros bioquímicos e hemodinâmicos transoperatórios. Realizado regressão linear múltipla para determinar os parâmetros intraoperatórios associados de forma independente com a atividade das enzimas da cadeia respiratória mitocondrial nas três estruturas cerebrais. Foi avaliado também, o efeito de uma dose única (10 mg endovenoso) de dexametasona sobre as enzimas dos complexos I, II, IV e sobre a atividade da succinato desidrogenase da cadeira respiratória mitocondrial, nos mesmos tecidos, coletados até 4 horas após a infusão do corticoide. Resultados: A atividade das ECRM nas amostras do córtex temporal, amigdala e hipocampo foram diferentemente associadas às médias de saturação de oxigênio, hemoglogina sérica e pressão arterial média. Os intervalos de tempo da última crise convulsiva até o ato cirúrgico, do início da anestesia até a 8 coleta das amostras e a média de tempo de seu armazenamento em freezer também foram associadas com as atividades das ECRM. Após o controle das variáveis clínicas, demográficas, neuroradiológias, hemodinâmicas, bioquímicas e transoperatórias dos pacientes do grupo tratado com dexametasona (n=14) e não tratado (n=10); não foi evidenciado diferenças estatisticamente significativas entre as atividades das ECRM nas amostras analisadas. Conclusão: O controle rigoroso dos parâmetros hemodinâmicos, bioquímicos, tempo de armazenamento das amostras, tempo desde a última crise convulsiva e tempo de anestesia são necessários para minimizar vieses confundidores em estudos com amostras cerebrais de adultos coletados em neurocirurgias eletivas. Em condições cirúrgicas estressantes, uma dose farmacológica única de dexametasona não causou mudanças significativas nas atividades das ECRM no córtex temporal, amigdala e hipocampo de pacientes com ELTM-EH. Os resultados indicam uma resistência natural ou um mecanismo rápido de adaptação das enzimas para o efeito do glicocorticoide em estruturas límbicas e neocorticais destes pacientes. O desenho do estudo não é capaz de concluir sobre o efeito da atividade das ECRM na epileptogênese e ictogenese da ELTM-EH. Os nossos resulta dos são relevantes para entendermos a função mitocondrial cerebral durante estados de estresse agudo em pessoas saudáveis e em pacientes com doenças neuropsiquiátricas.<br> / Abstract : Background: Glucocorticoids are widely used in clinical practice. Physiologically there is a clear circadian rhythm of cortisol secretion and involvement in the acute stress response. It also has an important role in self-preservation and the homeostasis of the central nervous system. The brain has a high metabolic rate and neuronal functions are particularly sensitive to mitochondrial dysfunction. There is a lack of studies of the effect of corticosteroids on the mitochondrial respiratory chain enzymes (MRCE) in cortical and limbic structures in adult humans. The activity of these enzymes can be successfully evaluated in frozen samples. The epilepsy surgery to drug refractory treatment offers an ethical opportunity to study human brain tissue. Epilepsy surgeries are performed under hemodynamic and laboratory parameters close to normal but there are no studies that examined the association between these parameters and the activity of enzymes involved in mitochondrial respiratory chain. Methods: Study of 24 adults with diagnosis of mesial temporal lobe epilepsy related to hippocampus sclerosis (MTLE-HS) refractory to drug treatment. All patients underwent neurosurgery for disease control and during surgery samples were removed from the temporal cortex, the amygdala and the hippocampus. They were obtained medical history and biochemical and intraoperative hemodynamic parameters. Performed multiplelinear regression to determine the intraoperative parameter sindependently associated with the activity of MRCE in three brain estrtuturas. Also evaluated the effect of a single dose (10 mgintravenously) dexamethasone on enzymes complexes I, II and IV and the succinate dehydrogenase activity of mitochondrial respiratory chair, in the same samples, collected up to 4 hours after administration the corticosteroids. Results: The activity of MRCE in samples of temporal cortex, amygdala and hippocampus were associated diferentente the average oxygen saturation, serum hemoglogina and mean arterial pressure. The time intervals of the last convulsive crisis to the surgery, the beginning of anesthesia to the collection of samples and the average time of their storage in freezer were also associated with the activities of MRCE. After controlling for clinical, demographic, neuroradiological, hemodynamic, biochemical and transoperative parameters, patients in the group treated with dexamethasone(n=14) and untreated (n= 11) was not evidenced significant differences between the activities of the MRCE samples. Conclusion: Careful control of hemodynamic parameters, biochemical, storage time of the samples, time since last seizureand anesthetic time are needed to minimize confounding biasesin studies of brain samples of adults collected in electiveneurosurgery. In stressful surgical conditions, a singlepharmacological dose of dexamethasone did not causesignificant changes in activities of the MRCE in the temporalcortex, amygdala and hippocampus of patients with MTLE-EH.The results indicate a natural resistance or a quick adjustmentmechanism for enzymes to the effect of glucocorticoids on limbicand neocortical structures of these patients. The study design isunable to conclude on the effect of the activity of MRCE inepileptogenesis and ictogenesis the MTLE-EH. Our results arerelevant for understanding the brain mitochondrial function during acute stress states in healthy people and in patients with neuropsychiatric diseases.