Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Le potentiel des plantes pour la production hétérologue de protéines recombinantes est maintenant bien établi, mais des problèmes de stabilité et de modifications post-traductionnelles inadéquates des protéines persistent et nuisent au développement des plateformes végétales. Bien que les plantes aient la capacité d'effectuer la plupart des modifications post-traductionnelles nécessaires aux propriétés biologiques des protéines produites, il existe des différences subtiles mais significatives entre les modifications post-traductionnelles des protéines chez les mammifères et les plantes. Ces différences peuvent affecter les propriétés biologiques des protéines recombinantes végétales et entraver leur valeur commerciale. Parmi ces modifications, la N-glycosylation et la maturation protéolytique sont celles qui affectent le plus souvent les rendements et la qualité des produits recombinants. Afin d'étudier le potentiel des plantes à produire des glycoproteines complexes, nous avons exprimé en culture cellulaire de tabac Nicotiana tabacum cv BY-2 l'inhibiteur de protéases alpha 1-antichymotrypsine (AACT) humaine, une glycopotéine d'intérêt clinique. La protéine a été adressée vers le compartiment endomembranaire de sécrétion (RE, vacuole et apoplasme) ou exprimée directement dans le cytosol afin d'établir l'impact de la localisation cellulaire sur sa stabilité et sa glycosylation. Nos études ont montré que, bien qu'exprimé dans tous les compartiments cellulaires, le produit obtenu était plus hétérogène au sein du système endomembranaire, probablement en raison d'une maturation de la N-glycosylation et à une maturation protéolytique indue. Inversement, la protéine recombinante exprimée dans le cytosol, sous forme non glycosylée, montrait une plus grande stabilité. Des études d'immunolocalisation ont par ailleurs démontré que cette forme de l'AACT exprimée dans le cytosol montrait une double localisation nucléaire et cytoplasmique. L'AACT possède un site de liaison à l'ADN et une mutation de ce site a permis ici d'inhiber cette interaction et d'altérer en partie la localisation nucléaire. Ces derniers résultats suggèrent que la liaison à l'ADN est impliquée dans la rétention nucléaire de l'AACT. / Plants represent interesting production platforms for recombinant proteins of therapeutical value. While the proof of concept for protein production in plants is no longer a matter of debate, protein stability and post-translational modifications essential for biological activity pose, on the other hand, serious challenges to the development of plant factories. Plant cells can perform most protein post-translational modifications, but plant and mammalian proteins often present minor but significant differences, with a possible negative impact on their commercial value. To assess the potential of plants for the production of structurallycomplex mammalian proteins, we expressed human alphal-antichymotrypsin (AACT), a glycosylated serine protease inhibitor, in cultured BY-2 tobacco cells. The inhibitor was targeted to different subcellular compartments to assess the impact of cellular final destination on accumulation, stability and glycosylation of the resulting variants. Our results showed that AACT entering the secretory pathway was readily processed to lower molecular weight forms. This post-translational maturation apparently was the result of glycan maturation and proteolytic processing of the polypeptide along the secretory pathway. Intriguingly, cytosolic expression generated more stable proteins, although not glycosylated, that accumulated mostly in the nucleus. We further demonstrated that mutation of AACT DNA binding site partially altered the nucleus distribution thus suggesting a role of DNA binding in recombinant AACT nuclear retention. Taken together, these results illustrate the complex and unpredictable nature of recombinant protein posttranslational maturation, and stress the need for additional empirical data on the expression of complex glycopropteins in plant cells.

La cytokinèse est un processus fondamental prenant place à la fin de la mitose et permettant la séparation des deux cellules filles. Un défaut de cytokinèse peut mener à une ségrégation anormale des chromosomes et engendrer des phénomènes de cancer. Dans beaucoup d'organismes eucaryotes, la cytokinèse nécessite l'assemblage et la contraction d'un anneau d'actomyosine permettant la formation d'un sillon et la réorganisation de la membrane cellulaire au site de clivage. Dans la plupart de ces organismes, des protéines du cytosquelette appelées septines participent à la cytokinèse. Chez la levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae, cinq septines sont exprimées durant la mitose (Cdc3, Cdc10, Cdc11, Cdc12 et Shs1). Ces protéines ont la capacité de s'assembler en un anneau au niveau du site de bourgeonnement, lieu de séparation entre la cellule mère et la cellule fille. Cet anneau de septines permet la fixation et le recrutement de nombreuses protéines intervenant dans la cytokinèse. La dynamique des septines change durant le cycle cellulaire, ce qui a une importance dans la régulation de la cytokinèse. La stabilisation de cet anneau est accompagnée d'un changement du niveau de phosphorylation des septines, mais les kinases responsables de ces modifications restent inconnues. Les travaux de l'équipe de Simonetta Piatti ont mis en évidence un nouveau rôle de la GTPase Rho1 et de sa cible, la protéine kinase C (Pkc1), dans la régulation de la dynamique des septines. Le but de ce travail de thèse était de déterminer les voies moléculaires par lesquelles la protéine Pkc1 intervient dans le recrutement et la stabilisation de l'anneau de septines. Pour se faire nous avons purifié le complexe de septines chez la levure bourgeonnante en présence ou en absence de la protéine Pkc1 et nous l'avons analysé par spectrométrie de masse. Cette analyse nous a permis d'observer que le niveau de phosphorylation d'un cluster (îlot) de 5 sérines était diminué sur Shs1. L'alignement de séquence nous a permis de constater que ce domaine était conservé dans la septine Cdc11. Par ailleurs ces deux protéines sont connues pour jouer un rôle dans l'assemblage des filaments et la formation de l'anneau de septines. Il a déjà été observé qu'un mutant phosphomimétique du cluster de sérine de la septine Shs1 empêche la formation des filaments in-vitro. Nous avons voulu caractériser le rôle de ce cluster dans la protéine Cdc11 en créant un mutant non-phosphorylable (CDC11-9A) et un mutant phosphomimétique (CDC11-9D). De manière très évidente, le mutant phosphomimétique provoque des problèmes de cytokinèse dans les cellules dont le gène codant la protéine Shs1 a été supprimé. A l'inverse le mutant non-phosphorylable améliore le phénotype des cellules ne comportant pas Shs1. Ces résultats sont en parfait accord avec l'observation selon laquelle les protéines Shs1 et Cdc11 pourraient avoir des fonctions très similaires, et mettent en avant le rôle important du cluster de sérines phosphorylées de Cdc11 lors de la cytokinèse. Nous avons constaté que Pkc1 ne phosphoryle pas directement les septines, mais agit par l'intermédiaire de kinases et de phosphatases impliquées dans la régulation des septines. Nous avons pu montrer que Pkc1 régule l'interaction de Gin4 avec les septines, cette kinase étant connue pour sa capacité à phosphoryler Shs1. De plus, nous avons observé que Pkc1 impacte sur le niveau de phosphorylation des deux autres kinases de la même famille, Hsl1 et Kcc4. Par ailleurs, la délétion de PKC1 diminue drastiquement la quantité de protéines Kcc4 dans la cellule.L'absence de Pkc1 augmente également l'interaction entre les septines et Bni4, une sous-unité régulatrice de la phosphatase PP1. Nous avons également observé que Bni4-PP1 peut déphosphoryler Cdc11, expliquant la diminution de son niveau de phosphorylation en cas d'absence de la protéine Pkc1.Ces travaux mettent en évidence que Pkc1 est un nouveau régulateur majeur des septines dans la levure. / Cytokinesis is the last step of mitosis and is the fundamental process leading to the physical separation of two daughter cells. Defects in cytokinesis generate polyploid cells that are prone to chromosome missegregation and cancer development. In animal cells and fungi, cytokinesis requires the formation and contraction of an actomyosin ring that drives ingression of the cleavage furrow. Additional cytoskeletal proteins called septins contribute to cytokinesis. In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, five different septins are expressed during the mitotic cell cycle (Cdc3, Cdc10, Cdc11, Cdc12 and Shs1). All septins, except for Shs1, are essential for cell viability. Yeast septins form filaments that in turn organize into a ring at the bud neck, which is the constriction between the mother and the future daughter cell where cytokinesis takes place. The septin ring then expands into a rigid septin collar that acts as scaffold for cytokinesis by recruiting most cytokinetic proteins to the bud neck. Cell cycle-regulated changes in septin ring dynamics are thought to be important for its cytokinetic functions and formation of the rigid septin collar is accompanied by septin phosphorylation. However, the kinases responsible for these modifications have not been fully characterized. Unpublished data from our laboratory indicate that the Rho1 GTPase, which is essential for actomyosin ring formation and contraction, and its target protein kinase C (Pkc1) contribute to deposition and stabilization of the septin ring. Here, we have addressed how Pkc1 regulates septin ring deposition and/or stability. To this end, septin complexes were purified from yeast and analyzed by mass spectrometry, comparing wild type and pkc1Δ mutant cells. This mass spectrometry analysis clearly showed that phosphorylation of a cluster of residues in Shs1 decreased in the absence of Pkc1. Interestingly, we found that this cluster is conserved in the septin Cdc11, which together with Shs1 is known to play an important role in the assembly of high-order structures like filaments and rings. Phosphomimetic mutations of the phosphorylatable cluster in Shs1 have been previously shown to disrupt filament formation in-vitro. We therefore proceeded to mutagenise the same cluster in Cdc11, generating a phosphomimetic (CDC11-9D) and in a non-phosphorylatable mutant (CDC11-9A). Strikingly, the phosphomimetic CDC11-9D caused cytokinesis defects in cells lacking Shs1, whereas the non-phosphorylatable CDC11-9A allele partially rescued the sickness of shs1∆ mutant cells. These observations are in agreement with the notion that Cdc11 and Shs1 share overlapping functions and highlight an important role of the phosphorylatable cluster of Cdc11 for cytokinesis. We also found that Pkc1 does not phosphorylate septins directly, but rather regulates the activity of septin kinases and phosphatases. Consistently, we show that Pkc1 affects the interaction between septins and the bud neck kinase Gin4, which is known to interact with septins and to phosphorylate them. In addition, Pkc1 impacts on the phosphorylation of two additional bud neck kinases, Hsl1 and Kcc4, which are part of the same family of Nim1-related kinases as Gin4. In addition, PKC1 deletion leads to a dramatic decrease in the levels of Kcc4 , so that it is barely detected at the bud neck.Deletion of PKC1 affects also the interaction between septins and the Bni4 protein, which is a regulatory subunit for the PP1 phosphatase at the bud neck. In turn, we found that Bni4-PP1 modulates Cdc11 phosphorylation, thereby explaining how the latter is decreased in the absence of Pkc1. Altogether, our data strongly suggest that Pkc1 is a novel major regulator of septins in yeast.

La s��nescence cellulaire est une r��ponse �� un stress des cellules de mammif��re caract��ris��e par un arr��t durable du cycle cellulaire. Celle-ci peut ��tre d��clench��e par un dysfonctionnement des t��lom��res, des stress g��notoxiques et l'activation d'oncog��nes. La s��nescence constitue une puissante ligne de d��fense contre le d��veloppement de cancers et intervient aussi dans le vieillissement. Les cellules en s��nescence r��organisent leur g��nome par l'assemblage en h��t��rochromatine sous forme de SAHFs (senescence-associated heterochromatin foci). Nous avons mis en ��vidence que la d��sac��tylation globale de H4-K16Ac par la d��sac��tylase SIRT2 est impliqu��e dans l'assemblage de l'h��t��rochromatine en s��nescence. De plus, nous avons identifi�� une accumulation de variants d'histones H2A et H2B sp��cifiquement dans des cellules en s��nescence pr��sentant des dommages persistants �� l'ADN. Ces variants d'histone pourraient avoir des fonctions sp��cifiques dans ces cellules et pourraient repr��senter un biomarqueur du vieillissement in vivo.Mes travaux apportent des ��l��ments pour la compr��hension des r��les de l'information ��pig��n��tique dans la s��nescence cellulaire.

Bcl-xL est un oncogène surexprimé dans plusieurs types de cancers et qui joue un rôle important dans la survie cellulaire en régulant deux processus: l'apoptose et l'autophagie. Récemment, nous avons identifié l'existence d'une nouvelle forme de Bcl-xL qui subit une simple déamidation sur le résidu Asn52. Cette forme monodéamidée est exprimée en conditions contrôles et apparaît spontanément in vitro et in vivo. La déamidation de Bcl-xL produit un mélange de protéines contenant en position 52 soit un résidu Asp, soit un résidu isoAsp. L'objectif de cette thèse est de caractériser les fonctions de ces deux espèces protéiques, et de déterminer comment la monodéamidation de Bcl-xL modifie les fonctions de survie de cet oncogène. Nous avons montré que le mutant déamido-mimétique Bcl-xL N52DN66A conserve la même fonction anti-apoptotique que Bcl-xL native, mais présente une activité autophagique plus grande, et des propriétés oncogéniques et tumorigéniques altérées in vitro, ex vivo et in vivo. Nous avons étudié certains des mécanismes impliqués dans la régulation de l'autophagie et les propriétés oncogéniques comme la voie mTor, les voies de signalisation médiées par l'oncogène Ras, ainsi que l'activité métabolique et l'état souche des cellules. D'autre part, nous avons aussi développé des tests in vitro pour analyser les interactions établies par les formes déamidées de Bcl-xL comportant un isoAsp. L'ensemble de nos données permet de suggérer une régulation des fonctions de Bcl-xL par des mécanismes indépendants de l'apoptose, et renforce l'importance d'explorer les fonctions non apoptotiques de cette protéine pour mettre en évidence sa capacité à promouvoir la survie cellulaire et entraîner la progression du cancer. / Bcl-xL is an oncogene overexpressed in many types of cancer and which promotes cell survival by regulating two cellular processes : apoptosis and autophagy. We have recently identified a new form of this oncogene, which results from the deamidation of Asn52. This monodeamidated form is expressed under control conditions and is ubiquitously found in vitro and in vivo. Bcl-xL monodeamidation produces a mixture of proteins containing either an Asp residue or an IsoAsp residue in position 52. Our goal is to caracterise the functions of both species, and to determine how Bcl-xL monodeamidation modifies the survival functions of this oncogene. We have shown that the deamidomimetic mutant Bcl-xL N52DN66A retains the same anti-apoptotic function as the native protein, but exhibits enhanced autophagic activity and impaired clonogenic and tumorigenic properties in vitro, ex-vivo, and in vivo. We have studied certain of the mechanisms which can be involved in the regulation of autophagy and oncogenic properties of Bcl-xL such as mTor, Ras oncogene signaling pathway, metabolic activity measurement and stemness. We also implement in vitro assays to analyse the interactions established by isoAsp containing forms of Bcl-xL. Altogether our results support the view that deamidation regulates Bcl-xL oncogenic properties through apoptosis-independent mechanisms, and reinforce the importance of deciphering the non apoptotic functions of this protein to tackle its ability to sustain cell survival and drivecancer progression.

La conductivité hydraulique racinaire (Lpr) traduit la facilité du passage de l'eau au travers des racines. Ce paramètre, majoritairement contrôlé par l'activité de canaux hydriques membranaires (aquaporines), est modulable par diverses contraintes environnementales. Ce travail a permis de caractériser, sur un même organisme (Arabidopsis), les effets d'un ensemble de contraintes abiotiques et biotiques, représentatives de situations environnementales, sur la Lpr. Alors que la flagelline n'affecte pas la Lpr, les contraintes osmotiques (NaCl, mannitol), oxydantes (H2O2, NO) et nutritionnelles (carence en phosphate, en nitrate, culture des plantes en nuit prolongée) inhibent la Lpr. Par contre, la réalimentation en phosphate ainsi que l'addition de saccharose à des plantes cultivées en nuit prolongée stimulent la Lpr. Une approche phosphoprotéomique quantitative, basée sur l'analyse par MS de protéines microsomales racinaires purifiées à partir de plantes cultivées dans trois de ces contextes (NaCl, NO, phosphate) a permis de quantifier les variations d'abondance de l'ensemble des aquaporines racinaires ainsi que de leur état de MPT. D'un point de vue qualitatif, 22 aquaporines ont été identifiées dans la racine ainsi que plusieurs types de MPTs, incluant des nouveaux sites de phosphorylation (7), de méthylation (13 à 15), de formylation (4) et de déamidation (25 à 26). D'un point de vue quantitatif, cette étude a permis de conclure que les observations réalisées au niveau de la Lpr sont la résultante de mécanismes multifactoriels incluant l'état de phosphorylation des trois sites de l'extrémité C terminale de PIP2;1/2;2/2;3, l'état de phosphorylation de l'extrémité N terminale de PIP1;1/1;2, ainsi que les aquaporines TIPs. Ce travail permet donc de proposer de nouveaux mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de la Lpr en réponse à des contraintes de l'environnement / The water uptake capacity of plant roots (root hydraulic conductivity, Lpr) is mainly determined by water channels (aquaporins) and is modulated by environmental constraints. The present work characterised, in a unique organism (Arabidopsis), effects on Lpr of abiotic and biotic constraints representative of environmental situations. Whereas flagelline does not affect Lpr, osmotic (NaCl or mannitol), oxidative (H2O2 or NO) and nutritional (phosphate or nitrate starvation, prolonged night) stimuli inhibit Lpr. However, phosphate and sucrose resupply stimulate Lpr. A phosphoproteomics approach based on MS analysis of microsomal proteins extracted from roots of plants cultivated in different environmental constraints (NaCl, NO,phosphate starvation and resupply) allowed to quantify variations of abundance of roots aquaporins and of their PTMs. As a qualitative point of view, 22 aquaporins were identified in roots as well as several post-translational modifications including new sites of phosphorylation (7), methylation (13 to 15), formylation (4) and deamidation (25 to 26). From a quantitative point of view, the present work drove to the conclusion that the modulations of Lpr result from multifactorial mechanisms including the phosphorylation status of the C terminal part of PIP2;1/2;2/2;3 and of the N-terminal part of PIP1;1/1;2 and TIP aquaporins. This study proposes new molecular mechanisms implicated in Lpr regulation in response to various environmental situations.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La capacité d'adaptation des bactéries à leur environnement repose, entre autres choses, sur des mécanismes de transduction du signal. Ces mécanismes leur permettent de percevoir la nature et les modifications du milieu dans lequel elles évoluent et d'adapter en conséquence leur métabolisme et leur physiologie. L'un de ces mécanismes identifié chez les procaryotes repose sur un processus de régulation impliquant, suite à un stimulus extérieur, une modification réversible des protéines au niveau de résidus séryles et thréonyles par phosphorylation via les sérine/thréonine protéine-kinases (STPK). Chez les bactéries pathogènes, notamment Mycobacterium tuberculosis et Staphylococcus aureus, les STPKs sont impliquées dans la régulation du métabolisme central, de la division cellulaire, de la composition de la paroi et de la virulence. Mes travaux de thèse ont eu pour objectif d'approfondir les connaissances sur la régulation post-traductionnelle des protéines via les STPKs chez ces deux pathogènes humains. Nous avons ainsi identifié de nouveaux substrats des STPKs chez M. tuberculosis et S. aureus et caractérisé l'effet de la phosphorylation sur l'activité de ces substrats. L'ensemble de mes travaux de thèse met en avant le rôle important de la régulation par les STPKs de voies métaboliques diverses chez ces deux pathogènes. / To overcome the stressful conditions imposed during host infections, pathogens have evolved various protective and offensive responses that could be achieved through cascades of phosphorylation. Many of the encountered external stimuli are transduced via sensor kinases embeded within the bacterial membrane, allowing the pathogen to adapt and survive in hostile environments. In addition to the classical two-component systems, Staphylococcus aureus and Mycobacterium tuberculosis possess eukaryotic-like Serine/Threonine Protein-Kinases (STPK). It is becoming clear that in these two human pathogens, many of the STPKs are involved in the regulation of metabolic processes, division, cell wall composition, virulence, etc. Therefore, signalling through STPK phosphorylation has recently emerged as a key regulatory mechanism in pathogenic bacteria. Thus, to investigate the mechanisms of STPK-dependent regulation in M. tuberculosis and S. aureus, we identified and characterized novel endogenous phosphorylated substrates, and analyzed the impact of phosphorylation on their specific activity. Overall, the results presented herein emphasize the important role of STPK-dependent mechanisms in various metabolic pathways in these two pathogens.

La sénescence cellulaire est une réponse à un stress des cellules de mammifère caractérisée par un arrêt durable du cycle cellulaire. Celle-ci peut être déclenchée par un dysfonctionnement des télomères, des stress génotoxiques et l’activation d’oncogènes. La sénescence constitue une puissante ligne de défense contre le développement de cancers et intervient aussi dans le vieillissement. Les cellules en sénescence réorganisent leur génome par l’assemblage en hétérochromatine sous forme de SAHFs (senescence-associated heterochromatin foci). Nous avons mis en évidence que la désacétylation globale de H4-K16Ac par la désacétylase SIRT2 est impliquée dans l’assemblage de l’hétérochromatine en sénescence. De plus, nous avons identifié une accumulation de variants d’histones H2A et H2B spécifiquement dans des cellules en sénescence présentant des dommages persistants à l’ADN. Ces variants d’histone pourraient avoir des fonctions spécifiques dans ces cellules et pourraient représenter un biomarqueur du vieillissement in vivo.Mes travaux apportent des éléments pour la compréhension des rôles de l’information épigénétique dans la sénescence cellulaire. / Cellular senescence is a stress response of mammalian cells characterized by a stable cell proliferation arrest. It can be triggered by telomere dysfunction, genotoxic stress and oncogene activation. Cellular senescence acts as a natural barrier against cancer development and is involved in ageing. Senescent cells reorganize their genome by the assembly of chromatin into senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). We showed that SIRT2-mediated global deacetylation of H4-K16Ac is involved in heterochromatin assembly in senescence. Moreover, we identified the accumulation with time of specific H2A and H2B variants in senescence triggered by persistent DNA damage signaling. These histone variants could have specific functions in senescent cells and could be a useful ageing biomarker in vivo.This work provides novel insights into chromatin modification and epigenetic regulation in cellular senescence.

Ces vingt dernières années, les réactions d'insertion d'atomes ou de fragments moléculaires dans des liaisons C-H peu réactives ont fait l'objet de nombreuses études sans que les mécanismes de ces réactions aient pu être établis. Les enzymes de la superfamille « Radical-SAM » catalysent l'activation de leur substrat en utilisant un centre [4Fe-4S] et le co-substrat S-adénosylméthionine (SAM). Les enzymes d'insertion radicalaire constituent un sous-groupe de cette famille et contiennent un second centre fer-soufre impliqué, lui, dans l'activation du deuxième substrat rendant ainsi possible la réaction d'insertion par couplage radicalaire. Le travail présenté dans cette thèse concerne deux de ces enzymes, la première, RimO, est une méthylthiotransférase (MTTase) qui catalyse l'insertion d'un groupement thiométhyle en beta du résidu D89 de la protéine ribosomale S12 (β-ms-D89-S12). La seconde TYW1 ou 4-demethylwyosine synthase catalyse l'insertion d'un groupement acétyle dérivé du pyruvate dans une liaison C-H d'un groupement N-CH3 appartenant à une guanine spécifique de certains ARNt eucaryotes. Cette réaction d'insertion est suivie d'une cyclisation conduisant en plusieurs étapes à la wybutosine (yW), une base tricyclique importante pour la fidélité traductionnelle de la cellule. Dans ce travail il a été montré que les deux centres de cette famille d'enzyme coopèrent pour ces réactions et contrôlent l'utilisation des différents acteurs par des mécanismes redox originaux. / Over the last twenty years, the insertion reactions of atoms or molecular fragments into poorly reactive C-H bonds have been actively investigated but the details of their mechanisms remain largely unknown. Enzymes belonging to the "Radical-SAM" superfamily catalyze the activation of their substrate using a [4Fe-4S] in conjunction with the co-substrate S-adenosylmethionine (SAM). Radical insertion enzymes are a subgroup of this family and contain a second iron-sulfur cluster involved in the activation of the second substrate allowing the insertion reaction by radical coupling to take place. The work presented in this thesis is focusing on two enzymes, the first one, RimO is a methylthiotransferase (MTTase) that catalyzes the insertion of a thiomethyl group on the beta position of D89 residue of the ribosomal protein S12 (β-ms-D89-S12). The second one, TYW1, or 4-demethylwyosine synthase, catalyzes the insertion of the acetyl moiety of pyruvate into a C-H bond of a N-methyl group of a guanine derivative in some eukaryotic and archeal tRNAs. This insertion reaction leads to the formation of a tricyclic ring and through several steps to wybutosine (yW), a hypermodified nucleotide important for the translational fidelity of the cell. In this work we demonstrate that these radical inserting enzymes utilize the two iron-sulfur clusters to cooperate and that they control the different partners of the reaction by original redox mechanisms.

Les invertases de plantes (Invs) hydrolysent de manière irréversible le saccharose en fructose et glucose. En fonction de leur pH optimum et de leur localisation subcellulaire, les Invs sont classées en trois groupes : alcaline et neutre (A/N-Inv), vacuolaire (VI) et de paroi (CWI). Le but de notre étude a été de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les régulations post-traductionnelles d'une VI de Solanum lycopersicum (VINV). L'ADNc codant pour VINV a été cloné et exprimé dans le système hétérologue Pichia pastoris. Après purification, la caractérisation biochimique a été réalisée et a montré des résultats comparables à ceux obtenus précédemment pour d'autres Invs. La structure tridimensionnelle de VINV a été résolue par cristallographie aux rayons X à 2,75 Å et il s'agit de la première structure d'une VI décrite jusqu'ici. Des expériences de mutagénèse dirigée ont permis d'identifier certains acides aminés impliqués dans la catalyse : le nucléophile, le catalyseur acide/base, le stabilisateur d'état de transition et un résidu qui module le pKa du catalyseur acide/base. Par ailleurs, la régulation de l'activité de VINV a été étudiée. La N-glycosylation de VINV recombinante semble être importante pour la stabilité de la structure. De plus, l'activité VINV peut aussi être modulée par un inhibiteur protéique spécifique. Une approche de génomique fonctionnelle a été utilisée, et un inhibiteur d'invertase vacuolaire putatif (SolyVIF) de S. lycopersicum a été identifié dans la banque de données des Solanacées. L'ADNc codant pour SolyVIF a été cloné et exprimé dans le système hétérologue Escherichia coli Rosetta gami (DE3). / Plant invertases (Invs) hydrolyze irreversibly sucrose into fructose and glucose. Based on their pH optima and subcellular localization, Invs are categorized into three groups: alkaline and neutral invertase (A/N-Inv), vacuolar invertase (VI), and cell wall invertase (CWI). The goal of our study was to better understand mechanisms involved in the molecular regulation of a VI from Solanum lycopersicum (VINV) at post-translational levels. The VINV cDNA was cloned and heterologously expressed in Pichia pastoris. After purification, the biochemical characterization was performed and showed comparable results with those obtained previously for other characterized Invs. The three-dimensional structure of VINV was solved by X-ray crystallography to 2.75 Å resolution and it was the first structure of a plant VI described so far. Mutations experiments allowed to identify important amino acids: the nucleophile, the acid/base catalyst, the transition-state stabilizer and a residue that modulate pKa of the acid/base catalyst. Moreover, the regulation of VINV at different post-translational levels was studied. N-glycosylation of recombinant VINV seems to be important for structure stability. VINV activity can also be modulated by specific proteinaceous inhibitor. A functional genomics approach was used, and a putative vacuolar invertase inhibitor (SolyVIF) of S. lycopersicum was identified in the Solanaceae data bank. SolyVIF cDNA was cloned and heterologously expressed in Escherichia coli Rosetta gami (DE3). Recombinant protein was purified and characterized.