Este estudo teve como objetivo realizar estudos de custos sob a perspectiva do Sistema Único de Saúde em dois temas relevantes para a saúde da população: o manejo clínico da cardiopatia isquêmica e os exames de diagnóstico molecular para rastreamento precoce de câncer hereditário. O estudo contempla a revisão teórica de avaliações econômicas e custos em saúde que consistiram no arcabouço conceitual para os dois temas. Para o estudo na área de cardiopatia isquêmica foi realizada uma coorte restrospectiva com 330 pacientes acompanhados em ambulatório especializado para os quais foram identificados e valorados os recursos utilizados em nível ambulatorial e hospitalar.Os resultados são apresentados no artigo 1. Nos estudos para avaliação de método diagnóstico, o câncer hereditário foi o tema escolhido, realizando-se a identificação dos custos operacionais na realização de diferentes testes para verificação de mutação do gene BRCA1 no câncer de mama hereditário no artigo 2 e para a identificação da mutação do gene TP53 p.R337H relacionado à predisposição de câncer familial no artigo 3. Esses três estudos poderão subsidiar pesquisas em outras áreas clínicas e futuras avaliações de custo-efetividade de estratégias terapêuticas nos temas abordados. / This study aimed to do direct costs analysis from the perspective of the Brazilian public health system, covering two topics which are relevant to the health of the Brazilian population: the clinical management of ischemic cardiomyopathy and of molecular diagnostic technologies for early screening in cancer genetics. The study includes a theoretical review of economic evaluations and of appropriation of costs related to health that composed the conceptual framework for the two topics. For the study of ischemic cardiomyopathy, we did a retrospective cohort with 330 patients followed in a specialized ambulatory, for whom the resources utilized in ambulatory and in-patient level were identified and valuated were used as model. The results are presented in article 1. In the studies to evaluation of diagnosis method, hereditary cancer was the chosen subject and we did the identification of operational costs involved in the testing for the mutation of the BRCA1 gene in hereditary breast cancer in article 2 and in the testing for the mutation of the TP53 p.R337H gene, which relates to the predisposition to familial cancer, in article 3. These three studies may subsidize research in other clinical fields, as well as future cost-effectiveness evaluations of therapeutic strategies regarding the broached subjects.

Estudos relacionados à malária autóctone em regiões de baixa transmissão no Brasil ganham cada vez mais relevância científica e epidemiológica, pois revelam a manutenção desse cenário em regiões de Mata Atlântica remanescente. No sudeste do Estado de São Paulo, a ocorrência de surtos no município de Juquitiba tem sido foco de pesquisas sobre a prevalência de Plasmodium na população, com registros de casos assintomáticos. Relatos de ocorrência da doença ou da presença de anticorpos antiplasmodiais em gestantes nessa região não haviam sido descritos anteriormente. Embora infecções por P. falciparum em gestantes tenham sido amplamente abordadas na literatura, a interação entre P. vivax e P. malariae com esta coorte imunodeprimida foi pouco explorada até o momento. Nesse estudo nós monitoramos trimestralmente a circulação de Plasmodium em gestantes atendidas em cinco Unidades de Saúde de Juquitiba. Para isso foi empregado o diagnóstico por gota espessa e metodologias moleculares sensíveis para detecção do parasito, além de ensaios imunológicos para avaliação de parâmetros imunes humorais. Desse modo, foram detectadas infecções por P. vivax e P. malariae em gestantes, incluindo casos assintomáticos. A alta prevalência de anticorpos IgG nesta população mostrou importante exposição das gestantes ao Plasmodium. Em regiões com perfil semelhante ao apresentado neste estudo, o diagnóstico de malária poderia ser indicado no seguimento pré-natal / Studies related to autochthonous malaria in low transmission areas in Brazil have acquired scientific and epidemiological relevance, since they suggest continued transmission in remaining Atlantic Forest regions. In the Southeast of São Paulo State, outbreaks in the municipality of Juquitiba has been focus of studies on the prevalence of Plasmodium in the population, with reports of asymptomatic cases. Data on the occurrence of the disease or presence of antiplasmodial antibodies in pregnant women in this region were not described previously. Although P. falciparum infections in pregnant women have been widely addressed in the literature, the interaction of P. vivax and P. malariae with this immunocompromised cohort were poorly explored to date. In this study, we monitored quarterly the circulation of Plasmodium in pregnant women in five health facilities in Juquitiba. For this purpose, we performed diagnosis by thick blood film and sensitive molecular protocols for parasite DNA detection, as well immunological assays in order to evaluate humoral immune parameters. Through these tools, it was possible to detect infections due to P. vivax and P. malariae in pregnant women, including asymptomatic cases. The high prevalence of IgG antibodies showed a significant exposure of this population to Plasmodium. In regions with a similar profile presented in this study, the diagnosis of malaria might be indicated in prenatal care

Atualmente, um dos grandes problemas relacionados à leishmaniose é a falta de um diagnóstico específico capaz de indentificar e diferenciar espécies de Leishmania com rapidez e precisão. O desenvolvimento de métodos moleculares como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), possibilita que o diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) possa se tornar mais preciso e, eventualmente, de fácil execução, uma vez que limitações importantes relacionadas à sensibilidade e especificidade desta técnica ainda são descritas, principalmente quando se utiliza amostras clínicas. Com o intuito de melhor avaliar a eficiência da PCR para o diagnóstico da LVC, foram selecionadas diferentes amostras clínicas (baço, aspirado de linfonodo, pele sem lesão, pele com lesão e amostras de sangue) de 26 cães com sorologia positiva para leishmaniose submetidos à eutanásia pelo Serviço de Vigilância Epidemiológica do município de Embu das Artes - SP. Realizamos uma análise comparativa entre a PCR-RFLP kDNA-HaeIII e PCR-RFLP hsp70-BsaJI/EcoRII com dois métodos diagnósticos tradicionais (parasitológico direto, e cultura in vitro). Amostras clínicas de 28 cães com sorologia negativa para LVC da mesma região foram utilizadas como controle negativo das reações. Notamos que a PCR aprensentou maior sensibilidade em todas as amostras clínicas testadas quando comparadas aos métodos tradicionais. Os resultados apontam que a PCR-RFLP kDNA-HaeIII é a mais eficiente para o diagnóstico da LVC, com um índice de 96,15% de positividade nas amostras de pele com lesão. Quanto à discriminação da espécie de Leishmania envolvida na infecção, nossos resultados de PCR-RFLP kDNA-HaeIII indicam Leishmania chagasi-infantum como o agente etiológico envolvido na infecção e transmissão canina na cidade de Embu das Artes. Por outro lado, a análise da PCR em Tempo Real (qPCR), mostrou que algumas amostras de sangue não apresentavam o padrão associado à Leishmania chagasi-infantum, podendo indicar uma co-infecção com outras parasitoses caninas. Nosso grupo também acompanhou 184 crianças de 4 a 10 anos de idade (população de risco) residentes da mesma região de transmissão autóctone da doença canina, como também foi realizado um levantamento das espécies de flebotomíneos da região (pela SUCEN). Até o momento, não foi encontrado nenhum caso da doença humana, nem a principal espécie transmissora do parasito (Lutzomiya longipalpis). Acreditamos que esses resultados possam contribuir significativamente para aprimorar o diagnóstico e a identificação das espécies Leishmania na LVC. / Currently, one of the major problems related to leishmaniasis is the lack of a specific diagnosis capable of identifying and differentiating Leishmania species quickly and accurately. The development of molecular methods such as Polymerase Chain Reaction ( PCR ) allows the diagnosis of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) to become more accurate and eventually, easy to perform, since that important limitations in terms of sensitivity and specificity of this technique are being described especially when using clinical samples. In order to better evaluate the efficiency of PCR for the diagnosis of CVL, we selected different clinical samples (spleen, lymph node aspirate, skin with and without lesions and blood samples) from 26 dogs with positive serology for leishmaniasis submitted to euthanasia by the Agency of Epidemiological Surveillance of Embu das Artes - SP. Therefore, we performed a comparative analysis between the kDNAPCR-RFLP HaeIII and hsp70PCR-RFLP BsaJI/EcoRII with two traditional diagnostic methods (direct parasitological test, and in vitro culture). Additionally, clinical samples from 28 dogs with negative serology for CVL in the same region were used as negative reactions control. We noted that the PCR showed greater sensitivity in all clinical samples tested when compared with traditional methods. The results indicate that the kDNAPCR-RFLP HaeIII is the most efficient test for the diagnosis of CVL, with a positivity index of 96.15 % in skin lesions samples. Related to the discrimination of the Leishmania species involved in the infection, our results of kDNAPCR-RFLP HaeIII indicate Leishmania infantum chagasi as the agent involved in canine infection in Embu das Artes city. Moreover, the analysis of real-time PCR (qPCR) showed that some blood samples has not showed the same pattern associated with Leishmania infantum chagasi suggesting a possible co-infection with other canine parasite. Our group also followed 184 children between 4 to 10 years old (risk population) living in the same region of autochthonous transmission of canine disease, as well a survey was conducted on the sandfly species in the region (by SUCEN). So far, we found no human infection, nor the main species involved in the transmission of the parasite (Lutzomyia longipalpis). We believe that these results can significantly contribute to the improvement of the diagnosis and identification of Leishmania species involved in the CVL worldwide.

O diagnóstico etiológico da hanseníase, causada pelo bacilo Mycobacterium leprae, pode ser difícil na forma paucibacilar (PB), na qual os exames têm baixa sensibilidade na detecção do bacilo. A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem se mostrado sensível para o diagnóstico da hanseníase. Amostras de linfa são rapidamente obtidas em campo e pouco invasivas. O objetivo principal deste trabalho foi comparar os resultados da PCR com 4 pares de primers (Ag85B, MntH, Pra-36kDa e RLEP), descritos na literatura para o diagnóstico da hanseníase, utilizando-se DNA extraído de amostras de linfa de orelhas, cotovelos e joelhos, coletadas em papel filtro. Além da comparação dos resultados da PCR com os 4 pares de primers, também foram comparados à baciloscopia de linfa no grupo MB e ao ELISA anti-PGL-1 nos grupos PB e MB, utilizando-se o teste de qui-quadrado de McNemar para amostras pareadas. Trinta e nove pacientes com hanseníase [12 (30,76%) na forma PB e 27 (69,23%), multibacilar (MB)], virgens de tratamento, atendidos consecutivamente no período de 2006 a 2010, foram incluídos. A detecção de bacilos à baciloscopia e na biópsia de pele foi confirmada em 55,55% e em 100% dos pacientes MB, respectivamente; e 67,56% dos pacientes (33,33% dos PB e 84% dos MB) apresentaram títulos de anti-PGL1 acima do cut-off no ELISA. A PCR foi positiva em 70,37% das 27 amostras de pacientes MB, considerando-se o resultado conjunto dos 4 primers (7,69% com Ag85B; 11,11% com MntH; 12,5% com Pra-36kDa; e 66,66% com RLEP). Uma amostra se mostrou positiva com os primers Ag85B, MntH e Pra-36kDa e negativa com RLEP. Não houve amplificação no grupo PB, portanto, os resultados do ELISA anti-PGL-1, embora não confirmatórios da etiologia, foram superiores para o diagnóstico da hanseníase PB. No grupo MB, os resultados da PCR com RLEP foram superiores àqueles com MntH, Ag85B e Pra- 36kDa (P<0,001); comparando-se MntH com Ag85B e Pra-36kDa (P=0,317; P=1,0, respectivamente), e Ag85B com Pra-36kDa (P=0,564), os resultados foramsemelhantes. A frequência de positividade da baciloscopia foi maior que a da PCR com MntH (P=0,001), Ag85B (P<0,001) e Pra-36kDa (P=0,004); semelhante ao RLEP (P=0,083); e menor, quando comparada ao resultado combinado dos 4 primers (P=0,046). Ainda no grupo MB, a frequência de positividade anti-PGL-1 foi superior à da PCR com MntH, Ag85B e Pra-36kDa (P<0,001) e à baciloscopia (P=0,011); porém, foi semelhante à PCR com RLEP (P=0,059) ou com os 4 primers combinados (P=0,102). A maior frequência de positividade da PCR com primers RLEP é explicada pela presença de múltiplas cópias RLEP no genoma do bacilo, aumentando a chance do anelamento e amplificação. Existe complementariedade entre os resultados com diferente primers, podendo uma mesma amostra apresentar diferentes resultados a depender da escolha destes. A frequência da positividade da PCR com par de primers RLEP, em amostras de linfa coletadas em papel filtro, mostrou-se semelhante à da baciloscopia e do ELISA anti-PGL-1 nos pacientes MB. Assim, encoraja-se seu emprego em trabalhos de campo devido à facilidade da coleta e possibilidade de remessa dos papéis filtro para centros de referência. / Leprosy\'s etiologic diagnosis may be difficult in paucibacillary (PB) patients, in which laboratory tests have low sensitivity for the detection of the causative agent, Mycobaterium leprae. Polymerase chain reaction (PCR) has shown good sensitivity in leprosy diagnosis. Lymph samples are readily acquired in the field and minimally invasive. The main objective of this paper is to compare the results of PCR with four sets of primers previously described in the literature (Ag85B, MntH, Pra-36kDa and RLEP), using DNA extracted from lymph samples from ear lobes, elbows and knees, stored in filter paper. We also aim to compare the PCR results to lymph bacilloscopy in the multibacillary (MB) group and to anti-PGL-1 serology in PB and MB group, using McNemar\'s chi-square test for paired samples. 39 treatment-naïve leprosy patients [12 (30.76%) PB and 27 (69.23%) MB] seen in the outpatient clinic of a referral center were included. Bacilli were detected in 55.55% of bacilloscopy samples and 100% of biopsies from MB patients; 67.56% of all patients (33.33% of PB and 84% of MB) had anti-PGL1 titers above the method\'s cut-off. PCR was positive in 70.37% of the 27 MB patients, taking in consideration the 4 primers combined (7,69% with Ag85B; 11,11% with MntH; 12,5% with Pra-36kDa; e 66,66% with RLEP). One sample was positive for primers Ag85B, MntH e Pra-36kDa and negative for RLEP. There was no DNA amplification in the PB group, in which antiPGL-1 ELISA, although not confirmatory of the disease, was superior in the diagnosis. In the MB group, PCR with RLEP primer was superior to Ag85B, MntH and Pra-36kDa (P<0,001); between MntH and Ag85B (P=0,317); MntH and Pra- 36kDa (P=1,0); and Ag85B and Pra-36kDa (P=0,564), results were similar. Bacilloscopy\'s frequency of positivity was greater than PCR with Ag85B (P<0,001), MntH (P=0,001) and Pra-36kDa (P=0,004); similar to RLEP (P=0,083); and inferior to the results of the four primers combined (P=0,046). Still in the MB group, anti-PGL-1 serology was superior to PCR with Ag85B, MntH and Pra-36kDa (P<0,001) and to bacilloscopy (P=0,011); its results were similar to PCR with RLEP (P=0,059) or with the four primers combined (P=0,102). RLEP\'s greater positivity is probably due to thepresence of multiple copies of the target DNA in the bacillus\' genome, enhancing the chances of primer annealing. The primers showed complementarity; therefore one sample may display different outcomes depending on primer choice. The frequency of positivity of PCR with RLEP primers, in lymph samples stored in filter paper, was similar to bacilloscopy and serology amongst MB patients. Hence, we encourage its use in fieldwork as a practical and easy method for acquiring samples that can be shipped for further processing in referral centers.

O vírus Epstein-Barr (EBV) é um herpes vírus humano que estabelece infecção persistente e está associado com várias doenças, como mononucleose infecciosa, linfomas, carcinoma de nasofaringe e leucoplasia pilosa, afetando principalmente pacientes imunossuprimidos. Leucoplasia pilosa é uma lesão epitelial não maligna associada ao EBV que ocorre principalmente nas bordas laterais de língua. É comum em indivíduos infectados pelo HIV e em pacientes que recebem medicações imunossupressoras. Histopatologicamente, a leucoplasia pilosa é caracterizada por hiperparaqueratose, acantose, células semelhantes a coilócitos ou células balonizantes, e discreto ou nenhum infiltrado inflamatório. As características histopatológicas da lesão não são patognomônicas, sendo necessária a detecção do EBV para o diagnóstico final de acordo com vários autores. O objetivo desse estudo foi verificar a presença do EBV, por meio da técnica de hibridização in situ, em lesões diagnosticadas histológicamente como sugestivas de leucoplasia pilosa e comparar esses resultados com algumas características histopatológicas.Trinta e seis espécimes foram selecionados do Serviço de Patologia Cirúrgica da Disciplina de Patologia Bucal. Todos foram submetidos à reação de hibridização in situ, e 27 casos (75%) foram positivos, confirmando o diagnóstico anterior. Nenhuma das características histológicas analisadas puderam se correlacionar com a hibridização in situ. Pudemos concluir que a análise histopatológica ao H&E não pode substituir a hibridização in situ no diagnóstico final da leucoplasia pilosa / Epstein-Barr virus (EBV) is a human herpesvirus that estabilishes persistent infection and is associated with many diseases, including infectious mononucleosis syndrome, lymphomas, nasopharyngeal carcinoma, and oral hairy leukoplakia, affecting principaly immunocompromised patients. Oral hairy leukoplakia is a non malignant, EBV-associated, epithelial disease that typically occurs on the lateral tongue borders. It is common in individuals with HIV infection and in patients receiving iatrogenic immunossupression. Histologically, hairy leukoplakia is characterized by shaggy hyperparakeratosis, acanthosis, “koilocyte"-like or ballon cells, and a paucity of inflamation. The histologically features of hairy leukoplakia are not patognomonic, and for the many authors definitive diagnosis requires demonstration of EBV. The aim of this study were to verify the presence of EBV, by in situ hibridization, in lesions diagnosed histologically suggestive of hairy leukoplakia and compare this results with histologically features. Thirty six biopsy specimens from lesions histologically suggestive of hairy leukoplakia were selected from the Department of Stomatology’s Oral Pathology Service archives. EBV in situ hibridization was performed on all 36 cases, and 27 cases (75%) were positive, confirmed the diagnose of oral hairy leukoplakia. Histopatologically features did not agree well with EBV in situ hibridization. We concluded that H&E histopathology should not be used as a substitute for in situ hibridization in the definitive diagnosis of hairy leukoplakia

Estudos relacionados à malária autóctone em regiões de baixa transmissão no Brasil ganham cada vez mais relevância científica e epidemiológica, pois revelam a manutenção desse cenário em regiões de Mata Atlântica remanescente. No sudeste do Estado de São Paulo, a ocorrência de surtos no município de Juquitiba tem sido foco de pesquisas sobre a prevalência de Plasmodium na população, com registros de casos assintomáticos. Relatos de ocorrência da doença ou da presença de anticorpos antiplasmodiais em gestantes nessa região não haviam sido descritos anteriormente. Embora infecções por P. falciparum em gestantes tenham sido amplamente abordadas na literatura, a interação entre P. vivax e P. malariae com esta coorte imunodeprimida foi pouco explorada até o momento. Nesse estudo nós monitoramos trimestralmente a circulação de Plasmodium em gestantes atendidas em cinco Unidades de Saúde de Juquitiba. Para isso foi empregado o diagnóstico por gota espessa e metodologias moleculares sensíveis para detecção do parasito, além de ensaios imunológicos para avaliação de parâmetros imunes humorais. Desse modo, foram detectadas infecções por P. vivax e P. malariae em gestantes, incluindo casos assintomáticos. A alta prevalência de anticorpos IgG nesta população mostrou importante exposição das gestantes ao Plasmodium. Em regiões com perfil semelhante ao apresentado neste estudo, o diagnóstico de malária poderia ser indicado no seguimento pré-natal / Studies related to autochthonous malaria in low transmission areas in Brazil have acquired scientific and epidemiological relevance, since they suggest continued transmission in remaining Atlantic Forest regions. In the Southeast of São Paulo State, outbreaks in the municipality of Juquitiba has been focus of studies on the prevalence of Plasmodium in the population, with reports of asymptomatic cases. Data on the occurrence of the disease or presence of antiplasmodial antibodies in pregnant women in this region were not described previously. Although P. falciparum infections in pregnant women have been widely addressed in the literature, the interaction of P. vivax and P. malariae with this immunocompromised cohort were poorly explored to date. In this study, we monitored quarterly the circulation of Plasmodium in pregnant women in five health facilities in Juquitiba. For this purpose, we performed diagnosis by thick blood film and sensitive molecular protocols for parasite DNA detection, as well immunological assays in order to evaluate humoral immune parameters. Through these tools, it was possible to detect infections due to P. vivax and P. malariae in pregnant women, including asymptomatic cases. The high prevalence of IgG antibodies showed a significant exposure of this population to Plasmodium. In regions with a similar profile presented in this study, the diagnosis of malaria might be indicated in prenatal care

O vírus Epstein-Barr (EBV) é um herpes vírus humano que estabelece infecção persistente e está associado com várias doenças, como mononucleose infecciosa, linfomas, carcinoma de nasofaringe e leucoplasia pilosa, afetando principalmente pacientes imunossuprimidos. Leucoplasia pilosa é uma lesão epitelial não maligna associada ao EBV que ocorre principalmente nas bordas laterais de língua. É comum em indivíduos infectados pelo HIV e em pacientes que recebem medicações imunossupressoras. Histopatologicamente, a leucoplasia pilosa é caracterizada por hiperparaqueratose, acantose, células semelhantes a coilócitos ou células balonizantes, e discreto ou nenhum infiltrado inflamatório. As características histopatológicas da lesão não são patognomônicas, sendo necessária a detecção do EBV para o diagnóstico final de acordo com vários autores. O objetivo desse estudo foi verificar a presença do EBV, por meio da técnica de hibridização in situ, em lesões diagnosticadas histológicamente como sugestivas de leucoplasia pilosa e comparar esses resultados com algumas características histopatológicas.Trinta e seis espécimes foram selecionados do Serviço de Patologia Cirúrgica da Disciplina de Patologia Bucal. Todos foram submetidos à reação de hibridização in situ, e 27 casos (75%) foram positivos, confirmando o diagnóstico anterior. Nenhuma das características histológicas analisadas puderam se correlacionar com a hibridização in situ. Pudemos concluir que a análise histopatológica ao H&E não pode substituir a hibridização in situ no diagnóstico final da leucoplasia pilosa / Epstein-Barr virus (EBV) is a human herpesvirus that estabilishes persistent infection and is associated with many diseases, including infectious mononucleosis syndrome, lymphomas, nasopharyngeal carcinoma, and oral hairy leukoplakia, affecting principaly immunocompromised patients. Oral hairy leukoplakia is a non malignant, EBV-associated, epithelial disease that typically occurs on the lateral tongue borders. It is common in individuals with HIV infection and in patients receiving iatrogenic immunossupression. Histologically, hairy leukoplakia is characterized by shaggy hyperparakeratosis, acanthosis, “koilocyte”-like or ballon cells, and a paucity of inflamation. The histologically features of hairy leukoplakia are not patognomonic, and for the many authors definitive diagnosis requires demonstration of EBV. The aim of this study were to verify the presence of EBV, by in situ hibridization, in lesions diagnosed histologically suggestive of hairy leukoplakia and compare this results with histologically features. Thirty six biopsy specimens from lesions histologically suggestive of hairy leukoplakia were selected from the Department of Stomatology’s Oral Pathology Service archives. EBV in situ hibridization was performed on all 36 cases, and 27 cases (75%) were positive, confirmed the diagnose of oral hairy leukoplakia. Histopatologically features did not agree well with EBV in situ hibridization. We concluded that H&E histopathology should not be used as a substitute for in situ hibridization in the definitive diagnosis of hairy leukoplakia

Submitted by Celso Magalhaes (celsomagalhaes@ufrrj.br) on 2017-10-19T13:49:16Z No. of bitstreams: 1 2016 - Claudia Bezerra da Silva.pdf: 8032175 bytes, checksum: ef71dd2a0e7801e9000e116c822a3a00 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-19T13:49:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016 - Claudia Bezerra da Silva.pdf: 8032175 bytes, checksum: ef71dd2a0e7801e9000e116c822a3a00 (MD5) Previous issue date: 2016-03-11 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / and investigate the circulation of this agent in dogs in the Itaguai microregion, Rio de Janeiro, Brazil, and dogs and ticks in two provinces of the island of Cuba, analyzing epidemiological aspects associated with infections caused by this bacterium in dogs. A new real-time polymerase chain reaction method (qPCR) was patterned to target the citrate synthase gene (gltA) for the identification of A. platys in naturally infected dogs. The primers and probe were designed to amplify a fragment of 84 base pairs based on gltA gene sequences of A. platys available in GenBank. 186 blood samples of dogs from Itaguai microregion, Rio de Janeiro, Brazil, were tested by qPCR. The same samples were tested by cytology and nested polymerase chain reaction (nPCR, 16S rDNA) to determine the performance of qPCR front of these techniques. 17.20% of the samples tested positive by qPCR were significantly more than that detected by nPCR (13.98%). The qPCR technique was more specific than cytology, due to false-positive results obtained by optical microscopy. The prevalence of A. platys in dogs from Itaguai microregion was 14.4%. Dogs less than six months, infested by ticks, that spend the most of the time restrict to domestic environment and without shelter are factors associated with infection by this hemoparasite in dogs in the study area. During research, A. platys held in Cuba, 100 blood samples were collected from residents dogs in four cities located in the provinces of Havana and Mayabeque. When inspecting the animals, found ticks were collected, identified and carefully grouped, forming a total of 49 pools. DNA extracted from blood samples from dogs and ticks were subjected nPCR (16S rDNA). Positive samples in nPCR were also subjected to conventional PCR (gltA gene), and the products were sequenced. Only the species Rhipicephalus sanguineus sensu lato was found in Cuban dogs and 10.2% (n=5/49) of these ticks added to 16.0% (n=16/100) dogs were considered positive for A. platys. All sequences analyzed of the gltA and 16S rDNA genes, respectively, showed a 99-100% identity with sequences from A. platys reported in other countries. Phylogenetic analysis showed two clusters defined for the 16S rDNA gene and three clusters defined for the gltA gene. Based on the gltA gene, the deduced amino acid sequence showed two points of non-synonymous mutations at positions 88 and 168 compared to the reference sequence DQ525687. A preliminary study on the epidemiological aspects associated with infection with A. platys showed no statistical association with the variables studied (p> 0.05). This study also to report the first evidence of A. platys in both dogs and ticks in Cuba also presents for the first time the development of a new qPCR method that contributes to the advancement of research involving A. platys. The epidemiological study in Brazil allowed us to identify significant factors in the occurrence of canine anaplasmosis, while in Cuba, it can be concluded that more research is needed to assess what the deciding factors in the transmission and spread of A. platys in that country. / platys, e investigar a circula??o deste agente em c?es na microrregi?o de Itagua?, Rio de Janeiro, Brasil, e c?es e carrapatos em duas prov?ncias da ilha de Cuba, analisando aspectos epidemiol?gicos associados ? infec??o causada por esta bact?ria em c?es. Um novo m?todo de rea??o em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) foi padronizado com alvo no gene citrato sintase (gltA) para a identifica??o de A. platys em c?es naturalmente infectados. Os oligoiniciadores e a sonda foram desenhados para amplificar um fragmento de 84 pares de base baseado em sequ?ncias do gene gltA de A. platys dispon?veis no GenBank. 186 amostras de sangue de c?es da microrregi?o de Itagua?, Rio de Janeiro, Brasil, foram testados pela qPCR. As mesmas amostras foram testadas pela citologia e rea??o em cadeia da polimerase nested (nPCR, 16S rDNA) para determinar o desempenho da qPCR frente ? essas t?cnicas. 17,20% das amostras testadas pela qPCR foram positivas, significativamente mais do que detectado pela nPCR (13,98%). A t?cnica de qPCR foi mais espec?fica que a citologia, em virtude dos resultados falsopositivos obtidos pela microscopia ?ptica. A preval?ncia de A. platys em c?es da microrregi?o de Itagua? foi de 14,4%. C?es com menos de seis meses, infestados por carrapatos, que possam maior tempo restrito ao ambiente dom?stico e sem abrigo s?o fatores associados a infec??o por este hemoparasito em c?es na regi?o do estudo. Durante investiga??o de A. platys realizada em Cuba, 100 amostras de sangue foram coletadas de c?es residentes em quatro cidades localizadas nas prov?ncias de Habana e Mayabeque. Ao inspecionar os animais, carrapatos encontrados foram coletados, identificados e criteriosamente agrupados, formando um total de 49 pools. Amostras de DNA extra?das do sangue dos c?es e de carrapatos foram submetidas a nPCR (16S rDNA). Amostras positivas na nPCR foram tamb?m submetidas a PCR convencional (gene gltA), e os produtos foram sequenciados. Somente a esp?cie Rhipicephalus sanguineus sensu lato foi encontrada em c?es cubanos, e 10,2% (n=5/49) desses carrapatos somado aos 16,0% (n=16/100) de c?es foram considerados positivos para A. platys. Todas as sequ?ncias analisadas dos genes gltA e 16S rDNA, respectivamente, mostraram uma identidade de 99-100% com sequ?ncias de A. platys reportadas em outros pa?ses. A an?lise filogen?tica mostrou dois clusters definidos para o gene 16S rDNA e tr?s clusters definidos para o gene gltA. Com base no gene gltA, a sequ?ncia de amino?cidos deduzidos demonstrou dois pontos de muta??es n?o-sin?nimas nas posi??es 88 e 168 comparados com sequ?ncia de refer?ncia DQ525687. Um estudo preliminar sobre os aspectos epidemiol?gicos associados com a infec??o por A. platys demonstrou nenhuma associa??o estat?stica com as vari?veis avaliadas (p > 0,05). O presente estudo al?m de relatar a primeira evid?ncia de A. platys em ambos c?es e carrapatos em Cuba, tamb?m apresenta pela primeira vez o desenvolvimento de um novo m?todo de qPCR que contribui para o avan?o da pesquisa envolvendo A. platys. O estudo epidemiol?gico realizado no Brasil permitiu identificar fatores importantes na ocorr?ncia da anaplasmose canina, enquanto em Cuba, pode-se concluir que mais investiga??es s?o necess?rias para avaliar quais os fatores decisivos na transmiss?o e dispers?o de A. platys nesse pa?s.

<p>Uvod: Virusni gastrointestinalni sindrom je aktuelni zdravstveni problem u celom svetu. To važi kako u razvijenim zemljama, tako i u zemljama u razvoju, a posebno u nerazvijenim zemljama, gde je drugi po redu uzrok mortaliteta. Nagli početak bolesti, praćen pojavom velikog broja tečnih stolica, mukom, povraćanjem, bolovima u stomaku, temperaturom, malaksalo&scaron;ću, ima za posledicu dehidrataciju. U svim starosnim grupama obolelih, a naročito kod sasvim male dece, starih i imunodeficitarnih osoba može da dođe do smrtnog ishoda, ukoliko se brzo ne postavi tačna etiolo&scaron;ka dijagnoza bolesti i ne pristupi se odmah nadoknadi vode i elektrolita, kao i primeni svih ostalih mera simptomatske terapije. Brzo postavljena tačna dijagnoza, &scaron;to se najbolje postiže real-time PCR testom, sprečava pojavu komplikacija, pa i fatalnog ishoda bolesti. Istovremeno, omogućava primenu odgovarajućih epidemiolo&scaron;kih mera da se spreči nastanak epidemija i njihovo &scaron;irenje. Cilj ovog istraživanja bio je da se tačno utvrdi incidenca virusnog gastrointestinalnog sindroma u Vojvodini i učestalost pojave epidemijskog i sporadičnog javljanja ove bolesti. Cilj je bio i postavljanje algoritma za primenu real-time PCR testa u dijagnostici virusnog gastrointestinalnog sindroma u budućem radu. Isto tako, cilj je bio da se molekularnom analizom, sekvenciranjem delova genoma pozitivnih uzoraka stolice, izvr&scaron;i genetska tipizacija i odredi filogenetska pripadnost virusa. Materijal i metode: Tokom petogodi&scaron;njeg istraživanja molekularnim real-time PCR testom pregledane su 1003 obolele osobe sa simptomima virusnog dijarealnog sindroma, starosti od mesec dana do preko 90 godina. Pregledani su na rota, noro, astro i enterične adenoviruse. Na osnovu podataka iz anketnih upitnika i istorija bolesti, detaljno su analizirani svi klinički pokazatelji (javljanje bolesti tokom godine, trajanje bolesti, simptomi). Procena težine kliničke slike vr&scaron;ena je prema Vesikari skali. Svi podaci su upoređivani prema vrsti virusnog uzročnika, prema starosti obolelih, godinama trajanja istraživanja i epidemijskom i sporadičnom javljanju oboljenja. Dobijeni podaci su statistički obrađeni, tabelarno i grafički prikazani. Rezultati: U petogodi&scaron;njem periodu real-time PCR testom pregledan je uzorak od 1003 obolele osobe različite starosti na 4 virusna uzročnika dijarealnog sindroma (rota, noro, astro i enterične adenoviruse). Virusni dijarealni sindrom dokazan je kod 709 obolelih (70,69%). Najče&scaron;će su dokazane rotavirusne infekcije u 28,81%. Statistički značajno najče&scaron;će rotavirusi su bili utvrđeni kod dece do 5 godina (38,90%), ali u visokom procentu i kod dece uzrasta 6 do 14 godina (24,83%). Deca mlađa od 5 godina imala su statistički značajno najtežu kliničku sliku, bila su če&scaron;će hospitalizovana i imala su statistički značajno vi&scaron;u temperaturu. Pored vi&scaron;e temperature kod obolelih od rotavirusa, klinička slika je kod ovih bolesnika bila teža i bolest je duže trajala nego kod obolelih od drugih virusa. Norovirusna infekcija je dokazana u 23,03% obolelih i to statistički značajno če&scaron;će kod odraslih osoba, starijih od 20 godina. Od kliničkih simptoma kod ovih bolesnika statistički značajno če&scaron;će su dokazani muka, povraćanje i bolovi u stomaku, nego kod obolelih od drugih virusa. Norovirusi su značajno če&scaron;će bili uzročnici epidemijskog javljanja bolesti. Astrovirus je dokazan kod znatno manjeg broja obolelih (u 2,29%) i to samo kod dece do 5 godina i dece uzrasta 6 do 14 godina. Infekcija izazvana enteričnim adenovirusima dokazana je kod 13,36% bolesnika. Njače&scaron;će je utvrđena kod dece uzrsta do 5 godina i 6 do 14 godina. Oboleli od adenovirusa imali su statistički značajno blažu kliničku sliku bolesti. Dva virusna uzročnika u uzorku stolice dokazana su u 3,19% osoba, obično u toku epidemijskog javljanja bolesti. Ovi bolesnici su imali bitno težu kliničku sliku. Najvi&scaron;e obolelih od dijarealnog sindroma bilo je u hladnim mesecima, mada su dijagnostikovani i tokom cele godine. U petogodi&scaron;njem periodu utvrđene su 22 epidemije u kolektivima i 9 porodičnih epidemija. Epidemijsko javljanje bolesti bilo je statistički značajno najče&scaron;će kod najstarijih bolesnika (starijih od 50 godina), a sporadično javljanje bilo je statističko značajno najče&scaron;će kod dece. U cilju potvrde tačnosti dijagnostike virusa u ispitivanim uzorcima real-time PCR testom, genotipizacije, kao i detaljnije molekularne analize, izabrani su reprezentativni uzorci pozitivni na rota, noro, astro ili adenoviruse. Delovi genoma ovih uzoraka su amplifikovani, a zatim sekvencirani. Sekvencirani izolati rotavirusa pripadali su grupi A i tipovima G1P[8], G2P[4], G3P[8] i G9P[8]. Sekvencirani izolati norovirusa pripadali su genogrupi I tipu 2, zatim genogrupi II tipovima 1, 2, 4 i 17. Sekvencirani izolati astrovirusa pripadali su grupi klasičnih astrovirusa i tipovima 1, 4 i 5. Sekvencirani izolati adenovirusa pripadali su grupi F i tipovima 40 i 41, kao i grupi C tipu 2. Pripadnost dobijenih sekvenci u ovom istraživanju, dodatno je potvrđena izradom filogenetskog stabla za sekvence pozitivne na rota, noro, astro ili adenoviruse. Zaključak: Incidenca virusnog dijarealnog sindroma u Vojvodini (70,69%) vrlo je visoka i vi&scaron;a je nego &scaron;to je bilo pretpostavljeno prilikom prijave teze (u hipotezi). Real-time PCR test treba da bude redovno kori&scaron;ćen u budućem dijagnostičkom radu, jer dovodi do brze dijagnostike, čak i ako su virusi prisutni u malom broju u uzorcima tečnih stolica, &scaron;to je utvrđeno tokom ovog dijagnostičkog rada. Ispitivani virusi treba da budu redovno dijagnostikovani kod obolelih od dijarealnog sindroma i to u svim starosnim grupama, tokom epidemijskog i sporadičnog javljanja oboljenja.</p> / <p>Introduction: Viral gastrointestinal syndrome is a current ongoing health problem worldwide. This is true of both developed and developing countries, especially underdeveloped ones where it is the second leading cause of mortality. Sudden onset of the disease&mdash;accompanied by the occurrence of large numbers of liquid stools, nausea, vomiting, abdominal pain, fever, and exhaustion&mdash;leads to dehydration. A fatal outcome can occur in all age groups of patients, especially very young children, the elderly, and the immuno-deficient, unless an accurate etiological diagnosis of the disease is quickly established, followed by a prompt institution of fluid and electrolyte placement, and implementation of other symptomatic therapy measures. Quick establishment of an accurate diagnosis, which is best achieved using the real-time PCR test, prevents the onset of complications, including a potentially fatal outcome of the disease. Simultaneously, it enables the implementation of appropriate epidemiological measures to prevent epidemic outbreaks and their spread. The aim of this study was to accurately determine the incidence of viral gastrointestinal syndrome in Vojvodina and the frequency of epidemic and sporadic occurrence of this disease. The aim was also to set up an algorithm for the application of the real-time PCR test in diagnostics of viral gastrointestinal syndrome in future work. Likewise, the aim was to carry out genetic typing and determine phylogenetic affiliation of the virus using molecular analysis and sequencing of parts of genomes from positive stool samples. Material and Methods: During a five-year study, 1003 patients with symptoms of viral diarrheal syndrome, aged from one month to more than 90 years old, were examined using molecular real-time PCR test. They were screened for rota, noro, astro, and enteric adenoviruses. Based on the data from survey questionnaires and medical case history, all clinical indicators were meticulously analyzed (disease occurrence during the year, disease duration, symptoms). The assessment of the clinical severity was carried out according to the Vesikari Clinical Severity Scoring scale. All data were compared according to the type of the viral causing agent, age of the patients, duration of research in years, and epidemic and sporadic occurrence of the disease. Obtained data were statistically analyzed, tabulated, and graphically displayed. Results: In a five-year period, a sample of 1003 patients of different ages was screened for four different viral causing agents of diarrheal syndrome (rota, noro, astro, and enteric adenoviruses) using the real-time PCR test. Viral diarrheal syndrome was confirmed in 709 patients (70.69%). The most commonly found were rotavirus infections in 28.81% of the cases. Rotaviruses were statistically significantly most common in children younger than 5 years old (38.90%), but were also found in high percentage in children aged 6-14 years old (24.83%). Children under 5 years of age had statistically significantly highest clinical severity and fever, and were more frequently hospitalized. In addition to higher fever in patients with rotavirus, clinical severity in these patients was also higher, and the disease lasted longer than in patients with other viruses. Norovirus infections were reported in 23.03% of the subjects, statistically significantly more frequently in adults over 20 years of age. Regarding the clinical symptoms in these patients, nausea, vomiting, and abdominal pain were statistically significantly more common than in patients with other viruses. Noroviruses were significantly more common as causing agents of epidemic disease outbreaks. Astrovirus was found in a significantly smaller number of patients (in 2.29%), and only in children under 5 years of age and children aged 6-14 years old. Enteric adenovirus infections were reported in 13.36% of the subjects. They were most commonly found in children younger than 5, and those aged 6- 14 years old. Adenovirus sufferers had statistically significantly milder clinical disease. Two viral causing agents in the stool sample were found in 3.19% of the subjects, usually during an epidemic disease outbreak. These patients had a significantly more severe clinical disease. Highest numbers of sufferers from diarrheal syndrome occurred during the cold months, although they were diagnosed throughout the year. In a five-year period, 22epidemics in collective groups and 9 family epidemics were identified. Epidemic outbreaks of the disease were statistically significantly most frequent in the elderly patients (older than 50), while sporadic occurrences were statistically significantly most frequent in children. Representative samples positive for rota, noro, astro, or adenoviruses were selected in order to confirm the accuracy of virus diagnostics in samples tested by the real-time PCR test, and perform genotyping as well as more detailed molecular analyses. Parts of the genomes of these samples were amplified and then sequenced. Sequenced rotavirus isolates belonged to group A and types G1P[8], G2P[4], G3P[8], and G9P[8]. Sequenced norovirus isolates belonged to genogroup I type 2, and genogroup II types 1, 2, 4, and 17. Sequenced astrovirus isolates belonged to the group of classical astroviruses and types 1, 4, and 5. Sequenced adenovirus isolates belonged to group F and types 40 and 41, as well as group C type 2. The affiliation of the obtained sequences in this study was further confirmed by creating a phylogenetic tree for sequences positive for rota, noro, astro, or adenoviruses. Conclusion: The incidence of viral diarrheal syndrome in Vojvodina (70.69%) is very high&mdash;higher than what was assumed at the time of the thesis submission (in the hypothesis). The real-time PCR test should be regularly used in future diagnostic work, since it leads to rapid diagnostics even if viruses are present in small numbers in liquid stool samples, as determined in the course of this diagnostic study. The investigated viruses should be regularly tested in patients with diarrheal syndrome belonging to all age groups during both epidemic and sporadic occurrences of the disease.</p>

Atualmente, um dos grandes problemas relacionados à leishmaniose é a falta de um diagnóstico específico capaz de indentificar e diferenciar espécies de Leishmania com rapidez e precisão. O desenvolvimento de métodos moleculares como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), possibilita que o diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) possa se tornar mais preciso e, eventualmente, de fácil execução, uma vez que limitações importantes relacionadas à sensibilidade e especificidade desta técnica ainda são descritas, principalmente quando se utiliza amostras clínicas. Com o intuito de melhor avaliar a eficiência da PCR para o diagnóstico da LVC, foram selecionadas diferentes amostras clínicas (baço, aspirado de linfonodo, pele sem lesão, pele com lesão e amostras de sangue) de 26 cães com sorologia positiva para leishmaniose submetidos à eutanásia pelo Serviço de Vigilância Epidemiológica do município de Embu das Artes - SP. Realizamos uma análise comparativa entre a PCR-RFLP kDNA-HaeIII e PCR-RFLP hsp70-BsaJI/EcoRII com dois métodos diagnósticos tradicionais (parasitológico direto, e cultura in vitro). Amostras clínicas de 28 cães com sorologia negativa para LVC da mesma região foram utilizadas como controle negativo das reações. Notamos que a PCR aprensentou maior sensibilidade em todas as amostras clínicas testadas quando comparadas aos métodos tradicionais. Os resultados apontam que a PCR-RFLP kDNA-HaeIII é a mais eficiente para o diagnóstico da LVC, com um índice de 96,15% de positividade nas amostras de pele com lesão. Quanto à discriminação da espécie de Leishmania envolvida na infecção, nossos resultados de PCR-RFLP kDNA-HaeIII indicam Leishmania chagasi-infantum como o agente etiológico envolvido na infecção e transmissão canina na cidade de Embu das Artes. Por outro lado, a análise da PCR em Tempo Real (qPCR), mostrou que algumas amostras de sangue não apresentavam o padrão associado à Leishmania chagasi-infantum, podendo indicar uma co-infecção com outras parasitoses caninas. Nosso grupo também acompanhou 184 crianças de 4 a 10 anos de idade (população de risco) residentes da mesma região de transmissão autóctone da doença canina, como também foi realizado um levantamento das espécies de flebotomíneos da região (pela SUCEN). Até o momento, não foi encontrado nenhum caso da doença humana, nem a principal espécie transmissora do parasito (Lutzomiya longipalpis). Acreditamos que esses resultados possam contribuir significativamente para aprimorar o diagnóstico e a identificação das espécies Leishmania na LVC. / Currently, one of the major problems related to leishmaniasis is the lack of a specific diagnosis capable of identifying and differentiating Leishmania species quickly and accurately. The development of molecular methods such as Polymerase Chain Reaction ( PCR ) allows the diagnosis of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) to become more accurate and eventually, easy to perform, since that important limitations in terms of sensitivity and specificity of this technique are being described especially when using clinical samples. In order to better evaluate the efficiency of PCR for the diagnosis of CVL, we selected different clinical samples (spleen, lymph node aspirate, skin with and without lesions and blood samples) from 26 dogs with positive serology for leishmaniasis submitted to euthanasia by the Agency of Epidemiological Surveillance of Embu das Artes - SP. Therefore, we performed a comparative analysis between the kDNAPCR-RFLP HaeIII and hsp70PCR-RFLP BsaJI/EcoRII with two traditional diagnostic methods (direct parasitological test, and in vitro culture). Additionally, clinical samples from 28 dogs with negative serology for CVL in the same region were used as negative reactions control. We noted that the PCR showed greater sensitivity in all clinical samples tested when compared with traditional methods. The results indicate that the kDNAPCR-RFLP HaeIII is the most efficient test for the diagnosis of CVL, with a positivity index of 96.15 % in skin lesions samples. Related to the discrimination of the Leishmania species involved in the infection, our results of kDNAPCR-RFLP HaeIII indicate Leishmania infantum chagasi as the agent involved in canine infection in Embu das Artes city. Moreover, the analysis of real-time PCR (qPCR) showed that some blood samples has not showed the same pattern associated with Leishmania infantum chagasi suggesting a possible co-infection with other canine parasite. Our group also followed 184 children between 4 to 10 years old (risk population) living in the same region of autochthonous transmission of canine disease, as well a survey was conducted on the sandfly species in the region (by SUCEN). So far, we found no human infection, nor the main species involved in the transmission of the parasite (Lutzomyia longipalpis). We believe that these results can significantly contribute to the improvement of the diagnosis and identification of Leishmania species involved in the CVL worldwide.