En réponse aux inducteurs de la mort cellulaire immunogénique, la calréticuline (CRT) est transportée depuis sa localisation orthotopique dans la lumière du réticulum endoplasmique (RE) vers la surface cellulaire où elle va jouer un rôle de signal puissant d’endocytose à l’endroit des cellules présentatrices d’antigène. Ici nous rapportons qu’une autre protéine, la lysyl-ARNt-synthétase (KRS), est exposée à la surface des cellules stressées où elle colocalise avec la CRT au niveau des radeaux lipidiques. La déplétionde KRS à l’aide d’ARNs interférents annihile l’exposition de la CRT induit par les anthracyclines ou les rayonnements UVC. A l’inverse de la CRT, KRS est aussi retrouvée dans le surnageant des cellules stressées. De plus, la protéine KRS recombinante (KRSr) est ici incapable d’influencer la liaison de laCRT recombinante à la surface cellulaire. Et KRSr ne possède pas la capacité de stimuler des macrophages in vitro. Enfin nous révélons que le statut de phosphorylation d’eIF2α constitue un critère différentiel entre l’oxaliplatine et la cisplatine, capable de rendre compte de l’incapacité de cette dernière à entrainer l’exposition de la CRT, et ce malgré une très grande ressemblance chimique entre ces deux composés. Ces résultats mettent donc en exergue la contribution respective de KRS et du stress du RE dans l’émission du signal prototypique de la mort immunogénique. / In response to immunogenic cell death inducers, calreticulin (CRT) translocates from its orthotopiclocalization in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) to the surface of the plasma membrane where it serves as a potent engulfment signal for antigen-presenting cells. Here, we report that another protein, the lysyl-tRNA-synthetase (KRS), was exposed on the surface of stressed cells, on which KRS co-localized with CRT in lipid rafts. Depletion of KRS with small interfering RNAs suppressed CRT exposure induced by anthracyclines or UVC light. In contrast to CRT, KRS was also found in the supernatant of stressed cells. Recombinant KRS (rKRS) protein was unable to influence the binding of recombinant CRT to the cell surface. Moreover, rKRS protein was unable to stimulate macrophages invitro. Finally, we reveal that the phosphorylation status of eIF2α constitute a differential criteria between oxaliplatin and cisplatin (CDDP), accounting for the incapacity of CDDP to trigger the exposure ofCRT, despite their structural and chemical similarities. These results underscore the respective contribution of KRS and ER stress to the emission of the prototypic signal of immunogenic cell death.

Dans le cadre de la recherche de nouvelles cibles pour le traitement du cancer, les phosphatases Cdc25 sont des candidats intéressants dont l'inhibition devrait permettre de ralentir la croissance tumorale et éventuellement d'améliorer les traitements actuellement en usage. Les objectifs de ce projet de thèse sont de concevoir et synthétiser de nouveaux composés capables d'inhiber les CDC25, et de déterminer l'efficacité des meilleurs composés dans les lignées cellulaires du cancer du sein. L'évaluation du potentiel inhibiteur des composés est réalisée in vitro par une méthode fluorimétrique très sensibilité (substrat 3-OMFP). Les effets des composés sont évalués dans les lignées cellulaires MCF-7 et MDA-MB-231 : La viabilité des cellules est évaluée par la méthode colorimétrique du MTT, la cytotoxicité est évaluée par coloration au bleu trypan et par observation microscopique avec le système de vidéomicroscopie Incucyte. La mort cellulaire est caractérisée par la détection de marqueurs apoptotiques (caspases) et de marqueurs des dommages de l'ADN (H.2AX Histone PARP) par western blot. L'analyses des mécanismes liés à la mort cellulaire sont explorées par cytométrie en flux via la détection d'espèces réactives de l'oxygène (ERO) avec les sondes H2DCFDA et Redox Sensor Red. L'inhibition de CDC25 dans les cellules est évaluée indirectement par détection des formes phosphorylées dse CDK en Western Blot. L'évaluation in vitro de 93 molécules synthétisées nous a permis d'identifier de nouveaux composés actifs. Ils appartiennent à diverses familles chimiques comprenant des stéroïdes, thiophènes, coumarines, imidazoles ainsi que des dérivés de quinone. Les dérivés coumariniques ont montré une intéressante inhibition de CDC25, non décrite jusqu'à présent. Une nouvelle structure coumarine-soufre-quinone, nommée SV37, a été conçue pour optimiser le potentiel d'inhibition. Ce composé présente un fort potentiel inhibiteur des CDC25 in vitro (CI50 < 5uM pour CDC25 A et C). L'effet de SV37 sur la croissance cellulaire a été évalué sur les lignées cellulaires MCF-7, MDA-MB-231, hTERT-HME1 et HepG2 sur lesquelles une inhibition de la croissance cellulaire est observée (CI50 de 9 à 18 µM). L'analyse de la viabilité des cellules traitées à la CI50 indique l'absence de mort cellulaire pour la lignée MCF7, tandis que pour la lignée MDA-MB-231 la diminution de la croissance cellulaire est liée à une augmentation de la mort cellulaire. Afin d'étudier les mécanismes liés à la mort cellulaire, nous nous sommes concentrés sur l'étude du modèle triple négatif MDA-MB- 231. Les modifications morphologiques de ces cellules sont caractérisées par l'apparition d'altérations cellulaires compatibles avec la mort cellulaire. Le clivage des caspase-3 et 7 a été observé dès 16h de traitement, ce qui suggère l'induction d'une mort apoptotique. Par ailleurs, des ERO ont été détectées 15 min après le début du traitement, cette émission d'ERO a pu être totalement bloquée par un prétraitement avec la N-acétylcystéine (NAC). La détection de marqueurs des dommages de l'ADN, entre 16 et 28 heures après début du traitement, corrobore l'activation des caspases et les observations réalisées en vidéo-microscopie. Après traitement à CI50, une accumulation des pCDK dans les cellules a été observée après 4 et 8 heures, suggérant une inhibition de l'activité CDC25. De plus, les cellules prétraitées avec la NAC n'ont montré aucune accumulation de pCDK après traitement par SV37. Ces résultats suggèrent un lien direct entre la production de ROS induit par le composé SV37 et l'inhibition des CDC25. Ce projet a permis de définir les coumarines en tant que nouvelle classe de composés inhibitrice des phosphatases CDC25. Ces travaux ont de plus permis l'identification d'un composé coumarine-soufre-quinone SV37 qui constitue une structure de base pour le développement d'inhibiteurs de plus en plus efficaces, ... / Within the context of research for new targets for cancer therapy, Cdc25 phosphatases are interesting candidates, the inhibition of which being able to slow down tumor growth and eventually improve the cancer treatments currently in use. The objectives of this PhD project are to design and synthesize new compounds able to inhibit CDC25 and to determine efficiency of identified compounds in breast cancer cell lines. In vitro evaluation of inhibitory potential of compound is realized through a high sensitivity fluorometric method (3-OMFP substrate). Cellular effects were evaluated in MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines. Effects on cell viability are assessed through MTT assays, and cytotoxicity is evaluated through trypan blue assays and microscopic observations with Incucyte videomicroscopy system. Cell death was characterized by detection of apoptotic markers (caspases) and DNA damages markers (PARP Histone H.2AX) by Western Blotting. The analyses of mechanisms underlying cell death were explored through cytometric detection of reactive oxygen species (ROS) with H2DCFDA and Redox Sensor Red probes. Inhibition of CDC25 in cells was indirectly evaluated through detection of phosphorylated forms of CDK by Western Blotting. In vitro evaluation of 93 synthesized compounds allowed us to find new active compound in various chemical families including steroid, thiophene, coumarinic, imidazole and quinone derivatives. The coumarinic derivatives showed potent CDC25 inhibition. A new coumarin-sulfurquinone combined structure, named SV37, was designed to optimize efficiency of inhibition. In vitro tests on this compound, showed a strong CDC25 inhibitory potential (IC50 under 5µM for CDC25 A and C). Effect of SV37 on cell growth was evaluated on various cell lines (MCF-7, MDA-MB-231, hTERT-HME1 and HepG2). Results indicate inhibition of cell growth (IC50 values from 9 to 18 µM). Analysis of cell viability indicates no remarkable cell death in MCF7 at IC50 value whereas in MDA-MB-231 the cell growth decrease was characterized by an increase of cell death. For deeper investigations on the cell death and on the underlying mechanisms, we focused the study on the triple negative model MDA-MB-231. The morphological changes of MDA-MB-231 cells during the treatment were characterized by the appearance of cellular alterations compatible with a cellular demise and culminating with a disruption of cells after 20h. Caspase-3 and 7 cleavages were observed 16h after beginning of the treatment, suggesting an apoptotic cell death. A ROS induction was observed 15 min after the beginning of the treatment and was totally prevented by Nacetylcysteine (NAC) pretreatment. DNA damage markers were detected between 16 and 28 hours after beginning of treatment, a timing falling with caspase activation and with the appearance of cell demise observed by video microscopy. Accumulation of pCDK in cells was observed after 4 and 8 hr of treatment by SV37 at IC50 suggesting an inhibition of CDC25 activity, and cells pretreated with NAC showed no accumulation of pCDK after SV37 treatment. This strongly suggests a direct link between ROS generation by the compound SV37 and the accumulation of pCDK. This project increased knowledge on inhibitors of CDC25 phosphatases and allowed the identification of coumarine compound as new CDC25 inhibitors. This work will enable the development of ever more efficient inhibitors, leading to efficient inhibition of CDC25 and inhibition of tumor development

Physiologiquement, l’ADN, séquestré dans les noyaux, n’est pas détecté par les récepteurs de danger du système immunitaire. En revanche, au cours d’inflammations chroniques, une rupture de la tolérance vis-à-vis de l’ADN du soi, consécutivement à sa libération dans le milieu extracellulaire par les cellules mortes, a été démontrée. L’accès de l’ADN extracellulaire aux récepteurs intracellulaires est médié par des molécules cargo capables de s’associer à l’ADN extracellulaire et d’induire sont internalisation.L’IL-26, qui est un membre de la famille de l’IL-10, a été décrite comme une cytokine pro-inflammatoire, dont les mécanismes moléculaires restent mal connus. Nous avons démontré que l’IL-26 se lie à l’ADN, permet son internalisation dans le cytosol des cellules myéloïdes et la sécrétion de cytokines pro inflammatoires via la voie STING et la voie des inflammasomes. La modélisation informatique de l’IL-26, basée sur la structure de l’IL-10,met en évidence des caractéristiques structurales similaires aux molécules cargo : un domaine de liaison à l’ADN, deux hélices amphipathiques et un motif d’ancrage à la membrane. De plus, des complexes circulants d’IL-26-ADN sont retrouvés dans les sérums de patients en poussée aigues de vascularite à ANCA,une pathologie inflammatoire chronique. L’IL-26 est détectée dans les lésions de glomérulonéphrite aigue nécrosante à croissants, ainsi qu’au niveau des cellules musculaires lisses artérielles de ces patients. Ces dernières sécrètent de l’IL-26 en présence de cytokinespro-inflammatoires. En conclusion, l’IL-26 établit d’une boucle d’autoamplification entre une mort cellulaire intense et l’inflammation. / In physiological conditions, self-DNA released by dying cells is not detected by intracellular DNA sensors. Inchronic inflammatory disorders, unabated inflammation has been associated with a break in innate immune tolerance to self-DNA. However, to gain access to intracellular DNA sensors, extracellular DNA has to complex with DNA-binding molecules. IL-26 is a member of the IL-10 cytokine family, overexpressed in numerous chronic inflammatory diseases, which biological activity remains unclear. We demonstrate here that IL-26 binds to DNA and shuttles it in the cytosol of human myeloid cells. As a consequence, IL-26 allows extracellular DNA to trigger proinflammatory cytokine secretion by monocytes, in a STING- and inflammasome-dependent manner. Supporting these biological properties, IL-10-based modelling predicts two DNA-binding domains, two amphipathic helices, and an in-plane membrane anchor in IL-26, structural features of cationic amphipathic cell penetrating peptides. In line with these properties, patients with active autoantibody-associated vasculitis, a chronic relapsing autoimmune inflammatory disease associated with extensive cell death, exhibit high levels of both circulating IL-26 and IL-26-DNA complexes. Moreover, in patients with crescentic glomerulonephritis, IL-26 is expressed by renal arterial smooth muscle cells and deposits in necrotizing lesions. Accordingly, human primary smooth cells secrete IL-26 in response to proinflammatory cytokines. In conclusion, IL-26 expressed in lesions confers proinflammatory properties to DNA released by dying cells, setting up a positive amplification loop between extensive cell death and unabated inflammation.

Le développement d’un cancer chez un individu immunocompétent témoigne, en partie, d’un échappement tumoral au système d’immunosurveillance. Par conséquent, la restauration ou l’induction de ces mécanismes de défense anti-tumorale est une des stratégies thérapeutiques actuelles. Un des principes de l’immunothérapie est basé sur l’injection d’anticorps ayant pour cible la cellule tumorale ou les cellules effectrices de l’immunité. L’efficacité anti-tumorale de ces anticorps a été considérablement améliorée par une meilleure compréhension des modes d’action et des effets modulateurs de ces anticorps. Ainsi, afin d’optimiser l’action des effecteurs immunitaires sur les cellules tumorales, un anticorps bispécifique, trifonctionnel, le catumaxomab, capable de se lier à la molécule d'adhérence des cellules épithéliales (EpCAM) exprimée par les cellules tumorales et à l'antigène CD3 des lymphocytes T, a été développé, essentiellement en traitement intra-péritonéal des ascites néoplasiques réfractaires.L’objectif de cette étude était de déterminer les effets immunomodulateurs du catumaxomab sur des cellules néoplasiques exprimant EpCAM, à partir de deux modèles expérimentaux (allogénique et autologue), de rechercher une cytotoxicité induite par la catumaxomab, et de la caractériser, notamment en analysant la présence ou non de signaux de stress inducteurs d’une mort immunogène tels que l’exposition membranaire de la calréticuline par les cellules tumorales pré-apoptotiques, la libération d’HMGB1 et d’adénosine triphosphate (ATP) dans le milieu extra-cellulaire, responsables d’une activation des lymphocytes T.En présence de cellules EpCAM+, le catumaxomab entrainait une activation majeure des lymphocytes T (expression de CD69, CD107a, HLA-DR et PD1), stimulait une réponse inflammatoire de type Thelper 1(Th1), et provoquait la synthèse d’interféron-gamma par les lymphocytes T CD8. Le catumaxomab engageait le CD16 (FcR) des cellules monocytaires et NK. De plus, sur des modèles allogéniques, le catumaxomab, provoquait une mort cellulaire associée à la libération d’ATP et induisait une mort immunogène après pré-incubation dans de l’oxaliplatine.Par conséquent, le catumaxomab permet de moduler l’environnement immunitaire dans les ascites néoplasiques, et de convertir une inflammation chronique et immunosuppressive (Th2) en une inflammation aigüe et immunogène (Th1). En revanche, dans ces conditions, l’administration seule de catumaxomab ne semble pas déclencher de mort immunogène.Différents moyens pourraient permettre d’améliorer la cytotoxicité de cet anticorps bispécifique : (1) le combiner avec un agent anti-néoplasique tel que l’oxaliplatine afin de promouvoir une mort immunogène, (2) affiner son action sur le CD3 des lymphocytes en modifiant sa configuration spatiale (anticorps BiTE), (3) amplifier son affinité pour le récepteur Fcdes cellules accessoires (Fc défucosylé), (4) augmenter sa cytotoxicité en modifiant la cible dirigée contre la molécule du système immunitaire (anti-PD-1…). Enfin, l’utilisation clinique pourrait être facilitée en humanisant cet anticorps chimérique murin afin d’éviter la formation d’anticorps anti-murins, dirigés contre le catumaxomab.Un essai thérapeutique de phase II dont le but est d’évaluer l’efficacité du catumaxomab intrapéritonéal après chirurgie de cytoréduction complète d’une carcinose gastrique, chez des patients ayant reçu en préopératoire une chimiothérapie systémique à base d’oxaliplatine vient de débuter. Au cours de cette étude, nous allons valider la capacité du catumaxomab 1) à induire un stress cellulaire immunogène et la mort des cellules cancéreuses, 2) à modifier la polarisation des cellules effectrices vers une maladie inflammatoire Th1, 3) à promouvoir l'expression des molécules de costimulation et TRAIL sur les cellules NK et monocytes, et corréler ces biomarqueurs immunitaires à l’efficacité du traitement. / The development of cancer in an immunocompetent individual reflects, in part, a tumor escape from the immunosurveillance. The tumor escape is a complex, multifactorial, in which tumor cells will evade the defense mechanisms of the host by changing their microenvironment. Therefore, restoration or induction of these defense mechanisms is one of the therapeutic strategies against cancer. One of the principles of immunotherapy is based on the injection of antibodies that target tumor cells or effector cells of immunity. The anti-tumor efficacy of these antibodies has been greatly improved by a better understanding of modes of action and modulatory effects of these antibodies.Thus, to optimize the action of immune effectors to tumor cells, a bispecific antibody, trifunctional: catumaxomab, capable of binding to the adhesion molecule of the epithelial cells (EpCAM), expressed by tumor cells and the CD3 antigen of T cells, has been developed mainly in intraperitoneal treatment of refractory malignant ascites.The objective of this study was to determine the immunomodulatory effects of catumaxomab on tumoral cells expressing EpCAM, from two experimental models (allogeneic and autologous), evaluate and characterize cytotoxicity induced by catumaxomab, and analyze the presence of stress signals inducing immunogenic cell death such as membrane exposure of calreticulin by pre-apoptotic tumor cells, release of HMGB1 and of adenosine triphosphate (ATP) in the extracellular medium, inducing a T cell activation.In the presence of EpCAM + cells, catumaxomab induced a major the activation of T cells (expression of CD69, CD107a, HLA-DR and PD1), stimulated an inflammatory response Thelper type 1 (Th1) and the synthesis of interferon-gamma by CD8 T cells. Catumaxomab committed CD16 NK cells and monocytes. More, in models allogeneic catumaxomab, caused cell death associated with ATP release and induced an immunogenic cell death after pre-incubation of oxaliplatin.Therefore, catumaxomab modulates the immune environment in malignant ascites, and convert chronic and immunosuppressive inflammation (Th2) in acute and immunogenic inflammation (Th1). However, in these conditions, catumaxomab alone does not seem to trigger immunogenic cell death.the cytotoxicity of this bispecific antibody could be enhance by different techniques: (1) combining with chemotherapy such as oxaliplatin to promote immunogenic cell death, (2) refining its action on CD3 lymphocytes by changing its spatial configuration (BiTE antibody), (3) increasing its affinity for the FcR of accessory cells (Fc aglycosylated), (4) increasing its cytotoxicity by changing the target directed against the immune molecule (anti-PD-1 ...). Finally, the clinical use could be facilitated by this humanizing murine chimeric antibody to prevent the formation of anti-murine antibodies directed against catumaxomab.A phase II clinical trial aimed to evaluate the efficacy of intraperitoneal catumaxomab after complete cytoreductive surgery of gastric carcinomatosis in patients who received preoperative systemic chemotherapy with oxaliplatin have just started. In this study, we will validate the ability of catumaxomab 1) to induce immunogenic cell stress and death of cancer cells, 2) to change the polarization of effector cells to Th1 inflammatory disease, 3) to promote the expression of costimulatory molecules and TRAIL on NK cells and monocytes, and we will correlate these immune biomarkers to treatment efficacy.

Au cours de ce travail de thèse, les deux approches permettant la caractérisation de nouveaux agents antileishmaniens ont été suivies : d’une part identification de molécules de synthèse originales et actives, par des méthodes de criblage, et d’autre part recherche de nouvelles cibles thérapeutiques leishmaniennes, faisant appel à des outils de biologie moléculaire, et de protéomique.Dans une première partie consacrée à l’optimisation du criblage antileishmanien de molécules de synthèse, nous avons notamment mis au point et validé une nouvelle méthode applicable aux formes promastigotes. Cette méthode reposant sur le principe de la bioluminescence, s’est avérée précise, rapide, répétable, sensible, automatisable et applicable à des isolats cliniques. Nous nous sommes également intéressés à la recherche d’une nouvelle méthode de criblage sur les formes amastigotes intracellulaires remplissant ces mêmes critères.Dans une seconde partie consacrée au lien entre la mort cellulaire programmée et les cystéines peptidases (métacaspase et Raptor) chez Leishmania, nous avons mis en évidence un lien possible entre métacaspase et autophagie chez L. infantum. De plus, nous avons identifié, in vivo, plusieurs substrats protéiques potentiels de ces peptidases : HSP70, ARN-Hélicase ATP-Dépendante et Lmjf09.1010 pour la métacaspase ; NDPKb et la protéine associée à l’ADN du kinétoplaste pour Raptor. Ces différents résultats ont permis de proposer un modèle conciliant les rôles possibles des cystéine-Peptidases métacaspase et Raptor au cours de l’autophagie et de l’apoptose chez Leishmania, rôles potentiellement dus au clivage de substrats protéiques spécifiques. / During this thesis work, two approaches affording the characterization of new antileishmanial agents were followed: on the one hand, the identification of new original antileishmanial synthetic drugs, through screening assays and on the other hand, research of new parasitic therapeutic targets by using molecular biology and proteomic tools. In the first part, dedicated to the optimization of the antileishmanial screening of synthetic compounds, we set up and validated a new bioluminescence-Based screening method for studying anti-Promastigote compounds. This method appears accurate, rapid, repeatable, sensitive and is also transposable to automats and usable on clinical isolates. In parallel, we investigated new screening protocols aiming at improving the screening in intracellular amastigotes which could meet the same criteria. In the second part focusing on the link between programmed cell death and cystein peptidases (metacaspase and Raptor) in Leishmania, our study first highlighted a possible link between metacaspase and autophagy in L. infantum. Moreover, we identified in vivo several potential subtrates for both peptidases: HSP70, ATP-Dependent RNA-Helicase and Lmjf09.1010 for the metacaspase; NDPKb and kinetoplast-DNA-Associated-Protein for Raptor. These results allowed us to propose a model reconciling the possible roles of cystein peptidases metacaspase and Raptor during autophagy and apoptosis in Leishmania, roles potentially due to the cleavage of specific proteic subtrates.

Dans de nombreuses maladies neurodégénératives dont la Maladie de Parkinson, mais également dans le processus de vieillissement normal, il a été observé une accumulation excessive des niveaux de fer associée à une production accrue d‘espèces réactives de l’oxygène (ROS).Il est bien connu que le fer (i) participe à la réaction de Fenton pour produire le ROS le plus toxique, le radical hydroxyle, (ii) accélère l’auto-oxidation de la dopamine, augmentant le stress oxydant et (iii) augmente la peroxydation lipidique qui va déclencher l'agrégation des protéines, dont l’&#945;-synucléine, une caractéristique de la maladie de Parkinson. Tous ces phénomènes rendent les neurones dopaminergiques très sensible au stress oxydant.Récemment, une nouvelle forme de mort cellulaire a été découverte sur des cellules cancéreuses. Cette mort cellulaire est appelée « ferroptose » car elle dépend essentiellement du fer intracellulaire. De plus, elle est liée à une très grande augmentation du stress lipidique.Le principal objectif de ce travail de thèse a donc porté sur la possible implication de la ferroptose dans la mort des cellules dopaminergiques.Dans un premier temps, nous avons montré que la lignée de neurones dopaminergiques (LUHMES) est un modèle particulièrement adapté à l’étude de mort cellulaire induite par le fer comparativement à d’autres modèles plus classique.La seconde partie du travail a donc été consacrée à l'étude de l’implication de la ferroptose dans les neurones dopaminergiques. D’abord par une approche cellulaire avec les cellules LUHMES, nous avons pu observer (i) que l’inducteur spécifique de cette mort, l’érastine, est très efficace pour induire la mort des cellules dopaminergiques, (ii) que l'inhibition de la ferroptose protégeait de la mort induite par des agents oxydants classiquement utilisés dans les études sur la maladie de Parkinson comme le MPP+ et (iii) que la PKC joue un rôle majeur dans la mort par ferroptose. Tous ces résultats ont ensuite été confirmés dans un modèle de culture organotypique, à l’interface entre la culture cellulaire et le modèle animal.Enfin, nous avons montré que l’utilisation des inhibiteurs de la ferroptose ainsi que celui de la PKC, confère une protection des neurones dopaminergiques dans un modèle de souris MPTP, modèle d’étude de la maladie de Parkinson.En conclusion ce travail de thèse montre pour la première fois l'implication de la ferroptose dans une maladie neurodégénérative comme la maladie de Parkinson et suggèrent que le développement d'inhibiteurs spécifiques de cette mort cellulaire pourrait être des futures cibles thérapeutiques possibles. / In many neurodegenerative diseases including Parkinson's disease, as well as in the regular aging process, an excessive accumulation of iron levels associated with increased production of oxygen species (ROS) have been observed.It is well known that iron (i) participates in the Fenton reaction to produce the most toxic ROS, the hydroxyl radical, (ii) accelerates auto-oxidation of dopamine, increasing the oxidative stress and (iii) increases lipid peroxidation that will trigger the aggregation of proteins, including &#945;-synuclein, a hallmark of Parkinson's disease. All theses factors make dopamine neurons very sensitive to oxidative stress.Recently, a new form of cell death was found on cancer cells. This cell death is called ferroptosis because it essentially depends on the intracellular iron. In addition, it is linked to a very large increase in lipid stress.The main objective of this work has focused on the possible involvement of ferroptosis in the death of dopamine cells.First, we showed that the line of dopaminergic neurons (LUHMES) is a model particularly suited to the study of cell death induced by iron compared to other more conventional models.The second part of the work has been devoted to the study of the involvement of ferroptose in dopaminergic neurons. First by a cellular approach with LUHMES cells, we observed that (i) the specific inducer of this death, erastin, is very effective to induce the death of dopaminergic cells, (ii) inhibition of ferroptosis protected from death induced by oxidizing agents conventionally used in studies of Parkinson's disease like MPP+ and (iii) that PKC plays a major role in death by ferroptosis. These results were then confirmed in an organotypic culture model, at the interface between cell culture and animal models.Finally, we have shown that the use of ferroptosis inhibitors and PKC inhibitor, provides protection of dopaminergic neurons in MPTP mice model, animal model for studying of Parkinson's disease.In conclusion this study demonstrates for the first time the involvement of ferroptosis in a neurodegenerative disease such as Parkinson's disease and suggest that the development of specific inhibitors of this cell death could be possible future therapeutic targets.

Certains agents chimiothérapeutiques tels que les anthracyclines ou l'oxaliplatine induisent une mort cellulaire immunogène, ce qui implique que les cellules mourrantes du patient servent de vaccin thérapeutique en stimulant une réponse immunitaire antitumorale. La mort cellulaire immunogène est caractérisée par la libération de signaux d'alarme par la cellule tumorale mourante qui permettent l’activation du système immunitaire. En premier lieu, l'exposition de la calréticuline à la surface de la cellule tumorale mourante va agir comme un signal de type «eat-me» pour les cellules dendritiques. Une fois relâchée, la protéine nucléaire HMGB1 se lie au récepteur TLR4 afin de faciliter la présentation antigénique. Les cellules mourantes vont également libérer de l'ATP qui agit sur les récepteurs P2X7 et active l’inflammasomme NLRP3, conduisant à la libération d'IL-1β et ainsi à l’activation des cellules T CD8+ productrices d’IFN-γ. L’autophagie est un mécanisme cellulaire qui est activé en réponse à la chimiothérapie. L'autophagie signifie «self-ating», il s'agit d'un processus cellulaire activé par diverses conditions de stress, par lequel les cellules peuvent dégrader les protéines et les organites. Il peut aussi être induit par un stress du réticulum endoplasmique. Ce dernier étant également impliqué dans l'exposition de la calréticuline pendant la mort cellulaire immunogène, nous avons au cours de cette étude cherché à déterminer le rôle de l'autophagie dans la mort cellulaire immunogène. Nous avons constaté que l'autophagie est nécessaire pour la libération de l'ATP après un traitement par des chimiothérapies immunogènes, en observant que le nockdown de gènes essentiels de l'autophagie limitait la sécrétion d'ATP. Nous avons également observé que des cellules déficientes pour l'autophagie traitées par une chimiothérapie immunogène sont incapables d’immuniser des souris contre une injection de cellules vivantes. En outre, les tumeurs déficientes pour l’autophagie ne répondent pas à un traitement systémique immunogène dans des souris immunocompétentes et continuent à proliférer en comparaison à des tumeurs “wild-type”. De plus, nous avons montré que les cellules déficientes pour l'autophagie ne sont pas en mesure de recruter des cellules dendritiques dans le lit tumoral ou d'induire l’activation des cellules T CD8+. A l'inverse, l'inhibition des enzymes de dégradation de l’ATP extracellulaire accroit les concentrations d'ATP dans les tumeurs déficientes pour l'autophagie, ce qui rétablit le recrutement des cellules immunitaires dans le lit tumoral et restaure la réponse chimiothérapeutique des cancers déficients pour l'autophagie. Ainsi, cette étude a montré l'importance de l'autophagie dans la réponse anti-tumorale spécifique, après traitement par des chimiothérapies immunogènes. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans le concept de la mort cellulaire immunogène. / In recent years it has been demonstrated that some chemotherapeutic agents such as anthracyclines or oxaliplatin can induce a type of tumor cell death that is immunogenic, implying that the patient’s dying cancer cells serve as a therapeuticvaccine that stimulates an antitumor immune response, which in turn can control or eradicate residual cancer cells. Immunogenic cell death is characterized by the emission of danger signals from the dying tumor cell, which activate the immune system. At first the exposure of calreticulin, acts as an «eat-me» signal for dendritic cells (DCs). Once released, the nuclear protein HMGB1 binds to TLR4 on DCs, facilitating antigen processing and presentation. The dying tumor cells also releases ATP, which acts on P2X7 receptors on DCs and activates the NLRP3 inflammasome, leading to IL-1β release, necessary for IFN-γ-producing CD8+ T cell activation. Autophagy literally ‘self-eating’ is a cellular process activated in response to various conditions of cellular stress, whereby cells can liberate energy resources via the degradation of proteins and organelles. Recently autophagy has been found activated in response to chemotherapy and in this project we aimed to determine the potential role of autophagy in immunogenic cell death. We found that autophagy isrequired for the release of ATP in response to immunochemotherapeutic treatment, as we observed that the knockdown of essential autophagy-related genes abolished its secretion. We observed that autophagy deficient cells treated with immunogenic cell death inducers failed to immunize mice against a re-challenge with living cells. Furthermore, autophagy deficient tumors growing on immunocompetent mice did not respond to systemic immunogenic treatment and continued proliferating in contrast to autophagy proficient tumors. We showed that autophagy deficient cells were neither able to recruit DCs into the tumor bed nor to activate CD8+ T cells. Conversely, the inhibition of extracellular ATP degrading enzymes increased extracellular ATP concentrations in autophagy deficient tumors, which reestablished the recruitment of immune cells into the tumor bed, and restored chemotherapeutic responses in autophagy-deficient cancers. Altogether, this study showed the importance of autophagy in tumor-specific immune response after treatment with chemotherapy, thus giving new insights into the concept of immunogenic cell death.

Alix est une protéine adaptatrice impliquée dans la régulation du système endolysosomal grâce à son interaction avec des protéines comme CIN85 et les endophilines, protéines participant à l'endocytose de récepteurs ou les protéines des complexes ESCRT nécessaires à la maturation des compartiments endosomaux, Alix pourrait également contrôler la mort neuronale en se fixant à la protéine ALG-2. Le but de mon projet de thèse a été de tester si Alix intervient dans la mort des motoneurones au cours du développement in vivo et de définir les mécanismes moléculaires sous-jacents. J'ai montré que l'expression d'une protéine tronquée, correspondant à la moitié C-terminale d'Alix (Alix-CT), protège les motoneurones cervicaux de la mort cellulaire programmée précoce (PCD). Cette protection dépend de la liaison d'Alix-CT à ALG-2 et à ESCRT-I mettant en évidence l'implication du complexe Alix/ALG-2 avec les protéines ESCRT dans la mort naturelle des motoneurones : Alix ferait le lien entre la voie endolysosomale et la machinerie de mort cellulaire. J'ai montré que la délétion du site de liaison à CIN85, connue pour participer à l'endocytose du récepteur au TNF, le TNFR1, dans Alix-CT, inhibe sa capacité protectrice sur la PCD. La suite de mon travail démontre qu'Alix fonctionne en aval de la signalisation du TNFR1 à la fois in vivo et in vitro. Alix/ALG-2 interagit avec le TNFR1 au niveau des endosomes et pourrait permettre la formation d'une plateforme d'activation de la caspase-8 qui serait recrutée au niveau des « endosome de mort » contenant le TNFR1.

Galig, gène interne au gène de la galectine-3, code deux protéines la mitogaligine et la cytogaligine. Ce travail de thèse a montré que l'expression de galig conduit à une mort cellulaire présentant des marqueurs caractéristiques de l'apoptose. Ainsi, la co-expression de Bcl-XL, protéine anti-apoptotique, réduit significativement la libération de cytochromec et la mort cellulaire. Cependant, certains caractères apoptotiques ne sont pas mis en évidence suggérant une nouvelle forme de mort cellulaire programmée. Des études de relation structure-fonction ont permis de délimiter le signal d'adressage mitochondrial en position interne dans la mitogaligine. Des anticorps anti-cytogaligine polyclonaux ont été produits puis utilisés en immunofluorescence et en western-blot. Un test de PCR quantitative a également été mis au point. Ces outils devraient permettre de quantifier l'expression du gène galig et la production des protéines in vivo dans différents échantillons de tissus humains.

Chez les angiospermes, l'oxygène singulet est la forme majoritaire des espèces réactives de l'oxygène, étant produite lors de la photosynthèse. Son excès provoque le dommage photooxidatif conduisant à la mort cellulaire, observée chez les mutants affectés dans la voie de la biosynthèse de la chlorophylle. Dans ce travail, nous avons utilisé des mutants d'Arabidopsis thaliana qui manifestent le phénotype conditionnel de la mort cellulaire, causée par l'absence d'une protéine de l'enveloppe externe des plastes, OEP16-1. Cette protéine est impliquée dans le transport des amines, acides aminés et également dans l'import d'une enzyme clé de la synthèse de la chlorophylle, NADPH: Protochlorophyllide oxydoreductase A (PORA), dans les plastes. Une approche génétique inverse a permis d'isoler et de caractériser quatre mutants indépendants Atoep16-1, ayant différentes combinaisons des propriétés de la mort cellulaire et de la présence/absence de la PORA. Deux des mutants accumulent en excès de la protochlorophyllide libre (Pchlide) à l'obscurité et meurent après illumination. Dans ce cas, la Pchlide agit comme un photosensibilisateur déclenchant la production de l'oxygène singulet. Les deux autres mutants évitent la surproduction de la Pchide et verdissent normalement. En utilisant le mutant de l'orge, tigrina d12 comme référence, nous avons montré que la mort cellulaire induite lors du photoblanchiment chez les mutants Atoep16-1, intervient dans la voie flu-indépendante. L'initiation de la traduction sur des ribosomes 80S, a été identifiée comme étant une cible majeure de l'oxygène singulet, au cours des premières heures du verdissement. Dans un stade plus tardif, l'oxygène singulet a provoqué la dissociation des ribosomes. Nous avons ainsi fourni des preuves que les deux effets sur la traduction sont génétiquement liés et qu'ils peuvent être ensuite étudiés à l'aide des mutants Atoep16-1 que nous avons isolé et du mutant flu, préalablement identifié.