Orientador: Ida Maria Foschiani Dias Baptista / Banca: Ana Carla Pereira Latini / Banca: Andrea Faria Fernandes Belone / Resumo: O município de Rondonópolis, no Mato Grosso é altamente endêmico para a hanseníase, apesar da existência de serviços qualificados para o diagnóstico e acompanhamento dos casos e a implementação da poliquimioterapia. Para resolver este paradoxo, um estudo completo de epidemiologia molecular foi iniciado. Questionários estruturados, incluindo detalhes clínicos, residencial, demográficas e ocupacionais, amostras biópsias de pele e outros exames laboratoriais para diagnóstico foram coletadas para 260 pacientes diagnosticados no período de 2007-2010. Genótipos de Mycobacterium leprae foram determinados pela a análise por STRs e tipagem de SNP utilizando DNA extraído de biópsias de pele antes de iniciar o tratamento. GoogleMaps foi utilizado para localizar os pacientes. A média de idade dos pacientes variou na faixa dos 11 aos 90 anos e incluiu a 137 homens e 123 mulheres. De acordo com a classificação Ridley & Jopling observamos um predomínio das formas TT (39%) e BT (33%), seguido por BB (19%), BL (5%), LL (3%) e I (1%). A cidade é essencialmente urbana, com 200.000 habitantes e os pacientes estavam distribuídos em 106 bairros. Bairros de alta endemicidade englobando bairros vizinhos puderam ser detectados. Das 260 amostras de DNA de biópsias foram analisadas por meio de 17 loci STRs, 15 loci foram polimórficos (2-23 alelos), enquanto que os loci de 6-3A e 21- 3 foram invariáveis. Quando foram analisados os genótipos do SNP observou-se que 77% (n = 200) foram genótipo 3, 16% (n = 41), o genótipo 4, 1,5% (n = 4), o genótipo 1 e 3, 8% (n = 10 ) genótipo 2. Duas amostras (0,76%) para diferenciar o genótipo 1 do 2 na análise de seqüenciamento foi inconclusivo e em outras três amostras (1,15%) não obtivemos amplificação. Por meio da análise filogenética, observou-se uma estrutura populacional composta por alguns subgrupos. Vários isolados tipados por STRs foram encontrados em cada um dos bairros. Diversidade... / Abstract: The municipality of Rondonópolis, in Mato Grosso is highly endemic for leprosy despite the existence of qualified services for diagnosis and monitoring of cases and the implementation of multidrug therapy. To address this paradox, a comprehensive molecular epidemiology study was initiated. Structured questionnaires including clinical, residential, demographic, and occupational details and skin samples for diagnosis and laboratory tests were collected for 260 patients diagnosed during the period of 2007-2010. Genotypes of Mycobacterium leprae were determined using STR analysis and SNP typing using DNA extracts from skin biopsies taken before starting treatment. GoogleMaps was used to localize patients. The patients ranging in age from 11 to 90 years included 137 males and 123 females. According to the classification of Ridley & Jopling observed a predominance of forms TT (39%) and BT (33%), followed by BB (19%), BL (5%), LL (3%) and I (1%). The city is primarily urban with 200,000 inhabitants and the patients could be assigned to 106 smaller units (villages). Neighborhoods of high endemicity encompassing adjoining villages could be detected. Of the 260 biopsy DNA samples analyzed across 17 STR loci, 15 loci were polymorphic (2-23 alleles), while the loci 6-3a and 21-3 were not. When we analyzed the genotypes of the SNP we observed that 77% (n = 200) were genotype 3: 16% (n = 41) genotype 4, 1.5% (n = 4) genotype 1 and 3, 8% (n = 10) 2 genotype. Two samples (0.76%) to differentiate genotype 1 and 2 the sequencing analysis was inconclusive and the other three samples (1.15%) did not amplification. Through phylogenetic analysis, we observed a particular population structure composed of some subgroups. Multiple STR strain types are found in each of the neighborhoods. Genetic diversity within and among the neighborhoods does not reveal a distinct population structure. Spatial clustering of patients is likely a consequence of socio-economic ... / Mestre

As grandes mudanças para os pesquisadores da área de vacinas sao a optimizaçao das vacinas de DNA para uso em humanos ou animais de grande porte e criar vacinas efetivas de uma única dose usando sistemas de liberação controlada apropriados. O plasmídeo de DNA codificando a proteína de heatshock 65 (hsp65) (DNA-hsp65) foi capaz de induzir resposta imune protetora e terapêutica no modelo murino da tuberculose (TB). Apesar do sucesso da vacina baseada na DNA-hsp65 em solução para proteger camundongos contra TB, esta requer múltiplas doses de grande quantidade de DNA para imunização efetiva. No intuito de otimizar esta vacina e simplificar o protocolo de vacinação, nós co-encapsulamos DNA-hsp65 e o adjuvante dimicolato de trealose (DMT) em microesferas biodegradáveis de ácido polilático-poliglicólico (PLGA) para uma única administração. Além disso, foi também desenvolvida uma formulação prime-boost da vacina de dose única baseada na mistura de duas diferentes microesferas de PLGA, apresentando liberação rápida e lenta, de DNAhsp65 e proteína hsp65 recombinante, respectivamente. Essas formulações foram testadas em cobaias pela comparação da eficácia protetora (components efetores da imunidade protetora) e toxicidade (componentes efetores da patologia) induzida pela preparação da preparação do DNA em solução ou BCG. A formulação de dose única prime-boost nitidamente apresentou maior eficácia e reduziu a patologia nos pulmões de cobaias. / The great challenges for researchers working in the field of vaccinology are optimizing DNA vaccines for use in humans or large animals and creating effective single-dose vaccines using appropriated controlled delivery systems. Plasmid DNA encoding the heat-shock protein 65 (hsp65) (DNAhsp65) has been shown to induce protective and therapeutic immune responses in a murine model of tuberculosis (TB). Despite the success of naked DNAhsp65-based vaccine to protect mice against TB, it requires multiple doses of high amounts of DNA for effective immunization. In order to optimize this DNA vaccine and simplify the vaccination schedule, we coencapsulated DNAhsp65 and the adjuvant trehalose dimycolate (TDM) into biodegradable poly(DLlactide- co-glycolide) (PLGA) microspheres for a single dose administration. Moreover, a single-shot prime-boost vaccine formulation based on a mixture of two different PLGA microspheres, presenting faster and slower release of, respectively, DNAhsp65 and the recombinant hsp65 protein was also developed. These formulations were tested in guinea pigs by comparison with the efficacy (effector components of protective immunity) and toxicity (effector components of pathology) induced by the naked DNA preparation or BCG. The single-shot prime-boost formulation clearly presented good efficacy and diminished lung pathology in guinea pigs.

Descrevem-se os aspectos epidemiológicos e clínico-patológicos da paratuberculose em um rebanho de búfalos no Município de Guaíba no Rio Grande do Sul. A propriedade possuía cento e noventa e quatro búfalos principalmente da raça mediterrâneo e destinava-se a produção de leite e carne. No período de abril de 2009 a setembro de 2010 seis búfalos apresentaram diarreia crônica intermitente, perda de peso e apetite normal. Na neccropsia observaram-se vasos linfáticos proeminentes no mesentério e na mucosa do intestino. Os linfonodos mesentéricos estavam moderadamente aumentados, com áreas escuras entremeadas com focos multinodulares brancacentos, principalmente na região cortical. A mucosa do intestino se encontrava espessa e cerebriforme. Ao exame histológico, desde o duodeno até o intestino grosso havia infiltrado composto principalmente por macrófagos epitelióides e, em menor escala, linfócitos, plasmócitos e células gigantes tipo Langhans. Outros achados observados foram dilatação dos vasos linfáticos, linfangite granulomatosa e linfangiectasia. Nos linfonodos mesentéricos verificaram-se lesões histológicas semelhantes. A coloração de Ziehl-Neelsen e a imuno-histoquimica revelaram bacilos álcool-ácido resistentes no interior de macrófagos, de células gigantes de Langhans e livres na mucosa e submucosa do intestino e dos linfonodos mesentéricos. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis foi isolado em cultivo bacteriano de amostras de fezes, raspado de mucosa intestinal e de linfonodos mesentéricos. A identificação do agente foi realizada pela técnica de PCR IS900. Foi realizado, também, levantamento sorológico de 136 búfalos da propriedade através da técnica de ELISA, na qual foram observados 15,45 % reagentes. O diagnóstico da paratuberculose foi baseado nos dados clínicopatológicos, sorologia, isolamento e identificação do agente. / It´s described the epidemiologic, clinical and pathologic aspects of paratuberculosis in a bubaline herd in Guaiba city, southern Brazil. The property had one hundred and ninety animals for milk and meet production. Six adults Mediterranean breed bubalines showed chronic intermittent diarrhea, lost of weight and normal appetite. At necropsy, the lymphatic vessels were prominent in the serosa, the mesenteric lymphnodes were slightly enlarged with dark areas interwoven by multinodular white spots mainly in the cortical region. The intestine mucosa were thickened and of corrugated aspect. The microscopic exam revealed severe diffuse granulomatous inflammation, marked dilatation of the lymphatic vessels, granulomatous lymphangitis and lymphangioectasia from the duodenum to the large bowl. The mesenteric lymphnodes showed similar histological lesions. Acid-fast bacilli in macrophages, in Langhans giant cells and freely in the mucosa and submucosa of the small intestine and lymphnodes were shown at Ziehl-Neelsen staining and immunohistochemistry. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis was isolated through bacterial cultivation of samples taken from feces, intestinal mucosa, mesenteric lymphnodes, and identified through IS900 PCR. In addition, a serologic survey was performed in the property by ELISA test. 15.45 percent of the animals reacted positive to the test. The diagnosis of paratuberculosis was based on clinical, pathological and epidemiological data, serology exam, bacterial isolation and identification of the agent.

As micobactérias compreendem um grupo de organismos que são heterogêneos em termos de metabolismo, crescimento, nicho ambiental, epidemiologia, patogenicidade, distribuição geográfica e associação com doenças. O diagnóstico micobacteriológico é atualmente um desafio aos laboratórios. Com a descrição de novas espécies de micobactérias nos últimos anos, tem sido cada vez mais difícil identificar com precisão estas espécies. Uma questão básica na identificação em micobactérias é a diferenciação entre o Complexo Mycobacterium tuberculosis e as Micobactérias Não Causadoras de Tuberculose (MNT); no entanto tem sido cada vez mais importante a diferenciação das MNT. Em virtude das semelhanças fenotípicas e genotípicas, é necessário a aplicação e desenvolvimento de metodologias que melhor caracterizem as MNT para que seja possível determinar de forma mais precisa a prevalência das diferentes espécies. Além disso, diferentes espécies de MNT podem apresentar diferenças no perfil de sensibilidade às drogas terapêuticas, sendo que a identificação precisa é crucial para a adoção de terapia medicamentosa adequada. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os isolados de MNT através da comparação entre duas técnicas moleculares, a técnica de PRA-hsp65 e um kit comercial GenoType® Mycobacterium CM, usando o método de sequenciamento do gene hsp65 como padrãoouro. Foram analisadas 96 isolados e a concordância entre os resultados do PRA-hsp65 e do GenoType® Mycobacterium CM foi de 92%. O método molecular PRA-hsp65 mostrou-se eficaz na identificação das espécies em 91% das amostras e o GenoType® Mycobacterium CM em 92%. Em relação aos custos referentes aos dois métodos, foi possível estabelecer que o PRA-hsp65 apresentou um valor final consideravelmente inferior ao do GenoType® Mycobacterium CM. No entanto, a técnica comercial necessita um prazo mais curto (2 dias) para ser realizada em comparação com a técnica PRA-hsp65 (requer 5 dias). Na nossa avaliação, a aplicabilidade do PRA-hsp65 aumenta a qualidade e rapidez do resultado final, já que se mostrou discriminatório, de baixo custo e relativamente de fácil execução na identificação de micobactérias. É possível concluir que ambas as técnicas moleculares avaliadas neste estudo apresentaram uma ótima capacidade de identificação de MNT, sendo que a implementação destas técnicas dependerá das características dos diferentes laboratórios bem como as necessidades clínicas das diferentes instituições. / Mycobacteria comprise a group of organisms that are heterogeneous in terms of metabolism, growth, environmental niche, epidemiology, pathogenicity, geographic distribution and disease association. The laboratory diagnosis of mycobacteria is currently a challenge to laboratories. Due to the increased description of new species of mycobacteria in recent years it is becoming difficult to accurately identify these species. A basic question in the identification of mycobacteria is the differentiation between Mycobacterium tuberculosis and the Non-Tuberculous Mycobacteria (NTM); however it has been increasingly important to differentiate the NTM species. Due to the fact that there are phenotypic and genotypic similarities, it is necessary to apply and develop methodologies to better characterize the NTM to be able to determine more accurately the prevalence of different species. Furthermore, different NTM species may differ in the profile of sensitivity to therapeutic drugs, and accurate identification is crucial for the adoption of appropriate drug therapy. The objective of this study was to characterize NTM isolates by comparing two molecular techniques, the technique of PRA-hsp65 (PCR-Restriction Enzyme Analysis) and a commercial kit GenoType® Mycobacterium CM, using the sequencing the hsp65 gene as gold standard. We analyzed 96 samples and the concordance between the results of the PRA-hsp65 and the GenoType® Mycobacterium CM was 92%. The PRA-hsp65 molecular method proved to be effective in 91% of species identification and the GenoType® Mycobacterium CM in 92%. Regarding costs for the two methods, we could establish that the PRA-hsp65 had a final value considerably lower than the GenoType® Mycobacterium CM. However, the commercial technique requires a shorter period (2 days) to be performed in comparison with the technique PRA-hsp65 (requires five days). In our evaluation, the applicability of the PRA-hsp65 increases the quality and speed of the final result (in relation to traditional phenotypic identification or outsourcing in referral centers), and proved to be discriminatory, inexpensive and relatively easy to perform the identification of mycobacteria. Finally, we conclude that both molecular techniques evaluated in this study showed a great capacity for identification of NTM and that the implementation of these techniques. However, depend on the characteristics of different laboratories as well as the clinical needs of different institutions.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-05-22T16:01:34Z No. of bitstreams: 1 Thaís Silva Peleteiro. Ausência de... 2012..pdf: 1334643 bytes, checksum: 7f6e0513fc52b940cf9cdb87c6d33f1f (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-22T16:01:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Thaís Silva Peleteiro. Ausência de... 2012..pdf: 1334643 bytes, checksum: 7f6e0513fc52b940cf9cdb87c6d33f1f (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Introdução: As doenças respiratórias alérgicas, tais como rinite e asma, afetam elevada proporção da população brasileira. Estima-se que mais de 58 mil pessoas foram afetadas por alguma destas condições no Brasil em 2002-2003. Estudos realizados em humanos e animais sugerem que a exposição ambiental ao Mycobacterium tuberculosis ou imunização com o M. bovis (vacina BCG), podem estar relacionadas à proteção contra doenças alérgicas. Objetivo: Investigar a influência da resposta Th1 a antígenos micobacterianos sobre a modulação da resposta do tipo Th2 ao ácaro Dermatophagoides pteronyssinus (Derp). Métodos: O estudo compreendeu duas fases. Para avaliar o efeito da resposta à revacinação com o BCG sobre a modulação de uma resposta do tipo Th2 ao Derp, foi realizado um estudo de intervenção randomizado com coorte prospectiva, e os voluntários que participaram compuseram a Amostra 1. Para avaliar o efeito da resposta à infecção latente com M. tuberculosis sobre a modulação de uma resposta do tipo Th2 ao Derp, foi feito um estudo de caso-controle e os voluntários que participaram compuseram a Amostra 2. A população foi composta por adultos jovens com idade entre 19 a 33 anos. Todos responderam ao questionáro ISAAC, modificado. Foi feita coleta de sangue para quantificação da IgE total, IgE específica ao D. pteronyssinus e citocinas das respostas Th1/Th2/inflamatória. Resultados: Não houve diferenças, quanto à produção de citocinas, IgE total e específica ao Derp, entre os grupos controle e revacinados ou entre os indivíduos infectados e não infectados. Isso foi verificado pela ausência de diferenças na produção de citocinas ou nos níveis de IgE total e específica ao Derp entre os grupos atópicos e não atópicos das duas amostras avaliadas. Conclusões: Não houve influência da resposta Th1 ao M. bovis (BCG) ou da resposta Th1 ao M. tuberculosis sobre a modulação da resposta do tipo Th2 ao ácaro D. pteronyssinus, indicando que o contato com micobactérias não parece afetar a resposta alérgica pré-estabelecida em indivíduos adultos jovens. / ntroduction: Allergic respiratory diseases such as asthma and rhinitis, affecting a high proportion of the Brazilian population. More than 58.000 people have been affected by some of these conditions in Brazil in 2002-2003. Studies in humans and animals suggest that environmental exposure to Mycobacterium tuberculosis or immunization with Mycobacterium bovis (BCG), may be related to protection against allergic diseases. Objective: To investigate the influence of Th1 response to mycobacterial antigens on the modulation of Th2-type response to aeroallergen Dermatophagoides pteronyssinus (Derp). Methods: The study comprised two phases. To evaluate the effect of the response to revaccination with BCG on the modulation of a Th2-type response to Derp, we conducted a randomized intervention study with prospective cohort, and the volunteers composed the Sample 1. To evaluate the effect of latent response to infection with M. tuberculosis on the modulation of a Th2-type response to Derp, a study was made of case-control and the volunteers composed the Sample 2. The population consisted of young adults aged 19 to 33 years. All responded to questionnaire ISAAC modified. Blood sampling was performed for quantification of total IgE, specific IgE to D. pteronyssinus and cytokine responses Th1/Th2/inflamatória. Results: No significant differences in cytokine production or levels of total and specific IgE to Derp between atopic and non-atopic groups of the two samples. Conclusions: There were no differences regarding cytokine production, total and specific IgE to Derp, between the control group and revaccinated or between infected and uninfected individuals indicating that contact with mycobacteria not seem to affect the allergic response in adults young.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-08-01T18:14:31Z No. of bitstreams: 1 Melissa Moura Abbehusen Estudo da imunogenicidade de vacinas de....pdf: 867164 bytes, checksum: 4ef801f12d349f64700eea900fccfc9b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-01T18:14:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melissa Moura Abbehusen Estudo da imunogenicidade de vacinas de....pdf: 867164 bytes, checksum: 4ef801f12d349f64700eea900fccfc9b (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A Proteína ácida ribossomal de Leishmania infantum (L. infantum) - LiP0 é um componente estrutural da subunidade maior do ribossomo e já foi descrita como um antígeno imunodominante, que participa na síntese de outras proteínas e é capaz de induzir resposta imune humoral específica em soro de pacientes e cães infectados com Leishmania chagasi (L. chagasi). Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis), é uma micobactéria oportunista, que apresenta crescimento rápido e uma poderosa capacidade adjuvante, já sendo utilizado como vetor de expressão para diversos antígenos. Neste trabalho avaliamos a capacidade imunoprotetora do Mycobacterium smegmatis recombinante (rM.smegmatis) expressando o gene que codifica a LiP0, bem como o plasmídeo e/ou proteína LiP0 utilizando estratégia homóloga (composta de plasmídeo de DNA) e heteróloga (composta de plasmídeo de DNA adicionado a proteína recombinante e CpG), contra a infecção causada por L. chagasi em hamsters. Hamsters foram imunizados e posteriormente infectados com L. chagasi por via endovenosa. Os animais imunizados com a micobactéria, apesar de apresentarem resposta imune humoral anti-M. smegmatis, não produziram anticorpo contra LiP0, que só foram detectados no soro dos animais que receberam a estratégia heteróloga de imunização. Na análise de citocinas, observou-se que os animais imunizados com rM.smegmatis LiP0 apresentaram maior concentração de IFN-γ e menor quantidade de TGF-ß e IL-10 quando comparado aos grupos controle, sugerindo uma resposta Th1. Em diferentes momentos após o desafio, o grau de proteção avaliado pela carga parasitária em órgãos alvo, foi estimado por ensaio de diluição limitante. Nenhuma diferença foi observada na carga parasitaria do baço, fígado e linfonodo em hamsters imunizados ou controles em todos os pontos da avaliação, sugerindo que a LiP0, não protegeu hamsters imunizados tanto com o Mycobacterium expressando o gene que codifica a proteína, nem como vacina de DNA utilizando a estratégia homóloga ou heteróloga contra infecção por L.chagasi. / The acid ribosomal protein of Leishmania infantum (L. infantum) - LiP0 is a structural component of the ribosomal subunit and it was described as an immunodominant antigen recognized either by serum of patients and dogs infected by Leishmania chagasi (L. chagasi) and cooperates in the synthesis of other proteins. Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis) is a opportunistic bacteria, which presents rapid growth, is a potent adjuvant and has been used as carrier of antigens in several different experimental models of immunoprotection. In this work we evaluate the immunoprotective capacity of recombinant M. smegmatis (rM. smegmatis) carrying the gene of LiP0 and the DNA or protein of LiP0 using homologous strategy (composed of plasmid DNA) and heterologous (consisting of plasmid DNA and recombinant protein more CpG) to immunize hamsters against infection by L. chagasi. The immunized animals produced anti-M.smegmatis antibodies but they did not produce antibody against LiP0, detected only in animals who received the heterologous strategy of vaccination. In the analysis of cytokines, we observed that animals immunized with rM.smegmatis LiP0 had higher concentration of IFN-γ and lower amounts of TGF-ß and IL-10 compared to control groups, suggesting a Th1 response. At different times after challenge, the degree of protection, evaluated by parasite load in the target organs, was estimated by limiting dilution assay. No difference was observed in the parasite load in the spleen, liver and lymph node between immunized hamsters and controls at all points of evaluation. There was no protection in animals immunized with rM. smegmatis expressing the acidic ribosomal protein gene, suggesting that LiP0 did not protect hamsters immunized with either Mycobacterium expressing the gene encoding the protein or DNA as a vaccine strategy using homologous or heterologous against infection L.chagasi.

Made available in DSpace on 2016-05-16T12:55:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 natalia_roque_ioc_mest_2011.pdf: 2207785 bytes, checksum: 5965085ee04bb1de36ccb11445b61038 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A formação de corpúsculos lipídicos é um evento que tem sido recentemente descrito durante a tuberculose tanto em condições clinicas quanto experimentais. O aumento no número dessas organelas é um fenômeno bem regulado que parece ter uma importante implicação na patogênese microbiana. Contudo, os mecanismos pelos quais as micobactérias desencadeiam a formação dos corpúsculos lipídicos bem como o seu papel na infecção ainda não estão totalmente compreendidos. Investigamos nesse trabalho os primeiros eventos da defesa do hospedeiro em resposta a infecção por BCG, bem como a formação de corpúsculos lipídicos, os receptores envolvidos na sua biogênese e o seu papel na modulação via endocítica. Durante a infecção experimental por BCG ocorreu uma intensa migração de neutrófilos nas 6 h iniciais. Em 24 h, um grande número de neutrófilos infectados (92%) apresentavam características de morte celular por apoptose. Nos experimentos in vitro, tanto os neutrófilos apoptóticos quanto a infecção com BCG sozinho foram capazes de induzir a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos. Contudo, a resposta foi amplificada no grupo contendo tanto os neutrófilos apoptóticos quanto o BCG. Ainda, o pré-tratamento in vivo com um inibidor de pan-caspase, o zVAD, inibiu a apoptose de neutrófilos, sem modificar o recrutamento destas células nos camundongos C57Bl/6 infectados com BCG. Sob esta condição, a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos foi significativamente inibida nos animais infectados, indicando o papel da célula apoptótica na formação dos corpúsculos lipídicos durante a infecção Além disso, foi observado o envolvimento dos receptores CD14 e CD36 na biogênese dos corpúsculos lipídicos induzidos por BCG in vitro e in vivo respectivamente. A parede celular das micobactérias tem sido apresentada como importante componente na interação patógeno-hospedeiro. Dessa forma, analisamos o papel de componentes da parede micobacteriana na indução de corpúsculos lipídicos. Foi observado que o LAM, TDM e TMM além do BCG, foram capazes de induzir a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos após 24 h de estimulação in vitro. Porém, a micobactéria não patogênica M. smegmatis e partículas de látex não revestidas não foram capazes de induzir um aumento no número de corpúsculos lipídicos. A análise por microscopia eletrônica de transmissão demonstrou a associação dos corpúsculos lipídicos com os fagossomas além da imagem sugestiva de um corpúsculo lipídico internalizado por um fagossoma infectado durante a infecção experimental por BCG in vivo Por imunofluorescência, foi observado que a interação dos corpúsculos lipídicos com os fagossomas não é dependente da viabilidade bacteriana. Partículas de látex revestidas com os componentes da parede micobacteriana LAM ou PIM apresentaram-se próximas dos corpúsculos lipídicos em diferentes tempos em experimentos in vitro. Após 24 h de infecção por BCG in vivo foi observada a presença da proteína da via endocítica Rab7 e do seu efetor a RILP, mas não da Rab5, co-localizada com os corpúsculos lipídicos, sugerindo que os corpúsculos lipídicos possam estar seqüestrando a Rab7, necessária para a maturação fagossomal. Nossos resultados mostraram diferentes mecanismos envolvidos na biogênese dos corpúsculos lipídicos induzidos por BCG sugerindo que a modulação dessas organelas pelo patógeno pode representar um importante mecanismo de escape da resposta imune do hospedeiro e um futuro alvo terapêutico / Lipid body formation is an event that has been recently described during tuberculosis in both clinical and experimental conditions. The increase of these organelles is a well regulated phenomenon that seems to have an implication in microbial pathogenesis. However, the mechanisms by which the microbial trigger the lipid bodies formation as well as its role in the infection are still not fully understood. We investigated in this work the first events of the host defense in the BCG infection response, as well as the lipid bodies formation, the receptors involved in their biogenesis, and their role in endocytic pathway modulation. During the experimental infection by BCG a great neutrophils influx happened in the initial 6 h. In 24h, a great number of infected neutrophils (92%) showed apoptotic cell death features. In in vitro experiments, both apoptotic neutrophils and BCG infection alone were able to induce lipid bodies formation in macrophages. However, the response was amplified in the group containing both apoptotic neutrophils and BCG. Still, the pre treatment in vivo with pan-caspase inhibitor, zVAD, inhibited the neutrophils apoptosis, without modifying the influx of these cells in the BCG infected C57Bl/6 mice. Under this condition, the lipid body formation in macrophages was drastically inhibited in infected animals, indicating the role apoptotic cells in the lipid body biogenesis during the infection. Beyond that, was observed the involvement of CD14 and CD36 receptors in the lipid bodies biogenesis induced by BCG in vitro and in vivo, respectively. The mycobacteria cell wall has been presented as an important component of host-pathogen interaction. In this way, we analyzed the role of mycobacteria cell wall component in the lipid bodies induction. It was observed that LAM, TDM, and TMM, beside BCG, were able to induce the lipid bodies formation in macrophages after 24h of in vitro stimuli. However, the non-pathogenic mycobacteria M. smegmatis and non coated latex beads were not able to induce an increase in the numbers of lipid bodies. Transmission electronic microscopic analyze showed an interaction between the lipid bodies and phagosomes, beside a suggestive image of an infected phagosome with an internalized lipid body during the experimental BCG infection in vivo. By imunofluorescence, it was observed that the interaction between the lipid bodies and phagosomes is not dependent of bacterial viability. Latex beads coated with mycobacterial cell wall components LAM or PIM presented themselves close of the lipid bodies in different times in in vitro experiments. After 24h of in vivo BCG infection, was observed the presence of Rab7 endocytic pathway protein and its effector RILP, but not the Rab5, co-localized with the lipid bodies, suggesting that the lipid bodies could be highjacking the Rab7, needed for the phagosome maturation. Our results showed different mechanisms involved in the lipid bodies biogenesis induced by BCG, suggesting that modulation of these organelles by the pathogen could represent an important escape mechanism of the host immune response and a future therapeutic target.

O Mycobacterium tuberculosis infecta um terço da população mundial. Cerca de 7 a 8 milhões de novos casos e 1,7 milhão de mortes ocorrem por ano no mundo. A disseminação de isolados clínicos de M. tuberculosis mostra grande dispersão destas cepas mundialmente, influenciando na transmissão e possivelmente o desenvolvimento de quadros clínicos distintos. O presente estudo teve como objetivo a avaliação da relação clonal, da sensibilidade aos agentes antimicrobianos específicos e da resistência ao Nitrito de Sódio de 19 isolados clínicos de M. tuberculosis, obtidos de estudo epidemiológico para averiguação da transmissão em contatos domiciliares. Foi observado que 36,8% (n=7) dos isolados foram resistentes aos radicais de nitrogênio em que o percentual de viabilidade ao NaNO2 variou de 17,1 a 114%. O teste de sensibilidade aos agentes antimicrobianos demonstrou que 42,1% (n=8) das cepas se mostraram resistentes a pelo menos uma das drogas testadas. Cinco cepas (26,3%) apresentaram resistência a uma droga, 15,7% (n=3) se mostraram resistentes a três ou mais drogas antimicobacterianas, demonstrando a circulação do fenótipo XDR. A maioria das cepas (57,8%) foram sensíveis as 6 drogas testadas. Quanto ao perfil molecular, avaliado através das técnicas de MIRU e Spoligotyping, foi demonstrado a inexistência de clones entre as amostras estudadas. No entanto, apesar de alguns isolados pertencerem a famílias previamente descritas como circulantes no território nacional (LAM, LAM 3, LAM 6, LAM 9, Haarlem - H, Haarlem 1 - H1, Haarlem 3 - H3), alguns deles pertenceram a famílias ainda não descritas como circulantes no país (T1 e U), demonstrando a dispersão e emergência de clones distintos na cidade do Rio de Janeiro. / Mycobacterium tuberculosis infects one third of the population of the world. Almost 7 to 8 million of new cases are diagnosed, and 1.7 million of deaths are reported by year. The dissemination of clinical isolates demonstrates a great dispersion of clones, and may influence the transmission and possibly, the development of distinct clinical outcomes. This study aimed to evaluate the clonal relationship among the isolates, the susceptibility to antimicrobial agents, and the resistance to sodium nitrite of M. tuberculosis clinical strains from a previous epidemiological study to evaluate the transmission within close contacts. It was found that 36.8% (n=7) were resistant to nitrogen reactive species (percentage of viability varied from 17.1 to 114%). The susceptibility to six antimicrobials demonstrated that 42.1% (n=8) of isolates were resistant to at least one of the drugs and 15.7% (n=3) presented resistance to two or more drugs, demonstrating the circulation of extensive drug resistant phenotype (XDR). Most of the clinical strains (57.9%) was sensitive to 6 tested drugs. In relation to the molecular profile evaluated by MIRU and Spoligotyping, it was observed the inexistence of clones among the isolates. Although some strains were related to families already described as circulating in our country (LAM, LAM 3, LAM 6, LAM 9, Haarlem - H, Haarlem 1 - H1, Haarlem 3 - H3), some isolates were characterized within families never previously described in Brazil or Latin America (T1 e U), showing the dispersion and the emergency of distinct clones in Rio de Janeiro.

Descrevem-se os aspectos epidemiológicos e clínico-patológicos da paratuberculose em um rebanho de búfalos no Município de Guaíba no Rio Grande do Sul. A propriedade possuía cento e noventa e quatro búfalos principalmente da raça mediterrâneo e destinava-se a produção de leite e carne. No período de abril de 2009 a setembro de 2010 seis búfalos apresentaram diarreia crônica intermitente, perda de peso e apetite normal. Na neccropsia observaram-se vasos linfáticos proeminentes no mesentério e na mucosa do intestino. Os linfonodos mesentéricos estavam moderadamente aumentados, com áreas escuras entremeadas com focos multinodulares brancacentos, principalmente na região cortical. A mucosa do intestino se encontrava espessa e cerebriforme. Ao exame histológico, desde o duodeno até o intestino grosso havia infiltrado composto principalmente por macrófagos epitelióides e, em menor escala, linfócitos, plasmócitos e células gigantes tipo Langhans. Outros achados observados foram dilatação dos vasos linfáticos, linfangite granulomatosa e linfangiectasia. Nos linfonodos mesentéricos verificaram-se lesões histológicas semelhantes. A coloração de Ziehl-Neelsen e a imuno-histoquimica revelaram bacilos álcool-ácido resistentes no interior de macrófagos, de células gigantes de Langhans e livres na mucosa e submucosa do intestino e dos linfonodos mesentéricos. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis foi isolado em cultivo bacteriano de amostras de fezes, raspado de mucosa intestinal e de linfonodos mesentéricos. A identificação do agente foi realizada pela técnica de PCR IS900. Foi realizado, também, levantamento sorológico de 136 búfalos da propriedade através da técnica de ELISA, na qual foram observados 15,45 % reagentes. O diagnóstico da paratuberculose foi baseado nos dados clínicopatológicos, sorologia, isolamento e identificação do agente. / It´s described the epidemiologic, clinical and pathologic aspects of paratuberculosis in a bubaline herd in Guaiba city, southern Brazil. The property had one hundred and ninety animals for milk and meet production. Six adults Mediterranean breed bubalines showed chronic intermittent diarrhea, lost of weight and normal appetite. At necropsy, the lymphatic vessels were prominent in the serosa, the mesenteric lymphnodes were slightly enlarged with dark areas interwoven by multinodular white spots mainly in the cortical region. The intestine mucosa were thickened and of corrugated aspect. The microscopic exam revealed severe diffuse granulomatous inflammation, marked dilatation of the lymphatic vessels, granulomatous lymphangitis and lymphangioectasia from the duodenum to the large bowl. The mesenteric lymphnodes showed similar histological lesions. Acid-fast bacilli in macrophages, in Langhans giant cells and freely in the mucosa and submucosa of the small intestine and lymphnodes were shown at Ziehl-Neelsen staining and immunohistochemistry. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis was isolated through bacterial cultivation of samples taken from feces, intestinal mucosa, mesenteric lymphnodes, and identified through IS900 PCR. In addition, a serologic survey was performed in the property by ELISA test. 15.45 percent of the animals reacted positive to the test. The diagnosis of paratuberculosis was based on clinical, pathological and epidemiological data, serology exam, bacterial isolation and identification of the agent.

Orientador: Ida Maria Foschiani Dias Baptista / Banca: Cleverson Teixeira Soares / Banca: Fernanda Saloum de Neves Manta / Resumo: O acesso às informações sobre a hanseníase, seu diagnóstico e tratamento com a Poliquimioterapia (PQT) se constituem como elementos chave da estratégia para seu controle. Resultado da infecção pelo Mycobacterium leprae (M. leprae), a hanseníase é uma doença crônica que acomete pele e nervos e a impossibilidade de cultivo do M. leprae em meio de cultura axênico, tem dificultado os estudos in vitro e o desenvolvimento de ensaios clínicos mostram-se complicados pela lenta progressão do bacilo. Assim, um método sensível e específico para a detecção da viabilidade do M. leprae adicionaria um critério imparcial aos meios já disponíveis, possibilitando ainda o diagnóstico em estágio mais precoce da doença. O presente estudo teve por finalidade a avaliação da viabilidade bacilar por meio da detecção de RNAr 16S específico para o M. leprae com a normalização das quantidades totais de micobactérias a partir da quantificação do DNA total de M. leprae. Foi utilizada como padrão a inoculação em coxim plantar de camundongos (Técnica de Shepard). Foram avaliados pacientes antes do tratamento, suspeitos de recidivas e pacientes em fim de tratamento. A inoculação foi altamente positiva nos pacientes não tratados quando comparados com os dos grupos recidiva e fim de tratamento. Os resultados sugerem que existe uma boa correlação entre os dados obtidos com a inoculação e o ensaio molecular, uma vez que também foi possível detectar níveis de RLEP e 16S rRNA nestas amostras. Esta metodologia poderá, futuramente, ajudar no monitoramento da eficácia do tratamento e na busca de novas possibilidades para o estudo da interação parasito-hospedeiro / Abstract: Access to information about the disease, its diagnosis and treatment with multidrug therapy (MDT) are constituted as key elements of the strategy for its control. Result of infection by Mycobacterium leprae (M. leprae), leprosy is a chronic disease that affects the skin and nerves and the impossibility of cultivating M. leprae in axenic culture medium, has hampered in vitro studies and the development of clinical trials show is complicated by the slow progression of the bacillus. Thus, a sensitive and specific method for detection of viable M. leprae add a fair criterion to the means already available, allowing diagnosis even in early stage disease. This study aimed at evaluating the bacterial viability by specific 16S rRNA detection for M. leprae with the normalization of the total quantities of mycobacteria from the quantification of total DNA of M. leprae. It was used as a standard inoculation into the footpads of mice (Shepard Technique). Patients were evaluated prior to treatment and relapses in patients suspected to treatment. The inoculation was highly positive in untreated patients compared to the relapse groups and end of treatment. The results suggest that there is a good correlation between the data obtained from inoculation and molecular assay, since it was also possible to detect levels of 16S rRNA and RLEP these samples. This methodology may in the future help monitor the effectiveness of treatment and the search for new possibilities for the study of host-parasite interaction / Mestre