A tuberculose é considerada um problema emergente de saúde pública. Este estudo tem como objetivo avaliar a associação da patogenicidade/virulência e propriedades imunomoduladoras de isolados clínicos de Mbv (cepas B2 e MP287/03) e Mtb (cepa Beijing 1471), e da cepa de Mtb H37Rv, como referência de virulência. Os isolados, MP287/03 e Beijing 1471, apresentaram maior virulência em relação às demais cepas, levando os camundongos à morte ainda na fase aguda de infecção. Foi verificada baixa produção de mediadores pró-inflamatórios nos animais infectados com o isolado MP287/03, enquanto nos infectados com o isolado Beijing 1471 os níveis destes mediadores foram exacerbados. O desbalanço na produção destes mediadores pode ter contribuído para morte precoce dos animais. Baseado nesse estudo, nós podemos concluir que as propriedades que conferem hipervirulência aos isolados clínicos de Mbv e Mtb estão principalmente relacionadas à alta capacidade de crescimento intracelular das bactérias, que parece ser pouco alterada pela presença de citocinas pró-inflamatórias. Sendo assim, as infecções por isolados hipervirulentos podem acarretar consequências semelhantes, mesmo quando associadas a diferentes padrões de modulação da resposta imune. / Tuberculosis is an emergent problem of public health. This study aimed to evaluate the association between pathogenicity/virulence and immunemodulatory ability of Mbv (B2 and MP287/03) and Mtb (Beijing 1471) clinical isolates, using H37Rv strain as reference of virulence. The virulence was assessed in C57BL/6 mice infected with a low dose of bacilli (~100 bacteria) via intratracheal route. MP287/03 and Beijing 1471 isolates showed higher virulence than all others strains, leading to mice death during the acute phase. It was verified low production of pro-inflammatory mediators in mice infected by MP287/03 bacteria, whereas in mice infected by Beijing 1471 bacteria were observed exacerbated levels of pro-inflammatory mediators. The disbalance of these mediators may have contributed to the early mouse death. Based on this study, we concluded that the properties that confer hypervirulence to Mbv and Mtb clinical isolates are primarily related to the high intracellular growth capacity of the bacteria, which seems to be marginally affected by the presence of pro-inflammatory cytokines. Therefore, the infection by hypervirulent isolates can lead to similar outcomes, even when associated to different patterns of modulation of the immune response.

A tuberculose é uma doença infectocontagiosa causada por bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) que afeta humanos e/ou animais. Membros desse complexo evoluíram clonalmente e possuem grande similaridade genômica, diferenciando-se por polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e regiões de diferença (RDs). Dentre os patógenos da tuberculose em animais, Mycobacterium bovis, causador da tuberculose bovina, é o membro do MTBC de maior importância global. Desta maneira, o presente estudo tem por objetivo o sequenciamento, a anotação e a análise da estirpe brasileira SP38 de M. bovis, seguido da genômica comparativa desse com outros genomas de M. bovis depositados no GenBank. Mycobacterium bovis SP38 apresenta um genoma tradicional de micobactéria tuberculosa, sendo esse único, circular com 4.347.646 pb, alto conteúdo de GC (65,6%) e 4.216 genes, incluindo 154 pseudogenes, 3 genes de rRNA (RNA ribossomal), 45 de tRNA (RNA transportador), 2 de ncRNA (RNA não codificante), 1 tmRNA (RNA transferência-mensageiro) e 4.011 sequências de DNA codificante (CDSs) (NZ_CP015773.1). Dentre as CDSs, a maioria (2.805 - 69,93%) foi anotado com função e 1.206 (30,07%) como hipotéticos. Para a genômica comparativa, os 31 genomas completos ou em drafts de M. bovis depositados no GenBank, 32 genomas de Mycobacterium bovis BCG e 23 genomas de Mycobacterium tuberculosis foram selecionados. Análises in silico dos padrões de RD resultaram na exclusão de três genomas anotados equivocadamente como M. bovis virulentos. A análise de genes ortólogos sugere que M. bovis está sob processo de decay genômico. A quantificação de sítios polimórficos indica uma maior variabilidade genética em números totais (8.335 em M. tuberculosis, 3.448 em M. bovis virulentos, e 1.088 em M. bovis BCGs) e comparações par-a-par (p ≤0,05) de M. tuberculosis em relação a M. bovis virulentos e BCGs, indicando uma maior pressão evolutiva sob M. tuberculosis, contrastando com o fato de que M. bovis é capaz de infectar um maior número de espécies hospedeiras que M. tuberculosis. A maioria desses sítios polimórficos estão localizados em CDSs hipotéticos (31,7% - 51,3%), sendo associados a família gênica PE/PPE, e apresentam uma proporção de mutações não sinônimas crescentes pela ordem M. bovis BCG, M. bovis virulentos e M. tuberculosis (48,90%, 51,92% e 59,52%, respectivamente). Essa menor proporção de mutações não sinônimas e a categorização funcional dissimilar entre CDSs contendo sítios polimórficos, indica que M. bovis BCG está sujeito a diferentes pressões seletivas quando comparado a M. bovis virulentos e M. tuberculosis. Por fim, a análise filogenética baseada em sítios polimórficos indica agrupamentos filogenéticos de M. bovis suportados pela classificação dos Complexos Clonais (CCs) e não por hospedeiros de origem dos isolados, confirmando que sítios polimórficos podem ser utilizados para classificação filogenética de linhagens genéticas desta espécie bacteriana. Além do mais, 2/28 (7,14%) genomas de M. bovis não puderam ser classificados nos CCs atualmente descritos, sugerindo a existência de complexos ainda não determinados. Este estudo representa o primeiro genoma de uma estirpe nacional de M. bovis a ser completamente sequenciado e a primeira análise de genômica comparativa de genomas desta espécie bacteriana. / Tuberculosis is an infectious disease caused by bacteria of the Mycobacterium tuberculosisComplex (MTBC) that affects human beings and/or animals. Members of this complex clonally evolved and have high genomic similarity, differentiated by single nucleotide polymorphisms (SNPs) and regions of difference (RDs). Among the animal tuberculosis pathogens, Mycobacterium bovis, the causative agent of bovine tuberculosis, is the MTBC member of greatest global importance. Therefore, the aim of the present study is to sequence, assemble and annotate the genome of the Brazilian strain SP38 of M. bovis, followed by the comparative genomics with other M. bovis genomes available in GenBank. Mycobacterium bovis SP38 has a traditional mycobacteria genome. It has a single and circular chromosome with 4,347,646 bp, high GC content (65.6%), and 4,216 genes, including 154 pseudogenes, 3 rRNA genes (ribosomal RNA), 45 tRNA (transfer RNA), 2 ncRNA (non-coding RNA), 1 tmRNA (transfer-messenger RNA), and 4,011 coding DNA sequences (CDSs) (NZ_CP015773.1). The majority of CDSs (2,805 - 69,93%) was annotated with function and 1,206 (30,07%) are hypothetical. For the comparative genomics analyses, the 31 genomes (complete and drafts) of M. bovis available in GenBank, 32 Mycobacterium bovis BCG and, 23 of Mycobacterium tuberculosis were chosen. In silico analysis of the RDs patterns resulted in the exclusion of three genomes, mistakenly annotated as virulent M. bovis. Orthologous gene analysis suggests that strains of M. bovis are under genomic decay. The quantification of polymorphic sites indicates the greater variability in absolute numbers (8,335 in M. tuberculosis, 3,448 in virulent M. bovis, and 1,088 in M. bovis BCG) and in pairwise comparisons (p≤0,05) of M. tuberculosis compared to virulent M. bovis and M. bovis BCG, suggesting that M. tuberculosis is under high evolutionary pressure. This is in contrast to the fact that M. bovis is capable of infecting a higher number of host species than M. tuberculosis. Most of these polymorphic sites are located in hypothetical CDSs (31.7% - 52.3%), being associated with PE/PPE family, and demonstrating a nonsynonymous mutations proportion of the following increasing order: M. bovis BCG, virulent M. bovis and M. tuberculosis (48.90%, 51.92% and 59.52%, respectively). This lower proportion of nonsynonymous mutations and the dissimilar functional categorization of CDSs with polymorphic sites indicates that M. bovis BCG is subjected to different selective pressure when compared to virulent M. bovis and M. tuberculosis. Finally, the phylogenetic analysis based on polymorphic sites indicates that the phylogenetic grouping of M. bovis is supported by Clonal Complexes (CCs), and not by the host of M. bovis isolates, confirming that polymorphic sites can be used for phylogenetic classification of genetic lineages of this bacterial species. Furthermore, 2/28 (7.14%) genomes of M. bovis could not be classified in the currently described CCs, suggesting the existence of complexes yet to be determined. This study represents the first genome of a Brazilian strain of M. bovis to be completely sequenced and the first comparative genomic analysis of the genomes of this bacterial species.

O Mycobacterium bovis causa a tuberculose bovina, doença zoonótica que propaga, provavelmente com baixa prevalência, em todo o território nacional e pode ser transmitida pelo leite. A adoção sistemática da pasteurização do leite contribuiu para a redução dos casos humanos da doença, mas em alguns países, como o Brasil, é comum o consumo de leite cru e de seus derivados, o que pode contribuir para ocorrência de casos humanos. A participação desse agente nos atuais índices de tuberculose humana, cujo principal agente é o M. tuberculosis, é pouco investigada, mas acredita-se que seja maior do que parece. As razões que contribuem para isso incluem o fato do tratamento humano ser o mesmo independentemente do agente,e as dificuldades e alto custo de distinguir as espécies. O método de diagnóstico \"gold standard\" em laboratório para Mycobacterium bovis em amostras clínicas é o isolamento do agente em meios como Stonebrink-Leslie ou similares. A riqueza em nutrientes dos meios, mais o lento metabolismo deste agente e o alto grau de contaminantes das amostras torna imprescindível o uso de descontaminantes que, via de regra, são tóxicos para o agente, dificultando o isolamento em amostras com níveis baixos do patógeno; cenário provável no caso do leite devido à mistura com o leite de animais sadios. Mas, a despeito de constituir-se uma importante zoonose transmitida pelo leite, não existe uma metodologia oficial para detecção desse agente em alimentos lácteos. Esses fatos justificam um estudo para avaliar o desempenho de meios líquidos, já utilizados em caros sistemas automatizados para detecção de micobactérias, como alternativa para um enriquecimento seletivo do M. bovis em amostras lácteas. Assim, amostras de leite integral esterilizado e de queijo tipo parmesão foram contaminadas com 10 a 100 UFC/ml ou g de M. bovis AN5 e enriquecidas em dois meios líquidos seletivos (MGIT e MGIT modificado), foram analisados nos dias 0, 7, 14, 21, 24, 28 e 32, mantidas em estufa a 37°C. Nessas datas, uma alíquota foi semeada em meio Stonebrink-Leslie e incubada a 37°C por 60 dias. No leite, houve crescimento exacerbado do M. bovis principalmente no MGIT modificado. No queijo, não foi possível isolar M. bovis de nenhuma amostra em MGIT modificado, devido à contaminação excessiva que deteriorou o meio de cultura. O MGIT modificado foi mais eficaz como enriquecimento para o Mycobacterium bovis, mas foi menos seletivo que o MGIT. Estudos futuros devem concentrar a investigação da curva de crescimento do agente na primeira semana de enriquecimento. / Mycobacterium bovis causes bovine tuberculosis, zoonotic disease raging, probably with low prevalence, throughout the national territory and can be transmitted through the milk. The systematic adoption of milk pasteurization helped reduce human cases of the disease, but in some countries, like Brazil, is the common consumption of raw milk and its derivatives, which may contribute to the occurrence of human cases. The participation of this agent in the current rates of human tuberculosis, the principal agent is M. tuberculosis, it is not investigated, but it is believed to be larger than it looks, the reasons contributing to this include the fact that human treatment is similar regardless of the agent and the difficulty / cost to distinguish between species. The diagnostic method \"gold standard\" for Mycobacterium bovis in clinical samples is the isolation of the agent means, Leslie as Stonebrink or the like. The species richness in nutrient media, over the slow metabolism this agent and the high degree of contamination of the samples makes indispensable using decontaminant that, as a rule, are toxic to the agent, making isolation in samples with low levels of the pathogen; scenario likely due to the milk mixture with the milk of healthy animals. But, despite constitute an important zoonosis transmitted by milk, there is no official method for detection of this agent in dairy foods. These facts justify a study to evaluate the performance of liquid media, as used in expensive automated systems for detection of mycobacteria, as alternative to a selective enrichment of M. bovis in milk samples. Thus, samples of sterilized milk and Parmesan cheese type were infected with 10 to 100 CFU / ml or g of M bovis AN5 and enriched in two selective liquid media (MGIT and modified MGIT) were analyzed on days 0, 7, 14, 21, 24, 28 and 32, maintaining at 37 ° C. On that date, an aliquot was plated on Stonebrink half- Leslie and incubated at 37 ° C for 60 days. In milk, there was overgrowth of M. bovis mainly in MGIT modified. Cheese, it was not possible to isolate M. bovis no sample in MGIT modified due to excessive contamination it deteriorated the culture medium. The modified MGIT was more effective as enrichment for Mycobacterium bovis, but was less selective than the MGIT. Future studies should focus on investigating the growth curve of the agent in the first week of enrichment.

A tuberculose bovina (bTB) é um problema sanitário importante em Moçambique e ainda a espera de uma ação organizada por parte dos Serviços Veterinários Oficiais. O presente estudo teve por objetivo investigar e mapear os genótipos de Mycobacterium bovis circulantes no país e paralelamente maximizar a utilização de abatedouros como fonte de informação epidemiológica da bTB. Durante o período de outubro de 2016 a abril de 2017 foram colhidas um total de 90 amostras de lesões sugestivas de tuberculose bovina nos abatedouros Municipais de Maputo e Maxixe e dois abatedouros privados da província de Maputo. Essas amostras, juntamente com outras 10, disponibilizadas pelo Laboratório Central de Veterinária e 72 do banco de amostras de Faculdade de Veterinária de Moçambique foram processadas para isolamento, identificação e discriminação molecular (MIRU-VNTR e spoligotyping) de micobactérias. Nos abatedouros foram coletados dados para calcular as prevalências de carcaças com lesões sugestivas de tuberculose e foi estimada em 0,63% e 80% das carcaças condenadas por tuberculose apresentaram lesões compatíveis com generalização da infecção. Foram obtidos 104 isolados identificados como gênero Mycobacterium, dos quais 80 foram compatíveis com o MTBC e 10 MNT. Destes 80 MTBC, 70 foram identificados como M. bovis. O MIRU-VNTR discriminou os 70 isolados de M. bovis em 47 perfis, agrupados em 3 complexos clonais e cinco singletons. Dos 24 loci estudados, os que apresentaram maiores polimorfismos foram MIRU 960, 2996 e QUB-4052. Em relação ao spoligotyping, foram identificados cinco perfis, dos quais o mais prevalente foi o SB0961, seguido do SB0140, SB2306, SB2481 (novo) e SB1099. Dos 70 isolados submetidos a análises dos complexos clonais africano 1, africano 2, europeu 1 e europeu 2, foram detectados apenas 18,5% de europeu. O distrito de Machanga foi o que apresentou maior diversidade de isolados e o Govuro maior número de isolados de M. bovis. Quando comparados as técnicas, o MIRU-VNTR apresentou maior poder de discriminação em relação ao spoligotyping. O complexo clonal europeu 1 está relacionado com o SB0140 que por sua vez é característico de isolados do Reino Unido e de países que tiveram trocas comerciais de bovinos com o país, incluindo os circunvizinhos a Moçambique e de onde há registros da importação de animais para Moçambique. A não identificação precisa dos complexos clonais dos spoligotyping SB0961, SB2306, SB2481 relacionados, podem ser derivados do BCG, que é sugestivo de evolução clonal própria de Moçambique e os complexos clonais até hoje existentes não são suficientes para discriminar os isolados de Moçambique. Embora os dados de abatedouros sugeriram que a prevalência da tuberculose bovina em Moçambique está entre as mais baixas dos países africanos, a predominância de carcaças com lesões generalizadas significa alto risco de exposição de animais e humanos, sobretudo das populações rurais que têm estreito contato com esses animais. Esse risco é ampliado em função da alta prevalência de humanos que vivem com HIV/AIDS no país. Assim, recomenda-se que Moçambique estruture programa de controle da doença nos animais e métodos de diagnóstico que detectem a infecção por M. bovis na população humana. / Bovine tuberculosis (bTB) is a major sanitary problem in Mozambique and awaits organized action by the Official Veterinary Services. The aim of this work was to investigate and map the circulating Mycobacterium bovis genotypes in the country and to maximize the use of slaughterhouses as a source of epidemiological information for bTB. During the period from October 2016 to April 2017, a total of 90 samples with lesions suggestive of bovine tuberculosis were collected from Maputo and Maxixe Municipal abattoirs and two private abattoirs from the province of Maputo. These samples, together with 10 others provided by the Central Veterinary Laboratory and 72 from the Veterinary Faculty sample bank were processed for isolation, identification and molecular discrimination (MIRU-VNTR and spoligotyping) of mycobacteria. Samples collected in the slaughterhouses were analyzed by calculating the prevalence of carcasses with lesions suggestive of bTB, which was estimated at 0.63% and 80% of carcasses condemned for tuberculosis presented lesions compatible with generalized infection. A total of 104 isolates were identified as M. bovis as Mycobacterium genus were obtained, of which 80 were compatible with MTBC and 10 MNT. Of these 80 MTBC, 70 were identified as M. bovis. The MIRU-VNTR discriminated the 70 isolates of M. bovis in 47 profiles, grouped in 3 clonal complexes and 5 singletons. Of the 24 loci studied, the ones with the highest polymorphisms were MIRU 960, 2996 and QUB-4052. In relation to spoligotyping, five profiles were identified; SB0961 was the most prevalent, being SB0961, followed by SB0140, SB2306, SB2481 (new) and SB1099. Of the 70 isolates submitted to analyzes of the clonal complexes African 1, African 2, European 1 and European 2, only 18.5% of European complex were detected. Machanga district presented the greatest diversity of isolates, while Govuro district had largest number of isolates of M. bovis. The MIRU-VNTR presented greater power of discrimination in relation to spoligotyping. The European clonal complex 1 was related to SB0140 which in turn is characteristic of isolates from the United Kingdom and from countries that have had commercial trade in cattle with UK including those surrounding Mozambique and where there are records of imports of animals for Mozambique. The precise identification of the clonal complexes of the SB0961, SB2306 and SB2481 related spoligotypings subject to the BCG derivatives, is suggestive of the clonal evolution of Mozambique and that the clonal complexes to date are not sufficient to discriminate against the isolates from Mozambique. Although data from slaughterhouses suggested that the prevalence of bovine tuberculosis in Mozambique is among the lowest in African countries, the predominance of carcasses with generalized lesions means a high risk of animal and human exposure, especially of rural populations that have close contact with these animals. This risk is amplified due to the high prevalence of people that living with HIV/AIDS in the country. Thus, it is recommended that Mozambique structure a disease control program in animals and diagnostic methods that detect M. bovis infection in the human population.

A legislação permite o uso de leite cru para fabricar queijos com maturação superior a 60 dias em temperatura acima de 5°C, mas falta comprovação científica sólida sobre a eficácia desse processo quanto à inativação de importantes patógenos que podem estar presentes no leite, como o Mycobacterium bovis; além disso, não há metodologia oficial para pesquisa deste agente em alimentos. Desta forma, este trabalho se propôs a estabelecer um protocolo para estudar a curva de inativação do Mycobacterium bovis durante a cura do queijo. Foram fabricadas três partidas de queijo do tipo parmesão com leite pasteurizado e contaminado com uma cepa de Mycobacterium bovis isolada de bovinos abatidos no estado de São Paulo. O queijo foi curado a 18°C e analisado semanalmente até o 63ºdia. As amostras foram submetidas à diluição decimal seriada, semeadas em duplicata em meio Stonebrink-Leslie, acrescido de antibióticos, e incubadas a 37°C por 45 dias. Os resultados de um queijo foram perdidos por contaminação por fungos. O valor D18°C médio, ponderado pelas incertezas, foi de 37,5 dias ± 5,3 dias. Esse resultado indica a necessidade de outros estudos para ampliar o número de queijos estudados e obter, portanto, um resultado mais representativo do efeito da cura sobre o decaimento da população de M. bovis. Há também necessidade de melhorar o poder inibitório do meio de cultura para evitar perdas devido ao crescimento de fungos. / The legislation that regulates the specific conditions for the consumption of food allows the use of raw milk to produce cheese matured over 60 days at temperatures above 5°C; however, the effectiveness of this process in the inactivation of important pathogens that may be present in milk, such as Mycobacterium bovis, lacks solid scientific evidence. In addition, there is no official methodology for the research of this pathogen in foods. Considering that context, this study proposes to establish a protocol to study the inactivation curve of Mycobacterium bovis during cheese curing. Three matches were made with parmesan cheese and pasteurized milk contaminated with a strain of Mycobacterium bovis isolated from cattle slaughtered in the state of São Paulo. The cheese was cured at 18°C and analyzed weekly until the 63th day. The samples were submitted to decimal serial dilution, plated in duplicate in the Middle Stonebrink-Leslie, plus antibiotics, and incubated at 37° C for 45 days. The results of a single cheese were lost to fungal contamination. The value D 18°C average, weighted by the uncertainties, was 37.5 days ±5.3 days. This result indicates the need for further studies to expand the number of cheeses studied and to therefore obtain a more representative result of the effect of healing on the decay of the population of M. bovis. There is also the need to improve the inhibiting power of the culture medium to avoid losses due to fungal growth.

Considerando que os meios de cultura e as condições de incubação são os principais fatores para o sucesso do primo isolamento, além do método de descontaminação, quatro meios de cultura e três condições de incubação foram investigados. Noventa e sete amostras de lesões granulomatosas foram submetidas ao método de descontaminação com cloreto de 1-hexadecilpiridinio (HPC) a 1,5%, e semeadas em dois meios a base de ovo, Stonebrink e Löwenstein-Jensen com piruvato de sódio, e em dois meios a base de ágar, B83 e Middlebrook 7H11. Cada meio foi incubado a 37ºC por 90 dias em três condições de incubação, atmosfera com 10% de CO2, atmosfera normal e atmosfera com suposta tensão de CO2 obtida pela queima do algodão hidrófobo e fechamento do tubo com rolha de cortiça. O tipo de condição de incubação utilizado teve influência nos meios a base de ovo apenas no inicio da incubação (30 dias), mas nenhuma nos meios a base de ágar. A incubação em atmosfera com 10% de CO2 diminuiu o tempo de aparecimento da primeira colônia e aumentou o número de UFC. O meio B83 foi mais rápido no aparecimento das colônias e teve o maior sucesso de isolamento aos 30 dias, mas não houve diferença com os meios Stonebrink e Löwenstein-Jensen com piruvato, no sucesso de isolamento e número de UFC aos 60 e 90 dias. De acordo com os dados, em sete oportunidades houve isolamento de M. bovis apenas no meio de Stonebrink e em quatro apenas no B83, assim, sugere-se a utilização desses dois meios de cultura em paralelo, incubados em atmosfera com acréscimo de CO2 / Considering that the culture media and the incubation conditions are the main factors for the success of primary isolation, besides the decontamination procedure, four culture media and three incubation conditions were investigated. Ninety-seven samples of granulommatous lesions were submitted to the decontamination procedure by 1-hexadecylpyridinium chloride at 1,5% w/v, and inoculated on two egg-based media, Stonebrink and Löwenstein-Jensen with sodium pyruvate, and two agar-based media, B83 and Middlebrook 7H11. Each medium was incubated at 37ºC for 90 days in three incubation conditions, in air containing 10% CO2, in air, and in air with a supposed higher CO2 tension created by burning the hydrophobic cotton used to close the tubes and subsequently closing with a cork. The type of incubation condition used had influence on the egg-based media only at the beginning of incubation (30 days), but none on the agar-based media. The incubation in air containing 10% CO2 decreased the time to first appearance of colonies and increased the number of colonies. B83 medium showed a faster growth and detected more isolates at 30 days of incubation. However, there was no difference between B83, Stonebrink and Löwenstein-Jensen with pyruvate at 60 and 90 days of incubation. According to the data, seven M. bovis isolates grew only on Stonebrink and four only on B83, therefore, the use of both media, in parallel, incubated in air containing CO2 is suggested.

A tuberculose é uma doença infectocontagiosa causada por bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) que afeta humanos e/ou animais. Membros desse complexo evoluíram clonalmente e possuem grande similaridade genômica, diferenciando-se por polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e regiões de diferença (RDs). Dentre os patógenos da tuberculose em animais, Mycobacterium bovis, causador da tuberculose bovina, é o membro do MTBC de maior importância global. Desta maneira, o presente estudo tem por objetivo o sequenciamento, a anotação e a análise da estirpe brasileira SP38 de M. bovis, seguido da genômica comparativa desse com outros genomas de M. bovis depositados no GenBank. Mycobacterium bovis SP38 apresenta um genoma tradicional de micobactéria tuberculosa, sendo esse único, circular com 4.347.646 pb, alto conteúdo de GC (65,6%) e 4.216 genes, incluindo 154 pseudogenes, 3 genes de rRNA (RNA ribossomal), 45 de tRNA (RNA transportador), 2 de ncRNA (RNA não codificante), 1 tmRNA (RNA transferência-mensageiro) e 4.011 sequências de DNA codificante (CDSs) (NZ_CP015773.1). Dentre as CDSs, a maioria (2.805 - 69,93%) foi anotado com função e 1.206 (30,07%) como hipotéticos. Para a genômica comparativa, os 31 genomas completos ou em drafts de M. bovis depositados no GenBank, 32 genomas de Mycobacterium bovis BCG e 23 genomas de Mycobacterium tuberculosis foram selecionados. Análises in silico dos padrões de RD resultaram na exclusão de três genomas anotados equivocadamente como M. bovis virulentos. A análise de genes ortólogos sugere que M. bovis está sob processo de decay genômico. A quantificação de sítios polimórficos indica uma maior variabilidade genética em números totais (8.335 em M. tuberculosis, 3.448 em M. bovis virulentos, e 1.088 em M. bovis BCGs) e comparações par-a-par (p ≤0,05) de M. tuberculosis em relação a M. bovis virulentos e BCGs, indicando uma maior pressão evolutiva sob M. tuberculosis, contrastando com o fato de que M. bovis é capaz de infectar um maior número de espécies hospedeiras que M. tuberculosis. A maioria desses sítios polimórficos estão localizados em CDSs hipotéticos (31,7% - 51,3%), sendo associados a família gênica PE/PPE, e apresentam uma proporção de mutações não sinônimas crescentes pela ordem M. bovis BCG, M. bovis virulentos e M. tuberculosis (48,90%, 51,92% e 59,52%, respectivamente). Essa menor proporção de mutações não sinônimas e a categorização funcional dissimilar entre CDSs contendo sítios polimórficos, indica que M. bovis BCG está sujeito a diferentes pressões seletivas quando comparado a M. bovis virulentos e M. tuberculosis. Por fim, a análise filogenética baseada em sítios polimórficos indica agrupamentos filogenéticos de M. bovis suportados pela classificação dos Complexos Clonais (CCs) e não por hospedeiros de origem dos isolados, confirmando que sítios polimórficos podem ser utilizados para classificação filogenética de linhagens genéticas desta espécie bacteriana. Além do mais, 2/28 (7,14%) genomas de M. bovis não puderam ser classificados nos CCs atualmente descritos, sugerindo a existência de complexos ainda não determinados. Este estudo representa o primeiro genoma de uma estirpe nacional de M. bovis a ser completamente sequenciado e a primeira análise de genômica comparativa de genomas desta espécie bacteriana. / Tuberculosis is an infectious disease caused by bacteria of the Mycobacterium tuberculosisComplex (MTBC) that affects human beings and/or animals. Members of this complex clonally evolved and have high genomic similarity, differentiated by single nucleotide polymorphisms (SNPs) and regions of difference (RDs). Among the animal tuberculosis pathogens, Mycobacterium bovis, the causative agent of bovine tuberculosis, is the MTBC member of greatest global importance. Therefore, the aim of the present study is to sequence, assemble and annotate the genome of the Brazilian strain SP38 of M. bovis, followed by the comparative genomics with other M. bovis genomes available in GenBank. Mycobacterium bovis SP38 has a traditional mycobacteria genome. It has a single and circular chromosome with 4,347,646 bp, high GC content (65.6%), and 4,216 genes, including 154 pseudogenes, 3 rRNA genes (ribosomal RNA), 45 tRNA (transfer RNA), 2 ncRNA (non-coding RNA), 1 tmRNA (transfer-messenger RNA), and 4,011 coding DNA sequences (CDSs) (NZ_CP015773.1). The majority of CDSs (2,805 - 69,93%) was annotated with function and 1,206 (30,07%) are hypothetical. For the comparative genomics analyses, the 31 genomes (complete and drafts) of M. bovis available in GenBank, 32 Mycobacterium bovis BCG and, 23 of Mycobacterium tuberculosis were chosen. In silico analysis of the RDs patterns resulted in the exclusion of three genomes, mistakenly annotated as virulent M. bovis. Orthologous gene analysis suggests that strains of M. bovis are under genomic decay. The quantification of polymorphic sites indicates the greater variability in absolute numbers (8,335 in M. tuberculosis, 3,448 in virulent M. bovis, and 1,088 in M. bovis BCG) and in pairwise comparisons (p≤0,05) of M. tuberculosis compared to virulent M. bovis and M. bovis BCG, suggesting that M. tuberculosis is under high evolutionary pressure. This is in contrast to the fact that M. bovis is capable of infecting a higher number of host species than M. tuberculosis. Most of these polymorphic sites are located in hypothetical CDSs (31.7% - 52.3%), being associated with PE/PPE family, and demonstrating a nonsynonymous mutations proportion of the following increasing order: M. bovis BCG, virulent M. bovis and M. tuberculosis (48.90%, 51.92% and 59.52%, respectively). This lower proportion of nonsynonymous mutations and the dissimilar functional categorization of CDSs with polymorphic sites indicates that M. bovis BCG is subjected to different selective pressure when compared to virulent M. bovis and M. tuberculosis. Finally, the phylogenetic analysis based on polymorphic sites indicates that the phylogenetic grouping of M. bovis is supported by Clonal Complexes (CCs), and not by the host of M. bovis isolates, confirming that polymorphic sites can be used for phylogenetic classification of genetic lineages of this bacterial species. Furthermore, 2/28 (7.14%) genomes of M. bovis could not be classified in the currently described CCs, suggesting the existence of complexes yet to be determined. This study represents the first genome of a Brazilian strain of M. bovis to be completely sequenced and the first comparative genomic analysis of the genomes of this bacterial species.

A pasteurização do leite é obrigatória no Brasil e o sistema lento (65ºC/30 minutos) é o mais empregado na fabricação de queijos. Os parâmetros de tempo e temperatura empregados no mundo foram definidos após estudos sobre a resistência térmica do Mycobacterium tuberculosis e da Coxiella burnetti, reconhecidos como os microrganismos patogênicos, não formadores de esporos e que eventualmente podem estar presentes no leite cru, que apresentam a maior resistência térmica. Entretanto, não há estudos sobre a resistência térmica do M. bovis que circula nos bovinos no Brasil. Este estudo propôs-se a avaliar a resistência térmica (65ºC) de cinco espoligotipos de M. bovis, isolados de bovinos abatidos no estado de São Paulo, em leite integral experimentalmente contaminado. Leite UHT foi contaminado com M. bovis e, então, submetido a tratamento térmico em banho-maria a 65ºC por 30 minutos. Cada espoligotipo foi testado 3 vezes. As amostras foram retiradas do banho nos tempos 0 (o momento em que o leite atingiu 65ºC), 5, 10, 15, 20, 25 e 30 correspondendo ao tempo, em minutos, de tratamento térmico. O leite contaminado também foi analisado, para quantificação da carga inicial. O controle do processo envolveu o acompanhamento da temperatura do leite (um tubo com termômetro) e análise das enzimas fosfatase alcalina e peroxidase ao final do tratamento; para tal, amostras de leite cru foram tratadas juntamente com as amostras-teste. Para quantificação, foi realizada a diluição decimal seriada seguida da semeadura em duplicata em meio Stonebrink-Leslie (37ºC/45dias). Os resultados mostraram que foi na fase de aquecimento que ocorreu a maior taxa de morte. Houve diferença de resistência entre os espoligotipos ao processo que simulou a pasteurização lenta e o BR024 foi o mais resistente. Conclui-se que houve diferença da eficácia da pasteurização, de acordo com o espoligotipo testado, mas que os resultados precisam ser melhor investigados. / Milk pasteurization is mandatory in Brazil and the Low Temperature Long Time - LTLT - Pasteurization (62 to 65°C/30 min.) is normally used for cheese making. Permitted parameters were based on the reports of Myconbacterium bovis/tuberculosis inactivation made up to that time. Since then, just a few studies have been done to determine if the M. bovis in circulation nowadays among bovine population still presents the same pattern of inactivation. In this way, this study verified the behavior of recently isolated M. bovis against LTLT Pasteurization parameters reproduced in water bath. M. bovis isolated from bovines slaughtered in São Paulo State, Brazil. When milk reached 65°C the 0 tube was removed and refrigerated while the others taken out after 5, 10, 15, 20, 25 and 30 minutes and cooled. For controlling heat treatment a thermometer was adapted to one tube with 5 ml each of raw milk which were submitted together to heat treatment and used for analysis of peroxidase and alkaline phosphatase enzymes after 30 minutes of heat treatment. Milk samples were submitted to serial decimal dilution in peptone water (0.1%) and inoculated in the Stonebrink-Leslie media. After 45 days at 37°C, colonies were counted and the result expressed in CFU/ml. The results showed that heating phase determined more inactivation than the holding phase. The resentence was different between the spoligotypes that simulated the low pasteurization and BR024 was more resentence. The results enable us to speculate that in the worst scenario of natural contamination of the milk.

Considerando que os meios de cultura e as condições de incubação são os principais fatores para o sucesso do primo isolamento, além do método de descontaminação, quatro meios de cultura e três condições de incubação foram investigados. Noventa e sete amostras de lesões granulomatosas foram submetidas ao método de descontaminação com cloreto de 1-hexadecilpiridinio (HPC) a 1,5%, e semeadas em dois meios a base de ovo, Stonebrink e Löwenstein-Jensen com piruvato de sódio, e em dois meios a base de ágar, B83 e Middlebrook 7H11. Cada meio foi incubado a 37ºC por 90 dias em três condições de incubação, atmosfera com 10% de CO2, atmosfera normal e atmosfera com suposta tensão de CO2 obtida pela queima do algodão hidrófobo e fechamento do tubo com rolha de cortiça. O tipo de condição de incubação utilizado teve influência nos meios a base de ovo apenas no inicio da incubação (30 dias), mas nenhuma nos meios a base de ágar. A incubação em atmosfera com 10% de CO2 diminuiu o tempo de aparecimento da primeira colônia e aumentou o número de UFC. O meio B83 foi mais rápido no aparecimento das colônias e teve o maior sucesso de isolamento aos 30 dias, mas não houve diferença com os meios Stonebrink e Löwenstein-Jensen com piruvato, no sucesso de isolamento e número de UFC aos 60 e 90 dias. De acordo com os dados, em sete oportunidades houve isolamento de M. bovis apenas no meio de Stonebrink e em quatro apenas no B83, assim, sugere-se a utilização desses dois meios de cultura em paralelo, incubados em atmosfera com acréscimo de CO2 / Considering that the culture media and the incubation conditions are the main factors for the success of primary isolation, besides the decontamination procedure, four culture media and three incubation conditions were investigated. Ninety-seven samples of granulommatous lesions were submitted to the decontamination procedure by 1-hexadecylpyridinium chloride at 1,5% w/v, and inoculated on two egg-based media, Stonebrink and Löwenstein-Jensen with sodium pyruvate, and two agar-based media, B83 and Middlebrook 7H11. Each medium was incubated at 37ºC for 90 days in three incubation conditions, in air containing 10% CO2, in air, and in air with a supposed higher CO2 tension created by burning the hydrophobic cotton used to close the tubes and subsequently closing with a cork. The type of incubation condition used had influence on the egg-based media only at the beginning of incubation (30 days), but none on the agar-based media. The incubation in air containing 10% CO2 decreased the time to first appearance of colonies and increased the number of colonies. B83 medium showed a faster growth and detected more isolates at 30 days of incubation. However, there was no difference between B83, Stonebrink and Löwenstein-Jensen with pyruvate at 60 and 90 days of incubation. According to the data, seven M. bovis isolates grew only on Stonebrink and four only on B83, therefore, the use of both media, in parallel, incubated in air containing CO2 is suggested.

A legislação permite o uso de leite cru para fabricar queijos com maturação superior a 60 dias em temperatura acima de 5°C, mas falta comprovação científica sólida sobre a eficácia desse processo quanto à inativação de importantes patógenos que podem estar presentes no leite, como o Mycobacterium bovis; além disso, não há metodologia oficial para pesquisa deste agente em alimentos. Desta forma, este trabalho se propôs a estabelecer um protocolo para estudar a curva de inativação do Mycobacterium bovis durante a cura do queijo. Foram fabricadas três partidas de queijo do tipo parmesão com leite pasteurizado e contaminado com uma cepa de Mycobacterium bovis isolada de bovinos abatidos no estado de São Paulo. O queijo foi curado a 18°C e analisado semanalmente até o 63ºdia. As amostras foram submetidas à diluição decimal seriada, semeadas em duplicata em meio Stonebrink-Leslie, acrescido de antibióticos, e incubadas a 37°C por 45 dias. Os resultados de um queijo foram perdidos por contaminação por fungos. O valor D18°C médio, ponderado pelas incertezas, foi de 37,5 dias ± 5,3 dias. Esse resultado indica a necessidade de outros estudos para ampliar o número de queijos estudados e obter, portanto, um resultado mais representativo do efeito da cura sobre o decaimento da população de M. bovis. Há também necessidade de melhorar o poder inibitório do meio de cultura para evitar perdas devido ao crescimento de fungos. / The legislation that regulates the specific conditions for the consumption of food allows the use of raw milk to produce cheese matured over 60 days at temperatures above 5°C; however, the effectiveness of this process in the inactivation of important pathogens that may be present in milk, such as Mycobacterium bovis, lacks solid scientific evidence. In addition, there is no official methodology for the research of this pathogen in foods. Considering that context, this study proposes to establish a protocol to study the inactivation curve of Mycobacterium bovis during cheese curing. Three matches were made with parmesan cheese and pasteurized milk contaminated with a strain of Mycobacterium bovis isolated from cattle slaughtered in the state of São Paulo. The cheese was cured at 18°C and analyzed weekly until the 63th day. The samples were submitted to decimal serial dilution, plated in duplicate in the Middle Stonebrink-Leslie, plus antibiotics, and incubated at 37° C for 45 days. The results of a single cheese were lost to fungal contamination. The value D 18°C average, weighted by the uncertainties, was 37.5 days ±5.3 days. This result indicates the need for further studies to expand the number of cheeses studied and to therefore obtain a more representative result of the effect of healing on the decay of the population of M. bovis. There is also the need to improve the inhibiting power of the culture medium to avoid losses due to fungal growth.