L'infarctus du myocarde (IDM) est l'une des principales causes de morbi-mortalité dans le monde et ce malgré une revascularisation rapide de l’artère coronaire occlue. L'obésité est un facteur de risque majeur pour l’IDM, et concerne 15 % de la population française (enquête ObEpi-Roche/INSERM, 2012). L'objectif de notre étude a été d'étudier l'efficacité de stratégies cardioprotectrices comme l’exercice physique chronique ou l’administration d’un donneur de CO (CORM-3) dans un contexte d’obésité. Un effet cardioprotecteur de l'exercice physique chronique a été démontré sur un modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris ob/ob (génétiquement dépourvu en leptine). Cet effet implique l’activation de la voie de signalisation cardioprotectrice RISK associée à une diminution des taux cytosoliques des protéines phosphatases inhibitrices correspondantes PTEN et MK3P ce qui aboutit à une amélioration des fonctions mitochondriales. Ce travail montre la capacité différentielle de stratégies à réduire la taille de l’infarctus en cas d’obésité. Par ailleurs, il souligne l’importance du rôle des mécanismes HCO3- dépendants dans le contrôle du pH intracellulaire à la reperfusion. Ils pourraient représenter une étape clef dans la cardioprotection. / Myocardial infarction (MI) remains the leading cause of morbidity and mortality in the developing countries despite significant therapeutic advances over the last years. Obesity is a major risk factor for coronary heart disease and concern 15% of the French population (ObEpi-Roche/INSERM survey, 2012). The aim of our studie was to investigate the efficacy of cardioprotective strategies such as regular treadmill exercice or CO donor administration (CORM-3) against MI during obesity. In ob/ob mice, regular exercise induces a robust cardioprotection by increasing kinase phosphorylation of RISK pathway, decreasing levels of corresponding phosphatases and improving the resistance of mitochondrial permeability transition pore opening. The present study shows differential capabilities of cardioprotective strategies at reducing myocardial infarct size with obesity. In addition, it underlines the role of HCO3- dependent mechanisms in the control of intracellular pH at reperfusion. They could represent a key step for mediating cardioprotection.

L’infarctus du myocarde (IDM) est une cause majeure de mortalité dans le monde. La stratégie thérapeutique actuelle repose sur la reperfusion précoce du myocarde qui contribue largement à l’amélioration du pronostic des malades. Les investigations menées chez des modèles d’ischémie/reperfusion (I/R) cardiaque ont montré que l’apoptose des cardiomyocytes était contrôlée en partie par les protéines de type Bcl-2. La production de radicaux libres (RL), en particulier par la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase, contribue aussi à l’altération de la fonction cardiaque. Récemment, les effets observés de l’érythropoïétine (Epo) sur l’I/R, sont principalement liés à ses effets anti-apoptotiques, anti-inflammatoires et à son rôle dans l’angiogénèse et le remodelage vasculaire. Ces propriétés suggèrent le potentiel de l’Epo dans la cardioprotection suite à un IDM. Dès lors, les objectifs de cette thèse ont été : 1) de confirmer les effets cardioprotecteurs d’un analogue de l’Epo, la darbepoétine-a (DA), chez un modèle d’I/R chez le rat; 2) d’étudier les voies de signalisation impliquées dans ses effets anti-apoptotiques et ; 3) de caractériser les effets antioxydants de la DA médiée par l’hème-oxygénase-1 (HO-1), et ; d’étudier le rôle de la NADPH oxydase. Dans la 1ère étude, le traitement par DA a permis de diminuer significativement la taille de l’infarctus, la production de RL et l’apoptose. La DA a activé la voie des protéines Jak2/Akt, augmenté l’expression des protéines P-Bad et P-GSK3ß et anti-apoptotiques, Bcl-2 et Bcl-xL. Ces mêmes effets bénéfiques ont été confirmés à plus long terme avec la réduction des lésions fibrotiques et l’augmentation du nombre da capillaires sanguins, suggérant une meilleure perfusion du ventricule gauche. La seconde étude, a confirmé les effets cardioprotecteurs de la DA. Parallèlement, la DA a induit l’expression et l’activité de l’HO-1 et régulé l’expression des sous-unités p47phox et Rac1 nécessaires à l’activation de la NADPH oxydase. Ces résultats sont concordants avec la baisse de la production des RL observés dans le groupe DA. Les effets bénéfiques de la DA ont été annihilés en présence de ZnPP, inhibiteur de l’HO-1. Des essais cliniques sont actuellement en cours pour démontrer que les bénéfices observés chez l’animal, peuvent être retrouvés chez l’homme. / Cardiovascular disease remains a leading cause of mortality in industrialized countries. Loss of cardiomyocytes via apoptosis is believed to contribute to the continuous decline of the ventricular function in heart failure. Several investigations revealed that following ischemia-reperfusion (I/R), cardiomyocytes apoptosis is controlled, at least, by the Bcl-2 proteins family members. The excessive reactive oxygen species (ROS) production, through NADPH oxidase, contributes also to cellular damages and death. Recently, erythropoietin (EPO), a hematopoietic cytokine, has been shown to protect heart exposed to ischemia or ischemia-reperfusion, limiting infarct size and cardiac remodeling. However, to date the precise cellular mechanism of DA-induced cardioprotection remains incompletely understood. Thus, the aims of this work were 1) to assess the short and long term cardioprotective effects of darbepoetin-a (DA), an Epo analog, in an in vivo rat model of I/R ; 2) to investigate the signaling pathway through which DA potentially limits apoptosis and ; 3) to elucidate whether its cardioprotective effect, and more particularly its antioxidative effect, is linked to an HO-1-dependent inhibition of the NADPH activity. In the first study, left ventricle infarct size (LV) was smaller than that in the control rats, in agreement with echocardiographics parameters. DA-treatment activated the JAK2/Akt signaling pathway, lowered cleaved caspase-3 and increased both P-Bad and P-GSK-3ß proteins. This was consistent with the decrease of ROS production and the lowered binding of Bad to Bcl-xL and Bcl-. Similarly, in long term study, histology alterations implicated lower LV cardiac fibrosis and greater capillary density; furthermore both Bcl-xL and Bcl-2 were upregulated. In the second study, both LVSF and LVEF were higher versus control and DA+ZnPP, a heme-oxygenase-1 (HO-1) inhibitor, matching with the decreased LV infarct size in DA rats. DA induced HO-1 and down regulated the expression of p47phox and the activation of Rac1, both regulatory subunits of the NADPH-oxidase. This was consistent with the decrease of ROS production and these DA effects were inhibited by ZnPP. Further experiments in humans are now required to prove benefits effects of DA and to promote the use of EPO as therapeutics in heart infarction.

Les maladies cardiovasculaires les plus fréquentes responsable du décès chez l'homme sont le choc septique et l'infarctus du myocarde. Le choc septique est l'illustration la plus caricaturale des conséquences néfastes que peut entraîner le développement d'une réponse inflammatoire dérégulée. Tout comme pour l'infarctus du myocarde, de nombreuses inhibitions expérimentales pharmacologiques de la réponse immunitaire innée au cours du choc septique se sont révélées bénéfiques, et ont conduit à la mise en place d'études cliniques de grande ampleur étudiant l'efficacité de différentes molécules anti- inflammatoires. Malheureusement, aucune efficacité significative n'a pu être démontrée en termes de mortalité. Un des acteurs essentiels au développement de cette réponse inflammatoire est TREM-1 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-1 (TREM-1). TREM-1 est un récepteur de la superfamille des immunoglobulines présent à la surface des neutrophiles et des monocytes/macrophages. Il joue un rôle important dans l'amplification de la réponse inflammatoire au cours aussi bien de pathologies infectieuses qu'inflammatoires non septiques. D'après nos résultats, nous avons constaté que TREM-1 semblait posséder un rôle de senseur pour différents signaux de danger, avec comme résultante l'amplification de la réponse inflammatoire. La modulation pharmacologique de TREM-1 par un peptide de synthèse (LR12) apparaît donc prometteuse en ce sens qu'elle ne s'accompagne jamais d'une inhibition complète de la réponse inflammatoire. Des résultats dans le choc septique et l'infarctus du myocarde certes expérimental, confirment l'efficacité de cette approche / The most frequent cardiovascular diseases people in charge of the death at the man are the septic shock and the myocardial infarction. Septic shock is the most caricatural illustration of the fatal consequences, which the development of a deregulated inflammatory response can involve. Just like for the myocardial infarction, of many pharmacological experimental inhibitions of the innate response during the septic shock appeared beneficial, and led to the installation of clinical studies of great width studied the effectiveness of various molecules anti-inflammatory drugs. Unfortunately, no significant effectiveness could be shown in terms of mortality. One of the actors essential with the development of this inflammatory response is TREM-1 (Triggering Receptor Expressed one Myeloid cells-1 (TREM-1). TREM-1 is a receptor of the superfamily of the immunoglobulin expressed by the neutrophils and monocytes/macrophages. TREM-1 is an amplifier of the inflammatory response in the inflammatory and infectious pathology. According to our results, we noted that TREM-1 seemed to have a role of sensor for various signals of danger, with like resultant the amplification of the inflammatory response. The pharmacological modulation of TREM-1 by a peptide of synthesis (LR12) thus appears promising in the sense that it is never accompanied by a complete inhibition of the inflammatory response. Results in the septic shock and the myocardial infarction certainly experimental, confirm the effectiveness of this approach

Le choc septique est une pathologie fréquente associée à un taux de mortalité dépassant les 50%. Il s’agit de la première cause de mortalité en réanimation. Malgré les avancées des connaissances physiopathologiques sur le sepsis, le taux de mortalité reste très élevé. La majorité des recherches pré-cliniques sont réalisées sur des animaux jeunes et sains et sans antécédents cardiovasculaires, alors qu’il est bien établi que l’incidence et le taux de mortalité du sepsis augmente sévèrement avec l’âge. L’objectif de cette étude est la mise au point d’un modèle animal de sepsis ayant plusieurs antécédents cardiovasculaires, et l’évaluation des effets de la combinaison de deux maladies (hypertension et infarctus du myocarde (IDM)) chez des rats septiques sur la fonction cardiovasculaire et sur les voies de signalisation responsables de la réponse inflammatoire et apoptotique. L’étude a été réalisée sur des rats normotendus Wistar-Kyoto (WKY) et des rats Hypertendus Spontaneously Hypertensive (SHR) qui ont subi l’induction d’un IDM par ligature de l’artère coronaire gauche suivie ou non par l’induction d’un sepsis par ligature et perforation du caecum. Nous avons montré que les rats polypathologiques SHR, ayant subi un IDM préalable au choc septique, présentent une diminution drastique des paramètres cardiaques et hémodynamiques par rapport aux rats WKY ayant subi seulement un choc septique. En effet, le débit cardiaque, la pression artérielle moyenne et la fraction d’éjection sont diminuées respectivement de 70 %, 60 % et 67 % chez les rats SHR polypathologiques par rapport aux rats WKY ayant seulement un sepsis. On a observé également une hypo-réactivité vasculaire aux vasopresseurs plus importante chez les rats SHR-IDM-CLP comparée à celle des rats WKY-CLP. L’expression génique des récepteurs adrénergiques alpha-1 est fortement diminuée chez les rats SHR-IDM-CLP par rapport aux rats WKY-CLP. L’étude du taux d’expression des protéines impliquées dans l’apoptose révèle une surexpression des protéines caspase 3, caspase 8 et Pp38 chez les rats SHR polypathologiques des rats SHR-IDM-CLP par rapport aux rats WKY-CLP ayant seulement un sepsis. De plus, on remarque une forte diminution de l’expression des protéines eNOS et Akt chez les rats SHR-IDM-CLP comparés aux rats WKY-CLP. L’hypertension artérielle associée à l’insuffisance cardiaque a conduit à une plus grande sensibilité des rats au sepsis. Les rats SHR polypathologiques ont développé une insuffisance cardiaque aggravée par rapport aux rats WKY ayant seulement un sepsis. Le modèle de rats SHR ayant subi un IDM préalable au sepsis se rapproche d’avantage des situations cliniques observées quotidiennement dans les services de réanimation. Ce modèle pourrait servir de bon candidat pour les études pré-cliniques / Septic shock is considered as the most common cause of death among patients admitted in medical intensive care units. Mortality remains very high (50%) despite advances in physiopathological knowledge of this disease. In fact, most experimental studies are often conducted on young and healthy animals, whereas it is well established that the incidence and mortality rates dramatically increase with age. The goal of this study was to evaluate the effect of the combination of two diseases (hypertension and myocardial infarction) in a septic rat model, on cardiovascular function, cell survival and the inflammatory response. Therefore, we used normotensive Wistar-Kyoto rats (WKY) and Spontaneously Hypertensive Rats (SHR) in which myocardial infarction was induced by left coronary descending artery ligation, followed or not by cecal ligation and perforation-induced sepsis. Our results showed that the polypathological SHR rats in which a myocardial infarction and sepsis were induced, exhibited a significant decrease in cardiac and hemodynamic parameters compared to WKY rats that have sepsis (CLP) only. Indeed, cardiac output, mean arterial pressure and ejection fraction were reduced by 70%, 60% and 67% respectively in the polypathological SHR rats versus the WKY rats with sepsis. We observed also that the vascular hyporeactivity in the polypathological SHR rats was higher than for the WKY CLP rats. A mesure of gene expression level of alpha1 adrenergic receptor shows a relatively low expression level in the rats from SHR IDM CLP rats compared to WKY CLP that could explain the observed vasodilation. The protein level of caspase3 and 8, Pp38 and proteins involved in apoptosis, is upregulated in SHR IDM CLP rats compared to WKY CLP rats. However, the polypathological SHR rats show a significant decrease in the expression of eNOS and Akt protein compared to WKY CLP rats. The combination of hypertension with myocardial infarct is associated with higher sensitivity of the rats to sepsis. The polypathological SHR rats developed a severe heart failure compared to WKY rats having sepsis only. Our animal model, the polypathological SHR rats is very close to observed clinical situations in intensive care units. This model could serve as a good candidate for pre-clinical studies.

Dans les pays « développés », les syndromes coronariens aigus (SCA) représentent une pathologie fréquente et grave et les maladies cardiovasculaires restent la première cause de mortalité en Europe. Au cours de la dernière décennie, pourtant, plusieurs travaux épidémiologiques ont suggéré une baisse sensible de l'incidence des infarctus et la mortalité cardiovasculaire est dorénavant en recul dans de très nombreux pays, dont la France. La cardiologie est une des disciplines médicales qui a connu les plus grands bouleversements au cours des 25 dernières années et la prise en charge des SCA ainsi que le profil des patients ont considérablement évolué. Dans ce contexte, il nous a paru intéressant d'étudier la manière dont le devenir des patients présentant un infarctus aigu pouvait participer à cette baisse générale de la mortalité cardio-vasculaire. A partir de quatre enquêtes longitudinales successives répertoriant les SCA (USIK 1995, USIC 2000, FAST-MI 2005, FAST-MI 2010) et de l’observatoire national des actes de cardiologie interventionnelle (ONACI), nous avons observé, après standardisation sur les caractéristiques initiales des différentes cohortes, une baisse spectaculaire de la mortalité quel que soit le type de SCA (avec sus-décalage ST [SCA ST+] ou ST-elevation myocardial infarction [STEMI] ; sans sus-décalage ST [SCA ST-] ou non-ST-elevation myocardial infarction [NSTEMI]). Cette évolution peut être expliquée par plusieurs paramètres : amélioration de la prise en charge globale, meilleur suivi des recommandations, changement de profils des patients (pour les STEMI), développement de la stratégie invasive et utilisation de nouvelles thérapeutiques, évolution des techniques de cardiologie interventionnelle… Ainsi, il apparaît que l'amélioration du pronostic des patients atteints d'infarctus est bien un des éléments ayant pu contribuer à la baisse de la mortalité cardiovasculaire. L’enjeu aujourd’hui est de maintenir ces résultats, de renforcer les mesures de prévention et d’améliorer le pronostic à long terme en développant notamment les programmes d’éducation thérapeutique. / In developed countries, acute coronary syndromes (ACS) represent a common and serious disease, and cardiovascular disease remains the leading cause of death in Europe. During the last decade, however, several epidemiological studies have suggested a significant reduction in the incidence of myocardial infarction and cardiovascular mortality in many countries, including France. Over the past 25 years, Cardiology has dramatically evolved and the management of ACS, as well as patient risk profile have substantially changed. In this context, we aimed to evaluate how the outcomes of patients with acute myocardial infarction could participate in the general decline in cardiovascular mortality. From four successive longitudinal surveys including ACS (USIK 1995, USIC 2000, FAST-MI 2005, FAST-MI 2010) and the national observatory of interventional cardiology (ONACI) we observed, after standardization of the cohorts on baseline clinical characteristics, a dramatic decline in mortality regardless of the type of ACS (STEMI, ST-elevation myocardial infarction, NSTEMI, non-ST-elevation myocardial infarction). This evolution can be explained by several factors: overall improvement in organization of care, better implementation of recommendations, substantial change in the patient risk profile (for STEMI), increasing use of invasive strategy and adjunctive therapies, improved technique for Interventional Cardiology ... Therefore, the improved prognosis of patients with myocardial infarction appears to be one of the factors that have contributed to the decline in cardiovascular mortality. For the future, the challenge will be to maintain these results, strengthen preventive measures and improve long-term prognosis in particular by developing the therapeutic education programs.

Les maladies cardiovasculaires sont une des principales causes de morbidité et de mortalité au monde. La plus courante est l’infarctus du myocarde définit pathologiquement par la mortalité cellulaire dû à une ischémie prolongée d’une partie du ventricule gauche. L'ischémie est caractérisée par un apport sanguin insuffisant causé par une obstruction d’une artère coronaire. La restauration, en clinique, du flux sanguin, appelée reperfusion, est considérée comme la méthode la plus efficace contre les dommages ischémiques. Paradoxalement, cette restauration du flux sanguin est associée à une exacerbation de la lésion tissulaire, entraînant alors des lésions d'ischémie-reperfusion (I/R). Dans le but de limiter ces lésions, le conditionnement ischémique myocardique est une avancée majeure dans le domaine de la cardioprotection. Ce protocole confère ses effets cardioprotecteurs via le recrutement de divers mécanismes endogènes suivant l’activation de deux voies intracellulaires : la voie RISK (Reperfusion Injury Salvage Kinase) et/ou la voie SAFE (Survivor Activator Factor Enhancer). Ces voies impliquent l'activation de différentes cascades de signalisation et de protéines kinases. En particulier, concernant la voie SAFE, le transducteur de signal et l'activateur de transcription-3 STAT3, a été identifié comme un acteur clé dans le postconditionnement ischémique (PostCI). Il est suggéré que les effets cardioprotecteurs attribués à STAT3 soient liés à ses effets en tant que facteur de transcription et en tant que régulateur de l’activité mitochondriale, mais tout n’est pas encore connu. En revanche, il est admis que STAT3 est activé par la phosphorylation ciblant les résidus tyrosine 705 et sérine 727. Dans nos travaux actuels, nous avions initialement pour objectif d’étudier les rôles cardioprotecteurs mitochondriaux de STAT3 après une I/R et un PostCI. Cependant, nous n'avons pas été en mesure de détecter STAT3 dans les mitochondries de cardiomyocytes adultes de souris, dans des conditions basales et de stress, en utilisant différentes approches. Fait intéressant, nous avons montré une localisation exclusive de STAT3 dans les myocytes cardiaques adultes, le long des tubules T, et nous avons mis en évidence les inconvénients des techniques précédemment utilisées.Outre les rôles putatifs de STAT3 dans les mitochondries, nous avons ciblé ses effets dans la signalisation et la génomique au cours de l'I/R et du PostCI. Nous avons tout d’abord cherché à déterminer, pendant l’I/R et le PostCI, la cinétique temporelle d’activation de STAT3 et des autres kinases de la voie RISK, notamment Akt et les MAPK ERK1 / 2, JNK et p38. En outre, nous avions pour objectif d’étudier les liens entre les voies SAFE et RISK en déchiffrant les liens entre STAT3 et les kinases RISK au cours du PostCI. Nous avons montré qu’après une ischémie et un temps court de reperfusion, STAT3 et ERK1/2 sont activés, et que l’utilisation d’un PostCI active d’autant plus STAT3 en induisant exclusivement la phosphorylation de sa tyrosine. Nous avons également montré que l’interconnexion entre les voies SAFE et RISK, dans le protocole PostCI utilisé, se fait par STAT3 et ERK1/2. À partir de ces résultats, nous nous sommes dirigés vers la génomique grâce à laquelle nous avons étudié l'activité de STAT3 au cours de l'IPoC. À cet égard, nous avons montré que STAT3 est impliqué dans la régulation de la réponse inflammatoire au cours de la PostCI. Dans l’ensemble, cette étude présente une approche globale des fonctions mitochondriales, de signalisation et génomiques de STAT3 dans le contexte de la protection cardiaque / Cardiovascular diseases are leading causes of morbidity and mortality worldwide. Among the mostly prevailing cardiovascular diseases is myocardial infarction, which is pathologically defined as myocardial death due to a prolonged ischemia. Ischemia is an insufficient supply of blood caused by a blockade in the coronary arteries. The early restoration of blood flow is considered the most effective method against the ischemic lesions. Paradoxically, this blood flow restoration is associated with an exacerbation of the tissue injury, leading to the ischemia-reperfusion (I/R) injury. To avoid this injury, the myocardial ischemic conditioning protocol has rejuvenated the field of cardioprotection. This protocol confers its cardioprotective effects via recruiting various endogenous mechanisms following the activation of two intracellular pathways: the reperfusion injury salvage kinase (RISK) or survivor activator factor enhancer (SAFE) pathways. These pathways involve the activation of different signaling cascades and protein kinases. Zooming in through the SAFE pathway, the signal transducer and activator of transcription-3, STAT3, has been identified as a prominent key player in ischemic postconditioning (IPoC). The cardioprotective effects attributed to STAT3 are suggested to be linked to its roles as a transcription factor and as a regulator of the mitochondrial activity, but these are not well studied and elaborated. STAT3 is activated by phosphorylation, which targets the tyrosine 705 and serine 727 residues. In our current work, we initially aimed to investigate the mitochondrial cardioprotective roles of STAT3 following I/R and IPoC. However, we were not able to detect STAT3 in the mitochondria of adult mouse cardiomyocytes under variousbasal and stress conditions using different approaches. Interestingly, we showed an exclusive STAT3 pattern in adult cardiac myocytes, along the T-tubules, and highlighted drawbacks of previously used techniques. Aside from the mitochondrial roles of STAT3, we targeted its signaling and genomic roles during I/R and IPoC. We first aimed to determine, during I/R and IPoC, the temporal kinetics of activation of STAT3 and the other kinases of the RISK pathway including Akt and the MAPKs ERK1/2, JNK and p38. In addition, we aimed to decipher the interlink between the SAFE and RISK pathways through deciphering the interlink between STAT3 and the RISK kinases following IPoC. We showed that a short reperfusion time activates STAT3 and ERK1/2 following ischemia, and that the application of IPoC further activates STAT3 through inducing its tyrosine phosphorylation. We also showed that the interlink between SAFE and RISK pathways, in the IPoC protocol we used, is through STAT3 and ERK1/2. From this signaling level, we moved toward the genomic level whereby we investigated the genomic activity of STAT3 during IPoC. In this regard, we have shown that STAT3 is involved in the regulation of the inflammatory response during IPoC. Overall, this study presents a global approach of STAT3’s mitochondrial, signaling and genomic functions in the context of cardiac protection

DANS MON TRAVAIL DE THESE JE M'INTERESSE A LA MODELISATION GEOMETRIQUE, MECANIQUE ET NUMERIQUE DU MYOCARDE. LA PARTIE GEOMETRIQUE CONSISTE A VERIFIER UNE CONJECTURE SELON LAQUELLE LES FIBRES MYOCARDIQUES COURENT COMME DES GEODESIQUES SUR DES SURFACES EMBOITEES. POUR CELA, LES TRAJECTOIRES ET LES SURFACES DE FIBRES ONT ETE IDENTIFIEES. DANS LA PARTIE MECANIQUE, NOUS AVONS ETABLI UNE NOUVELLE LOI DE COMPORTEMENT MACROSCOPIQUE DU MYOCARDE PAR UNE TECHNIQUE D'HOMOGENEISATION DISCRETE A PARTIR DE LA DESCRIPTION MICROSCOPIQUE DE L'ARRANGEMENT DES CELLULES CARDIAQUES ET DE LEUR COMPORTEMENT MECANIQUE INDIVIDUEL. CETTE LOI DE COMPORTEMENT PREND EN COMPTE LA STRUCTURE FIBREUSE. DE PLUS, NOUS AVONS APPLIQUE NOTRE METHODE D'HOMOGENEISATION AUX NANOTUBES DE CARBONE.

Thèse d'exercice : Médecine : Nancy 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine : Nancy 1 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre.

Les maladies cardiovasculaires sont une des premières causes de mortalité dans les pays industrialisés. L'infarctus du myocarde provoque la mort d'un grand nombre de cellules cardiaques, diminuant la qualité de vie des gens qui survivent à une telle attaque. La transplantation d'un organe entier présente des limites telles que la faible quantité de donneurs et la possibilité de rejet par l'organisme du receveur. Le cœur possède une capacité de se régénérer mais le nombre de cellules souches résidentes pouvant accomplir cette tâche apparaît être insuffisant. Afin d'aider à la régénération, des approches thérapeutiques tentent l'implantation de cellules fonctionnelles dans la zone infarcie. Les cellules implantées sont, entre autres, des myoblastes squelettiques, des cellules souches embryonnaires ou adultes (cellules souches mésenchymateuses) indifférenciées, des cardiomyocytes fœtaux. Les résultats positifs parfois obtenus ont vite fait passer ces études des animaux à l'humain. La mise au point de thérapies cellulaires efficaces pour le cœur nécessite la compréhension des mécanismes moléculaires gouvernant la différenciation et la morphogénèse cardiaques, et l'habileté à manipuler ces mécanismes. Les cellules de carcinome embryonnaire P19, un modèle de cellules souches embryonnaires (ES), peuvent se différencier en cardiomyocytes lorsqu'elles sont traitées avec l'acide rétinoïque (AR) ou l'ocytocine (OT). Des cellules de muscle squelettique sont aussi générées. D'autre part, l'AR permet la différenciation de cellules ES en adipocytes et l'OT inhibe la maturation finale de pré-adipocytes. Nous avons émis l'hypothèse que l'AR et l'OT peuvent induire les cellules P19 à générer, de façon concomitante mais dans des rapports différents, des adipocytes, cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique. De plus, des analogues de l'AR capables d'activer préférentiellement les récepteurs de l'acide rétinoïque (RAR) ou les récepteurs de rétinoïdes-X (RXR) pourraient influencer les rapports mésodermiques. Enfin, les kinases ERK1/2 et P38, des protéines-kinases activées par des mitogènes (MAPK), pourraient avoir un rôle dans la différenciation mésodermique induite par l'AR et l'OT. Des marqueurs ont servi à identifier les phénotypes cellulaires : PPARy, aP2, lipoprotéines-lipase et gouttelettes lipidiques colorables à l'huile rouge pour les adipocytes; MyoD et α-actinine sarcomérique pour les cellules de muscle squelettique; troponine I cardiaque (cTpnI), chaîne légère de la myosine cardiaque-2v et α-actinine sarcomérique pour les cardiomyocytes. La culture en agrégats de cellules P19 pendant sept jours, avec une induction à l'AR entre les jours deux (J2) et J5, suivie d'une période de maturation de 20 jours en présence d'insuline et de l'hormone thyroïdienne T3 permet d'obtenir des adipocytes. Des cellules battantes exprimant l'α-actinine sarcomérique sont aussi générées. Une importante proportion de ces cellules montre la forme allongée ou fibrillaire caractéristique de myocytes squelettiques. Une faible proportion a une forme arrondie et exprime la cTpnI, indiquant la génération de cardiomyocytes. L'induction des cellules P19 avec l'AR, à J2, a donc un effet mésodermique large. L'ajout d'OT au milieu de maturation n'augmente pas la proportion de cellules cardiaques par rapport aux cellules musculaires squelettiques ou aux adipocytes. L'AR agit principalement en se liant aux RAR et RXR. Pour activer de façon spécifique chacune de ces deux familles de récepteurs, nous avons remplacé l'AR comme agent inducteur par le LG100268, un agoniste spécifique des RXR, ou par le TTNPB, un agoniste spécifique des RAR. Le LG100268 génère des adipocytes et des myocytes aussi efficacement que l'AR. Le TTNPB est un agent adipogénique plus efficace que l'AR mais inhibe la myogenèse. Les influences mésodermiques différentes des trois agents sont associées à des actions différentes sur ERK1/2 et P38. Ainsi, l'AR et le LG100268 diminuent similairement phospho-ERK1/2 et augmentent similairement phospho-P38. Par contre, le TTNPB, le rétinoïde le plus efficace à diminuer phospho-ERK.1/2, n'a pas stimulé la phosphorylation de P38. L'inhibition pharmacologique d'ERK1/2 ou de P38 pendant le traitement des cellules avec l'AR a augmenté le rendement myogénique, et l'inhibition de P38 a, de plus, augmenté le rendement adipogénique. La voie des RXR est permissive à la fois à l'adipogenèse et à la myogenèse alors que celle des RAR n'est permissive qu'à l'adipogenèse. P38 serait un régulateur négatif de l'adipogénèse. La différenciation à base d'OT produit des cardiomyocytes et, dans une moindre mesure, des cellules de muscle squelettique. L'OT est ajouté durant les quatre jours de l'agrégation et la période de maturation est de dix jours. Les rendements myogéniques sont faibles et nous avons pensé que l'ajout d'AR à l'OT pouvait les augmenter. Lorsqu'il est ajouté dès le J0 du traitement des cellules avec l'OT (addition précoce), l'AR inhibe la myogenèse. Cette inhibition est reliée aux RAR puisqu'elle est reproduite par le TTNPB et non le LG100268. Étonnamment, l'AR ajouté au J2 du traitement avec l'OT (addition tardive) fait plus que doubler le rendement des cellules musculaires, spécialement celui des cellules de muscle squelettique. L'AR a donc un effet dual, temporellement régulé, sur l'action myogénique de l'OT. Un tel effet est aussi observé sur la phosphorylation d'ERK1/2. OT stimule cette phosphorylation, et la stimulation est fortement inhibée par l'addition précoce mais non tardive d'AR. L'inhibition pharmacologique d'ERK1/2 abolit l'action myogénique d'OT. Par contre, l'ajout d'un activateur indirect d'ERK2 à la combinaison "OT + AR tardif" augmente la phosphmylation d'ERK1/2 ainsi que le rendement en cardiomyocytes. Des niveaux de phospho-ERK1/2 sont critiques pour la myogénèse et pour les rendements respectifs en cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique. En conclusion, les cellules P19 génèrent adipocytes, cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique de façon concomitante lorsqu'elles sont induites avec l'AR. Dans ce processus, l'activation des RAR n'est permissive qu'à l'adipogenèse alors que celle des RXR permet l'adipogenèse et la myogenèse. L'action antimyogénique de l'activation des RAR est aussi observée en présence d'OT, cependant cette action ne se manifeste que si l'activation est faite tôt (J0). AR et OT influencent chacun la phosphorylation de MAPK et, réciproquement, leur action mésodermique est influencée par des modulateurs pharmacologiques de ces kinases. Le sens des influences peut cependant différer. Ainsi, les meilleurs rendements myogéniques ont été observés pour les traitements suivants : "AR + inhibiteur d'ERK (J2 à J5)", "AR + inhibiteur de P38 (J2 à J5)", "OT (J0 à J4) + AR (J2 à J4)", "OT + activateur d'ERK (J0 à J4) + AR (J2 à J4)". La modulation de l'activité des voies RAR, RXR et MAPK a une influence sur les rendements myogéniques et adipogéniques ainsi que sur les rendements en cardiomyocytes et en cellules de muscle squelettique. Le sens de l'influence dépend de la fenêtre temporelle de la modulation et de la présence ou non de l'OT. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cardiomyocytes, Cellules de muscle squelettique, Adipocytes, Acide rétinoïque, Ocytocine, Rétinoïdes, MAPK, ERK, P38, PCR, Immunobuvardage, Cytofluorescence, Cytochimie