La voie de signalisation calcineurine/NFAT (Nuclear Factor of Activated T-cells) est très largement impliquée dans plusieurs aspects du développement et des pathologies du muscle squelettique. De nombreuses études ont souligné son implication dans la spécification des fibres musculaires adultes. Cependant, son rôle dans l’établissement du phénotype musculaire au cours de l’embryogenèse reste peu connu. Il faut noter que certains travaux suggèrent une implication de NFATc3 dans le nombre de fibres musculaires alors que l’isoforme NFATc2 pourrait être impliquée dans la taille des fibres musculaires. Les facteurs myogéniques (MRF) de la famille MyoD (incluant MyoD, Myf5, MRF4 et la myogénine) sont des facteurs de transcription à domaine bHLH (basic-Helix-Loop-Helix) clés pour la myogenèse squelettique. L’étude de leurs partenaires protéiques est essentielle pour bien comprendre la régulation de l’expression des gènes musculaires. Un nouveau paradigme de la transcription a été démontré (Armand et al. 2008), où une protéine NFAT pourrait coopérer spécifiquement avec un MRF : en effet, l’isoforme, NFATc3, coopère avec MyoD pour activer l’expression de la myogénine au cours de la somitogenèse. Ce rôle est spécifique du complexe NFATc3/MyoD puisque les souris mutantes myod (-/-) ; nfatc2 (-/-) ne présentent aucune modification de l’expression de la myogénine au cours de la somitogenèse. L’objectif de ce travail est d’étudier l’implication du complexe NFATc2/MyoD dans la myogenèse chez la souris. Nous montrons que l’isoforme NFATc2 coopère avec MyoD pour induire spécifiquement l’expression de la chaine lourde néonatale la myosine (MHCneo), in vitro aussi bien qu’in vivo. Cette coopération est spécifique et cruciale puisque les souris double mutantes myod (-/-) ; nfatc2 (-/-) meurent à la naissance avec une réduction spectaculaire de l’expression de la MHCneo, principale isoforme de la myosine exprimée à la naissance, alors que l’expression de cette chaine lourde de la myosine n’est pas affectée chez les simples mutants. Par des analyses d’immunoprécipitation de la chromatine et de retard sur gels, nous avons montré que les isoformes NFATc1 et NFATc3 se lient de manière préférentielle au gène codant la chaine lourde embryonnaire de la myosine (MHC emb). Ce travail, qui met en évidence pour la première fois le rôle de la voie de signalisation calcineurine/NFAT dans la construction précoce de la fibre musculaire au cours de l’embryogenèse, montre aussi l’implication spécifique du complexe NFATc2/MyoD dans le contrôle du nombre de fibres musculaires au cours de l’embryogenèse. / Cell biology

Ce travail de thèse a porté sur l'étude de l'équilibre entre la prolifération et la différenciation dans le cadre de la myogenèse embryonaire et postnatale. Chez l'embryon, le sortie du cycle cellulaire est contrôlé par p57 et p21 pendant la myogenèse. Nous avons montré que la voie de signalisation Notch ainsi que les facteurs de régulation myogéniques (MRFs) régulent l'expression de p57 dans les cellules progénitrices et les myoblastes en différentiation. Chez l'adulte, p21 et p57 ne sont pas exriés dans la population quiescente de cellules souches du muscle (cellules satellites - SCs). p21 et p57 sont rapidement induits après activation et durant la différentiation des SCs. Ex vivo, les myoblastes déficients pour le gène p21 présentent des défauts de prolifération et de différenciation. In vivo, l'étude de la régénération musculaire chez les mutants p21 a montré une réduction précoce des SCs, avec un retard de reconstitution du tissu musculaire. Afin de pouvoir étudier le rôle de p57 après la naissance (les mutants p57 meurent à la naissance) nous avons généré un modèle murin permettant de muter le gène p57 de manière spatio-temporelle avec le système de recombinaison Cre/LoxP. Nous avons combiner notre allèle p57 conditionnel avec une Cre exprimée de manière ubiquitaire, et observé des phénotypes identiques aux phénotypes décrits précédemment chez les souris présentant une perte du p57. L'ablation conditionnelle de p57 dans les SCs adultes, a conduit à une diminution de la différenciation myogénique in vitro. Notre travail suggère que p21 et p57 jouent un rôle important dans la régulation de la différenciation et le cycle cellulaire dans le muscle adulte. / This thesis focuses on the coordination of proliferation and differentiation in embryonic and adult myogenesis. During development, we demonstrated that skeletal muscle progenitors interact with the differentiating myoblasts via the Notch pathway to maintain their pool. It has previously been established that p57 and p21 redundantly promote cell cycle exit in developing muscle and we showed that Notch and Myogenic Regulatory Factors act through muscle-specific regulation of p57. We then examined p21 and p57 in adult skeletal muscle stem cells, called satellite cells (SCs). Although absent from quiescent SCs, p21 and p57 are expressed upon activation (including proliferating myoblasts) and differentiation. p21-null myoblasts exhibited proliferation and differentiation defects in myofiber cultures, implicating p21 at the early activation phase. In vivo muscle regeneration studies with p21 mutants showed an early impact on the SC pool, while SCs and muscle structure were re-established by the end of regeneration. Since p57-deficient mice die at birth, we generated a conditional knock-out (KO) allele for postnatal studies using the loxP/Cre recombination system. With a ubiquitous Cre we observed developmental and perinatal phenotypes similar to previously described KO embryos. The new p57 allele also includes a β-galactosidase reporter and we showed that it recapitulates p57 expression profile in embryonic and adult tissues. Conditional ablation of p57 in adult SCs reduced myogenic differentiation in primary myoblast culture. Our work suggests that p21 and p57 are involved in adult myogenesis and cell cycle exit, working at the early steps of satellite cell activation.

L'utilisation des cellules souches est une approche prometteuse pour le traitement des maladies dégénératives neuromusculaires. De nombreuses études portent actuellement sur les cellules souches embryonnaires (ES) et les cellules pluripotentes induites par reprogrammation (IPs) dont l'utilisation en médecine régénérative reste sujette à caution à cause du potentiel de ces cellules à former des tératomes. Des lors, aussi bien les ES que les IPs nécessitent une différenciation vers un type cellulaire précis. Cette différenciation peut mener à des risques supplémentaires tels que la dérive génique ou diverses sources de contamination.Le muscle squelettique adulte, avec sa grande plasticité et capacité régénératrice, contient une population de cellules souches qui est spécifique de ce compartiment tissulaire et qui a été isolée et étudiée au laboratoire. Les cellules souches du muscle squelettique adulte: skeletal Muscle-Derived Stem Cells, MDSC, repeuplent et réparent en quelques jours le muscle squelettique lésé avec une haute efficacité, même en présence des cellules satellites endogènes. (Arsic et al Exp. Cell Res. 2008). Le laboratoire d'accueil a entrepris de caractériser cette population cellulaire, en particulier par son origine histologique, de tester le potentiel de réparation tissulaire de ces cellules transplantées dans des modèles murins, et de déterminer la bio-distribution de ces cellules en vue d'utilisation thérapeutique.Mon travail de thèse s'est intéressé à cette population de cellules souches issues du muscle qui ont une propriété commune : la faible adhérence au substrat. La faible adhérence est une propriété très intéressante car en plus de définir des cellules plus proches de l'état pluripotent, cette propriété leur confère une grande capacité de migration. Ces cellules seraient donc plus facilement utilisables en médecine régénératrice. Dans cette perspective il est intéressant de disposer de cellules souches multipotentes qui pourrait se comporter comme des cellules pluripotentes en terme de capacité régénératrice, mais sans les inconvénients de ces dernières à savoir ; risque tératogène et prolifération incontrôlée, et manipulation des cultures cellulaires longues et couteuses.Au début de ma thèse je me suis donc intéressée aux différentes populations de cellules présentes dans le muscle et je me suis concentrée sur différents marqueurs connus chez les cellules souches, dont la présence a été établie chez différentes cellules souches y compris chez les cellules souches dérivées du muscle squelettique, mais pas clairement identifiés d'un point de vue histologique. Les cellules souches du muscle expriment le facteur de pluripotence Sox2, mais aussi des marqueurs d'immaturité tels que BCRP1/ABCG2, Sca-1 et SSEA1. J'ai examiné leur potentiel de différenciation in vitro en plusieurs lineages tels que des cellules cardiaques spécifiques (dites pacemakers), des cellules productrices d'insuline et des cellules qui présentent des marqueurs neuronaux. Je me suis également concentrée sur les possibles applications thérapeutiques grâce à l'utilisation de modèles génétiques murins et notamment dans les cas de problèmes du rythme cardiaque, et du diabète insulinodépendant. Pour ces études in vivo du potentiel réparateur des MDSC on procède à une simple injection des cellules souches dérivées du muscle squelettique (MDSC). Le fait de retrouver des MDSC injectées dans les organes cibles des souris modèles pose aussi la question de la biodistribution de ces cellules dans l'organisme. J'ai donc consacré plus d'un an de mon financement doctoral pour examiner cette biodistribution et montré un recrutement ciblé dès 48h après injection, vers les organes ou tissus lésés. / The use of stem cells is a promising approach for the treatment of neuromuscular degenerative diseases. Many studies currently focus on embryonic stem cells (ES) and induced pluripotent stem cells (IPs) for use in regenerative medicine. But some problems remain for their use in cell therapy in particular the potential of these cells to form teratomas. This problem requires both ES and IPs to be differentiated towards a specific cell type. Such induction of differentiation can lead to additional risks such as genetic drift or various sources of contamination.The adult skeletal muscle, has a high plasticity and regenerative capacity, it contains a stem cell population that is specific for muscle, and has been isolated and studied in the laboratory. Adult skeletal Muscle-Derived Stem Cells, MDSC repopulate and repair damaged skeletal muscle with high efficiency in a few days, even in the presence of endogenous satellite cells. (Arsic et al Exp. Cell Res. 2008). The host laboratory is characterizing this cell population and its histological identity and testing the tissue repair potential of transplanted MDSC in mouse models, as well as their bio-distribution for therapeutic use.My thesis work addressed the study of this stem cells population isolated from skeletal muscle showing low adhesion to substrate. Poor/low adherence is an interesting property because in addition to be defined as closer to the pluripotent state, this property is associated with a higher migration capability. This population of muscle stem cells should be easier to use than pre-differentiated stem cells in regenerative medicine. In this perspective it is interesting to use multipotent stem cells that are close to pluripotent cells in terms of differentiation and regenerative capacity, but without the inconveniencies like teratogenic risk and uncontrolled proliferation, as well as expensive and time-consuming cell culture.At the beginning of my thesis I was interested by the different populations of cells present in muscle and I focused my work on known markers of stem cells, whose presence has been established in skeletal muscle, but not clearly identified histologically. Muscle stem cells expressed the pluripotency factor Sox2, but also markers, such as BCRP1/ABCG2, Sca-1 and SSEA1. I have examined the potential of MDSC to differentiate in vitro into several cell types such as cardiac pacemaker-like cells, insulin-producing cells and cells that exhibit neuronal markers. I also focused on the possible therapeutic applications of MDSC, particularly in the case of heart rhythm problems and in the case of insulin-dependent diabetes. For these in vivo studies of the repair potential of MDSC, a single systemic injection is carried out in mouse models of the diseases. The histological recovery of injected MDSC into target organs also raises the question of the biodistribution of MDSC in the body. Therefore I spent more than a year of my doctoral thesis to address this issue and showed a targeted recruitment of MDSC to injured tissue or organs within 48h of their systemic injection.

Les muscles squelettiques, responsables des mouvements volontaires tels que la locomotion ou le maintien de la posture, représentent environ 40% de la masse corporelle.Cette masse musculaire est maintenue par plusieurs voies de signalisation qui régulent entre autres l’équilibre entre la synthèse et la dégradation des protéines myofibrillaires. En ciblant la voie de signalisation Akt/mTOR, la myostatine est un régulateur négatif de la myogenèse. Elle inhibe la différentiation myogénique et le renouvellement cellulaire. Parmi les différents facteurs moléculaires extracellulaires qui régulent la myostatine, les protéines GASP (Growth and differentiation factor Associated Serum Protein) ont été décrites comme des antagonistes de son activité. L’Unité de Génétique Animale a développé plusieurs stratégies qui permettent d’appréhender les mécanismes moléculaires qui régissent le(s) rôle(s) des protéines GASP au cours du développement musculaire. Ainsi, la création de la lignée murine appelée surGasp-1-20 a permis de montrer que la surexpression de Gasp-1 entraîne un phénotype hypermusclé associé à une hypertrophie des myofibrilles. Une analyse de l’expression génique dans des myoblastes dérivés des cellules satellites montre une surexpression de la myostatine corrélant avec une absence d’hyperplasie chez les souris surGasp-1-20. Des études similaires actuellement en cours pour la protéine GASP-2 devraient permettre de préciser son rôle dans le contexte musculaire. Les protéines GASP sont également définies comme des inhibiteurs composés hétérotypiques caractérisés par plusieurs domaines inhibiteurs pouvant moduler l’activité de différentes protéases. Parmi ces différents domaines,le second domaine Kunitz de GASP-2 a été précédemment décrit comme pouvant inhiber la trypsine. Dans ce travail, nous avons pu montrer que les deux protéines entières conservent cette capacité d’inhibition. Nos résultats indiquent cependant que GASP-1 et GASP-2 présentent une différence de spécificité due à la composition du second domaine Kunitz et non à l’environnement moléculaire présent dans chacune des protéines. Enfin, nous proposons un modèle structural du second domaine Kunitz impliqué dans la dualité fonctionnelle dans l'inhibition anti-trypsine de GASP-1 et GASP-2. / Skeletal muscles, responsible for voluntary movements such as locomotion or posture maintenance, represent about 40% of body mass. This muscle mass is maintened by several signaling pathways that regulate , among other things, the balance between synthesis and degradation of myofibrillar proteins. By targeting the Akt/mTOR pathway, myostatin is anegative regulator of myogenesis. It inhibits myogenic differentiation and cell turnover. Among the various endogenous molecular factors that regulate myostatin, proteins GASP (Growth and differentiation factor Associated Serum Protein) have been described as antagonists of its activity. The Animal Genetics Unit has developed several strategies to understand themolecular mechanisms that govern the role (s) of GASP proteins during muscle development.Thus, the creation of the transgenic mouse line named surGasp-1-20 has shown that overexpression of Gasp-1 results in a hypermuscular phenotype associated with myofibril hypertrophy. An analysis of gene expression in myoblasts derived from satellite cells showed overexpression of myostatin correlating with an absence of hyperplasia in Gasp-1-20 mice.Similar studies currently underway for the protein GASP-2 should clarify its role in the muscular context. Proteins GASP are also defined as compound heterotypic inhibitors characterized by several inhibitory domains that can modulate the activity of different proteases. Among these different modules, the second Kunitz domain of GASP-2 was previously been described asable to inhibit trypsin. In this work, we have shown that the two whole proteins conserve this capacity of inhibition. However, our results indicate that GASP-1 and GASP-2 exhibit a difference in specificity due to the composition of the second Kunitz domain and not to the molecular environment present in each of the proteins. Finally, by modeling, we propose a structural model of the second Kunitz domain of GASP-1 and GASP-2 implicated in the antitrypsin inhibition specificity

Le muscle strié squelettique est un tissu richement vascularisé. Cependant, les vaisseaux ne sont pas seulement des pourvoyeurs d'oxygène et de nutriments, mais participent activement à l'homéostasie tissulaire en interagissant avec les cellules souches musculaires. La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une pathologie associée à un dommage musculaire, des cycles de nécrose/régénération, un remodelage tissulaire et une plasticité vasculaire. Nous avons en effet, démontré par des études in vivo un défaut d'organisation du réseau vasculaire en 3D grâce au croisement entre une souris mdx et une souris Flk1-GFP (modèle murin de la DMD fluorescente pour les cellules endothéliales), ainsi qu'une atteinte histologique du réseau vasculaire (analyse quantitative et morphométrique des vaisseaux) incluant un défaut de vascularisation des fibres musculaires. L'atteinte histologique est associée à un défaut de perfusion du muscle que nous avons démontré en RMN (résonnance magnétique nucléaire), une technique sophistiquée et non invasive nous permettant d’étudier à la fois la perfusion et le métabolisme énergétique. Dans le modèle du muscle strié squelettique, qui régénère complètement après une lésion, l'angiogenèse et la myogenèse sont concomitantes. Notre hypothèse générale est que le couplage entre myogenèse et angiogenèse est altéré dans les myopathies dégénératives mais leurs mécanismes cellulaires et moléculaires restent mal connus. Nos travaux ont mis en évidence l'existence d'un couplage cellulaire et moléculaire fonctionnel entre la myogenèse et l'angiogenèse en utilisant des modèles in vitro et in vivo dans lesquels les cellules endothéliales (ECs) et les cellules précurseurs myogéniques (MPCs) sont associées. Nos résultats montrent que MPCs et ECs s'attirent réciproquement, suggérant la sécrétion de facteurs chimiotactiques spécifiques. Les ECs stimulent fortement l'entrée des cellules souches du muscle dans le programme de différenciation myogénique (prélude indispensable à la formation des structures multinucléées et contractiles). Nous avons également démontré, grâce à une technique de coculture en 3 dimensions, que les MPCs présentent un potentiel pro-angiogénique important, permettant la formation de structures vasculaires différenciées. Ces résultats ont été validés in vivo (angiogenèse en plug sous-­‐cutanés) et démontrent ainsi que la myogenèse et l'angiogenèse sont des processus couplés au cours de la régénération musculaire. Nous avons identifié trois déterminants moléculaires mis en jeu, suite à l’analyse d’un transcriptome des cellules souches musculaires et des cellules endothéliales, isolées à partir du muscle à différents temps au cours de la régénération. Ces données indiquent que l'environnement vasculaire contrôle le destin des cellules souches musculaires, qui en retour, interagissent sur leur environnement proche. Par ces interactions, les cellules vasculaires jouent donc un rôle central dans le remodelage tissulaire après un phénomène destructif. Ce travail montre pour la première fois que l'organisation et la fonction des vaisseaux sont altérées au cours des pathologies musculaires dégénératives et l'importance des interactions entre cellules souches du parenchyme et cellules endothéliales des vaisseaux dans la régulation de l'homéostasie tissulaire, et ouvrent une réflexion sur la prise en compte du processus d'angiogenèse associé étroitement à la réparation tissulaire – ici la myogenèse – dans une perspective thérapeutiques. / Skeletal muscle is highly vascularized and has the outstanding capacity to regenerate ad integrum after an injury. Beyond oxygen and nutriment supply, new functions for vessels have been recently identified, through the interactions vessel cells establish with muscle stem cells. Duchenne Muscular Dystrophy is characterized by the lack of dystrophin, a sarcolemma anchoring protein, and by cycles of necrosis/regeneration, tissue and vessel remodeling that lead to progressive loss of muscle force. In this severe context, our aim was to decipher alterations of the vascular network structural organization and better understand the functional repercussions on the muscle tissue. We performed a confrontation between morphological and functional approaches using a non-invasive protocol. Histology and morphometry were performed using Flk1GFP/+ crossed with mdx mice (model for the human DMD where all blood vessels express GFP). Multiparametric and functional nuclear magnetic resonance consisted in simultaneous acquisition of arterial spin labelling imaging of perfusion and 31P spectroscopy of phosphocreatine kinetic. We demonstrated for the first time that the vascular system displayed marked alterations in 12 month--‐old mdx mice, more specifically at the capillary scale. Histological results confirmed these observations showing strong perturbations of the microvascular network that are directly linked to the muscle lesions. In parallel, we analyzed the repercussions of these disruptions on skeletal muscle physiology. Our results demonstrated that after a hypoxic stress, blood perfusion was decreased in mdx mouse. During skeletal muscle regeneration, myogenic precursor cells (MPCs) interact with neighboring cells to expand and differentiate. Among them, endothelial cells (ECs) have to be considered. Their close proximity suggests that myogenesis and angiogenesis take place together during muscle regeneration. Our aim was to investigate the existence of such a coupling and to identify the underlying molecular mechanisms. We demonstrated a functional interplay between the two cell types as both cells attracted each other, suggesting the secretion of specific attractive factors. ECs strongly stimulated MPC differentiation and using 3D co-cultures, we revealed that MPCs promoted angiogenesis. These results were validated in vivo using matrigel plug assay. By analyzing transcriptomic from ECs and MPCs sorted at different time points during muscle regeneration, we evidenced and validated the role of the 3 novel molecules regulating angiogenesis/myogenesis coupling: Apelin, Oncostatin M and Periostin, that each plays specific roles during early and late phases of muscle regeneration. Thus, interactions between vessel cells and MPCs seem to play a central role in the tissue remodeling after an injury. Collectively our results point out, for the first time, strong perturbations of the vascular network with functional repercussions on muscle tissue perfusion in dystrophinopathic muscle. In light of our results evidencing the coupling between myogenesis and angiogenesis during skeletal muscle regeneration, due to the specific interactions between ECs and MPCS, it is likely that, coupling between myogenesis and angiogenesis could be affected in pathological context.

Les homéoprotéines SIX sont codées par les gènes Sine oculis homeobox related genes Six1 à Six6 chez les vertébrés parmi lesquels Six1, Six2, Six4 et Six5 sont exprimés dans le lignage myogénique. Bien que Six1 et Six4 soient requis pour la myogenèse hypaxiale, les animaux doubles KO pour ces deux gènes (s1s4KO) forment leurs muscles épaxiaux et craniofaciaux. Nous avons caractérisé le phénotype de mutants composites des gènes Six et avons montré que l’absence de Six1 et Six2 empêchait la formation des muscles craniofaciaux et empirait les défauts de formation des muscles des membres observés chez les fœtus mutants pour Six1. Nous avons aussi observé que les fœtus dépourvus d’activité de SIX1, SIX2, SIX4 et SIX5 étaient toujours capables de former leurs muscles épaxiaux, mais que l’expression de Pax7 dans leurs progéniteurs myogéniques était fortement diminuée et mêlée à l’expression de Myogénine. Alors que les fœtus s1s4KO forment des muscles épaxiaux, leurs cellules PAX7+ ont un défaut de nichage entre la membrane plasmique des myofibres et la lame basale qui les entoure. Nos analyses transcriptomiques, nos expériences de transplantation et nos études in vitro nous ont permis de conclure que le nichage des cellules PAX7+ nécessitait un environnement adéquat combinant des propriétés des myofibres et des cellules PAX7+ ; environnement perturbé dans les muscles épaxiaux s1s4KO. Nos expériences de transplantation nous ont aussi permis de conclure que Six1 et Six4 étaient requis pour une bonne ré-innervation des myofibres après blessure et pour la mise en place du phénotype rapide de ces myofibres. De plus, les muscles transplantés avec des cellules PAX7+ fœtales s1s4KO après blessure se reforment d’un grand nombre de petites myofibres. Nous avons pu relier ce phénotype au comportement des cellules s1s4KO in vitro où elles montrent un défaut de fusion. Enfin, les homéoprotéines SIX ont besoin de co-facteurs pour induire l’expression de leurs gènes cibles, tels que les protéines EYA codées par les gènes Eya1 à Eya4 chez les vertébrés. Eya3 et Eya4 sont fortement exprimés dans les cellules satellite au cours de la régénération, cellules qui requièrent aussi Six1 pour une réparation musculaire efficace. Nous avons étudié la régénération musculaire en absence d’expression d’Eya3 et n’avons pas observé de défaut nous menant à la conclusion qu’Eya3 n’est pas requis pour la régénération musculaire adulte, mais que sa perte d’expression était peut-être compensée par un autre gène Eya chez les animaux mutants. Pour conclure, Six1 et Six2 sont indispensables à la formation des muscles craniofaciaux, et Six1 et Six4 sont requis pour la myogenèse hypaxiale, et pour l’établissement d’un environnement propice à la maturation des myofibres fœtales et au nichage des cellules PAX7+ au cours de la myogenèse épaxiale, et permettant la croissance des myofibres et leur ré-innervation après blessure. La collaboration des protéines SIX avec leurs co-facteurs EYA au cours de la myogenèse nécessite d’autres études pour mieux définir leurs fonctions. / SIX homeoproteins are encoded by the Sine oculis homeobox related genes Six1 to Six6 in vertebrates among which Six1, Six2, Six4 and Six5 are expressed in the muscle lineage. Whereas Six1 and Six4 are required for hypaxial myogenesis, double KO for those two genes (s1s4KO) still form their epaxial and craniofacial muscles. We further characterized the phenotype of compound Six mutant embryos and showed that the absence of Six1 and Six2 completely impairs craniofacial myogenesis and worsen muscle limb development observed in single Six1 mutants. We also showed that mouse fetuses devoid of SIX1, SIX2, SIX4 and SIX5 activity are still able to develop epaxial muscles, but that Pax7 expression in myogenic progenitors of these mutants is reduced and intermingled with Myogenin expression. While s1s4KO fetuses still develop epaxial muscles, their PAX7+ cells show a perturbed homing process into their niche, between the plasma membrane of a myofibre and the basal lamina surrounding it. Transcriptomic analysis, transplantation experiments and in vitro studies allowed us to conclude that the homing of PAX7+ cells into their niche during fetal myogenesis requires an adequate environment combining properties of the myofibers and the PAX7+ cells; environment disturbed in s1s4KO epaxial muscles. Transplantation experiments also led us to conclude that Six1 and Six4 are required for proper myofiber re-inervation after injury and for the establishment of the fast phenotype of myofibers. Furthermore, muscles transplanted with s1s4KO fetal PAX7+ cells after injury are formed of numerous and tiny myofibers. We could link this phenotype to the behavior of s1s4KO cells in vitro where they showed perturbed fusion. Finally, SIX homeoproteins require co-factors to induce their target genes expression, as EYA proteins encoded by Eya1 to Eya4 in vertebrates. Eya3 and Eya4 are strongly expressed in satellite cells during regeneration, cells in which Six1 is also required for proper muscle repair. We investigated muscle regeneration in absence of Eya3 expression and observed no obvious phenotype. We concluded that Eya3 is not required for muscle regeneration but that other Eya genes might compensate its function in KO mouse. To conclude, Six1 and Six2 are required for craniofacial myogenesis and Six1 and Six4 for hypaxial myogenesis and for the establishment of a proper environment allowing myofibre maturation and PAX7+ cells homing during fetal epaxial myogenesis and enabling myofibre growth and re-innervation after injury. The role of the collaboration between SIX and EYA proteins during myogenesis still needs more investigation.

La régénération du muscle fait appel à des cellules souches spécialisées mais elle nécessite également une action coordonnée d'éléments et de cellules du stroma et des tissus de soutien. L'étude de la régénération musculaire ne peut se borner à la seule étude de l'activation, la prolifération et la différenciation des cellules souches musculaires. L'objectif de mon travail de thèse a été d'approcher les mécanismes qui participent à la régénération harmonieuse du muscle à côté des cellules satellites à savoir les différents éléments cellulaires des tissus de soutien et aussi le stroma au travers de l'étude de la chimiokine CXCL12 et de son ancrage à la matrice extra-cellulaire musculaire. Dans un premier temps, nous avons fait le constat que les modèles de lésions musculaires étaient nombreux et étaient utilisés de façon indistincte avec une méconnaissance de leurs spécificités propres. Ainsi, la première partie de ce travail de thèse a consisté en la comparaison des modèles les plus utilisés dans la littérature afin de connaître leurs cibles potentielles et de choisir le mieux adapté aux questions scientifiques posées. Dans un deuxième temps, nous avons utilisé un modèle d'animaux génétiquement invalidés pour l'ancrage de l'isoforme gamma de CXCL12 à la matrice pour étudier le muscle strié squelettique, son développement, les cellules souches et l'organisation de leur niche et enfin, sa réparation. Bien que dans tous les modèles la lésion du muscle évolue à terme vers une restitution ad integrum, les processus mis en oeuvre varient en fonction du type et de l'ampleur de l'atteinte. En outre, nous avons montré que les paramètres histologiques seuls ne sont pas entièrement suffisants pour affirmer que la régénération musculaire est achevée et qu'il faut savoir considérer chaque type cellulaire en détail ainsi que des paramètres fonctionnels qu'il conviendra de mesurer dans les suites de ce travail. Nous avons ensuite étudié l'influence de l'adhésion de la chimiokine CXCL12 aux glycosaminoglycanes dans sa capacité à réguler la réparation musculaire. Pour ce faire nous avons utilisé comme modèle d'étude la souris knock in CXCL12Gagtm/Gagtm, récemment développée au laboratoire et dans laquelle le gène CXCL12 a été muté dans la région du site contrôlant l'ancrage de la molécule CXCL12 aux HS. Chez cette souris, CXCL12 est présent mais incapable de se fixer aux HS de la matrice extracellulaire tout en gardant son activité via CXCR4. Dans ce cas précis CXCL12 est donc incapable de générer un gradient responsable de l'attraction, la rétention et la migration de cellules cibles.Même si cette mutation n'altère pas le bon développement de la souris et que le muscle à l'état basal est normal, nous avons montré un défaut de régénérescence musculaire chez ces souris mutées ayant subit l'agression musculaire la plus sévère avec la présence d'un tissus fibreux cicatriciel et une infiltration d'adipocytes. Nous avons montré que l'absence de gradient de CXCL12 aboutit à une dérégulation de l'angiogenèse dont certains stigmates sont visibles à l'état basal, mais dont la pleine anomalie ne se mesure qu'en conditions d'agression. Cette dérégulation pourrait s'expliquer par la présence de vaisseaux non stabilisés par des cellules murales (cellules musculaires lisses et péricytes). Le développement de ce modèle de fibrose ouvre la voie à différentes questions sur le déroulement de la fibrose en général, de la réparation musculaire, et des relations qu'entretient l'arbre vasculaire les cellules de soutien. / Muscle regeneration needs specialized stem cells but it also requires coordinated action of stromal cells and supporting tissue. The study of muscle regeneration can not be only limited to the study of the activation, proliferation and differentiation of muscle stem cells. The aim of this thesis was to approach the mechanisms involved in the harmonious regeneration of the muscle beside satellite cells to know the different cellular elements of the supporting tissues and also the stroma through the study of CXCL12 chemokine and its anchorage to the GAG of the muscle extracellular matrix.First, we made the observation that muscle damage models were numerous and were used indistinctly with ignorance of their own specificities. Thus, the first part of this thesis consisted of comparing different injury models commonly used in the literature to determine their potential targets and choose the most adapted to scientific questions asked. secondarily, we used an animal model genetically invalidated for anchoring of CXCL12 gamma isoform to the matrix to study the skeletal muscle development, stem cells and the organization of their niche and finally, the repair.We showed initially that the initial choice of the injury model is important during pathophysiological studies. Although all muscle injury models lead to an ad integrum restitution, regeneration processes vary considerably and the impact on different cell types also varies widely. In addition, we have shown that the only histological parameters, are not entirely sufficient to say that muscle regeneration is complete and each cell type should be considering in detail as well as functional parameters that should be measured in perspectives of this work.We used as a study model, mice knock in CXCL12Gagtm/Gagtm recently developed in the laboratory and in which CXCL12 gene has been mutated for the region coding the controlling anchoring of CXCL12 to HS. In this mouse, CXCL12 is present but unable to bind to the extracellular matrix HS while keeping its activity via CXCR4. In this case CXCL12 is unable to generate a gradient responsible for the attraction, retention and migration of target cells.Although this change does not affect the development of the mouse and the muscle at basal state is normal, we have shown a lack of muscle regeneration in these mice with fibrosis and fat infiltartion.The muscle stem cell compartment seems not to be altered in the mutant mice in the basal state and during the regeneration of the muscle. We have shown that the absence of CXCL12 gradient leads to deregulated angiogenesis through vascular hyperproliferation at the basal state. This deregulation seems to be responsible of an altered vascular regeneration after injury with the presence of non-stabilized mural cells (smooth muscle cells and pericytes). This lack of vascular regeneration appears to be responsible for a muscle regeneration failure.

Les cellules des muscles striés squelettiques sont constituées d'éléments contractiles enveloppés par un réseau membranaire. La formation et l'entretien du muscle strié squelettique impliquent la migration des précurseurs myogéniques, la fusion des myoblastes en myotubes et la mise en place des triades. Ces évènements reposent sur le remodelage des membranes et du cytosquelette d'actine des cellules musculaires. Au cours de ma thèse, j’ai étudié le rôle de la protéine adaptatrice CKIP-1 (casein kinase 2 interacting protein-1) dans certaines étapes du développement du muscle strié squelettique. Après avoir identifié le complexe de nucléation de l’actine Arp (actin-related protein) 2/3 comme un nouvel interacteur de CKIP-1, nous avons montré que l’inhibition de l’expression de ckip-1 chez l’embryon de poisson zèbre altère la morphologie des myoblastes et empêche leur fusion du fait d’une désorganisation du cytosquelette d’actine. J’ai également montré que CKIP-1 n’est présente qu’au cours des étapes précoces de la myogenèse in vitro et in vivo chez la souris, puis elle est progressivement clivée. En outre, la modulation de l’expression de CKIP-1 provoque des défauts membranaires aussi bien in vitro qu’in vivo dans le muscle adulte de souris, suggérant que CKIP-1 est impliquée dans le remodelage des membranes. CKIP-1, par ses capacités à remodeler le cytosquelette d’actine et les membranes, pourrait intervenir dans plusieurs étapes de la vie du muscle : la migration, la fusion des myoblastes et la mise en place ou le maintien du réseau membranaire interne des cellules du muscle strié squelettique. / Skeletal muscle cells are composed of contractile elements wrapped in a membrane network. Formation and maintenance of skeletal muscle involve muscle precursor migration, fusion and triad formation. These events rely on actin cytoskeleton and membrane remodelling in muscle cells. The aim of my thesis work was to study the role of the scaffold protein CKIP-1 (casein kinase 2 interacting protein-1) at different steps of skeletal muscle development. We identified the actin nucleation complex Arp (actin-related protein) 2/3 as a CKIP-1 new interactor and showed that Ckip-1 depletion in zebrafish embryos alters fast twitch myoblast morphology and prevents their fusion due to actin cytoskeleton disorganization. I further showed that CKIP-1 is only present during early myogenesis in vitro and in vivo in mouse, and is then cleaved. Modulation of CKIP-1 expression induces membrane defects in vitro but also in vivo in adult mouse muscle, suggesting that CKIP-1 is involved in membrane remodelling. Through its abilities to remodel actin cytoskeleton and thus membranes, CKIP-1 could be implicated in various steps of muscle life: myoblast migration, fusion, and formation or maintenance of the intracellular membrane compartments of skeletal muscle cells.

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Le système d’activation du plasminogène (AP) comprenant les protéases uPA et tPA, et leur inhibiteur PAI-1, génère une activité protéolytique dans la matrice extracellulaire et contribue au remodelage tissulaire dans une grande variété de processus physiopathologiques, y compris la myogenèse squelettique, et la différenciation adipocytaire.Nous avons évalué son rôle spécifique dans la différenciation des cellules souches embryonnaires (ES) de souris. On a trouvé que les activités d’uPA et de tPA ainsi que les niveaux protéiques de PAI-1 sont maximaux dans les cellules différenciées, contrairement aux cellules ES indifférenciées où ils sont indétectables et augmentent progressivement dès le jour 3 de la différenciation. La différenciation adipocytaire dans le modèle des cellules ES est inhibée par le traitement par l’amiloride, un inhibiteur spécifique de l’uPA. Egalement, les cellules ES surexprimant une forme active du PAI-1 sous le contrôle d’un système d’expression inductible, montrent des capacités adipogéniques réduites après l’induction du gène. Nos résultats démontrent que le contrôle de l’adipogenèse des cellules ES par le système AP correspond à des étapes successives, différentes, depuis les cellules indifférenciées jusqu’aux cellules bien différenciées. De plus, les capacités de la différenciation adipogénique des cellules pluripotentes induites déficientes en PAI-1 sont augmentées par rapport aux cellules contrôles.Similairement, la myogenèse squelettique est réduite par l’inhibition de l’uPA par l’amiloride ou par la surexpression du PAI-1 durant l’étape terminale de la différenciation du jour 7 au jour 24. Cependant, l’interférence avec l’uPA durant les jours 0 à 3 de la différenciation, stimule la formation des myotubes. Les différenciations cardiomyocyotaire, neuronale, endothéliale et du du muscle lisse ne sont pas affectées par le traitement à l’amiloride ou la surexpression du PAI-1.Nos résultats montrent que le système AP est capable de moduler spécifiquement l’adipogenèse et la myogenèse squelettique des cellules ES par des mécanismes moléculaires successifs différents. / Regulation of the extracellular matrix (ECM) plays an important functional biological role either in physiological or pathological conditions. The plasminogen activation (PA) system, comprising the uPA and tPA proteases and their inhibitor PAI-1, is one of the main suppliers of extracellular proteolytic activity contributing to tissue remodeling. Although its function in development is well documented, its precise role in mouse embryonic stem cell (ESC) differentiationin vitro is unknown. We found that uPA and tPA activities and PAI-1 protein are very low in undifferentiated ESCs and increase strongly during the differentiation, reaching a maximum in well differentiated cells. Adipocyte formation by ESCs is inhibited by amiloride treatment, a specific uPA inhibitor. Likewise, ESCs expressing ectopic PAI-1 under the control of an inducible expression system, display reduced adipogenic capacities after induction of the gene. Our results demonstrate that the control of ESC adipogenesis by the PA system correspond to different successive steps from undifferentiated to well differentiated ESCs. Furthermore, the adipogenic differentiation capacities of PAI-1-/- induced pluripotent stem cells (iPSCs) are augmented as compared to wt iPSCs. Similarly, skeletal myogenesis is decreased by uPA inhibition or PAI-1 overexpression during the terminal step of differentiation. However, interfering with uPA during days 0 to 3 of the differentiation process augments ESC myotube formation. Neither neurogenesis, cardiomyogenesis, endothelial cell nor smooth muscle formation are affected by amiloride or PAI-1 induction. Our results show that the PA system is capable to specifically modulate adipogenesis and skeletal myogenesis of ESCs by successive different molecular mechanisms.