Made available in DSpace on 2015-04-14T13:09:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 414796.pdf: 186239 bytes, checksum: 84d975c8024507f47eadc59f4d672996 (MD5) Previous issue date: 2007-03-30 / A angiostrongil?ase abdominal ? causada pelo Angiostrongylus costaricensis, um nemat?deo intra-arterial, que vive na regi?o ?leo-cecal de roedores silvestres. Esta parasitose tem sido registrada desde o sul dos Estados Unidos at? o norte da Argentina. O homem ? hospedeiro acidental e se infecta ingerindo as larvas de terceiro est?gio (L3) presentes no muco do hospedeiro intermedi?rio (veronicel?deos). Outra esp?cie, que tamb?m ? parasita do homem, ? Angiostrongylus cantonensis, um verme pulmonar de ratos, causador da meningite eosinof?lica, que ocorre na ?sia e ilhas do Pac?fico. Parasitas de parasitas s?o atualmente alvo de estudos n?o somente para abrir novas possibilidades terap?uticas, bem como para aprimorar t?cnicas diagn?sticas. O interesse pela Wolbachia sp, uma bact?ria gram-negativa endosimbionte, aumentou no momento em que descobriram sua caracter?stica mutual?stica em rela??o ? fil?ria. Estas considera??es levaram a novas id?ias para o tratamento destas parasitoses atrav?s da utiliza??o de drogas antibacterianas. O objetivo principal deste trabalho ? verificar a presen?a de Wolbachia em A. costaricensis e em A. cantonensis, e estudar a sua contribui??o para a resposta imune humoral do hospedeiro vertebrado. O primeiro passo foi buscar evid?ncias da presen?a de ?cidos nucl?icos de Wolbachia, atrav?s da t?cnica de PCR. Em alguns experimentos foram obtidos produtos de amplifica??o, o que poderia ser um ind?cio da presen?a da bact?ria, mas esses dados devem ser confirmados por microscopia eletr?nica e por imunohistologia. Diante das dificuldades para se obter ant?geno de Wolbachia sp alternativamente amostras de soro de indiv?duos com angiostrongil?ase foram testados contra ant?genos de Escherichia coli por ser uma bact?ria comum na microbiota de vertebrados e que eventualmente poderia colonizar o verme. Atrav?s da an?lise por imunoeletrotransfer?ncia ficou claramente demonstrada uma reatividade n?o relacionada exclusivamente aos indiv?duos infectados por A. costaricensis. Al?m disso, fragmentos de vermes foram semeados em meio de cultura a fim de estudar a microbiota do verme adulto de Angiostrongylus. O fato de s? ser encontrada um bacilo gram positivo nesse experimento parece confirmar a hip?tese de que, por ser o ambiente intravascular pouco tolerante ? presen?a de bact?rias, a microbiota do verme deve ser pouco numerosa e diversa. Permanece aberta para futuras investiga??es a contribui??o de outras bact?rias ou outros simbiontes em helmintos, para reconhecimento antig?nico pelo hospedeiro vertebrado, com poss?veis implica??es para diagn?stico, patogenia e tratamento.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:09:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 427622.pdf: 4680280 bytes, checksum: 75e54492eea58e6d4b33bd97da9115de (MD5) Previous issue date: 2010-08-25 / Dentre os angiostrongil?deos, h? duas esp?cies que t?m sido extensamente estudadas por constitu?rem problemas de sa?de humana: Angiostrongylus costaricensis e A. cantonensis. Enquanto existem numerosos estudos sobre a manuten??o e desenvolvimento in vitro de tremat?deos, s?o poucas as tentativas registradas na literatura do mesmo esfor?o em rela??o aos nemat?deos. Atrav?s do desenvolvimento de cultivos e co-cultivos com c?lulas embrion?rias de B. glabrata buscou-se encontrar a forma mais adequada para a produ??o de larvas nas fases intramolusco dos dois parasitos em estudo. Em um trabalho anterior foi utilizada a axeniza??o das larvas de primeiro est?gio, este m?todo foi adaptado especialmente quanto ? concentra??o de hipoclorito de s?dio que foi utilizado a 0,25% de modo eficiente. Verificou-se que nos cultivos enriquecidos com extrato prot?ico do corpo de B. glabrata, houve uma maior recupera??o de larvas de segundo est?gio. A fim de se investigar a possibilidade de uma diferen?a quanto ? express?o de prote?nas entre caramujos infectados e n?o infectados, foi realizada a eletroforese bidimensional. Uma prote?na de 37 kDa no ponto isoel?trico de 4,2 foi expressa apenas nos tecidos dos caramujos infectados. Para se ter um estoque de larvas de primeiro est?gio, testou-se formas de criopreserv?-las com diferentes concentra??es de dimetil-sulf?xido (DMSO) e de soro fetal bovino (SFB). Para ambos nemat?deos, o uso de 1% de DMSO em meio enriquecido com 5% de SFB, incuba??o pr?via de 60 minutos com o criopreservante em temperatura ambiente, seguido pelo congelamento r?pido em nitrog?nio l?quido, apresentou os melhores ?ndices de larvas ativas recuperadas.Embora os experimentos n?o tenham tido ?xito para produzir in vitro larvas de terceiro est?gio (L3), v?rios aspectos foram analisados e todo o conhecimento resultante representa o in?cio do caminho para, com esfor?o cont?nuo, se estabelecer um sistema in vitro capaz de produzir em grande quantidade e regularmente essas formas parasit?rias. Os resultados apresentados contribuem para uma melhor compreens?o da complexa tarefa de manipula??o in vitro desses nem?todeos e dos desafios para o melhor entendimento de sua biologia.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:09:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 448197.pdf: 1838361 bytes, checksum: 7924b0b15d7d6da94d6a3c9d188d1048 (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 / Two species of parasites nematode of Angiostrongylidae family, genus Angiostrongylus intra-arterial localization are capable of human desease production: Angiostrongylus costaricensis and Angiostrongylus cantonensis. Both species are rodent s parasites and the human infection is considered incidental. On humans, A. cantonensis cause eosinophilic meningitis and A. costaricensis cause abdominal angiostrongiliase. Since there is no elimination of parasitic forms in human infection, diagnosis becomes difficult and molecular methods are necessary. After years of discovery of angiostrongil?ases, there are still many efforts in the study and development of a specific and sensitive diagnostic test capable of discriminating Angiostrongyliases of the other parasites. In this context, cross-reactivity becomes a problem in specificity of serologic tests. The main objective of this study was to analyze the sharing of antigens between Angiostrongylus spp. and parasites Strongyloides spp., Fasciola hepatica, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis diminuta and Toxocara canis, and identify these molecules shared. To obtain antigens, some rats were captures and their feces analyzed by the method of Baerman addition to being seeded Agar Plates. Were obtained larvae of Strongyloides spp. and Angiostrongylus spp. In pulmonary arteries were found 11 female worms and 2 male worms of A. cantonensis, which led to the first report of the occurrence of this parasite in Rio Grande do Sul. In the small intestine was obtained a Strongyloides spp worm and analysis of small intestine were obtained Hymenolepis diminuta worms. From the adult worms of parasites were obtained antigens used in this study. Furthermore, we used antigens of allergens such as peanut, tomato, strawberry and pollen. To identify shared antigens, proteins were separated by one and two dimensional electrophoresis technique assayed by Western blot using sera of patients with angiostrongyliases. All antigens were recognized by sera from patients infected with angiostrongyliases, being a total of fourteen bands identified as being immunogenic. The fourteen bands were cut out of polyacrylamide gels and analyzed by mass spectrometry. The proteins identified were: Phosphoenolpyruvate carboxykinase, heat shock protein 70 (HSP70), DAPPUDRAFT hypothetical protein, 60 kDa Chaperonin 5, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, sigma class GST Chain A, Glucose-6-phosphate isomerase, pyruvate dehydrogenase subunit E1, Glutamate dehydrogenase 2, arachin Ahy-1, Full = Allergen Ara h 1, clone P41B, Gly1. The data generated in this study show that there is sharing of antigens between organisms of different taxonomic groups, but also with allergens tested. Moreover, the description and analysis of shared molecular components can help in understanding the evolutionary history and phylogeny of these organisms. / Duas esp?cies de parasitos nemat?deos da fam?lia Angiostrongylidae, do g?nero Angiostrongylus de localiza??o intra-arterial s?o capazes de produzir doen?a em humanos: Angiostrongylus costaricensis e Angiostrongylus cantonensis. Ambas as esp?cies s?o parasitos pr?prios de roedores e a infec??o humana ? considerada acidental. No homem, A. cantonensis ? o causador da meningite eosinof?lica e A. costaricensis causador da angiostrongil?ase abdominal. Como n?o h? elimina??o de formas parasit?rias na infec??o humana, o diagn?stico se torna dif?cil e m?todos moleculares se tornam necess?rios. Depois de anos da descoberta das angiostrongil?ases, ainda h? muitos esfor?os no estudo e desenvolvimento de um teste de diagn?stico espec?fico e sens?vel capaz de discriminar as Angiostrongil?ases de outras parasitoses. Neste contexto, a reatividade cruzada se torna um problema na especificidade de testes sorol?gicos. O objetivo principal deste trabalho foi analisar o compartilhamento de ant?genos entre Angiostrongylus spp. e os parasitos Strongyloides spp., Fasciola hepatica, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis diminuta e Toxocara canis, assim como identificar essas mol?culas compartilhadas. Para obten??o de ant?genos, algumas ratazanas foram capturas e suas fezes analisadas atrav?s do m?todo de Baerman al?m de terem sido semeadas em Placas de ?gar. Foram obtidas larvas de Strongyloides spp. e Angiostrongylus spp. Nas art?rias pulmonares de uma ratazana foram encontrados 11 vermes f?meas e 2 vermes machos de A. cantonensis, que deu origem ao primeiro relato da ocorr?ncia deste parasito no Rio Grande do Sul. No intestino delgado foi obtido um verme de Strongyloides spp e da an?lise do intestino delgado foram obtidos vermes de Hymenolepis diminuta. A partir dos vermes adultos dos parasitos, foram obtidos os ant?genos utilizados neste trabalho. Al?m disso, foram utilizados ant?genos de alergenos como o amendoim, tomate, p?len e morango. Para identifica??o dos ant?genos compartilhados, as prote?nas foram separadas por eletroforese uni e bidimensional ensaiadas pela t?cnica de Western-Blot utilizando-se soro de pacientes com angiostrongil?ases. Todos os ant?genos foram reconhecidos pelo soro de pacientes infectados com angiostrongil?ases, sendo um total de quatorze bandas identificadas como imunog?nicas. As quartorze bandas foram recortadas dos g?is de poliacrilamida e analisadas por espectrometria de massas. As prote?nas identificadas foram: Fosfoenolpiruvato carboxiquinase, Prote?na de choque t?rmico 70 (HSP70), Prote?na hipot?tica DAPPUDRAFT, 60 kDa Chaperonina 5, Gliceralde?do-3-fosfato-desidrogenase, Cadeia A sigma classe GST, Glucose-6-fosfato isomerase, Piruvato desidrogenase subunidade E1, Glutamato desidrogenase 2 , arachin Ahy-1, Full=Allergen Ara h 1, clone P41B , Gly1. Os dados gerados no presente trabalho demonstram que h? compartilhamento de ant?genos entre organismos de diferentes grupos taxon?micos, como tamb?m com os alergenos testados. Al?m disso, a descri??o e a an?lise de componentes moleculares compartilhados podem ajudar na compreens?o da hist?ria evolutiva e da filogenia destes organismos.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:09:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 459196.pdf: 1894686 bytes, checksum: 241ac90cbaf1917d1bf7a9c7970d7bb6 (MD5) Previous issue date: 2014-03-14 / Angiostrongylus cantonensis is a nematode of the Angiostrongylidae family. In humans, they can cause eosinophilic meningitis. Although the parasite have been described in 1935, little is known about the mechanisms of adaptation to its hosts. A. cantonensis owns molecules that help the parasite in the evasion of the host?s immune system, among these are SOD, catalase and HSP70. The main goal of this work was to study the profiles of HSP70, SOD and CAT of L5 produced in different hosts and analyze the diagnostic potential of the extracts. For the obtainment of fifth stage larvae (L5), rats and mice were infeceted with 104 and 50 third stage larvae, respectively, and euthanized after 21 days. The L5 were recovered from the brain of the animals and homogenized in different buffers to obtain the protein extracts. The quantification of the total protein suggests no significant difference between extracts. For the identification of HSP70, it was performed dot blot and Western blot, showing that in both samples HSP70 were present. ELISA assays were used for the quantification of HSP70 and analyze antigen-antibody binding with from individuals with confirmed diagnosis for angiostrongyliasis. L5 from usual hosts were recognized by the sera showing superior titles to the L5 from the accidental hosts. Levels of stress proteins HSP70, SOD (339U versus 0.08U of SOD/mg of protein) and catalase (184.4 versus 75.6 pmol of CAT mg-1 proteins) were higher p<0.05, in A. cantonensis larvae from usual hosts in comparison to the larvae obtained from accidental hosts. These data suggest that the levels of stress proteins may be associated to the adaptation of A. cantonensis to the usual hosts. / Angiostrongylus cantonensis ? um nemat?deo da fam?lia Angiostrongylidae. Em humanos, podem causar meningite eosinof?lica. Apesar de o parasito ter sido descrito em 1935, pouco se sabe dos mecanismos de adapta??o aos seus hospedeiros. A. cantonensis possui mol?culas que o auxilia na evas?o do sistema imune do hospedeiro, dentre estas est?o SOD, catalase e HSP70. O objetivo principal deste trabalho foi estudar o perfil de HSPs 70, SOD e CAT de L5 produzidas em diferentes hospedeiros e analisar o potencial diagn?stico dos extratos. Para a obten??o das larvas de quinto est?gio (L5), ratos e camundongos foram infectados com 104 e 50 larvas de terceiro est?gio, respectivamente, e eutanasiados ap?s 21 dias. As L5 foram recuperadas do c?rebro dos animais e homogeneizadas em diferentes tamp?es para obten??o dos extratos prot?icos. A quantifica??o de prote?nas totais sugere n?o haver diferen?as significativas entre os extratos. Para a identifica??o de HSP70 foram realizados dot blot e Western blot, mostrando que em ambas as amostras HSP70 estavam presentes. Ensaios de ELISA foram utilizados para a quantifica??o de HPS70 e para analisar a liga??o ant?geno anticorpo com soros de ind?viduos com diagn?stico confirmado para a angiostrongiliase, sendo que L5 provenientes de hospedeiros habituais apresentam reconhecimento pelos soros com t?tulos superiores ?s L5 provenientes de hospedeiros habituais. Os n?veis das prote?nas de estresse HSP70, SOD (339U versus 0,08U de SOD/mg de prote?na) e catalase (184,4 versus 75,6 pmole de CAT mg-1 prote?nas) foram superiores p<0,05, em larvas de A. cantonensis provenientes de hospedeiros habituais em compara??o com as larvas obtidas de hospedeiros acidentais. Estes dados sugerem que os n?veis de prote?nas de estresse podem estar associados a adapta??o do A. cantonensis aos hospedeiros habituais.

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-10-09T14:30:50Z No. of bitstreams: 1 DIS_CARLA_ARISTONARA_MULLER_COMPLETO.pdf: 527881 bytes, checksum: 65cb8a9c315b5bbc1f675738fa4f71d0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-09T14:30:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_CARLA_ARISTONARA_MULLER_COMPLETO.pdf: 527881 bytes, checksum: 65cb8a9c315b5bbc1f675738fa4f71d0 (MD5) Previous issue date: 2017-02-15 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / The Phylum Nematoda is extremely diverse and occurs in several ecosystems, thus occupying a key role in the soil trophic webs. The knowledge of nematode species and their patterns of distribution in soils habitats may contribute to our understanding of soil ecology and functioning. The aims of this work was to describe the nematofauna occurring in the Center of Research and Environmental Conservation - PR?-MATA-RS and classifies the nematodes according to their feeding habits thus provide additional information about the Pr? Mata soil diversity. Identification was performed through light microscopy and following taxonomic keys evidencing the diagnostic characters of each group. In total, 1.500 nematodes were found into 200 cm? of soil analyzed. The Chromadorea class was represented by 63% of the individuals, whereas the class Enoplea class by only 12%. Four orders, eight families and 13 genera were recovered. As for feeding trophic groups, were represented plant parasites by 35%, bacterial feeders by 30%, omnivores by 7% and predators by 5%. After extracting nematodes from soil, DNA extraction for amplification of the V4 and V9 regions of the 18S gene of ribosomal DNA was performed. The amplified product was sequenced, obtaining 281,400 sequences passed. Based on the DNA sequences, seven orders, 15 families, and 16 nematode genera were recovered. / O filo Nematoda ? bastante diverso e ocorre em v?rios ecossistemas, ocupando uma posi??o central na cadeia tr?fica de solos. O conhecimento das esp?cies e distribui??o destas pode contribuir em estudos sobre a ecologia e funcionamento do solo, incluindo a din?mica de popula??o e controle biol?gico n?o s? dos pr?prios nemat?deos, mas tamb?m do ecossistema ali presente. Este trabalho teve como objetivo descrever a nematofauna ocorrente na ?rea do Centro de Pesquisas e Conserva??o da Natureza PR?-MATA-RS, e classific?-la taxonomicamente e de acordo com seu grupo tr?fico. A identifica??o foi realizada atrav?s de microscopia ?ptica baseada em chaves taxon?micas evidenciando os caracteres diagn?sticos de cada grupo. Mil e quinhentos nemat?deos foram encontrados em 200 cm? de solo. 63% pertencentes ? classe Chromadoria e 12% ? classe Enoplea, classificados em quatro ordens, oito fam?lias e 13 g?neros. Quanto aos h?bitos alimentares dos nemat?deos foram classificados como 35% parasitos de plantas, 28% bacter?voros, 7% on?voros e 5% como predadores. Ap?s isolamento dos nemat?deos, foi realizada extra??o de DNA para a amplifica??o das regi?es V4 e V9 do gene 18S do DNA (rDNA). O produto amplificado foi sequenciado, obtendo-se 281.400 sequ?ncias. Dentre o filo Nematoda, as fam?lias classificadas foram: Cephalobidae, Chromadoridae, Criconematidae, Plectidae, Ironidae, Prismatolaimidae, Rhabdolaimidae e Tripylidae.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 432345.pdf: 979099 bytes, checksum: 820bba184bdc3f509975d4086e7aaeb4 (MD5) Previous issue date: 2011-03-23 / Angiostrongylus cantonensis ? um nemat?deo de roedores, seus hospedeiros definitivos. Ao infectar o ser humano, um hospedeiro n?o habitual, causa meningoencefalite eosinof?lica. A droga indicada para o tratamento ? o albendazol, por?m n?o existe, at? o presente momento, droga de efic?cia cl?nica demonstrada para o tratamento das angiostrongil?ases. Assim, a id?ia de buscar uma subst?ncia que reduza ou previna a morbidade ? uma alternativa ? abordagem usual de drogas vermicidas. Neste sentido, o presente estudo objetivou verificar o efeito de tr?s subst?ncias com potencial capacidade de inibi??o da oviposi??o em A. cantonensis. Roedores da esp?cie Rattus norvegicus foram inoculados com 100 larvas L3 de A. cantonensis e ap?s 42 dias de infec??o larvas L1 come?aram a ser eliminadas nas fezes. As subst?ncias foram administradas aos animais com 42 dias de infec??o durante 5 dias para a lovastatina (400 mg/Kg) pela via oral, 4 dias para a fenantrolina (20 mg/Kg) pela via intraperitoneal diluindo-se em carboximetilcelulose (CMC) a 1% como coadjuvante e 3 dias, de 12 em 12 horas, para a nitazoxanida (8,3 mg/Kg) pela via oral. Os resultados mostraram um decl?nio na elimina??o de larvas por R. norvegicus quando foi utilizada a nitazoxanida em rela??o aos animais infectados e n?o tratados demonstrando um potencial efeito na inibi??o da oviposi??o deste parasito. Estes resultados demonstram que esta id?ia deve ter continuidade e mais estudos devem ser realizados para aprimorar essa nova hip?tese

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 444695.pdf: 624430 bytes, checksum: e4547549fd33f8db2dfcdef98c9ca071 (MD5) Previous issue date: 2012-08-31 / The two parasites in the genus Angionstrongylus that cause disease in humans are Angiostrongylus costarisensis and Angiostrongylus cantonensis. They have different target organs: A. costarisensis is located in the mesentery and causes eosinophilic ileocolitis, whereas A. cantonensis is a neurotropic parasite responsible for eosinophilic meningoencephalitis. Based on several indications that the sexual maturation is associated with increased pathogenesis in angiostrongylid worms, proteomic analysis was performed on A. cantonensis protein samples, to describe differential protein expression between 21 and 42 days post infection. Triplicated bidimensional electrophoresis was submitted to analysis and 11 proteins were found to be exclusively expressed after sexual maturation. Acetate kinase was the only protein that could be identified after mass spectrometry (LC-MS/MS). Since acetate is an important end-product of the energy metabolism among many parasites but not among their mammalian hosts, acetate formation is an attractive target for the development of new anti-parasitic drugs. Furthermore, studying the adaptations in parasite metabolisms can result in an increased understanding of the host-parasite interaction. This data open opportunities for control interventions and new strategies for molecular diagnosis. / Os principais parasitos do g?nero Angionstrongylus que causam doen?a nos seres humanos s?o Angiostrongylus costarisensis e Angiostrongylus cantonensis. Eles t?m distintos ?rg?os alvos: A. costarisensis est? localizado no mesent?rio e causa ileocolite eosinof?lica, enquanto que A. cantonensis ? um parasita neurotr?pico respons?vel pela meningoencefalite eosinof?lica. Com base em v?rias evid?ncias de que a matura??o sexual est? associada ao aumento da patog?nese em vermes deste g?nero, uma an?lise prote?mica foi realizada em vermes de A. cantonensis para descrever a express?o diferencial de prote?nas entre 21 e 42 dias ap?s a infec??o. Eletroforese bidimensional em triplicata foi submetida ? an?lise e 11 prote?nas foram encontradas exclusivamente expressas ap?s a matura??o sexual. A acetato quinase foi a ?nica prote?na identificada por espectrometria de massa (LC-MS/MS). O acetato ? um importante produto final do metabolismo energ?tico de muitos parasitos, mas n?o de seus hospedeiros mam?feros. Sendo assim, ? um alvo atrativo para o desenvolvimento de novas drogas anti-parasit?rias. Al?m do mais, o estudo das adapta??es no metabolismo do parasito pode resultar em uma maior compreens?o da rela??o parasito-hospedeiro. Este trabalho abre oportunidades para interven??es de controle e novas estrat?gias de diagn?stico molecular.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:09:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437829.pdf: 3097644 bytes, checksum: 63052063f3fb08648c7ca5a4506262bc (MD5) Previous issue date: 2011-12-16 / The genus Angiostrongylus Kamensky, 1905 belongs to the Phylum Nematode, with round shape as its main feature. Two species have medical importance, A. costaricensis living in mesenteric arteries of wild mice and causing abdominal angiostrongyliasis in human and A. cantonensis which lives in pulmonary arteries of rats and may cause eosinophilic meningoencephalitis in humans. The diagnosis of both diseases is difficult due to absence of parasite in feces in case of the infection by A. costaricensis and seldom detected larvae in the cerebrospinal fluid in case of eosinophilic meningoencephalitis. Several studies have been performed to improve the diagnosis of angiostrongyliasis which should be able to differentiate in a specific and sensitive way among other parasitic infections. The 31kDa antigen has been considered the main antigen for eosinophilic meningoencephalitis diagnosis due to A. cantonensis infection. However this antigen is obtained from crude extracts of the worm by a laborious process of purification with low yielding and insufficient amount for large distribution to other diagnostic centers. In order to improve the serologic diagnostic of angiostrongyliasis and make the antigens widely available the present work aimed to identify new antigenic targets and also characterize the 31kDa antigen for further recombinant production. Besides that, essential molecules for parasite survival were investigated which in the future may be targets for disease treatment. Two sources of antigen from female worms were used: excretion and secretion products (ES) and total extract (TE). In ES, sample antioxidant enzymes activity were detected such as catalase and superoxide dismutase. Also was identified by Western blot and Mass spectrometry (MS), 17 proteins target for disease diagnosis and treatment like hemoglobinases, heat shock proteins and proteases inhibitors. In TE sample antioxidant enzymes as well as glutathione transferases (GST) which is another kind of defense enzyme were also detected. GSTs were purified by affinity chromatography and analyzed by MS. Peptide sequences from this experiment matched with homologous sequences of sigma class GST. In TE samples was possible to characterize the 31kDa and after two-dimensional electrophoresis was shown to be composed of four spots around 4.5 of isoelectric point (pI) and being recognized by sera from patients infected with Angiostrongylus spp. The spots were analyzed by MS and three different proteins were identified: 14-3-3 protein, NAC domain containing protein, and epsilon subunit of the coatomer protein complex isoform 2. The 31kDa antigen was characterized as a glycoprotein through studies of oxidation of carbohydrate where it was observed that the antigenicity of four spots was dependent on sugar residues. The DNA sequences of the antigens were obtained by random sequencing of the genome for 454 platform (Roche) and deposited in Genbank. The data generated in this study contribute significantly to the development of recombinant antigens that may be widely distributed for independent diagnostic validation / O g?nero Angiostrongylus Kamensky, 1905 agrupa animais pertencentes ao filo Nematoda, cuja caracter?stica marcante ? a forma corporal cil?ndrica. Duas esp?cies possuem import?ncia m?dica: A. costaricensis cujo habitat natural s?o as art?rias mesent?ricas de camundongos silvestres e na infec??o humana pode levar ao desenvolvimento de angiostrongil?ase abdominal; e A. cantonensis que habita as art?rias pulmonares de roedores e na infec??o humana pode causar meningoencefalite eosinof?lica. O diagn?stico de ambas as doen?as ? dificultado pela aus?ncia de formas parasit?rias nas fezes, no caso de infec??es por A. costaricensis e raramente encontradas no l?quido cefaloraquidiano no caso de meningoencefalite eosinof?lica. Muitos estudos v?m sendo desenvolvidos para o aprimoramento da detec??o das angiostrongil?ases visando testes que sejam capazes de discernir das diferentes infec??es parasit?rias de forma sens?vel e espec?fica. O ant?geno de 31kDa ? considerado atualmente o principal ant?geno para o diagn?stico da meningoencefalite eosinof?lica, causada por A. cantonensis, entretanto ? proveniente da purifica??o de extratos brutos do parasito o que acarreta num processo laborioso e dispendioso que em ?ltima an?lise gera quantidades insuficientes para que haja ampla distribui??o e compartilhamento entre os centros de diagn?stico. Com o intuito de aprimorar o diagn?stico sorol?gico das angiostrongil?ases e tornar os ant?genos dispon?veis globalmente o presente trabalho buscou identificar novos alvos antig?nicos e caracterizar o ant?geno de 31kDa para posterior propaga??o de formas recombinantes. Al?m disso, foram estudadas mol?culas que podem ser fundamentais na manuten??o do parasitismo, que futuramente poder?o ser alvos para o tratamento das angiostrongil?ases. Duas fontes de ant?genos a partir de vermes adultos f?meas foram empregadas: produtos de excre??o e secre??o (ES) e extrato bruto (TE). Nos ES foi detectada a atividade de enzimas antioxidantes como catalase e super?xido dismutase e identificadas, por western blot e espectrometria de massas (MS), 17 prote?nas alvo para o diagn?stico e tratamento das angiostrongil?ases dentre elas hemoglobinases, prote?nas de choque t?rmico e inibidores de proteases. Nas amostras de TE al?m da identifica??o de enzimas antioxidantes, estavam presentes glutationas transferases (GST), outra classe de enzimas de defesa. Estas prote?nas foram purificadas por cromatografia de afinidade e analisadas por MS o que revelou sequencias pept?dicas hom?logas a GST de classe sigma. Em TE tamb?m foi poss?vel a caracteriza??o do ant?geno de 31kDa que quando submetido a eletroforese bidimensional mostrou-se ser composto por 4 spots com ponto isoel?trico (pI) em torno de 4,5 sendo reconhecidos pelo soro de pacientes infectados com Angiostrongylus spp. Os spots foram analisados por MS e tr?s diferentes prote?nas foram identificadas: 14-3-3; prote?na com dom?nio NAC e a subunidade ?psilon do coatamero. O ant?geno de 31kDa foi caracterizado como uma glicoprote?na atrav?s de estudos de oxida??o de glic?deos, onde se observou que a antigenicidade dos 4 spots foi dependente de res?duos de a??car. As sequ?ncias de DNA dos ant?genos foram obtidas pelo sequenciamento aleat?rio do genoma pela plataforma 454 (Roche) e depositadas no Genbank. Os dados gerados no presente trabalho contribuem de forma significativa para o desenvolvimento de ant?genos recombinantes que poder?o ser amplamente distribu?dos para valida??o e aplica??o em diagn?stico

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:09:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 440746.pdf: 8186310 bytes, checksum: 2ddc0fe8a6260707c7754fc8b9f27f5b (MD5) Previous issue date: 2012-05-07 / The Angiostrongylus genus includes two species that can infect humans, A. cantonensis and A. costaricensis. They may cause infections known as eosinophilic meningitis and abdominal angiostrongyliasis, respectively. In A. costaricensis infection, eggs and larvae are central elements in the inflammatory reactions, which may get worse with death of the worms. The currently available anthelmintics act on the parasite essential metabolic pathways with a killing effect. Therefore, an alternative substance to treat angiostrongyliasis, acting mainly in worms reproduction is necessary. An in vitro study conducted with Schistosoma mansoni showed inhibition of oviposition by Phenanthroline. In another study with Caenorhabditis elegans, it was shown that serotonin increases the egg-laying rate of the female nematode, besides controlling the change of its posture state (rest and activation). Serotonin is a neurotransmitter present in vertebrates and invertebrates. In order to test the effect on egg laying of Angiostrongylus spp., two substances that interfere with serotonin neurotransmission in humans, Buspirone and Pizotifen, were used in an experimental model in vivo. 28 rodents of species Rattus norvegicus were divided into three groups and infected with 100 L3 of A. cantonensis: a control group (untreated) and two groups treated with each substance. The substances were administered as soon as all rodents started releasing larvae, once a day, orally, for 10 days, at a concentration of 0.03 mg / mL each. In this period rodent feces were collected daily for counting the number of L1 and after 10 days the animals were euthanized for collection of the worms. The average number of larvae released in feces was 37,934 by the Control group, 10,658 by the Buspirone group and 6,658 by the Pizotifen group. The worms were counted and separated by sex: in the Control group 59 females and 40 males were obtained; in Buspirone group 86 females and 41 males were found; and in the Pizotifen group 83 females and 64 males were counted. The comparison of data from Control and Experimental groups was statistically analyzed by ANOVA and no significant difference was observed. Females were measured using a millimetric eyepiece installed in a stereomicroscope. The ANOVA analysis resulted in a significant difference between Control and Pizotifen, which had an average size of 18 mm, compared with to average size of 19 mm of Control, indicating that Pizotifen would have some effect in the nematodes development, but not affecting their reproduction. These results indicate that the search for alternative drugs that act on egg laying needs a better understanding of the pathways that regulate the reproductive system of parasitic organisms. / O g?nero Angiostrongylus engloba duas esp?cies A. cantonensis e A. costaricensis, que podem infectar o ser humano e causar infec??es conhecidas como meningite eosinof?lica e angiostrongil?ase abdominal, respectivamente. Na infec??o por A. costaricensis, ovos e larvas s?o elementos centrais nas rea??es inflamat?rias podendo haver o agravamento dessas les?es, pela morte dos vermes. Os anti-helm?nticos atualmente dispon?veis, atuam em vias metab?licas essenciais ao parasito, culminando com a morte dos vermes. Portanto, uma droga alternativa para o tratamento das angiostrongil?ases, que atue principalmente na reprodu??o dos vermes, se torna necess?ria. Um estudo in vitro realizado com Schistosoma mansoni demonstrou a inibi??o da oviposi??o pela fenantrolina. Em outro estudo com Caenorhabditis elegans foi demonstrado que a serotonina estimula o aumento da taxa de ovos liberados pela f?mea do nemat?deo, al?m de controlar a altera??o do seu estado de postura (repouso e ativa??o). A serotonina ? um neurotransmissor presente tanto em vertebrados como em invertebrados. Com o objetivo de testar o efeito na oviposi??o de Angiostrongylus cantonensis, duas subst?ncias que interferem na neurotransmiss?o da serotonina em humanos, Buspirona e Pizotifeno, foram utilizadas em modelo experimental in vivo. 28 roedores da esp?cie Rattus norvegicus foram divididos em 3 grupos e infectados com 100 L3 de A. cantonensis: um grupo controle (n?o tratado) e 2 grupos tratados com cada subst?ncia. As subst?ncias foram administradas a partir do momento em que todos os roedores iniciaram a larvipostura, uma vez ao dia por via oral, durante 10 dias, numa concentra??o de 0,03 mg/mL cada. Neste per?odo as fezes dos roedores foram recolhidas diariamente para a contagem do n?mero de L1 eliminadas e, ap?s os 10 dias, os animais foram eutanasiados para coleta dos vermes. A m?dia de larvas eliminadas nas fezes para o grupo controle foi 37.934, para o grupo Buspirona 10.658 e para o grupo Pizotifeno 6.658. Os vermes foram contados e separados pelo sexo: no grupo controle foram obtidas 59 f?meas e 40 machos; no grupo Buspirona foram encontradas 86 f?meas e 41 machos e no grupo Pizotifeno 83 f?meas e 64 machos. A compara??o dos dados dos grupos experimentais e do controle foram analisadas estatisticamente pelo teste ANOVA e nenhuma diferen?a significativa foi verificada. As f?meas foram medidas atrav?s de uma ocular milimetrada instalada em um estereomicrosc?pio. A an?lise foi feita tamb?m pelo teste ANOVA e resultou numa diferen?a significativa entre o grupo controle e o Pizotifeno, no qual teve um tamanho m?dio de 18 mm, em compara??o com o tamanho m?dio do controle de 19 mm, indicando que o Pizotifeno poderia ter algum efeito no desenvolvimento dos nemat?deos, por?m n?o afetando a reprodu??o. Estes resultados indicam que para a procura de drogas alternativas, que atuem na oviposi??o, ? necess?rio uma melhor compreens?o das vias reguladoras do sistema reprodutivo dos organismos parasitos.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2016-05-30T16:54:35Z No. of bitstreams: 1 TES_CAROLINA_DE_MARCO_VERISSIMO_COMPLETO.pdf: 3480923 bytes, checksum: c145d85afafb9cc7cd5782a17ac34cfb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-30T16:54:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TES_CAROLINA_DE_MARCO_VERISSIMO_COMPLETO.pdf: 3480923 bytes, checksum: c145d85afafb9cc7cd5782a17ac34cfb (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / Angiostrongylus cantonensis is a nematode parasite, main etiologic agent of the eosinophilic meningitis (EM) in humans, a disease endemic in many tropical and sub tropical countries. The diagnosis of EM involves clinical evaluation, eosinophils counting >10% in liquor, and consuming historical of raw mollusks, as they are the intermediate hosts of the Angiostrongylus. Definitive diagnosis through larvae visualization in the liquor is rare. Serological test, mainly involving the 31-kDa component detection, which presents high sensitivity and specificity, has been employed as an alternative way for diagnostic. The 31-kDa antigen is composed for glycoproteins and tentatives in producing it in a recombinant way, using either prokaryotic or eukaryotic models, were inable to mantain immunological recognition, probably due the lack or deficient glycosilation of the molecules. Due the lack of information about A. cantonensis glycans and the need of producing a standard antigen able to be used worldwide in a diagnostic test, the main goal of this work was to study the A. cantonensis glycan profile and their role on the immune diagnosis of EM. It was used total soluble extract (TE) and excretory-secretory products (ES) as sources of glycans and glycoconjugates. The N-linked glycans and glycoconjugates from A. cantonensis female TE and 31-kDa antigen were analyzed and identified by mass spectrometry (MS) and lectin array, and the immunogenecity of these molecules were characterized by dot blot and Western blots. Furthermore, It was investigated the biosynthesis routes of glycans using in silico analysis of the Angiostrongylus genome and transcriptome dataset. N-glycans containing complex structures, with truncated antennas containing terminal with galactose and N-acetylgalactosamine, and core ?1-6 fucosylated were identified. Lectin array analysis could also dentify Gal and GalNAc structures in Angiostrongylus glycoconjugates. Eight genes involved with biosynthesis of N-glycans, among them GCS1; GANAB, MAN1, MGAT2 and FUT8; and three involved with O-glycan biosynthesis, GALNT, C1GALT1 e OFUT1 were found by in silico analysis. Immunogenicity of the 31-kDa antigen is tottaly dependent of N-glycans and not to O-glycans. Modeling of proteins of the 31kDa component showed N-glycosilation sites and predicted structures that were the same identified by MS analysis. Taking together, the data generated in this study shown the glycan importance for angiostrongyliasis diagnosis and also the glycan repertoire that Angiostrongylus produces. This work is an important contribution to the development of a standard diagnosis for EM and also for new perspectives in the study of angiostrongyliasis diagnosis, parasite biology and host-parasite relationship. / Angiostrongylus cantonensis ? um nemat?deo parasita, principal agente etiol?gico da meningite eosinof?lica (ME) em humanos, doen?a end?mica em diversos pa?ses tropicais e subtropicais. A ME se caracteriza pela eosinofilia >10% no l?quor, e hist?rico de ingest?o de moluscos crus, j? que estes s?o hospedeiros intermedi?rios do Angiostrongylus. O diagn?stico definitivo ? raramente poss?vel atrav?s da visualiza??o da larva no liquor. Testes sorol?gicos envolvendo principalmente a detec??o do componente de 31-kDa, que apresenta alta sensibilidade e especificidade, tem sido empregados como uma alternativa diagn?stica. O ant?geno de 31-kDa ? composto por glicoprote?nas e tentativas em produzi-lo de maneira recombinante, em modelos procari?ticos ou eucari?ticos, n?o tiveram sucesso em manter o reconhecimento imunol?gico, provavelmente pela incorreta ou insuficiente glicosila??o das mol?culas. Devido ? falta de informa??o sobre glic?dios de A. cantonensis e a necessidade de produzir um ant?geno padr?o capaz de ser usado em um teste de diagn?stico para distribui??o mundial, o objetivo principal deste trabalho foi estudar o perfil glic?dico de A. cantonensis e o papel dessas mol?culas no imunodiagn?stico da ME. Foram utilizados extratos sol?veis totais (ET) de vermes adultos machos e f?meas e produtos de excre??o e secre??o (ES) como fontes dos glic?dios e glicoconjugados estudados. Os N-glic?dios e glicoconjugados do ET de verme f?mea de A. cantonensis e o ant?geno de 31-kDa foram analisados e identificados por espectrometria de massa (EM) e lectina array, e a import?ncia imunog?nica destas mol?culas foi caracterizada por tratamento com glicosidases aliado a dot blot ou Western blot. Al?m disso, foi investigada a presen?a de enzimas envolvidas na s?ntese de diferentes glic?dios a partir de an?lises in silico do genoma e transcriptoma do Angiostrongylus. Diversos N-glic?dios foram identificados nas amostras analisadas. Estes continham estruturas complexas, com antenas truncadas contendo galactose e N-acetilgalactosamina em posi??es terminais e n?cleo ?1-6 fucosilado. As mesmas estruturas terminais foram identificadas pela an?lise de Lectin Array. Em rela??o a an?lise in s?lico da bioss?ntese de glic?dios em Angiostrongylus, foram identificados oito genes envolvidos na s?ntese de N-glic?dios, entre eles GCS1; GANAB, MAN1, MGAT2 e FUT8; e pelo menos tr?s genes envolvidos na s?ntese de O-glic?dios, GALNT, C1GALT1 e OFUT1. Os N-glic?dios se mostraram essenciais para a imunogenicidade do ant?geno de 31-kDa quando soros positivos para A. cantonensis foram testados. Uma modelagem in silico dos componentes de 31-kDa, demonstrou s?tios de glicosila??o para N-glic?dios, e previu as mesmas estruturas que foram identificadas por EM. Em conjunto, os dados gerados neste estudo mostraram a import?ncia de glic?dios para o diagn?stico de angiostrongil?ases e tamb?m o repert?rio de glic?dios que este parasito pode produzir. Este trabalho ? uma contribui??o importante para o desenvolvimento de um diagn?stico padr?o para a ME e tamb?m para novas perspectivas no estudo do diagn?stico de angiostrongil?ases, biologia do parasito e rela??o parasito-hospedeiro.