Personalized medicine can be an approach to address the unsatisfactory treatment outcomes in inflammatory conditions such as cancer, arthritis, and cardiovascular diseases. A common feature of chronic diseases is the infiltration of pro-inflammatory macrophages at the disease loci. Infiltrating macrophages have been previously utilized for disease diagnosis. These features suggest that macrophages can be broadly applicable targets for simultaneous therapy and diagnosis. Cyclooxygenase-2 (COX-2), an enzyme involved in the biosynthesis of a lipid inflammatory mediator, prostaglandin E2 (PGE2), is over expressed in macrophages infiltrating the pathological site. Inhibition of PGE2 leads to reduced inflammation, pain and macrophage infiltration. To utilize macrophages for the purpose of simultaneous therapy and diagnosis, we proposed to integrate therapeutic and imaging capabilities on a single nanomedicine platform, referred as theranostics. A stable 19F MRI visible nanoemulsion platform was developed, incorporating celecoxib for COX-2 inhibition and near-infrared fluorescent dye(s) for fluorescence imaging. We hypothesized that inhibition of COX-2 in macrophages using a theranostic nanoemulsion will reduce the inflammation (and pain), and that this response can be visualized by monitoring changes in macrophage infiltration. In vitro characterization demonstrated that the theranostic displays excellent stability with no toxicity, and significant uptake in macrophages. Furthermore, it delivers celecoxib to macrophages and reduces PGE2 production from these cells. In vivo studies in a murine paw inflammation model showed nanoemulsion presence at the inflamed site, specifically in COX-2 expressing macrophages compared to neutrophils. Supporting our hypothesis, celecoxib delivered through a nanoemulsion demonstrated time-dependent reduction in fluorescence from the inflamed paw, indicative of reduced macrophage infiltration. In a neuropathic pain model, celecoxib delivered to macrophages led to reduced pain concomitant with reduced macrophage infiltration at the inflamed site compared to free drug control (cross reference: Kiran Vasudeva, Dissertation, 2015). In conclusion, inhibition of COX-2 in macrophages using theranostic nanoemulsions proves to be an effective and generalized strategy facilitating simultaneous therapy and diagnosis, which can be applied to many chronic diseases. The diagnostic information during therapy can be used to tailor the treatment and reduce patient variability leading to personalized medicine. / Mylan School of Pharmacy and the Graduate School of Pharmaceutical Sciences; / Pharmaceutics / PhD; / Dissertation;

L’imagerie préclinique est devenue une ressource incontournable pour l’évaluation de paramètres physiopathologiques, pour le suivi du développement tumoral ainsi que pour le développement de thérapies anticancéreuses. Les évolutions technologiques apparues ces dernières années ont conduit au développement de nouvelles modalités d’imagerie ayant un fort potentiel de translation vers la clinique. Ce manuscrit présente diverses approches par imagerie échographique, photoacoustique et de fluorescence dans le proche infrarouge pour le suivi de la pathologie cancéreuse. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de l’hypoxie et son suivi au cours du temps dans différents modèles de cancers humains. Différentes stratégies d’imagerie multimodale ont ensuite été mises en oeuvre pour évaluer l’efficacité d’une nouvelle prodrogue thérapeutique permettant la libération d’une molécule active dans le proche environnement tumoral sur des modèles humains de tumeurs pancréatiques, mammaires, pulmonaires. Enfin, dans un contexte de recherche translationnelle, nous avons exploré le potentiel de l’imagerie photoacoustique et de la fluorescence infrarouge pour la mise en évidence de l’invasion ganglionnaire tumorale en mettant en oeuvre des modèles de ganglions sentinelles minimalement envahis. Au cours de ce travail, nous avons montré l’intérêt du suivi de l’hypoxie tumorale en onco-pharmacologie et mis en évidence le fort potentiel de l’imagerie PA pour les approches translationnelles en oncologie. La principale limitation correspond à la profondeur relativement faible des régions explorables, mais ce point suscite actuellement de nombreux développements technologiques. Les études de faisabilité réalisées ainsi que la validation de protocoles de preuves de concept permettront l’exploitation en routine de ces nouvelles modalités d’imagerie. / Preclinical imaging has become an unavoidable step for pathophysiological parameters assessments, for the follow up of tumor growth and for the anticancer therapies development. Technological improvements have emerged in recent years, allowing the emergence of new imaging modalities with a high potential for translation into clinical practice. This manuscript presents several approaches by ultrasound imaging, photoacoustics and near infrared fluorescence in order to monitor the cancer pathology. Initially, we focused on the characterization of hypoxia and its longitudinal assessment in various preclinical models of human cancers. Various multimodal imaging strategies were implemented to assess the efficacy of a new therapeutic prodrug allowing the release of an active molecule in the tumor microenvironment on human models of pancreatic, breast and lung tumors. Finally, in a context of translational research, we explored the potential of photoacoustic and near infrared fluorescence imaging to highlight the lymph node invasion by cancer cells implementing minimally invaded sentinel lymph node models. In this work, we have shown the interest in monitoring the tumor hypoxia in onco-pharmacology and highlighted the high potential of photoacoustic imaging for oncology translational approaches. The main limitation is the relatively shallow depth of regions that we can explore, but this point is currently subject to many technological developments. Feasibility studies performed and validation of proof of concept protocols will enable routine exploitation of these new imaging modalities.

Background: Near-IR fluorescence (NIRF) imaging is becoming a promising approach in preclinical tumor detection and clinical image-guided oncological surgery. While heptamethine cyanine dye IR780 has excellent tumor targeting and imaging potential, its hydrophobic property limits its clinical use. In this study, we developed nanoparticle formulations to facilitate the use of IR780 for fluorescent imaging of malignant brain tumor. Methods: Self-assembled IR780-liposomes and IR780-phospholipid micelles were prepared and their NIRF properties were characterized. The intracellular accumulation of IR780-nanoparticles in glioma cells were determined using confocal microscopy. The in vivo brain tumor targeting and NIRF imaging capacity of IR780-nanoparticles were evaluated using U87MG glioma ectopic and orthotopic xenograft models and a spontaneous glioma mouse model driven by RAS/RTK activation. Results: The loading of IR780 into liposomes or phospholipid micelles was efficient. The particle diameter of IR780-liposomes and IR780-phospholipid micelles were 95 and 26nm, respectively. While stock solutions of each preparation were maintained at ready-to-use condition, the IR780-phospholipid micelles were more stable. In tissue culture cells, IR780-nanoparticles prepared by either method accumulated in mitochondria, however, in animals the IR780-phospholipid micelles showed enhanced intra-tumoral accumulation in U87MG ectopic tumors. Moreover, IR780-phospholipid micelles also showed preferred intracranial tumor accumulation and potent NIRF signal intensity in glioma orthotopic models at a real-time, non-invasive manner. Conclusion: The IR780-phospholipid micelles demonstrated tumor-specific NIRF imaging capacity in glioma preclinical mouse models, providing great potential for clinical imaging and image-guided surgery of brain tumors.

Développer de nouveaux fluorophores ayant une forte section efficace d’absorption à deux photons (ADP) et des propriétés d'émission dans le rouge lointain est important, en particulier pour l’imagerie in-vivo profonde. Cette gamme de longueur d'onde correspond en effet à la fenêtre de transparence optique des tissus. Cette thèse étudie le potentiel de nouveaux fluorophores émettant dans rouge construits sur un noyau fluorène pour la microscopie à deux photons in-vivo, en privilégiant l'imagerie du système vasculaire, d'une part, et la mesure optique de la pression d'oxygène dissous, d'autre part.Ainsi, une famille de chromophores asymétriques a été conçue et synthétisée. La plupart des chromophores présentent une forte émission dans le proche IR, induite par l'agrégation. De plus, une stratégie de co-protection basée sur un système micellaire / silice a été utilisé pour préparer des nanoparticules avec un intérieur apolaire et conserver les propriétés optiques des chromophores dipolaires en solution aqueuse. Des mesures de fluorescence excitée à deux photons ont été menées en solvant organique et en suspension aqueuse. Les agrégats et les nanoparticules ont été utilisés avec succès en imagerie biphotonique du système vasculaire sur petit animal en utilisant un modèle de tumeur à l'intérieur de la peau de l'oreille de la souris. Les nanoparticules de silice montrent une coloration exceptionnelle du système vasculaire qui en fait de parfaits marqueurs du système vasculaire.Dans un deuxième temps, quatre nouveaux chromophores, absorbant à deux photons, ont été synthétisés et leurs propriétés photo physiques à un et à deux photons ont été étudiées. Le chromophore le plus adapté a ensuite été greffé de manière covalente par chimie click, à un complexe de palladium avec un ligand porphyrine, cœur phosphorescent dont l’émission est sensible à la présence d’oxygène. Deux composés contenant quatre ou huit absorbeur à deux photons ont été obtenus et étudiés. Les résultats démontrent que l'incorporation d'un chromophore ADP approprié peut effectivement augmenter les propriétés d’ADP du système, ce qui permet une sensibilité efficace vis-à-vis de l'oxygène. / The development of fluorophores with efficient two-photon absorption (TPA) and emission properties in the far red/NIR is important, especially for in depth in-vivo optical imaging as this wavelength range corresponds to the optical transparency window of tissues. This thesis investigates the potential of new red emitting fluorophores containing a fluorene ring for in-vivo two-photon microscopy focusing on vascular imaging on one hand and on oxygen pressure measurement on the other hand.A new series of asymmetrical fluorene-based chromophores were designed and synthesized. Their structure-property relationships were systematically investigated. It was found that most of chromophores exhibit aggregation-induced emission behaviors in the NIR region. In addition, a micelle/silica coprotection strategy was proposed to prepare nanoparticles with a less polar interior, which can be used to conserve optical properties of dipole chromophores in aqueous solution. The two-photon excited fluorescence (TPEF) measurements indicate that they all display obvious TPA activities in organic solvent and aqueous suspension. Both the NIR-emissive aggregates and nanoparticles have been successfully used for TPEF imaging of blood vessels inside mouse ear skin. The silica nanoparticles show outstanding staining of the vascular system making them perfect blood pool markers.On a second part, four new fluorene-based two-photon absorbing chromophores have been synthesized and their one- and two-photon photophysical properties were investigated. The optimum chromophore was successfully attached covalently to an oxygen responsive phosphorescent Pd-porphyrin complex by click chemistry. Two new compounds contain four or eight TPA chromophores donor connected to the phosphorescent core. The result demonstrate that the incorporation of a suitable TPA chromophore can effectively enhance the TPA of the system, allowing efficient sensitivity towards oxygen.

La biopsie du ganglion sentinelle (GS) est actuellement la technique de référence pour le diagnostic des métastases ganglionnaires du cancer du sein. Cependant, les traceurs utilisés pour la cartographie du GS (colorant bleu et radiocolloïde) ne sont pas idéaux et peuvent occasionner des réactions allergiques et engendrer des coûts importants. Une alternative à l'utilisation de ces traceurs repose sur le repérage du GS par imagerie de fluorescence proche infrarouge à l'aide de nanoparticules. Deux types de nanoparticules ont été étudiés : les Quantum Dots (QDs) à base d'indium et les nanoparticules de silice (NPSi) renfermant de la cyanine 7. Dans un modèle murin de carcinome mammaire, tous les GS envahis par les métastases ont pu être visualisés grâce à la fluorescence des QDs-indium. L'étude de biodistribution a mis en évidence une capture majeure des QDs au point d'injection et dans les ganglions associée à une faible concentration dans le foie et la rate. La toxicité des QDs a été évaluée in vitro et a démontré une toxicité fortement réduite des QDs-indium par rapport aux QDs-cadmium. Les NPSi présentent les avantages suivants : biocompatibilité, amélioration de la rétention dans le ganglion et des propriétés photophysiques par rapport au fluorophore libre. Le GS est rapidement visualisable par fluorescence suite à l'injection de NPSi. Le suivi des souris, pendant 3 mois post-injection, n'a révélé aucun signe de toxicité générale ou hépatique. Ces deux types de nanoparticules fluorescentes sont particulièrement bien adaptés à la cartographie du GS et pourraient avantageusement remplacer les traceurs employés actuellement / Sentinel lymph node (SLN) biopsy is a reliable technique for the diagnosis of metastases in breast cancer. However, the tracers used (blue dye and radiocolloid) are not optimal because they can cause allergic reactions and major costs in waste processing. Our strategy was to use near-infrared emitting nanoparticles for the mapping of SLN: indium-based Quantum Dots (QDs) and cyanine 7 embedded in silica nanoparticles (SiNP). In a murine model of mammary carcinoma, all SLN containing lymphatic metastases could be visualized with fluorescent indium-based QDs. The biodistribution study concluded that the major organs of retention were the injection point and lymph nodes whereas liver and spleen accumulated fewer QDs. The cytotoxicity tests demonstrated a weak in vitro toxicity of indium- compared to cadmium-based QDs. SiNP show several advantages over free fluorophore such as biocompatibility, better retention in the SLN and greatest photophysical properties. SLN could be mapped as soon as 5 minutes after SiNP injection. The in vivo toxicity in mice was followed during 3 months after injection and did not reveal any signs of general or hepatic toxicity. Both fluorescent nanoparticles are thus well adapted for the mapping of the SLN and could be a favourable substitute to the actually tracers

Introduction : La thérapie ciblée des cancers des VADS nécessite la mise au point de nouveaux vecteurs spécifiques. Ces vecteurs servent à acheminer des substances thérapeutiques, mais aussi ils peuvent être couplés à des fluorophores afin de les utiliser dans la chirurgie guidée par l'imagerie de fluorescence proche infrarouge.Objectifs : L'objectif de notre travail est de tester de nouveaux vecteurs des cancers des VADS et d'étudier l'apport de l'imagerie de fluorescence proche infrarouge dans la chirurgie des cancers des VADS chez un modèle animal orthotopique que nous mettons au point.Matériel et méthodes : La lignée cellulaire des cancers des VADS CAL33 est caractérisée in vitro et in vivo. De nouveaux vecteurs qui ciblent un ou plusieurs récepteurs des cellules CAL33 comme l'intégrine alpha v beta 3, l'EGFR et la NRP1, sont testés in vitro. Parallèlement, un modèle animal orthotopique des cancers des VADS est développé par implantation de fragments tumoraux des cellules CAL33, au niveau de la cavité buccale de la souris nude. La résection des tumeurs orthotopiques est guidée par l'imagerie de fluorescence proche infrarouge, après injection systémique du peptide RAFT-c[RGD]4 couplé à un fluorophore. Ce peptide cible l'intégrine alpha v beta 3 et est préalablement testé in vivo sur les cellules CAL33.Résultats : Nos résultats préliminaires montrent que certaines molécules bispécifiques présentent une liaison accrue in vitro aux cellules CAL33. Par ailleurs, la chirurgie guidée par l'imagerie de fluorescence proche infrarouge ciblant l'intégrine alpha v beta 3, présente un impact positif sur la survie sans rechute dans notre modèle orthotopique, à travers la détection de reliquats tumoraux qui pourraient passer inaperçus si l'exérèse tumorale avait été réalisée exclusivement d'une façon macroscopique. Elle permet aussi de détecter les adénopathies métastatiques.Conclusion : L'imagerie de fluorescence proche infrarouge améliore la qualité de l'exérèse tumorale dans notre modèle orthotopqiue optimisé des cancers des VADS. Cette étape préclinique est indispensable avant de tester cette technique chez l'être humain. / Introduction: Targeted therapy of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) requires the development of novel specific vectors that can deliver therapeutic molecules. These vectors could also be coupled to fluorophores to be used in near infrared fluorescence imaging-guided surgery.Objectives: The aim of our work is to test new targeted vectors of HNSCC and to study the role of the near infrared fluorescence imaging-guided surgery in HNSCC resection in a novel orthotopic animal model that we develop.Materials and Methods: The HNSCC cell line CAL33 is characterized in vitro and in vivo. Novel vectors that target one or more receptors of this cell line such as alpha v beta 3 integrin, EGFR and NRP1, are tested in vitro. Meanwhile, an orthotopic animal model of HNSCC is developed by implanting tumor fragments of CAL33 cells, in the oral cavity of nude mice. Surgical resection of orthotopic tumors is guided by the near infrared fluorescence imaging after systemic injection of RAFT-c[RGD]4 peptide coupled with a fluorophore. This peptide targets alpha v beta 3 integrin and is previously tested in vitro.Results: Our preliminary results show that bispecific vectors would present an increased binding to CAL33 cells in vitro. On the other hand, near infrared fluorescence imaging-guided surgery has a positive impact on the recurrence-free survival rate in our orthotopic model, by detecting fluorescent cancer foci that could remain unidentified if resection was performed exclusively under visual guidance. Our results show also that near infrared fluorescence imaging can also help to detect metastatic lymph nodes.Conclusion: Near-infrared fluorescence imaging-guided surgery improves the quality of tumor resection in our optimized orthotopic animal model of HNSCC. This preclinical stage is essential before testing this novel technique in humans.

L'athérosclérose, à l’origine de la plupart des maladies cardiovasculaires telles que l'infarctus du myocarde ou l'AVC, est la principale cause de décès dans le monde. Les cliniciens ont donc besoin de techniques d'imagerie fiables pour identifier les patients «vulnérables» porteur d’athérome à haut risque d'occlusion thrombotique. Cette pathologie est une maladie inflammatoire qui implique beaucoup d'acteurs cellulaires et moléculaires, parmi lesquels les cellules endothéliales et immunitaires, les lipoprotéines, les cellules apoptotiques et les plaquettes. L'imagerie moléculaire visant à détecter ces acteurs avant la survenue d'événements cardiovasculaires dramatiques est en plein essor. Des anticorps humains (HuAbs) sélectionnés par phage-display pour reconnaître des biomarqueurs de la pathologies ont ici proposés comme ligands servant à fonctionnaliser des vecteurs pour l'imagerie IRM, de fluorescence ou TEP. Les HuAbs ont été modifiés, en introduisant soit des Cystéines soit un site de reconnaissance pour la Sortase, afin de développer un greffage site-spécifique. Les agents ciblant ont été validés in vitro et ex vivo sur des coupes d'athérome de modèles animaux. Des résultats prometteurs ontété obtenus en injectant dans des souris ApoE-/- l’anticorps antiplaquettaire TEG4, apportant ainsi de nouvelles connaissances sur la biologie de l'athérome et la preuve de concept d'une possible détection des plaques à haut risque riches en plaquettes. Des améliorations sont en cours pour développer des agents de contraste multi-fonctionnalisés avec des HuAbs et permettant de réaliser une imagerie moléculaire multimodale de l'athérosclérose facilement transposable en clinique. / Because cardiovascular diseases are the leading cause of death in the world, providing clinicians with reliable and straightforward imaging techniques to identify "vulnerable" patients from the general population appears like the Holy Grail of the cardiovascular field. Atherosclerosis, identified as the underlying condition for most acute cardiovascular events, is characterized by the constitution of a lipidrich atheroma plaque, driven both by excess cholesterol and inflammation, which eventual rupture triggers clotting into the blood flow. It involves a wealth of cellular and molecular actors, which are so many potential markers for molecular imaging, aiming at deciphering how to warn clinicians about the possible occurrence of myocardial infarction or stroke. Here, human antibodies (HuAbs) selected by phage-display for their recognition of over-expressed biomarkers of the pathology are proposed as targeting ligands. They were further engineered for site-specific grafting, either by introducing Cysteine or Sortase recognition tags, and used to target contrast agents for MRI, fluorescence, or PET imaging. In vitro and ex vivo validation studies were carried out on atheroma sections of animal models. In vivo studies in the ApoE-/- mouse model were realized with the anti-platelet TEG4 HuAb using MRI, which provided insights on the biological relevance and feasibility to detect platelets-rich, high-risk atheroma plaques. The development of contrast agents useful in multi-modality imaging, and multi-functionalized with HuAbs is underway. It should serve as an accurate molecular imaging method for atherosclerosis, further more easily translated into the clinical arena.

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