Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-06-01T20:02:08Z No. of bitstreams: 1 TESE Leslie Clifford Noronha Araújo.pdf: 1451824 bytes, checksum: fe84cfc90617851c91791c636966ada7 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-01T20:02:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Leslie Clifford Noronha Araújo.pdf: 1451824 bytes, checksum: fe84cfc90617851c91791c636966ada7 (MD5) Previous issue date: 2016-07-19 / CNPQ / As neoplasias malignas urológicas mais prevalentes são o câncer de próstata, de bexiga e o de rim. Estas três neoplasias estão relacionadas a uma perda importante da qualidade de vida dos pacientes e possuem tratamentos agressivos. O diagnóstico de cada uma destas doenças é realizado, na maioria das vezes, de forma invasiva e possui complicações inerentes a cada procedimento. Neste sentido, a busca de métodos por diagnóstico não invasivos tem sido estudada, e a via metabonômica através da espectometria por ressonância nuclear magnética de hidrogênio (RNM 1H) fornece informações de vias metabólicas que podem diagnósticas patologias sem a necessidade de procedimentos invasivos. Os voluntários foram distribuídos em grupo controle (07 voluntários) composto de homens com idades entre 60 e 67 anos, grupo CP com voluntários portadores câncer de próstata (09 voluntários) com idades entre 61 e 69 anos, grupo CB com voluntários portadores câncer de bexiga (05 voluntários), sendo dois homens com idade de 70 e 76 anos e três mulheres com idades entre 57 e 75 anos e grupo CR com voluntários portadores câncer de rim (05 voluntários), sendo um homem com 35 anos e 4 mulheres com idade entre 54 e 64 anos. Uma amostra de 3ml de urina foi colhida de 26 voluntários para a elaboração do estudo piloto. Este material foi submetido à RNM 1H seguindo o protocolo do Departamento de Química Fundamental da UFPE com posterior geração de espectros. A estatística multivariada para a elaboração de modelos metabonômicos e a análise de comparação de grupos foi realizada. Esses modelos mostraram uma discreta separação entre o grupo controle e cada um dos três grupos de voluntários com patologias oncológicas. Para criação de modelos definitivos foi necessário agrupar os voluntários com câncer de bexiga e rim (CB/CR) devido ao pequeno número de amostras por grupo. O modelo metabonômico quando comparado ao grupo controle mostrou uma sensibilidade de 90,9%, especificidade de 100%, VPP de 100% e VPN de 85,7% para o grupo CB/CR e sensibilidade, especificidade, VPP e VPN de 100% para o grupo CP. Este estudo piloto demonstra que o método é simples, de fácil execução, não invasivo e com possibilidade de diagnóstico das patologias oncológicas com uma única coleta de urina. / The most prevalent urological malignancies are prostate cancer, bladder cancer and kidney cancer. The first one is the most common solid cancer in men and the others can affect men and women. These three malignancies are related to a significant loss of quality of life of patients and have aggressive treatments. The diagnosis of each of these diseases is conducted, in most cases, invasively and including all complications inherent to each procedure. In this sense the search for noninvasive diagnostic methods has been studied, and the metabonomics spectrometry method by nuclear magnetic resonance of hydrogen (1H NMR) provides pathways of diagnostic information that can identify pathologies without the need of invasive procedures. A sample of 3ml of urine was collected of 26 volunteers for the preparation of this pilot study. They were distributed in 4 groups. The control group (07 volunteers) comprised men aged 60 to 67 years, CP group of volunteers with prostate cancer (09 volunteers) aged 61 to 69, CB group included volunteers with bladder cancer (05 volunteers), two men aged 70 and 76 years and three women aged between 57 and 75 years and CR group of volunteers with kidney cancer (05 volunteers), one man of 35 years and four women aged between 54 and 64 years. This material was subjected to 1H MRI following the protocol of the Fundamental Chemistry Department of UFPE with generation of spectra. The multivariate statistics for the development of metabonomics models and comparison analysis groups was performed. These models showed a slight separation between the control group and each of the three groups of patients with oncological diseases. For the elaboration of the definitive models it was necessary to incorporate the volunteers of the CB and CR due to the small number of samples per group. The metabonomic method when compared to control group shown sensitivity of 90.9%, specificity of 100%, 100% PPV and NPV of 85.7% for the group CB/CR and sensitivity, specificity, PPV and NPV of 100% for the CP group. This pilot study demonstrates that the method is feasible with easy execution, showing simplicity besides being not invasive and allowing the diagnosis of oncological diseases with a single urine collection.

Orientadores: Ubirajara Ferreira, Fernandes Denardi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T15:47:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Matheus_WagnerEduardo_D.pdf: 1544170 bytes, checksum: b8c2ff3d48db298c2b90e9243e4fad82 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O melhor tratamento para o carcinoma urotelial invasivo de bexiga é a cirurgia de cistectomia radical. O objetivo principal desse estudo foi de comparar a taxa de sobrevida global dos tumores músculo invasivos primários dos tumores invasivos progressivos. O objetivo secundário foi comparar a taxa de sobrevida global dos subgrupos pT3/4, acometimento linfonodal e presença de metástases, dos tumores primários e invasivos. Nesse estudo multicêntrico retrospectivo, foram avaliados 242 pacientes submetidos à cistectomia radical, no período de 1992 a 2005, para tratamento de carcinoma urotelial invasivo de bexiga. Os pacientes foram divididos em dois grupos: Grupo I ¿ 185 pacientes com tumor invasivo primário e Grupo II - 57 pacientes com carcinoma urotelial invasivo progressivo. Além disso, conforme achados histopatológicos, ambos os grupos foram divididos em subgrupos: pT2 (invasão de musculatura vesical), pT3/4 (invasão de gordura perivesical e órgãos ou tecidos adjacentes), N+ (acometimento de linfonodos) e M+ (presença de metástases). Para análise estatística foram aplicados os testes de qui-quadrado, Mann-Whitney, Kaplan-Meier e Wilcoxon (Breslow). A média e mediana de seguimento foram de 98 e 90 meses para o Grupo I, e 96 e 88 meses para o Grupo II, respectivamente, e sem diferença estatística significativa (p = 0.0734). No seguimento, foram observadas as seguintes taxas de sobrevida global: no primeiro ano, 77% para o Grupo I e 84% para o Grupo II; no terceiro ano, 59% e 74% e, no quinto ano, 52% e 58% para os grupos I e II, respectivamente, sem diferença estatística significativa. Quando analisados separadamente, os três subgrupos: tumores PT3/T4, acometimento linfonodal e presença de metástases, também não foram observadas diferenças estatísticas significativas nos grupos I e II. No presente estudo, não houve diferença significativa de sobrevida global dos pacientes portadores de tumores vesicais invasivos primários e progressivos, no seguimento de cinco anos. Também não houve diferença significativa na sobrevida global, quando analisados separadamente os subgrupos: PT3/4, com acometimento linfonodal e presença de metástases / Abstract: The best treatment for all-invasive bladder cancer is radical cystectomy. The main purpose of this study was to compare the overall survival rate of primary muscle-invasive urothelialbladder carcinoma (UC) to the progressive muscle-invasive bladder carcinoma. A secondary aim was to compare the survival rate of the subgroups pT3/4, lymph nodes involvement and the presence of metastasis in primary and invasive bladder carcinomas. A retrospective multicentric analysis was performed studying a total of 242 patients who underwent radical cystectomy for invasive TCCB from 1992 to 2005. The patients were divided into two groups. There were 185 patients in Group I with progressive invasive TCCB, while Group II had 57 patients with primary invasive TCCB. Both groups were further divided according to the pathological findings in pT2 (muscle invasion), pT3/4 (perivesical fat and/or adjacent organs/structure invasion), N+ (positive lymphaticnodes) and M+ (distant organ metastasis). Several tests were employed for the statistical analysis: qui-square, Mann-Whitney, Kaplan-Meier method and Wilcoxon (Breslow). The average and median follow-ups were, respectively, 98 and 90 months in Group I and 96 and 88 months in Group II, without a significant statistical difference (p = 0.0734). The 1-year survival rate was 77% in Group I and 84% in Group II. After 3 years of follow-up the survival rate fell to 59% in Group I and 74% in Group II. Finally, the 5-year survival rate was 52% in Group I and 58% in Group II, without a significant statistical difference. When the three subgroups were analyzed separately for tumors pT3/T4, invasivelymphatic nodes and the presence of metastasis, no significant statistical differences were found in either Group I or Group II. In the present study, patients with primary invasive and progressive invasive TCCB showed a similar 5-year global survival rate. Pathological stage (PT, N and M) and patient demography did not interfere with the results / Doutorado / Cirurgia / Doutor em Cirurgia

Introdução: Ocupação foi identificada como o segundo fator de risco mais importante para o câncer de bexiga depois de fumar sendo responsável por até 20% de todos os cânceres de bexiga em países industrializados. Apesar dos esforços consideráveis para investigar ocupações em relação ao risco de câncer de bexiga, muitas não foram encontrados de forma consistente. Material e Métodos: Foram incluídos 200 pacientes com diagnóstico de câncer de bexiga entre os anos de 2009 e 2013. Foi aplicado um questionário para obter informações sobre a profissão, tempo de exposição e hábitos diários, sintomas, e também dados de doenças incluindo estágio, grau e número e tamanho de lesões. Os pacientes do Grupo 1 foram aqueles sem emprego previamente associados com o risco de câncer de bexiga. Grupo 2 representado pacientes em risco devido a profissões. Resultados: Os pacientes do Grupo 2 apresentaram uma proporção significativamente maior de pT2 CaB (P = 0,037), enquanto que os pacientes do grupo 1 apresentaram significativamente mais pTa (p = 0,002) da doença. Analisando preditores de pT2, a presença de ocupação aumento de alto risco por 2,80 vezes a chance de desenvolver uma doença invasiva. Ao analisar o grau do tumor descobriram que um tempo de exposição de 10 anos ou mais aumenta o risco de tumores de alto grau em 4,28 vezes (p = 0,001). Conclusão: Pacientes com história de exposição a agentes cancerígenos devido à sua atividade profissional podem estar em maior risco de desenvolvimento de tumores invasivos e aqueles que estão expostos a estes agentes para mais de 10 anos podem desenvolver doença de alto grau com mais freqüência. População em risco pode, portanto, beneficiar de rastreamento para o câncer de bexiga / Occupation was identified as the second most important risk factor for bladder cancer after smoking accounting for up to 20% of all bladder cancers in industrialized countries. Despite considerable efforts to investigate occupation against the risk of bladder cancer, many have not been found consistently. We included 200 patients diagnosed with bladder cancer between 2009 and 2013. A questionnaire was applied to obtain information about the profession, exposure time and daily habits, symptoms, and also diseases of data including stage, grade and number and lesion size. Patients in Group 1 were those without jobs previously associated with the risk of bladder cancer. Group 2 represented patients at risk because of professions. Group 2 patients had a significantly higher proportion of pT2 CaB (P = 0.037), whereas patients in group 1 had significantly more pTa (p = 0.002) of the disease. Analyzing predictors of pT2, the presence of high-risk occupation increases by 2.80 times the chance of developing invasive disease. In considering the degree of tumor found that a time of 10 or more years of exposure increases the risk of high-grade tumors in 4.28 times (p = 0.001). Patients with a history of exposure to carcinogens because of their duties may be at greater risk of developing invasive tumors and those who are exposed to these agents for more than 10 years can develop high-grade disease more often. Population at risk can therefore benefit from screening for bladder cancer

Introdução: O câncer de bexiga é a segunda neoplasia maligna mais frequente do trato urinário, com 386.000 casos estimados e 150.000 mortes para 2011 no mundo. Noventa e cinco por cento são carcinomas uroteliais (CUB) papilíferos não músculo-invasivos de baixo grau, que apresentam altas taxas de recidiva, mas raramente progridem. Tumores invasivos de alto grau representam 10-20% dos diagnósticos, são altamente agressivos levando à mortalidade elevada. O conhecimento das vias moleculares envolvidas na carcinogênese dessa neoplasia é importante para a identificação de novos marcadores para diagnóstico, acompanhamento, prognóstico e desenvolvimento de novas terapias alvo. Micro RNA (miRNA) são pequenas sequências não codificantes de RNA que regulam a expressão dos genes inibindo a tradução da proteína ou promovendo a degradação do RNA mensageiro, estando atualmente envolvidos em vários processos celulares fisiológicos e patológicos, incluindo o câncer. Objetivos: Caracterizar o perfil de expressão de miRNA no CUB, relacionando-o com os parâmetros prognósticos clássicos para a doença: grau histológico e estadiamento. Além disso, relacionar esse padrão de comportamento dos miRNA com a recidiva tumoral e sobrevida câncer-específica em pacientes tratados cirurgicamente para CUB. Material e Métodos: Catorze miRNA (miR-100, miR-10a, miR-21, miR-205, miR-let7c, miR- 125b, miR-143, miR-145, miR-221, miR-223, miR-15a, miR-16-1, miR-199a e miR- 452) foram isolados de espécimes cirúrgicos de 60 pacientes divididos em 2 grupos: 30 pacientes com CUB não invasivo (pTa) de baixo grau submetidos à RTU de bexiga, 30 com CUB invasivo (pT2-3) de alto grau submetidos à cistectomia radical. O grupo controle é representado por cinco pacientes portadores de bexiga normal sem CUB que realizaram tratamento cirúrgico aberto para tratamento da hiperplasia prostática benigna (HPB). O processamento dos miRNA envolveu três fases: (1) extração do miRNA com kit específico, (2) geração do DNA complementar e (3) amplificação do miRNA por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). A expressão de cada miRNA foi obtida através do cálculo 2- CT e os RNU-43 e RNU-48 foram utilizados como controles endógenos. Testes estatísticos foram aplicados para estudar as variáveis envolvidas e curvas de Kaplan-Meyer foram usadas para avaliar a sobrevida livre de recidiva (SLR) e sobrevida câncer-específica (SCE). Resultados: Dos 14 miRNA estudados a maioria apresentou subexpressão nos dois grupos de tumor analisados, com exceção do miR-10a para o grupo pTa de baixo grau e do miR-100, 21 e 205 para os tumores pT2/pT3 de alto grau, onde demonstraram-se superexpressos. Essas diferenças de expressão de miRNA entre os dois grupos foram estatisticamente. Quando estudamos a relação entre expressão de miRNA e a evolução dos pacientes através de curvas de sobrevida, observamos que maiores níveis de expressão do miR-21 relacionou-se com menor SLR para tumores pTa. Ainda, maiores concentrações de miR-10a e miR-145 se associaram com menor SLR e maiores níveis de miR-10a com menor SCE para tumores pT2-3. Conclusões: Demonstramos um predomínio de subexpressão de miRNA em xv carcinomas de bexiga. Os miR-100, miR-10a, miR-21 e miR-205 demonstraram diferenças no perfil de expressão para grau e estadiamento dentro dos dois grupos de tumor, sendo capazes de diferenciá-los. Maiores níveis de miR-21 se relacionaram com menor SLR para tumores pTa de baixo grau, enquanto maiores concentrações de miR-10a estiveram associadas com menor SLR e SCE para tumores pT2/pT3 de alto grau / Introduction: Bladder cancer (BC) is the second most common malignancy of the urinary tract, with 386,000 cases estimated and 150,000 deaths in 2011. Urothelial carcinomas (UC) represent 95% of BC cases, and knowledge of the molecular pathways associated with BC carcinogenesis is crucial to identify new diagnostic and prognostic biomarkers, and development of new target molecular therapies. MicroRNAs (miRNAs) are short non-coding RNA molecules that play important roles in the regulation of gene expression by acting directly on mRNAs, leading to either mRNA degradation or inhibition of translation, involved in many physiological and pathological processes, including cancer. Objectives: To characterize miRNAs expression profiles in UC, associating with classic prognostic factors: grade and stage. Moreover, correlate miRNA expression with tumor recurrence and survival. Material and Methods: Fourteen miRNAs (miR-100, miR-10a, miR-21, miR-205, miR-let7c, miR-125b, miR-143, miR-145, miR-221, miR-223, miR-15a, miR-16-1, miR- 199a e miR-452) were isolated from surgical specimens from 60 patients classified in two groups: 30 patients with low-grade non-invasive pTa UC that underwent TURB, 30 with high-grade invasive pT2/pT3 UC underwent radical cystectomy. The control group consists in five normal bladder tissue taken from patients that underwent retropubic prostatectomy to treat benign prostatic hyperplasia (BPH). miRNA processing involved three phases: (1) miRNA extraction by specific kits, (2) cDNA generation (3) miRNA amplification through qRT-PCR. Expression profiles were obtained by relative quantification determined by 2-ct method. Endogenous control were RNU-43 and RNU-48. Statistic tests were used to study the prognostic variables and Kaplan-Meyer curves were constructed to analyze disease-free (DFS) and disease-specific (DSS) survivals. Results: All miRNAs were underexpressed in both groups, except miR-10a in pTa and miR-100, 21 and 205 in pT2/pT3 tumors, that where over-expressed. miR-100, miR-21, miR-10a and miR-205 differentialy expressed in both groups and this differences were statistically significant. The Kaplan-Meyer survival curves showed that higher levels of miR-21 were related to shorter DFS for pTa group. Also, higher levels of miR-10a and miR-145 were associated with shorter DFS and higher levels of miR-10a were also related to shorter DSS in pT2/pT3 group. Conclusions: The majority of miRNA were shown to be underexpressed in bladder UC. miR-100, miR-10a, miR-21 and miR-205 were differentially expressed considering tumor grade and stage. The miRNA profile was able to distinguish pTa low grade and pT2-3 high grade tumors. Higher levels of miR- 21 were related to shorter DFS in pTa, while higher levels of miR-10a were associated with shorter DFS and DSS in pT2-3, high grade UC

Introdução: Um dos principais obstáculos para compreensão dos eventos biológicos envolvidos no câncer é a falta de modelos adequados para o estudo in vitro em especial em relação ao câncer de próstata (CaP) e ao câncer de bexiga (CaB). Há um número limitado de linhagens celulares de CaP e de CaB sendo a maioria proveniente de tumores invasivos e metastáticos. Sabe-se ainda, que existem diferenças étnicas entre as populações quanto ao comportamento de neoplasias. Desta forma, a pesquisa baseada em linhagens de uma população homogênea seria fonte de resultados limitados, não contemplando a diversidade que sabidamente ocorre entre os diferentes grupos. Além desse aspecto, as linhagens celulares comerciais são na sua maioria adquiridas na Coleção Americana de Culturas de Tecido (ATCC, do inglês American Tissue Cell Culture) que apesar de serem bem padronizadas, requerem processos de importação com aumento do custo e demandas burocráticas que dificultam a pesquisa. Portanto, consideramos vital para a compreensão dos fenômenos relacionados à carcinogênese, assim como estudos de resistência a drogas, quimioprevenção e novas estratégias terapêuticas, o desenvolvimento de linhagens tumorais derivadas de tumores primários que acometem a nossa população, peculiarmente miscigenada. No presente trabalho, fragmentos de carcinoma urotelial da bexiga e de adenocarcinoma da próstata foram obtidos durante cirurgia para remoção de tumores primários de pacientes tratados e acompanhados na Divisão de Urologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP) e no Hospital Sírio Libanês. As linhagens estabelecidas a partir destes fragmentos foram caracterizadas através da análise da cinética de crescimento, análises imunocitoquímicas e anormalidades cromossômicas incluindo cariótipo e hibridização in situ por fluorescência (FISH). Além disso, as linhagens obtidas foram submetidas a estudos de quimiossensibilidade com o uso dos compostos curcumin e Prima-1. Avaliamos ainda, a tumorigenicidade de nossas linhagens em camundongos atímicos. Os resultados deste trabalho demonstram o desenvolvimento de três linhagens de CaB e três linhagens de CaP sendo as mesmas não tumorigênicas em camundongos atímicos. Além disso, demonstramos que o curcumin na concentração de 50 M induziu morte celular em todas as linhagens estudadas, sendo seu efeito mais evidente nas linhagens de CaP. Por fim, Prima-1 reduziu a viabilidade celular independente do status de p53 nas linhagens de CaB / Introduction: One of the main obstacles for understanding biological events involved in cancer is the lack of appropriated models for in vitro studies especially for prostate cancer (PC) and bladder cancer (BC). There are a limited number of PC and BC cell lines being the majority originated from metastatic and invasive tumors. Also it is well known that there are ethnic differences between populations concerning the behavior of tumors. In such a way, the research based on cell lines derived from a homogenous population should be source of limited results, not contemplating the diversity known to occur among different groups. In addition the commercial cell lines are generally acquired at American Tissue Cell Culture (ATCC) that although wellestablished requires importation processes with cost increase and bureaucratic demands that difficult the research. Therefore we consider vital to the comprehension of the carcinogenesis phenomena, as well as drug resistance studies, chemoprevention and new therapeutic strategies, the development of tumor lineages derived from primary tumors that assail our miscigenated population. At the present work, fragments of bladder urothelial carcinoma and prostate adenocarcinoma were obtained by surgical resection of primary tumors from patients treated and followed in the Division of Urology of the Clinical Hospital of the São Paulo University (FMUSP) and Syrian Lebanese Hospital. The cell lines established from these fragments were characterized through growth kinetic, immunocytochemistry and chromosome abnormalities including karyotyping and Fluorescence in situ hybridization (FISH). Moreover, the cell lines were submitted to chemosensitivity studies using curcumin and Prima-1 and analyzed regarding their tumorigenicity in athymic mice. The results of this work show the development of three BC and three PC cell lines that were not tumorigenic in athymic mice. Curcumin at 50 M concentration induced cell death in all studied lineages, being more effective in PC cell lines. Finally, PRIMA-1 reduced the cellular viability independent of the p53 status in BC cell lines

A bexiga urinária é exposta constantemente a substâncias potencialmente prejudiciais presentes na urina, cuja exposição crônica pode levar a diversas patologias. Dentre estas patologias está a cistite hemorrágica que é uma condição inflamatória grave da bexiga associada ao uso de fármacos quimioterápicos, como a ciclofosfamida. É descrito que a exposição em longo prazo à ciclofosfamida aumenta o risco de desenvolvimento do câncer de bexiga, o qual é caracterizado como sendo a segunda neoplasia mais comum do trato urinário e o sétimo câncer mais prevalente entre homens no mundo. Alterações na sinalização purinérgica têm sido evidenciadas em diferentes patologias associadas à bexiga urinária. De fato, o sistema purinérgico tem emergido como um potencial alvo a ser estudado. Portanto, nesta tese buscou-se avaliar o envolvimento da sinalização purinérgica em um modelo in vivo de cistite hemorrágica e em um modelo in vitro de câncer de bexiga. No intuito de identificar estratégias preventivas e tratamentos eficazes para reduzir a morbidade e a mortalidade associadas à cistite hemorrágica, a espécie Uncaria tomentosa foi investigada, devido a sua ampla utilização em casos de inflamação crônica e doenças do trato urinário. A partir dos estudos conduzidos in vivo, demonstramos que o tratamento sistêmico com a fração purificada de glicosídeos do ácido quinóvico de U. tomentosa foi capaz de prevenir os eventos nociceptivos e inflamatórios associados à cistite hemorrágica. A diminuição da expressão dos receptores P2X7, provavelmente pela inibição da migração dos neutrófilos ao local da inflamação foi observada, evidenciando propriedades anti-inflamatórias promissoras para esta fração podendo, no futuro, se tornar um agente terapêutico potencial no tratamento desta patologia. Para o câncer de bexiga músculo invasivo, a cistectomia radical é considerada o tratamento padrão, porém está associada à morbidade significativa. Na tentativa de proporcionar uma melhor qualidade de vida aos pacientes, o interesse por abordagens terapêuticas que visam à preservação da bexiga urinária tem aumentado. Neste sentido, a radioterapia tem recebido destaque por ser uma modalidade de tratamento já utilizada. Desta forma, investigamos os efeitos da radioterapia sobre a sinalização purinérgica em linhagem celular de câncer de bexiga humano T24. Dentre os receptores expressos pelas células T24, o receptor P2X6 apresentou aumento expressivo após a radioterapia. A partir da análise de pacientes com câncer de bexiga (Kaplan-Meier), evidenciamos a relação existente entre a alta expressão deste receptor e o aumento da taxa de sobrevivência. Na sequência, o provável envolvimento da família das ectonucleotidases nos efeitos da radioterapia na linhagem celular T24 também foi avaliado. Observamos que a sinalização purinérgica, principalmente via hidrólise do ATP à adenosina pela ação combinada de ectoenzimas demonstrou papel importante no tratamento radioterápico in vitro. A indução transitória da expressão da enzima ecto- 5’NT/CD73 pela radioterapia também foi observada, sendo a adenosina gerada a responsável por contribuir na morte celular. O papel crucial da ecto-5’NT/CD73 na radiossensibilização das células foi confirmado pela inibição farmacológica e pelo uso do nocaute da enzima. Em conjunto, os resultados in vitro demonstraram que a vantagem da radioterapia parece ser alcançada naqueles pacientes que expressam o receptor P2X6 e a enzima ecto-5’NT/CD73 na área tumoral, podendo no futuro, ambos serem considerados possíveis marcadores para prever a eficácia da resposta à radioterapia para o tratamento do câncer de bexiga. Por fim, a realização do ensaio radiométrico frente à ecto-5’NT/CD73 evidenciou o potente efeito inibitório do ácido ursólico sobre esta enzima, cujo potencial também foi confirmado frente à linhagem celular T24. / The urinary bladder is constantly exposed to potentially harmful substances in the urine, whose chronic exposure can lead to various diseases. Among these pathologies the hemorrhagic cystitis is a severe inflammatory condition of the bladder associated with the use of chemotherapeutic drugs, such as cyclophosphamide. It has been reported that long-term exposure to cyclophosphamide increases the risk of developing bladder cancer, which is characterized as being the second most common cancer of the urinary tract and the seventh most common cancer among men in the world. Alterations in the purinergic signaling have been shown in diseases associated with urinary bladder. In fact, the purinergic signaling has emerged as a potential target to be studied. Therefore, this thesis sought to evaluate the involvement of purinergic signaling in an in vivo model of hemorrhagic cystitis and in an in vitro model of bladder cancer. In order to identify preventive strategies and effective treatments to reduce morbidity and mortality associated with hemorrhagic cystitis, the Uncaria tomentosa species was investigated due to its wide use in cases of chronic inflammation and urinary tract diseases. From studies conducted in vivo, we demonstrated that systemic treatment with the quinovic acid glycosides purified fraction from U. tomentosa was able to prevent nociceptive and inflammatory events associated with hemorrhagic cystitis. The decreased expression of the P2X7 receptor was observed, most likely by the reduction of neutrophils migration to the site of inflammation. Therefore, this investigation has shown promising antiinflammatory properties for this fraction, which may in the future become a potential therapeutic agent for the treatment of this pathology. For bladder muscle invasive cancer, although radical cystectomy has been considered the standard treatment is still associated with significant morbidity. In an attempt to provide a better quality of life for patients, interest in therapeutic approaches aimed the preservation of the urinary bladder have increased. In this regard, the radiotherapy has been highlighted by being a treatment modality already used. Thus, we investigated the effects of radiation on the purinergic signaling in T24 human bladder cancer cell line. Among the receptors expressed by T24 cells, the P2X6 receptor showed significant increase after radiotherapy. From the analysis of patients with bladder cancer (Kaplan-Meier), we noticed the relationship between high expression of this receptor and increased survival rate. Following, the involvement of ectonucleotidases after irradiation exposure in T24 cell line was also evaluated. The purinergic signaling, mainly through hydrolysis of ATP to adenosine by the combined action of ectoenzymes, demonstrated important role in radiotherapy in vitro. The transient induction of ecto-5’NT/CD73 expression by radiotherapy was also observed, being the adenosine generated a possible responsible in T24 cell death. The crucial role of ecto-5’NT/CD73 in the radiosensitization of the cells was confirmed by pharmacological inhibition and the use of the enzyme knockout. Taken together, the in vitro results demonstrate that the benefit of radiation therapy appears to be achieved in those patients that express the P2X6 receptor and the enzyme ecto-5’NT/CD73 in the tumor area, and in the future both may be considered potential markers for predicting the effectiveness response to radiotherapy for the treatment of bladder cancer. Finally, the radiometric ecto-5’NT/CD73 assay showed the potent inhibitory effect of ursolic acid on this enzyme, whose potential was also confirmed through the T24 cell line.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 458593.pdf: 1436191 bytes, checksum: b126309dee58688d2fe23cb45be67db7 (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / The purinergic system can induce proliferation, differentiation and death on tumor cells. Different P2 purinergic receptors are involved in preventing the growth of these cells. Although the mechanisms are not completely known, they may represent interesting therapeutic targets to control tumors. The RT4 and T24 human tumor bladder cell lines have been used as low and high cancer malignancy phenotype models, respectively. Our research group has demonstrated that quercetin increases the ADP hydrolysis and inhibits ecto-5'-nucleotidase/ CD73, exerting an anti-proliferative effect on T24 cell lines. We also demonstrate that T24 cell lines expresses the purinergic enzymes CD39L4 and ecto-5'-nucleotidase / CD73, and have low hydrolytic activity of ATPase and ADPase in contrast to a high activity AMPase. These data suggest the involvement of the enzymes and purinergic receptors on progression the tumor of the bladder, as well as other tumor types. The objective of the present study was characterize the purinergic receptors P2X (1-7) expression profile on human bladder tumor cell lines and biopsies; and investigate the inflammatory genes that are up-regulated on high-grade human tumor bladder cells compared to low grade tumor bladder cells. Human bladder cells RT4 and T24 were obtained from the ATCC. Cells were cultured in DMEN and RPMI, respectively, supplemented with 10% of fetal bovine serum (FBS), under ideal conditions of cultivation Data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA), followed by Tukey Kramer test. To confirm the relevance of P2X (1-7) receptors in bladder cancer, we have also assessed their expression in human biopsies. For this purpose, upon approval by the local ethics committee, specimens of bladder tumors and normal tissues were obtained from the same patients, who have been undergone surgical resection at the Hospital S?o Lucas/PUCRS. All samples were collected and rapidly frozen in -80?C with RNA holder. Tissue specimens were ground and then sonicated in a TRIzol kit. The mRNA level was analyzed using RT-PCR analysis. Real-time PCR revealed that the mRNA expression of P2X purinergic receptors, particulary P2X4R was significantly up-regulated on both T24 and RT4 cell lines. Data from human bladder tumor biopsies comparing to bladder normal tissue, showed that P2X6 and P2X7 receptors appeared to be most often up-regulated on tumor tissues. Twelve inflammation related genes, CCL2, CCR2, TNF-α, MAPK3, IL-1β, IL-6, ADORA1, CD200, CD4, CHRNA4, EDNRA e ITGB2 were significantly up-regulated on the grade III bladder tumor cell line T24 when compared to grade I bladder tumor cell line RT4. Our results indicate that the inflammation genes overexpressed may play an important role in regulating urinary bladder cancer. We can conclude that P2X purinoreceptors and inflammation genes are differentially distributed among normal bladder, low and high tumor bladder, which could contribute to the different characteristics of these different types of cells. / O sistema purin?rgico pode induzir a prolifera??o, diferencia??o e morte em c?lulas tumorais. Diferentes receptores purin?rgicos P2, est?o envolvidos na inibi??o do crescimento tumoral. Embora os mecanismos n?o sejam completamente conhecidos, estes receptores podem representar alvos terap?uticos interessantes no tumor de bexiga. As linhagens celulares derivadas de tumor de bexiga humano RT4 e T24 t?m sido usadas como modelo de baixa e alta malignidade de tumor, respectivamente. Estudos realizados pelo nosso grupo de pesquisa t?m demonstrado o envolvimento do sistema purin?rgico no tumor de bexiga. A quercetina aumenta a hidr?lise do ADP e inibe a ecto - 5' - nucleotidase / CD73, exercendo um efeito anti - proliferativo sobre as c?lulas T24. Tamb?m demonstramos que as linhagens de c?lulas T24 expressam enzimas CD39L4 e ecto - 5' - nucleotidase / CD73, e t?m baixa atividade hidrol?tica de ATPase e ADP?sica com uma elevada atividade AMP?sica. Estes dados sugerem o envolvimento das enzimas e receptores purin?rgicos na progress?o do tumor de bexiga, bem como em outros tipos de tumor. O objetivo do estudo ? caracterizar a express?o dos receptores purin?rgicos P2X (1-7) em bi?psias de c?ncer de bexiga e linhagens celulares de tumor de bexiga humano, relacionado com o perfil de genes inflamat?rios mais expressos nestas amostras. Metodologia: As linhagens celulares de bexiga humanas RT4 e T24 foram obtidas a partir da ATCC. As c?lulas foram cultivadas em meio RPMI e DMEN, respectivamente, suplementado com 10 % de soro fetal bovino (SFB), sob condi??es ideais de cultivo. Para confirmar a relev?ncia dos receptores P2X (1-7) no tumor de bexiga, avaliou-se a express?o em bi?psias humanas. Para isso, ap?s aprova??o pelo comit? de ?tica local, amostras de tecidos normais e tumorais de bexiga foram obtidas dos mesmos pacientes, submetidos ? ressec??o cir?rgica no Hospital S?o Lucas / PUCRS. O RNA total dos tecidos foi isolado utilizando kit TRIzol . O n?vel de mRNA foi analisado utilizando an?lise RT - PCR . Resultados: O PCR em tempo real revelou que a express?o de mRNA de receptores purin?rgicos P2X, particularmente P2X4R foi significativamente up- regulada em ambas linhagens RT4 e T24. Dados a partir de bi?psias de tumores de bexiga humanos que comparam os resultados de express?o do tecido tumoral em rela??o ao tecido normal de bexiga, demonstrou que os receptores de P2X6 e P2X7 est?o superexpressos em tecidos tumorais. Doze genes relacionados com a inflama??o, CCL2, CCR2, TNF-α, MAPK3, IL-1β, IL-6, ADORA1, CD200, CD4, CHRNA4, EDNRA e ITGB2 foram significativamente superexpressos em c?lulas T24 derivadas de tumor de grau III quando comparadas com as c?lulas RT4 derivadas de tumor de grau I. Nossos resultados indicam que os genes superexpressos de inflama??o podem desempenhar um papel importante na regula??o do tumor de bexiga urin?ria. Conclus?o: Podemos concluir que purinoreceptores P2X e os genes inflamat?rios s?o diferencialmente distribu?dos entre bexiga normal e tumoral, o que pode contribuir para as diferentes caracter?sticas destes diferentes tipos de tumores.

A bexiga urinária é exposta constantemente a substâncias potencialmente prejudiciais presentes na urina, cuja exposição crônica pode levar a diversas patologias. Dentre estas patologias está a cistite hemorrágica que é uma condição inflamatória grave da bexiga associada ao uso de fármacos quimioterápicos, como a ciclofosfamida. É descrito que a exposição em longo prazo à ciclofosfamida aumenta o risco de desenvolvimento do câncer de bexiga, o qual é caracterizado como sendo a segunda neoplasia mais comum do trato urinário e o sétimo câncer mais prevalente entre homens no mundo. Alterações na sinalização purinérgica têm sido evidenciadas em diferentes patologias associadas à bexiga urinária. De fato, o sistema purinérgico tem emergido como um potencial alvo a ser estudado. Portanto, nesta tese buscou-se avaliar o envolvimento da sinalização purinérgica em um modelo in vivo de cistite hemorrágica e em um modelo in vitro de câncer de bexiga. No intuito de identificar estratégias preventivas e tratamentos eficazes para reduzir a morbidade e a mortalidade associadas à cistite hemorrágica, a espécie Uncaria tomentosa foi investigada, devido a sua ampla utilização em casos de inflamação crônica e doenças do trato urinário. A partir dos estudos conduzidos in vivo, demonstramos que o tratamento sistêmico com a fração purificada de glicosídeos do ácido quinóvico de U. tomentosa foi capaz de prevenir os eventos nociceptivos e inflamatórios associados à cistite hemorrágica. A diminuição da expressão dos receptores P2X7, provavelmente pela inibição da migração dos neutrófilos ao local da inflamação foi observada, evidenciando propriedades anti-inflamatórias promissoras para esta fração podendo, no futuro, se tornar um agente terapêutico potencial no tratamento desta patologia. Para o câncer de bexiga músculo invasivo, a cistectomia radical é considerada o tratamento padrão, porém está associada à morbidade significativa. Na tentativa de proporcionar uma melhor qualidade de vida aos pacientes, o interesse por abordagens terapêuticas que visam à preservação da bexiga urinária tem aumentado. Neste sentido, a radioterapia tem recebido destaque por ser uma modalidade de tratamento já utilizada. Desta forma, investigamos os efeitos da radioterapia sobre a sinalização purinérgica em linhagem celular de câncer de bexiga humano T24. Dentre os receptores expressos pelas células T24, o receptor P2X6 apresentou aumento expressivo após a radioterapia. A partir da análise de pacientes com câncer de bexiga (Kaplan-Meier), evidenciamos a relação existente entre a alta expressão deste receptor e o aumento da taxa de sobrevivência. Na sequência, o provável envolvimento da família das ectonucleotidases nos efeitos da radioterapia na linhagem celular T24 também foi avaliado. Observamos que a sinalização purinérgica, principalmente via hidrólise do ATP à adenosina pela ação combinada de ectoenzimas demonstrou papel importante no tratamento radioterápico in vitro. A indução transitória da expressão da enzima ecto- 5’NT/CD73 pela radioterapia também foi observada, sendo a adenosina gerada a responsável por contribuir na morte celular. O papel crucial da ecto-5’NT/CD73 na radiossensibilização das células foi confirmado pela inibição farmacológica e pelo uso do nocaute da enzima. Em conjunto, os resultados in vitro demonstraram que a vantagem da radioterapia parece ser alcançada naqueles pacientes que expressam o receptor P2X6 e a enzima ecto-5’NT/CD73 na área tumoral, podendo no futuro, ambos serem considerados possíveis marcadores para prever a eficácia da resposta à radioterapia para o tratamento do câncer de bexiga. Por fim, a realização do ensaio radiométrico frente à ecto-5’NT/CD73 evidenciou o potente efeito inibitório do ácido ursólico sobre esta enzima, cujo potencial também foi confirmado frente à linhagem celular T24. / The urinary bladder is constantly exposed to potentially harmful substances in the urine, whose chronic exposure can lead to various diseases. Among these pathologies the hemorrhagic cystitis is a severe inflammatory condition of the bladder associated with the use of chemotherapeutic drugs, such as cyclophosphamide. It has been reported that long-term exposure to cyclophosphamide increases the risk of developing bladder cancer, which is characterized as being the second most common cancer of the urinary tract and the seventh most common cancer among men in the world. Alterations in the purinergic signaling have been shown in diseases associated with urinary bladder. In fact, the purinergic signaling has emerged as a potential target to be studied. Therefore, this thesis sought to evaluate the involvement of purinergic signaling in an in vivo model of hemorrhagic cystitis and in an in vitro model of bladder cancer. In order to identify preventive strategies and effective treatments to reduce morbidity and mortality associated with hemorrhagic cystitis, the Uncaria tomentosa species was investigated due to its wide use in cases of chronic inflammation and urinary tract diseases. From studies conducted in vivo, we demonstrated that systemic treatment with the quinovic acid glycosides purified fraction from U. tomentosa was able to prevent nociceptive and inflammatory events associated with hemorrhagic cystitis. The decreased expression of the P2X7 receptor was observed, most likely by the reduction of neutrophils migration to the site of inflammation. Therefore, this investigation has shown promising antiinflammatory properties for this fraction, which may in the future become a potential therapeutic agent for the treatment of this pathology. For bladder muscle invasive cancer, although radical cystectomy has been considered the standard treatment is still associated with significant morbidity. In an attempt to provide a better quality of life for patients, interest in therapeutic approaches aimed the preservation of the urinary bladder have increased. In this regard, the radiotherapy has been highlighted by being a treatment modality already used. Thus, we investigated the effects of radiation on the purinergic signaling in T24 human bladder cancer cell line. Among the receptors expressed by T24 cells, the P2X6 receptor showed significant increase after radiotherapy. From the analysis of patients with bladder cancer (Kaplan-Meier), we noticed the relationship between high expression of this receptor and increased survival rate. Following, the involvement of ectonucleotidases after irradiation exposure in T24 cell line was also evaluated. The purinergic signaling, mainly through hydrolysis of ATP to adenosine by the combined action of ectoenzymes, demonstrated important role in radiotherapy in vitro. The transient induction of ecto-5’NT/CD73 expression by radiotherapy was also observed, being the adenosine generated a possible responsible in T24 cell death. The crucial role of ecto-5’NT/CD73 in the radiosensitization of the cells was confirmed by pharmacological inhibition and the use of the enzyme knockout. Taken together, the in vitro results demonstrate that the benefit of radiation therapy appears to be achieved in those patients that express the P2X6 receptor and the enzyme ecto-5’NT/CD73 in the tumor area, and in the future both may be considered potential markers for predicting the effectiveness response to radiotherapy for the treatment of bladder cancer. Finally, the radiometric ecto-5’NT/CD73 assay showed the potent inhibitory effect of ursolic acid on this enzyme, whose potential was also confirmed through the T24 cell line.

Resumo não disponível

A bexiga urinária é exposta constantemente a substâncias potencialmente prejudiciais presentes na urina, cuja exposição crônica pode levar a diversas patologias. Dentre estas patologias está a cistite hemorrágica que é uma condição inflamatória grave da bexiga associada ao uso de fármacos quimioterápicos, como a ciclofosfamida. É descrito que a exposição em longo prazo à ciclofosfamida aumenta o risco de desenvolvimento do câncer de bexiga, o qual é caracterizado como sendo a segunda neoplasia mais comum do trato urinário e o sétimo câncer mais prevalente entre homens no mundo. Alterações na sinalização purinérgica têm sido evidenciadas em diferentes patologias associadas à bexiga urinária. De fato, o sistema purinérgico tem emergido como um potencial alvo a ser estudado. Portanto, nesta tese buscou-se avaliar o envolvimento da sinalização purinérgica em um modelo in vivo de cistite hemorrágica e em um modelo in vitro de câncer de bexiga. No intuito de identificar estratégias preventivas e tratamentos eficazes para reduzir a morbidade e a mortalidade associadas à cistite hemorrágica, a espécie Uncaria tomentosa foi investigada, devido a sua ampla utilização em casos de inflamação crônica e doenças do trato urinário. A partir dos estudos conduzidos in vivo, demonstramos que o tratamento sistêmico com a fração purificada de glicosídeos do ácido quinóvico de U. tomentosa foi capaz de prevenir os eventos nociceptivos e inflamatórios associados à cistite hemorrágica. A diminuição da expressão dos receptores P2X7, provavelmente pela inibição da migração dos neutrófilos ao local da inflamação foi observada, evidenciando propriedades anti-inflamatórias promissoras para esta fração podendo, no futuro, se tornar um agente terapêutico potencial no tratamento desta patologia. Para o câncer de bexiga músculo invasivo, a cistectomia radical é considerada o tratamento padrão, porém está associada à morbidade significativa. Na tentativa de proporcionar uma melhor qualidade de vida aos pacientes, o interesse por abordagens terapêuticas que visam à preservação da bexiga urinária tem aumentado. Neste sentido, a radioterapia tem recebido destaque por ser uma modalidade de tratamento já utilizada. Desta forma, investigamos os efeitos da radioterapia sobre a sinalização purinérgica em linhagem celular de câncer de bexiga humano T24. Dentre os receptores expressos pelas células T24, o receptor P2X6 apresentou aumento expressivo após a radioterapia. A partir da análise de pacientes com câncer de bexiga (Kaplan-Meier), evidenciamos a relação existente entre a alta expressão deste receptor e o aumento da taxa de sobrevivência. Na sequência, o provável envolvimento da família das ectonucleotidases nos efeitos da radioterapia na linhagem celular T24 também foi avaliado. Observamos que a sinalização purinérgica, principalmente via hidrólise do ATP à adenosina pela ação combinada de ectoenzimas demonstrou papel importante no tratamento radioterápico in vitro. A indução transitória da expressão da enzima ecto- 5’NT/CD73 pela radioterapia também foi observada, sendo a adenosina gerada a responsável por contribuir na morte celular. O papel crucial da ecto-5’NT/CD73 na radiossensibilização das células foi confirmado pela inibição farmacológica e pelo uso do nocaute da enzima. Em conjunto, os resultados in vitro demonstraram que a vantagem da radioterapia parece ser alcançada naqueles pacientes que expressam o receptor P2X6 e a enzima ecto-5’NT/CD73 na área tumoral, podendo no futuro, ambos serem considerados possíveis marcadores para prever a eficácia da resposta à radioterapia para o tratamento do câncer de bexiga. Por fim, a realização do ensaio radiométrico frente à ecto-5’NT/CD73 evidenciou o potente efeito inibitório do ácido ursólico sobre esta enzima, cujo potencial também foi confirmado frente à linhagem celular T24. / The urinary bladder is constantly exposed to potentially harmful substances in the urine, whose chronic exposure can lead to various diseases. Among these pathologies the hemorrhagic cystitis is a severe inflammatory condition of the bladder associated with the use of chemotherapeutic drugs, such as cyclophosphamide. It has been reported that long-term exposure to cyclophosphamide increases the risk of developing bladder cancer, which is characterized as being the second most common cancer of the urinary tract and the seventh most common cancer among men in the world. Alterations in the purinergic signaling have been shown in diseases associated with urinary bladder. In fact, the purinergic signaling has emerged as a potential target to be studied. Therefore, this thesis sought to evaluate the involvement of purinergic signaling in an in vivo model of hemorrhagic cystitis and in an in vitro model of bladder cancer. In order to identify preventive strategies and effective treatments to reduce morbidity and mortality associated with hemorrhagic cystitis, the Uncaria tomentosa species was investigated due to its wide use in cases of chronic inflammation and urinary tract diseases. From studies conducted in vivo, we demonstrated that systemic treatment with the quinovic acid glycosides purified fraction from U. tomentosa was able to prevent nociceptive and inflammatory events associated with hemorrhagic cystitis. The decreased expression of the P2X7 receptor was observed, most likely by the reduction of neutrophils migration to the site of inflammation. Therefore, this investigation has shown promising antiinflammatory properties for this fraction, which may in the future become a potential therapeutic agent for the treatment of this pathology. For bladder muscle invasive cancer, although radical cystectomy has been considered the standard treatment is still associated with significant morbidity. In an attempt to provide a better quality of life for patients, interest in therapeutic approaches aimed the preservation of the urinary bladder have increased. In this regard, the radiotherapy has been highlighted by being a treatment modality already used. Thus, we investigated the effects of radiation on the purinergic signaling in T24 human bladder cancer cell line. Among the receptors expressed by T24 cells, the P2X6 receptor showed significant increase after radiotherapy. From the analysis of patients with bladder cancer (Kaplan-Meier), we noticed the relationship between high expression of this receptor and increased survival rate. Following, the involvement of ectonucleotidases after irradiation exposure in T24 cell line was also evaluated. The purinergic signaling, mainly through hydrolysis of ATP to adenosine by the combined action of ectoenzymes, demonstrated important role in radiotherapy in vitro. The transient induction of ecto-5’NT/CD73 expression by radiotherapy was also observed, being the adenosine generated a possible responsible in T24 cell death. The crucial role of ecto-5’NT/CD73 in the radiosensitization of the cells was confirmed by pharmacological inhibition and the use of the enzyme knockout. Taken together, the in vitro results demonstrate that the benefit of radiation therapy appears to be achieved in those patients that express the P2X6 receptor and the enzyme ecto-5’NT/CD73 in the tumor area, and in the future both may be considered potential markers for predicting the effectiveness response to radiotherapy for the treatment of bladder cancer. Finally, the radiometric ecto-5’NT/CD73 assay showed the potent inhibitory effect of ursolic acid on this enzyme, whose potential was also confirmed through the T24 cell line.