Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-06-17T13:10:52Z No. of bitstreams: 1 Carlos Diogenes Ferreira de Lima Filho.pdf: 3825289 bytes, checksum: b1e7dacbbb9bec4d775fb8e1f9124f70 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-17T13:10:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carlos Diogenes Ferreira de Lima Filho.pdf: 3825289 bytes, checksum: b1e7dacbbb9bec4d775fb8e1f9124f70 (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Neospora caninum is an important etiologic agent of worldwide distribution, which causes abortions in dairy and beef cattle, and consequently significant economic losses to the avian production. The cattle in Brazil is by far the economic activity that occupies the largest area of land, including the Fernando de Noronha Archipelago, where agriculture is a permitted activity, particularly for subsistence, where it is exercised in order rustic and low productivity. This work aims to determine the prevalence and risk factors associated with infection by Neospora caninum in cattle in Fernando de Noronha, Pernambuco, Brazil. They collected 122 samples of bovine serum, and 16 dogs serum samples from 10 properties in the perimeter of the same areas in a radius of 2 km from the handling corral the center, were also collected 22 samples of dogs. The collections occurred in beef cattle or milk, male or female, of different age groups, with clinical history of infection or not neosporosis. The diagnosis of infection was performed by anti N. caninum IgG antibody research by Immunofluorescence Reaction (IFA) was used as cut-off point 1: 200 and 1:50 for cattle and dogs respectively. Of the 122 cattle tested, 84 (68.85%) had anti Neospora caninum antibodies and 09 dogs total of 38 (23.68%) also showed reagents. It was noted in this study that Neospora caninum infection is widespread in all Archipelago properties, the introduction of control and prophylaxis measures being necessary, thus preventing the perpetuation of the agent in herds. The results of the univariate analysis of risk factors associated with infection by Neospora caninum showed no significant odds ratio, however the variables supplementary feeding, technology equipment for the animals, the presence of barn and milking showed a trend in the association between seropositivity of animals in this study . Logistic regression analysis of risk factors associated with infection by N. caninum showed a significant odds ratio of difference for the variables mixed farm (odds ratio p = 13.79) and not raise poultry (odds ratio p = 5,45), demonstrating the influence of these factors on the agent maintaining the studied herds. / Neospora caninum é um importante agente etiológico de distribuição mundial, que ocasiona abortos em bovinos de leite e de corte, e consequentemente grandes prejuízos econômicos a cadeia produtiva destes animais. A criação de bovinos no Brasil é de longe, a atividade econômica que ocupa a maior extensão de terras, incluindo o Arquipélago de Fernando de Noronha, no qual a agropecuária é uma atividade permitida, particularmente para subsistência, onde a mesma é exercida de forma rústica e com baixa produtividade. Este trabalho, tem por objetivo, determinar a prevalência e os fatores de risco associados à infecção por Neospora caninum em bovinos no Arquipélago de Fernando de Noronha, Pernambuco, Brasil. Foram coletadas 122 amostras de soro bovino, e 16 amostras de soro de cães oriundas de 10 propriedades, nas regiões perimetrais das mesmas, em um raio de 2 km do centro do curral de manejo, ainda foram coletadas 22 amostras de cães. As coletas ocorreram em bovinos de corte ou leite, machos ou fêmeas, com diferentes faixas etárias, com histórico clinico ou não de infecção da neosporose. O diagnóstico da infecção foi realizado através da pesquisa de anticorpos IgG anti N. caninum pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), utilizado-se como ponte de corte 1:200 e 1:50 para bovinos e cães respectivamente. Dos 122 bovinos testados, 84 (68,85%) apresentaram anticorpos anti Neospora caninum e 09 cães do total de 38 (23,68%) também se mostraram reagentes. Constatou-se neste estudo que a infecção por Neospora caninum encontra-se disseminada em todas as propriedades do Arquipélago, sendo necessária a introdução de medidas de controle e profilaxia, evitando assim a perpetuação do agente nos rebanhos. Os resultados da análise univariada dos fatores de risco associadas à infecção por Neospora caninum não apresentaram odds ratio significativas, contudo as variáveis suplementação alimentar, tecnologia em equipamentos para os animais, presença de curral e ordenha apresentaram uma tendência na associação da soropositividade dos animais desse estudo. A regressão logística dos fatores de risco associados a infecção por N. caninum revelou diferença de odds ratio significativa para as variáveis exploração mista (odds ratio p = 13,79) e não criar aves (odds ratio p = 5,45), demonstrando a influencia desses fatores na manutenção do agente nos rebanhos estudados.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-11-08T13:27:56Z No. of bitstreams: 1 Whaubtyfran Cabral Teixeira.pdf: 1497962 bytes, checksum: 6d81f488f57b0167c942138cbd006fcd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-08T13:27:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Whaubtyfran Cabral Teixeira.pdf: 1497962 bytes, checksum: 6d81f488f57b0167c942138cbd006fcd (MD5) Previous issue date: 2008-02-08 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The protozoan Neospora caninum and Toxoplasma gondii cause neurological and reproductive disorders in cattle, and neuromuscular changes in dogs. The bovine creation in the state Maranhão - Brazil represents a sector of the economy of high importance, however, the losses caused by parasitic diseases represent a serious problem for the development of livestock. The objective in the present study was to determine the prevalence of anti-N. caninum and anti-T. gondii antibodies in sera from dairy cattle and dogs of rural properties of three microrregions in the state of Maranhão. There were visited properties of dairy cattle, where collected blood samples from cattle (812) and dogs (93), of both sexes and different ages. Serum samples were packed in eppendorfs and stored at -20°C until the realization of the Indirect Immunofluorescence test (IFI). It was used the cut-off of 1:200 and 1:50 to anti-N. caninun and 1:64 and 1:16 for anti-T. gondii in cattle and dogs, respectively. It was used as antigen, tachyzoites of the strains NC-Bahia, NC-1 and Rh-Toxoplasma, produced in theLaboratory Diagnosis of Parasitism of Animals, School of Veterinary Medicine of the Federal University of the state of Bahia - Brazil. Of the total samples of cattle examined, it was found that 50.74% (412/812) and 70.20% (570/812) were seropositive for N. caninum and T. gondii, respectively. The titles of antibodies to N. caninum in cattle ranged from 1:200 to 1:6400, while 108 (26.21%) of serum samples showed title of 1:200; 132 (32.04%) 1:400; 94 (22.81%) 1:800; 46 (11.16%) 1:1600; 23 (5.58%) 1:3200 and nine (2.18%) with titers of 1:6400. While, for T. gondii ranged from 1:64 to 1:1024, while 272 (47.72%) samples showed title of 1:64; 182 (31.93%) 1:128; 90 (15.79%) 1:256; 25 (4.39%) 1:512 and one (0.17%) with title of 1:1024. In samples of dogs, it was found that 62.37% (58/93) and 79.57% (74/93) were seropositive for N. caninum and T. gondii, respectively. The titles of antibodies to N. caninum ranged from 1:50 to 1:1600, with four (6.90%) samples with title of 1:50; nine (15.52%) 1:100; eight (13.79%) 1:200; 18 (31.03%) 1:400; 14 (24.14%) of 1:800 and five (8.62%) with title of 1:1600. For T. gondii the titles ranged from 1:32 to 1:2048; six (8.11%)samples with title of 1:32; nine (12.16%) 1:64; 14 (18.92%) 1:128; 22 (29.73%) 1:256; 13 (17.57%) 1:512; nine (12.16%) with 1:1024 and a (1.35%) 1:2048. No significant association was found (P>0.05) between the sex of the animals and seroprevalence for anti-N. caninum and anti-T. gondii in the two species studied. The high rates of seropositivity found for these parasites in cattle and dogs from all regions, suggest that there is spread of the parasites in the areas studied. / Os protozoários Neospora caninum e Toxoplasma gondii causam distúrbios reprodutivos e neurológicos em bovinos, além de alterações neuromusculares em cães. A bovinocultura Maranhense representa um setor da economia de elevada importância, contudo, as perdas causadas por doenças parasitárias representam um sério problema para o desenvolvimento dos rebanhos. Objetivou-se, no presente estudo, determinar a prevalência de anticorpos anti-N. caninum e anti-T. gondii em soros de bovinos leiteiros e cães de propriedades rurais de três microrregiões no estado do Maranhão. Foram visitadas propriedades de gado de leite, onde se coletaram amostras sangüíneas de bovinos (812) e cães (93), de ambos os sexos e diferentes idades. Os soros obtidos foram acondicionados em eppendorfs e estocados a -20°C até a realização do teste de Imunofluorescência Indireta (IFI). Foram utilizados como pontos de cortes 1:200 e 1:50 para anti-N. caninun e 1:64 e 1:16 para anti-T. gondii em bovinos e cães, respectivamente. Utilizou-se como antígeno, taquizoítos das cepas NC-Bahia, NC-1 e Rh-Toxoplasma, produzidos no Laboratório de Diagnóstico das Parasitoses dos Animais daEscola de Medicina Veterinária da UFBA. Do total de amostras de bovinos analisadas, verificou-se que 50,74% (412/812) e 70,20% (570/812) foram sororreagentes para N. caninum e T. gondii, respectivamente. Os títulos de anticorpos para N. caninum em bovinos variaram de 1:200 a 1:6400, sendo que 108 (26,21%) amostras de soro apresentaram título de 1:200; 132 (32,04%) 1:400; 94 (22,81%) 1:800; 46 (11,16%) 1:1600; 23 (5,58%) 1:3200 e nove (2,18%) com títulos de 1:6400. Enquanto que, para T. gondii variaram de 1:64 a 1:1024, sendo que 272 (47,72%) amostras apresentaram título de 1:64; 182 (31,93%) 1:128; 90 (15,79%) 1:256; 25 (4,39%) 1:512; e uma (0,17 %) com título de 1:1024. Nas amostras dos cães, verificou-se que 62,37% (58/93) e 79,57% (74/93) foram sororreagentes para N. caninum e T. gondii, respectivamente. Os títulos de anticorpos para N. caninum variaram de 1:50 a 1:1600, sendo quatro (6,90%) amostras com titulo de 1:50; nove (15,52%) de 1:100; oito (13,79%) 1:200; 18 (31,03%) 1:400; 14 (24,14%) 1:800 e cinco (8,62%) com título de1:1600. Para T. gondii os títulos variaram de 1:32 a 1:2048, sendo seis (8,11%) amostras com título de 1:32; nove (12,16%) com 1:64; 14 (18,92%) 1:128; 22 (29,73%) 1:256; 13 (17,57%) 1:512; nove (12,16%) 1:1024 e uma (1,35%) de 1:2048. Não foi observada associação significativa (P>0,05) entre o sexo dos animais e a soroprevalência para anticorpos anti-N. caninum e anti-T. gondii nas duas espécies estudas. As altas taxas de soropositividade encontradas para os referidos parasitos em bovinos e cães de todas as regiões, sugerem que há disseminação dos parasitos nas áreas estudadas.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_nilton_cunha_filho.pdf: 562698 bytes, checksum: 8ecca8a95ee4af63a3925be6db47b247 (MD5) Previous issue date: 2007-06-29 / Neospora caninum is a protozoan parasite that causes neurological problems in dogs. It has been shown that it may act as definitive hosts of the parasite. There is a need for more information on the occurrences of N. caninum in due to the wide range of its incidence in several Brazilian states, and the lack of animals diagnosed serum positive in Rio Grande do Sul. Rural dogs from (meat and dairy producers) and urban areas from the city of Pelotas were examined. Serum samples of 339 dogs were tested for the detection of antibodies against N. caninum by indirect immunofluorescence (RIFI ≥1:50). Antibodies for N. caninum were found in 53 (15,6%) of the dogs serum samples. The occurrence in the urban area was 5,5%, among the rural dogs 14,1% (18 dogs) belonged to dairy and 28,4% (29 dogs) from cattle farms. Dogs over three years old present the higher levels of serum positively and its presence increased with age. The dogs antibody titers were 1:50 (12 dogs), 1:100 (07 dogs), 1:200 (08 dogs), 1:400 (19 dogs), 1:800 (05 dogs) and 1:1600 (02 dogs). None of the dogs examined presented clinical signs of neosporosis when the blood was collected. The study of the variables (risk factors for N. caninum) in the logistic regression between the rural and urban environment has shown that older animals are 3,75 times more likely to get infected by the N. caninum then the younger ones. Also in farms where the carcasses of dead animals are not removed there is a risk 2,67 times greater (IC 95% = 1,31 5,42) of a N. caninum infection. In the rural environment, dogs from cattle raising farms have a chance 2,24 times greater of being infected by N. caninum then dogs from dairy farms. In addition, the risk of having serum positive dogs in farms where the carcasses are not removed was more significant (OR = 6,11 IC 95% = 1,00 37,17). The data suggest that Neospora caninum is present in the southern region of Rio Grande do Sul and afflicts both rural and urban dogs. The probability of serum positive dogs in the rural area is grater, possibly by the easy access they have to infected material and the canine/bovine contact, which is characteristic of the cattle raising in the region. The main form of infection by N. caninum among the dogs studied is the horizontal (post natal), suggested by the fact that serum prevalence increase with the age. / Neospora caninum é um protozoário parasito que causa problemas neurológicos em cães. Foi demonstrado que os cães podem atuar como hospedeiros definitivos do parasito. Devido às diferenças entre as ocorrências e prevalências de N. caninum nos diversos estados brasileiros, e a falta de diagnóstico de animais soropositivos no Rio Grande do Sul, revelam a necessidade de maiores informações a respeito de ocorrências do N. caninum em cães no sul do Rio Grande do Sul. Cães provenientes do Município de Pelotas, de diferentes ambientes, rural (corte e leite) e urbanos domiciliados foram examinados. Amostras de soro de 339 cães foram testadas para a detecção de anticorpos para N. caninum mediante a reação de imunofluorescência indireta (RIFI ≥1: 50). Anticorpos para N. caninum foram encontrados em 53 (15,6%) amostras de soro dos cães. Na área urbana a ocorrência foi de 5,5%, entre os cães rurais, 14,1% (18 cães) eram de propriedades de criação de gado de leite e 28,4% (29 cães) de propriedade de corte. Foi observado que cães acima de três anos de idade são mais soropositivos para N. caninum e a soropositividade dos cães aumentou conforme aumentou a idade. Os títulos de anticorpos dos cães foram 1:50 (12 cães), 1:100 (07 cães), 1:200 (08 cães), 1:400 (19 cães), 1:800 (05 cães) e 1:1600 (02 cães). Nenhum dos cães examinados apresentou sinais clínicos de neosporose no momento da coleta de sangue. O estudo das variáveis (fatores de risco para N. caninum) na regressão logística feita entre o ambiente urbano e rural demonstrou que nos ambientes estudados, animais mais velhos tem 3,75 vezes mais chances de se infectarem com N. caninum do que animais jovens, até três anos de idade. Em propriedades que os proprietários não recolhem carcaças de animais mortos do campo representou um risco 2,67 vezes maior (IC 95% = 1,31- 5,42) de infecção por N. caninum. Quando analisou-se em separado o ambiente rural (leite e corte) observou-se que, cães provenientes de propriedades de criação de gado de corte tem 2,24 vezes mais chance de serem infectados por N. caninum do que cães de propriedades de produção leiteira, e o risco de cães serem soropositivos em propriedades onde os proprietários não tem o hábito de recolher carcaças de animais mortos do campo foi maior (Odds Ratio = 6,11 IC 95% = 1,00- 37,17). Os dados sugerem que Neospora caninum está presente na região sul do Rio Grande do Sul, infectando cães urbanos domiciliados e rurais (leite e corte). A probabilidade de cães da área rural da região serem soropositivos para N. caninum é maior neste ambiente, provavelmente pelo fácil acesso destes animais a material infectado e ao grande contato cão/bovino, característico da bovinocultura da região. A principal forma de infecção por N. caninum entre os cães analisados é a horizontal (pós-natal), uma vez que a soroprevalência aumenta conforme aumenta a faixa etária.

Estima la frecuencia de anticuerpos contra toxoplasma gondii y Neospora caninum en vicuñas de la provincia de Yauli–Junín, así como también determinar el grado de concordancia entre las pruebas de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y ELISA indirecta. Se colectaron 79 muestras de sangre de vicuñas, obtenidas durante un “Chaku”, técnica ancestral de arreo que permite la captura de animales vivos para la esquila, realizado en el distrito de Paccha provincia de Yauli, ubicado en el departamento de Junín. Las muestras fueron trasladadas al laboratorio de Microbiología y Parasitología Sección Parasitología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la UNMSM, para su posterior análisis. El diagnóstico para ambas enfermedades se realizó utilizando las pruebas de ELISA indirecta e IFI, en cada caso. La frecuencia hallada para Toxoplasma gondii fue de 5.06 y 3.08% por las pruebas de ELISA indirecta y la de IFI respectivamente; no encontrándose reacción seropositiva para Neospora caninum con las dos pruebas usadas. Con relación al grado de asociación, entre las dos pruebas usadas en el diagnóstico de Toxoplasma gondii se encontró un valor de kappa de 0.85, lo cual significa que la concordancia ofrecida por ambas pruebas es muy buena. / Tesis

Neospora caninum é um parasita intracelular obrigatório pertencente ao filo Apicomplexa, conhecido por ser uma das principais causas de aborto parasitário em bovinos e por apresentar transmissão transplacentária. Para locomoverem-se e acessarem o conteúdo intracelular de células hospedeiras, organismos apicomplexas fazem uso de um mecanismo não convencional que se utiliza de uma maquinaria celular cujo papel central é exercido pelo motor actina-miosina, auxiliado por proteínas intermediárias e de acoragem, que realiza a propulsão do parasita na direção do movimento. Para o funcionamento dessa maquinaria, é essencial que actina esteja em sua forma filamentosa (actina-F). Porém, actinas de apicomplexas são conhecidas por serem funcional e estruturalmente não convencionais, formando filamentos pequenos e instáveis in vitro, assim como pelo predomínio de grande maioria de actina monomérica (actin-G) nas células in vivo. Desse modo, para formar e manter actina-F a dinâmica de actina desses organismos requer uma regulação precisa, que, em apicomplexas, é conduzida por um arsenal conhecidamente pequeno de proteínas que se ligam a actina (ABPs). Nosso objetivo neste estudo foi identificar e caracterizar ABPs de N. caninum. Para isso, duas ABPs de N. caninum foram estudadas: fator de despolimerização de actina (NcADF) e proteína associada a ciclase (NcCAP); também, foi gerado e caracterizado soro contra região de actina de N. caninum entre aminoácidos 201 e 310 (anti-NcAct201-310). NcADF (correspondente ao acesso NCLIV_012510 em ToxoDB) foi submetida a caracterização molecular e bioquímica. A sua estrutura terciária foi gerada por modelagem molecular baseada em homologia, apresentando folding conservado, porém com F-loop de menor tamanho, quando comparada a ADF/cofilinas canônicas. A forma recombinante de NcADF foi expressa E. coli BL21 por plasmídeos pET32a(+) e pET28a(+) e solubilizada em tampão desnaturante e nativo, respectivamente. NcADF_pET32 foi purificada e utilizada para geração de soro anti-NcADF, que detectou ambas NcADF recombinantes, assim como proteínas endógenas em western blot 1-D e 2-D com peso molecular e pI próximos aos preditos. O soro anti-NcADF também localizou NcADF difusa no citoplasma, com menos intensidade nos polos de taquizoítas de N. caninum extracelulares. NcADF_pET28 foi purificado na forma nativa e utilizado para caracterização funcional para avaliação de seu papel na dinâmica de actina liofilizada de coelho. Ensaios de cossedimentação, cinética de polimerização e despolimerização, viscosimentria de baixo cisalhamento (queda de bola), estado estacionário e ligação entre actina-G e NcADF, em conjunto, mostraram que NcADF causa despolimerização de actina-F, realiza sequestro de monômeros de actina e quebra de filamentos. NcCAP foi submetida a caracterização molecular e foi identificada como produto de expressão do gene de acesso NCLIV_054140. NcCAP recombinante foi expressa em pET32a(+) e pET28a(+) predominantemente em corpos de inclusão e foi solubilizada em tampão desnaturante. A forma purificada de pET32_NcCAP, identificada por espectrometria de massas, foi utilizada para imunização e o soro resultante detectou NcCAP recombinante e endógena por western blot 1-D e 2-D, apresentando bandas e spots de peso molecular e pI próximos ao esperado. O soro anti-NcCAP também localizou NcCAP em taquizoítas ii extracelulares de N. caninum difusa no citoplasma e/ou com predomínio na região periplasmática da célula. Por fim, o soro anti-NcAct201-310 foi gerado, sendo capaz de detectar proteínas em sua forma nativa e realizar marcação na região periférica e, possivelmente, nuclear de taquizoítas de N. caninum extracelulares. A caracterização de ABPs de N. caninum feita neste trabalho amplia o conhecimento sobre a conservação dessas proteínas ao longo do filo Apicomplexa. Ademais, representa uma contribuição para o entendimento da dinâmica de actina e, por consequência, futuramente, pode colaborar para a elucidação de mecanismos-chave para a sobrevivência e disseminação dos parasitas pelo seu hospedeiro / Neospora caninum is an obligate intracellular parasite that belongs to the phylum Apicomplexa. It is known as one of the main causes of infectious abortion in cows and for its efficient transplacentary transmission. Apicomplexan organisms use a phylum-specific mechanism of invasion and gliding motility, which use an unusual cellular machinery based on an actin myosin motor assisted by intermediary and anchoring proteins that creates the traction force to impulse the parasite forward. Filamentous actin (F-actin) is essential to the appropriate functioning of this machinery, although apicomplexan unconventional actin forms small and unstable filaments in vitro and is found preponderantly as monomer (G-actin) in cells. Thus, the parasites need actin-binding proteins (ABPs) to strictly regulate actin dynamics and to form and maintain F-actin when it is necessary to the cell. Here, we aimed at identifying and characterising ABPs from N. caninum. Two ABPs were characterised: actin-depolymerising factor (NcADF) and cyclase-associated protein (NcCAP) from N. caninum. In addition, a serum against the actin region between amino acids 201 and 310 (anti-NcAct201-310) was raised. NcADF, which corresponds to identification NCLIV_012510 on ToxoDB, was molecular and biochemically characterised. Firstly, the tertiary structure of NcADF was generated by molecular modelling based on homology. Comparing to canonical ADF/cofilins, NcADF presented a conserved folding, albeit its smaller F-loop. The recombinant form of NcADF was expressed in E. coli BL21 using pET32a(+) and pET28a(+) plasmids and solubilized in denaturing and native buffers, respectively. Polyclonal antibodies were raised in mice against purified NcADF_pET32, which was able to detect both forms of recombinant NcADF as well as proteins in 1-D and 2-D western blot with expected molecular weight and isoelectric point (pI). Additionally, NcADF was localised in extracellular N. caninum tachyzoites as a diffuse pattern on cytoplasm with less intensity in both poles. NcADF_pET28 was successfully purified in native form and used for functional characterisation to evaluate the role of recombinant NcADF on lyophilised rabbit actin dynamics. Together, co-sedimentation, polymerisation and depolymerisation kinetic, low shearing viscometry (falling ball), steady state, and G-actin and NcADF binding assays showed that NcADF was able to depolymerise actin-F, sequester actin monomers, and sever filaments. Moreover, NcCAP (identification NCLIV_054140) was also characterised. Recombinant NcCAP was expressed in pET32a(+) and pET28a(+) plasmids predominantly in inclusion bodies and was solubilised in denaturing buffer. NcCAP_pET32 was purified and identified by mass spectrometry. Then, the polyclonal antibodies against this recombinant protein was generated in mice. It was able to detect recombinant and endogenous NcCAP, presenting bands and spots in 1-D and 2-D western blot with molecular weight and pI quite near to the predicted ones. NcCAP was localised as a diffuse pattern on cytoplasm and/or predominantly on periplasmic regions of extracellular taclyzoites of N. caninum. Finally, the serum containing anti-NcAct201-310 polyclonal antibodies was raised in mice. It detected endogenous proteins mainly in native form and localised them on periplasmic and possibly nuclear region in extracellular N. caninum tachyzoites. The characterisation of N. caninum ABPs iv extends our understanding of these proteins conservation and their function throughout the Apicomplexa phylum. Furthrmore, it represents a contribution to the field towards the comprehention of actin dynamics and in the future might provide information for important mechanisms of dissemination and survival of the parasite at its host

Neospora caninum (filo Apicomplexa) é um parasita obrigatório intracelular como todos os membros deste filo, alguns reconhecidos por causarem doenças com impacto relevante na saúde humana (Plasmodium e Toxoplasma) e veterinária (Babesia, Eimeria e Cryptosporidium). Causador da neosporose, N. caninum vem emergindo como um dos maiores causadores de abortos infecciosos em bovinos, levando a consideráveis perdas econômicas na bovinocultura mundial. Devido à sua recente descoberta, o conhecimento sobre diversos processos bioquímicos de N.caninum ainda é limitado, demandando novas pesquisas para a compreensão de seus mecanismos de sobrevivência e consequente identificação de alvos para intervenção terapêutica. O processo de invasão celular é bastante investigado em pesquisas envolvendo apicomplexas, uma vez que a sobrevivência desses parasitas depende do sucesso de sua entrada na célula hospedeira. Proteínas secretadas de organelas filo-específicas (micronemas, roptrias e grânulos densos) estão intimamente envolvidas com a invasão celular. Elas são responsáveis pela interação inicial com a célula hospedeira, participam da junção de movimento formada no momento da invasão, e contribuem para a estabilização do vacúolo parasitóforo. Neste trabalho as proteínas secretadas por taquizoítas de N. caninum foram investigadas de duas formas: (1) por caracterização molecular de proteínas com domínio Apple; e (2) por estudo do secretoma do parasita. Os domínios proteicos do tipo Apple são caracterizados pela capacidade de interação proteína-proteína e proteína-carboidrato, e estão presentes em algumas proteínas micronêmicas com propriedades adesivas. Neste trabalho três proteínas de N. caninum contendo domínios Apple foram caracterizadas: MIC17A, MIC17B e MIC17C. A análise das sequências proteicas e das estruturas dos domínios Apple, obtidas por modelagem molecular, mostraram alta identidade sequencial e estrutural entre MIC17A e MIC17C. Apesar de ser paráloga às outras duas, MIC17B apresenta diferenças importantes em sua sequência e estrutura. Para MIC17B e MIC17C foram realizados experimentos de detecção das proteínas nativas nos extratos total e secretado do taquizoíta que sugerem diferentes formas de processamento entre essas proteínas no parasita. Para MIC17B foi confirmada a localização em micronemas, num padrão diferente do observado para MIC17C. Os ensaios de invasão combinados aos de localização indicam que estas proteínas estejam relacionadas ao processo de invasão celular, porém, suas funções permanecem desconhecidas. O secretoma é o conjunto de proteínas secretadas pelo parasita e, para explorar a composição deste extrato (ESA) no taquizoíta de N. caninum, duas abordagens complementares foram utilizadas. Na primeira abordagem foram identificadas as proteínas presentes no ESA por espectrometria de massas. Na segunda abordagem realizou-se uma ii quantificação relativa das proteínas, marcadas por dois isótopos, nos extratos totais de taquizoítas submetidos ou não ao estímulo secretório. O resultado esperado seria com as proteínas secretadas diminuídas no parasita estimulado. Em ambas as abordagens foram utilizadas técnicas de espectrometria de massas de alta resolução (nanoLC-MS/MS), o que resultou num alto número de identificações; 615 proteínas no ESA e 2011 proteínas quantificadas. A comparação das duas abordagens permitiu o reconhecimento de proteínas com maior probabilidade de secreção. Uma rede de interação entre as proteínas diferencialmente expressas foi predita, gerando resultados que, associados às informações sobre as proteínas aumentadas, permitiram uma investigação sobre proteínas potencialmente envolvidas com a regulação do metabolismo relacionado à secreção. Os resultados obtidos por ambos os estudos aqui demonstrados somam conhecimento acerca do parasita N. caninum e demonstram ser úteis para guiar a busca e seleção de alvos a serem investigados para o desenvolvimento de terapêutica contra a neosporose. / Neospora caninum (Apicomplexa phylum) is an obligatory intracellular parasite like all members from this phylum, some causing diseases with relevant impact on human (Plasmodium and Toxoplasma) and veterinary (Babesia, Eimeria and Cryptosporidium) health. Causative agent of neosporosis, N. caninum has emerged as one of the leading causes of infectious abortion in cattle, generating huge economical losses in worldwide livestock. Due to its recent discovery, knowledge of N. caninum biochemical processes remains scarce, demanding new research for comprehending its survival mechanisms and, consequently, identifying new targets for therapeutic intervention. The invasion process has often been investigated in apicomplexans since their survival depends on the success of their entry into the host cell. Proteins secreted from phylum-specific organelles (micronemes, rhoptries and dense granules) are deeply involved with invasion. They are responsible for the initial interaction with the host cell; participate of the moving junction formed in the moment of invasion; and contribute for the stabilization of the parasitophorus vacuole. In this study, the proteins secreted by N. caninum tachyzoites were investigated in two ways: (1) the molecular characterization of Apple domaincontaining proteins; and (2) exploring the parasite secretome. The Apple protein domains are characterized by the ability to interact as protein-protein and proteincarbohydrate, and are present in some microneme proteins with adhesive properties. Here three N. caninum proteins containing Apple domains were characterized: MIC17A, MIC17B and MIC17C. Analyses of the Apple domains sequences and structures, obtained by molecular modeling, revealed high sequential and structural identities between MIC17A and MIC17C. Although being a paralog of the other two proteins, MIC17B presents significant differences in its sequence and structure. Experiments were performed for native MIC17B and MIC17C detection in the total and secreted tachyzoite extracts, suggesting different processing forms for these proteins in the parasite. For MIC17B, the microneme localization was confirmed, differently from the pattern observed for MIC17C. Invasion and localization assays indicated that these proteins are related to the cell invasion process; nevertheless, their functions remain unknown. The secretome is the set of proteins secreted by the parasite and, to explore this extract (ESA) composition in N. caninum, two complementary approaches were used. Firstly proteins present in ESA were identified by mass spectrometry. In the second approach, a relative quantification was performed on the proteomes of ethanol stimulated/non stimulated tachyzoites, expecting that the secreted proteins would be down regulated at the stimulated parasite. Both approaches were performed with high resolution mass spectrometry techniques (nanoLC-MS/MS), reaching a high number of identifications: 615 proteins iv in ESA and 2011 quantified proteins. The comparison between both approaches allowed the recognition of the most likely secreted proteins. An interaction network was predicted, involving the differentially expressed proteins. These results, associated with the information of up regulated proteins, allowed the investigation of proteins potentially involved with the secretion metabolism regulation. The findings from our two studies add up knowledge about N. caninum and demonstrate to be useful in guiding the search and selection for new targets for therapeutic development against neosporosis.

O protozoário Neospora caninum é considerado um dos principais causadores de abortos infecciosos na pecuária de corte e de leite no mundo. No Brasil, a presença do parasita varia de acordo com a região do país e com o tipo de rebanho, com perdas maiores na agroindústria do leite que ultrapassam US$ 50 milhões ao ano. A neosporose possui como principal manifestação clínica as perdas fetais ou abortamentos em bovinos, além de comprometimento neuronal esporádico em cães. Apesar da sua importância, a neosporose não possui atualmente tratamento eficaz e as opções de controle envolvem basicamente medidas de prevenção. As vacinas ainda são uma alternativa de desenvolvimento exploradas, sobretudo aquelas que utilizam antígenos recombinantes. Uma dificuldade ao se produzir proteínas recombinantes em sistemas de expressão heterólogos é a formação de corpúsculos de inclusão que são agregados de proteínas insolúveis. Estes agregados devem ser submetidos a processos dispendiosos para tornarem-se ativos, resultando num baixo rendimento da proteína final. Diversos recursos são utilizados para obtenção de proteínas solúveis, desde o emprego de diferentes técnicas de purificação, solubilização até o uso de tags de afinidade. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu e patenteou o vetor pET28/NcMIC2-like1/1081 que possui uma tag rica em ácido glutâmico acoplada, conhecida como Nc1081. Esta tag foi capaz de estimular a solubilidade da proteína micronêmica tipo 2 de N. caninum (NcMIC2-like1) fazendo com que a proteína recombinante (rNcMIC2-like1/1081) fosse expressa na forma solúvel. O presente trabalho procurou dar continuidade ao estudo com a rNcMIC2-like1/1080 e com a tag através da clonagem e expressão de uma outra proteína relacionada à invasão do parasita conhecida como proteína associada à adenil ciclase (NcCAP). A sequência codificadora da proteína foi clonada no vetor contendo a tag Nc1081, a proteína recombinante (rNcCAP/1081) foi expressa com um peso de 38 kDa na forma solúvel em tampão não desnaturante Tris-Cl. No teste de ELISA, as proteínas rNcMIC2-like1 e a rNcCAP acopladas ou não a tag foram detectadas com intensidade semelhante pelos respectivos soros policlonais anti-rNcMIC2-like1 e anti-rNcCAP, demonstrando que a presença da tag não influenciou no reconhecimento das proteínas. As proteínas recombinantes solúveis rNcMIC2-like1/1081 e rNcCAP/1081 ainda foram testadas através de ensaios in vitro de invasão e adesão. No ensaio de invasão, a forma solúvel de NcMIC2-like1 (rNcMIC2-like1/1081) na concentração de 5 ?g/mL, aumentou a invasão das células VERO pelo parasita, enquanto sua forma insolúvel (rNcMIC2-like1) diminuiu a invasão. Já no teste de adesão (binding), foi possível identificar que a rNcMIC2-like1/1081 aderiu à proteína serina treonina fosfatase 2C, ao fator de alongamento alfa 1 e a proteína hipotética identificada ii como NCLIV_029860, enquanto a rNcCAP/1081 aderiu à proteína hipotética NCLIV_041330. O presente trabalho permitiu o início de estudos das propriedades funcionais das proteínas NcMIC2-like1 e NcCAP que seriam inviáveis com suas formas recombinantes insolúveis, demonstrando a aplicabilidade do vetor com a tag 1081. / Neospora caninum parasite is considered as a major cause of infectious abortion in beef and milk cattle in the world. In Brazil, the presence of the parasite varies in dairy or beef herd and according to the region with greater losses in dairy industry that exceed $ 50 million per year. Neosporosis has as main clinical manifestation fetal losses or abortion in cattle, in addition to sporadic neuronal impairment in dogs. Despite its importance, neosporosis has currently no effective treatment and control options rely primarily on preventive measures. Vaccines still represent an alternative explored by the veterinary industry, especially those employing recombinant antigens. The difficulties regarding production of recombinant proteins in heterologous expression systems are formation of inclusion bodies, which are insoluble protein aggregates. These aggregates have to undergo costly procedures to become active, resulting in low yield of final protein. Many techniques are used to obtain soluble proteins ranging from different purification or solubilizing techniques to the use of affinity tags. Our research group has developed and patented a vector pET28/NcMIC2-like1/1081 that has a rich glutamic acid tag attached, known as Nc1081. This tag is capable of stimulating the solubility of the recombinant micronemic protein type 2 like 1 of N. caninum (rNcMIC2-like1), expressingsoluble rNcMIC2-like1/1081. This study aimed to continue the study with rNcMIC2-like1/1080 and the tag by cloning and expressing another protein related to parasite invasion known as cyclase-associated protein (NcCAP). The protein coding sequence was cloned into the vector containing the Nc1081 tag, recombinant protein (rNcCAP/1081) was expressed with a molecular weight of 38 kDa in soluble form in non-denaturing Tris-Cl. In the ELISA test, rNcMIC2- like1 protein and rNcCAP coupled or not with the tag were detected with similar intensities by the respective polyclonal anti-sera rNcMIC2-like1 and antirNcCAP, demonstrating that the tag did not decrease the recognition of the proteins. Soluble recombinant proteins rNcMIC2-like1/1081 and rNcCAP/1081 were also tested in vitro in invasion and binding tests. In the invasion assay, a soluble form of NcMIC2-like1 (rNcMIC2-like1/1081) at a concentration of 5 ?g/mL increased the VERO cell invasion by the parasite, while its insoluble form (rNcMIC2-like1) decreased invasion. In the binding test, the rNcMIC2-like1/1081 bound to protein serine threonine phosphatase 2C, the elongation factor 1 alpha and the hypothetical protein identified as NCLIV_029860, while rNcCAP/1081 bound to the hypothetical protein NCLIV_041330. The current work allowed the initial functional studies of the NcMIC2-like1 and NcCAP proteins, otherwise unfeasible with their insoluble recombinant forms, demonstrating the applicability of the vector with the tag 1081.

Neospora caninum (filo Apicomplexa) é um parasita obrigatório intracelular como todos os membros deste filo, alguns reconhecidos por causarem doenças com impacto relevante na saúde humana (Plasmodium e Toxoplasma) e veterinária (Babesia, Eimeria e Cryptosporidium). Causador da neosporose, N. caninum vem emergindo como um dos maiores causadores de abortos infecciosos em bovinos, levando a consideráveis perdas econômicas na bovinocultura mundial. Devido à sua recente descoberta, o conhecimento sobre diversos processos bioquímicos de N.caninum ainda é limitado, demandando novas pesquisas para a compreensão de seus mecanismos de sobrevivência e consequente identificação de alvos para intervenção terapêutica. O processo de invasão celular é bastante investigado em pesquisas envolvendo apicomplexas, uma vez que a sobrevivência desses parasitas depende do sucesso de sua entrada na célula hospedeira. Proteínas secretadas de organelas filo-específicas (micronemas, roptrias e grânulos densos) estão intimamente envolvidas com a invasão celular. Elas são responsáveis pela interação inicial com a célula hospedeira, participam da junção de movimento formada no momento da invasão, e contribuem para a estabilização do vacúolo parasitóforo. Neste trabalho as proteínas secretadas por taquizoítas de N. caninum foram investigadas de duas formas: (1) por caracterização molecular de proteínas com domínio Apple; e (2) por estudo do secretoma do parasita. Os domínios proteicos do tipo Apple são caracterizados pela capacidade de interação proteína-proteína e proteína-carboidrato, e estão presentes em algumas proteínas micronêmicas com propriedades adesivas. Neste trabalho três proteínas de N. caninum contendo domínios Apple foram caracterizadas: MIC17A, MIC17B e MIC17C. A análise das sequências proteicas e das estruturas dos domínios Apple, obtidas por modelagem molecular, mostraram alta identidade sequencial e estrutural entre MIC17A e MIC17C. Apesar de ser paráloga às outras duas, MIC17B apresenta diferenças importantes em sua sequência e estrutura. Para MIC17B e MIC17C foram realizados experimentos de detecção das proteínas nativas nos extratos total e secretado do taquizoíta que sugerem diferentes formas de processamento entre essas proteínas no parasita. Para MIC17B foi confirmada a localização em micronemas, num padrão diferente do observado para MIC17C. Os ensaios de invasão combinados aos de localização indicam que estas proteínas estejam relacionadas ao processo de invasão celular, porém, suas funções permanecem desconhecidas. O secretoma é o conjunto de proteínas secretadas pelo parasita e, para explorar a composição deste extrato (ESA) no taquizoíta de N. caninum, duas abordagens complementares foram utilizadas. Na primeira abordagem foram identificadas as proteínas presentes no ESA por espectrometria de massas. Na segunda abordagem realizou-se uma ii quantificação relativa das proteínas, marcadas por dois isótopos, nos extratos totais de taquizoítas submetidos ou não ao estímulo secretório. O resultado esperado seria com as proteínas secretadas diminuídas no parasita estimulado. Em ambas as abordagens foram utilizadas técnicas de espectrometria de massas de alta resolução (nanoLC-MS/MS), o que resultou num alto número de identificações; 615 proteínas no ESA e 2011 proteínas quantificadas. A comparação das duas abordagens permitiu o reconhecimento de proteínas com maior probabilidade de secreção. Uma rede de interação entre as proteínas diferencialmente expressas foi predita, gerando resultados que, associados às informações sobre as proteínas aumentadas, permitiram uma investigação sobre proteínas potencialmente envolvidas com a regulação do metabolismo relacionado à secreção. Os resultados obtidos por ambos os estudos aqui demonstrados somam conhecimento acerca do parasita N. caninum e demonstram ser úteis para guiar a busca e seleção de alvos a serem investigados para o desenvolvimento de terapêutica contra a neosporose. / Neospora caninum (Apicomplexa phylum) is an obligatory intracellular parasite like all members from this phylum, some causing diseases with relevant impact on human (Plasmodium and Toxoplasma) and veterinary (Babesia, Eimeria and Cryptosporidium) health. Causative agent of neosporosis, N. caninum has emerged as one of the leading causes of infectious abortion in cattle, generating huge economical losses in worldwide livestock. Due to its recent discovery, knowledge of N. caninum biochemical processes remains scarce, demanding new research for comprehending its survival mechanisms and, consequently, identifying new targets for therapeutic intervention. The invasion process has often been investigated in apicomplexans since their survival depends on the success of their entry into the host cell. Proteins secreted from phylum-specific organelles (micronemes, rhoptries and dense granules) are deeply involved with invasion. They are responsible for the initial interaction with the host cell; participate of the moving junction formed in the moment of invasion; and contribute for the stabilization of the parasitophorus vacuole. In this study, the proteins secreted by N. caninum tachyzoites were investigated in two ways: (1) the molecular characterization of Apple domaincontaining proteins; and (2) exploring the parasite secretome. The Apple protein domains are characterized by the ability to interact as protein-protein and proteincarbohydrate, and are present in some microneme proteins with adhesive properties. Here three N. caninum proteins containing Apple domains were characterized: MIC17A, MIC17B and MIC17C. Analyses of the Apple domains sequences and structures, obtained by molecular modeling, revealed high sequential and structural identities between MIC17A and MIC17C. Although being a paralog of the other two proteins, MIC17B presents significant differences in its sequence and structure. Experiments were performed for native MIC17B and MIC17C detection in the total and secreted tachyzoite extracts, suggesting different processing forms for these proteins in the parasite. For MIC17B, the microneme localization was confirmed, differently from the pattern observed for MIC17C. Invasion and localization assays indicated that these proteins are related to the cell invasion process; nevertheless, their functions remain unknown. The secretome is the set of proteins secreted by the parasite and, to explore this extract (ESA) composition in N. caninum, two complementary approaches were used. Firstly proteins present in ESA were identified by mass spectrometry. In the second approach, a relative quantification was performed on the proteomes of ethanol stimulated/non stimulated tachyzoites, expecting that the secreted proteins would be down regulated at the stimulated parasite. Both approaches were performed with high resolution mass spectrometry techniques (nanoLC-MS/MS), reaching a high number of identifications: 615 proteins iv in ESA and 2011 quantified proteins. The comparison between both approaches allowed the recognition of the most likely secreted proteins. An interaction network was predicted, involving the differentially expressed proteins. These results, associated with the information of up regulated proteins, allowed the investigation of proteins potentially involved with the secretion metabolism regulation. The findings from our two studies add up knowledge about N. caninum and demonstrate to be useful in guiding the search and selection for new targets for therapeutic development against neosporosis.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Neosporosis is a parasitic disease of wide distribution and great importance to the cattle industry, mainly due to its associated reproductive losses. The life cycle of Neospora caninum typified by the tree know infectious stages: tachyzoites, tissue cysts with bradyzoites, and oocysts. Transmission routes can be horizontal and/or vertical. The vertical transmission or transplacentally is the most frequent form of infection, and an important form of maintain the agent in herds. With aim of to determine the occurrence of anti-Neospora caninum antibodies in serum samples of 260 bovine fetuses, collected in a slaughter in the municipality of Santa Maria, in Rio Grande do Sul, Brazil. For detection antibodies anti-N. caninum indirect fluorescent antibody test was used and immunoglobulin G and M were detected, using a cut-off 1:25. Of the 260 serum samples tested, 15% (39/260) were positive for the presence of anti-N. caninum. Of these, in 38 the presence of IgG where detected (97.4%) and in six IgM were present (10.3%). Five samples (15.4%) tested were positive for both IgG and IgM. The results reaffirming the ability of N. caninum in determine fetal infection. The results presented on the first chapter indicated that the search of IgM anti-N. caninum is of very limited help in the detection of the transplacental infection in cattle. In second chapter, was evaluated the susceptibility to infection by N. caninum in different cell cultures, for the purpose of observe the ability in vitro multiplication this agent. For this, eight cell cultures were tested, among the cell cultures tested, four presented good susceptibility to agent: cell lines VERO (yield of 21.2 tachyzoites/cell) and MA-104 (17.1); primary bovine testicle (16.3) and lung cells (13.6). Primary bovine kidney (8.2 tachyzoites/cell), MDBK (5.1) and RK-13 cell lines (0.4) presented moderate to low sensitivity. No viable tachyzoites were detected in the culture of MDCK cells. These results demonstrate that MA-104 cells present adequate susceptibility to N. caninum compared to VERO cells, which have been largely used to multiply the parasite in vitro. Due to the easy manipulation, quick multiplication and relatively low nutritional equirements, these results indicate that MA-104 cells are adequate for multiplication of N. caninum in vitro. / A neosporose é uma doença parasitária de ampla distribuição e com grande importância para a bovinocultura, principalmente pelas perdas reprodutivas que determina. O ciclo do Neospora caninum caracteriza-se por apresentar três estágios infecciosos: os taquizoítos, os cistos teciduais contendo bradizoítos e os oocistos. Suas rotas de transmissão podem ser horizontal e/ou vertical. A infecção vertical ou transplacentária é a forma mais freqüente de infecção, sendo uma importante forma de manutenção do agente nos rebanhos. Com o objetivo de determinar a ocorrência de anticorpos anti-N. caninum em fetos bovinos, foram coletadas 260 amostras de soro em abatedouro localizado no município de Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brasil. Para detecção de anticorpos anti-N. caninum, utilizou-se a técnica de imunofluorescência indireta com a presença de imunoglobulinas G e M (IgG e IgM), sendo analisada com ponto de corte de 1:25. Do número total de amostras testadas, 15% (39/260) foram positivas para anticorpos anti-N. caninum. Destas, em 38 (97,4%) foi detectada a presença de IgG anti-N. caninum e em seis (15,4%) de IgM. Em cinco amostras (12,8%) detectaram-se ambos, IgG e IgM. Os resultados reafirmam a capacidade do N. caninum determinar infecção fetal. Os resultados obtidos no primeiro capítulo desta dissertação permitiram demonstrar que a pesquisa de IgM foi de limitada importância na detecção da infecção via transplacentária em soro fetal bovino. No segundo capítulo, foi avaliada a susceptibilidade à infecção pelo N. caninum em diferentes cultivos celulares, com a finalidade de observar a capacidade de multiplicação deste agente in vitro. Para isto, foram testados oito cultivos, sendo que quatro apresentaram boa susceptibilidade a multiplicação pelo N. caninum: células VERO (produção de 21,2 taquizoítos/célula), MA-104 (17,1), cultivo primário de testículo (16,3) e pulmão bovino (13,6). O cultivo primário de rim bovino (8,2), células MDBK (5,1) e RK-13 (0,4) apresentaram baixa sensibilidade, enquanto células MDCK não produziram taquizoítos viáveis. Os resultados obtidos demonstram que as células MA-104 apresentaram susceptibilidade semelhante a das células VERO linhagem tradicionalmente utilizada para o cultivo deste protozoário. Pela facilidade de cultivo e rápida multiplicação, menor exigência nutricional e produção de taquizoítos em níveis semelhantes às células VERO, as células MA-104 demonstraram ser adequadas para a manutenção e multiplicação do N. caninum in vitro.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Lectins are proteins that bind specifically to carbohydrates and have important role in modulation of the immune response. KM+ and Jacalin (JAC) are lectins from the seeds from jackfruit (Artocarpus integrifolia) and ScLL is a lectin from the Synadenium carinatum latex. Neospora caninum is an apicomplexan parasite that causes neuromuscular disease in dogs and reproductive disorders in cattle, with serious economic impact on the livestock industry. The immunestimulatory role of plant lectins has been investigated in several parasitic infections, but not in neosporosis. This study aimed to evaluate the adjuvant effect and the immunestimulatory potential of KM+, JAC and ScLL in immunization of mice against neosporosis. C57BL 6 mouse groups were subcutaneously immunized three times at 15-day intervals with Neospora lysate antigen (NLA) associated with lectins (NLA+KM, NLA+JAC and NLA+ScLL groups), NLA alone, lectins alone (KM, JAC and ScLL groups), and PBS group (infection control). Animals were challenged with Nc-1 isolate (2x107 tachyzoites) and evaluated for morbidity, mortality, specific antibody response, cytokine production by spleen cells, cerebral parasite burden and histopathological lesions. Serological assays demonstrated higher levels of IgG to N. caninum for NLA+KM and NLA+ScLL than NLA+JAC and NLA groups. NLA+KM group induced higher levels of IgG2a isotype whereas NLA+ScLL induced higher levels of IgG1 isotype. In all groups, IgG1 response was higher than IgG2a response before and after challenge, but the IgG2a/IgG1 ratio increased after challenge in NLA+KM, NLA+ScLL and KM groups. Cytokine production after in vitro antigenic stimulation showed that NLA+KM induced high levels of IFN-g and IL-10, presenting the highest IFN-g/IL-10 ratio, followed by NLA+ScLL group, indicating a pattern of immune response toward Th1 type. NLA+JAC induced low levels of these cytokines and the lowest IFN-g/IL-10 ratio in relation to other groups, indicating a profile of Th2 type immune response. After parasite challenge, NLA+KM mice showed the highest survival with low brain parasite burden and moderate tissue inflammation, whereas NLA+ScLL mice presented intermediate survival with low brain parasite burden and low scores of morbidity and inflammation. NLA+JAC group exhibited intermediate survival, but with the highest brain parasite burden and mild inflammation. In conclusion, KM+ and ScLL lectins showed suitable adjuvant effect by increasing NLA immunogenicity and immunostimulatory role by conferring partial protection of mice immunized and challenged with lethal dose of N. caninum, while the JAC lectin showed no adequate adjuvant effect in the immunization against neosporosis. / Lectinas são proteínas que se ligam especificamente a carboidratos e possuem importantes papéis na modulação da resposta imune. KM+ e Jacalina (JAC) são lectinas da semente da jaca (Artocarpus integrifolia) e ScLL é uma lectina do látex da planta Synadenium carinatum. Neospora caninum é um parasito do filo Apicomplexa que causa doença neuromuscular em cães e desordens reprodutivas em bovinos, causando sério impacto econômico na indústria agropecuária. O papel imunoestimulador de lectinas de plantas tem sido investigado em diversas infecções parasitárias, mas não na neosporose. Esse estudo teve como objetivo avaliar o efeito adjuvante e o potencial imunoestimulador de KM+, JAC e ScLL na imunização de camundongos contra a neosporose. Grupos de camundongos C57BL/6 foram imunizados subcutaneamente por três vezes, em intervalos de quinze dias, com o antígeno de lisado total de Neospora (NLA) associado com as lectinas (grupos NLA+KM, NLA+JAC, NLA+ScLL), NLA somente, lectinas somente (KM, JAC e ScLL), além do grupo PBS (controle da infecção). Os animais foram desafiados com isolado Nc-1 (2x107 taquizoítas) e avaliados quanto aos escores de morbidade, mortalidade, resposta imune humoral específica, produção de citocinas por células do baço, carga parasitária cerebral e lesões histopatológicas. Resultados sorológicos demonstraram maiores níveis de IgG anti N. caninum produzidos pelos animais dos grupos NLA+KM e NLA+ScLL que NLA+JAC e NLA somente. O grupo NLA+KM induziu maiores níveis do isotipo IgG2a, enquanto NLA+ScLL induziu maiores níveis do isotipo IgG1. Em todos os grupos, a resposta de IgG1 foi maior do que de IgG2a antes e após o desafio, porém a razão IgG2a/IgG1 aumentou após o desafio nos grupos NLA+KM, NLA+ScLL e KM. A produção de citocinas após o estímulo antigênico in vitro demonstrou que NLA+KM induziu altos níveis de IFN-g e IL-10, apresentando a maior razão IFN-g/IL-10, seguido pelo grupo NLA+ScLL, indicando um padrão de resposta imune direcionado ao perfil Th1. NLA+JAC induziu baixos níveis destas citocinas e menor razão IFN-g/IL-10 em relação aos demais grupos, indicando um padrão de resposta imune do tipo Th2. Após o desafio com o parasito, camundongos do grupo NLA+KM apresentaram a maior sobrevida com baixa carga parasitária cerebral e moderada inflamação tecidual, enquanto animais imunizados com NLA+ScLL apresentaram sobrevida intermediária com baixa carga parasitária cerebral e baixos escores de morbidade e inflamação. O grupo NLA+JAC exibiu sobrevida intermediária, mas com alta carga parasitária cerebral e suave inflamação. Em conclusão, as lectinas KM+ e ScLL mostraram ser adjuvantes satisfatórios por aumentar a imunogenicidade do NLA e apresentaram efeito imunoestimulador por conferir proteção parcial dos camundongos imunizados e desafiados com dose letal de N. caninum, enquanto a lectina Jacalina não produziu efeito adjuvante suficiente na imunização contra a neosporose. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas