Zur Durchführung peripherer Nervenblockaden werden im klinischen Alltag nichtselektive Lokalanästhetika verwendet, die neben sensorischen auch motorische Nervenfasern blockieren. Diese Arbeit untersucht und beschreibt Grundlagen für die Verwendung selektiv wirksamer Co-Analgetika. Ziel dieser Arbeit war in diesem Kontext die Analyse der intrazellulären Signalwege, welche nach Applikation von rtPA am peripheren Nerven zur Öffnung der perineuralen Barriere und so zu einer opiat- vermittelten Analgesie führen. Gemäß unserer Hypothese bindet rtPA an den LRP-1- Rezeptor und löst eine intrazelluläre Signalkaskade aus: Erk wird phosphoryliert und inhibiert über bislang unklare Mechanismen die Claudin-1-Transkription. Claudin-1 wird weniger in die Zellmembran eingebaut und/oder verlässt durch Endozytose/ Internalisierung die Zellmembran, was zur Öffnung der perineuralen Barriere führt und den Durchtritt selektiv wirksamer Analgetika erlaubt. In der späteren Phase steht die Analyse der Wiederherstellung der Barrierefunktion der Zellmembran im Vordergrund. Die ist von zentraler Bedeutung um eine Schädigung des Nervens durch das Umgebungsmilieu zu verhindern. Vermutlich wird die Wiederherstellung der Barrierefunktion über den Wnt-Signalweg gesteuert. Die Akkumulation von b-Catenin und Cdx2 führt zu einem erneuten Anstieg der Claudin-1-Transkription. Der Claudin-1- Gehalt steigt in Western Blot-Untersuchungen jedoch bereits zu einem früheren Zeitpunkt in der Zellmembran wieder an. Dies legt nahe, dass weitere von der Transkription unabhängige Mechanismen zur Wiederherstellung der Barrierefunktion beitragen. Eine mögliche Alternative zu rtPA stellt katalytisch inaktives rtPAi dar, welches in Untersuchungen ähnliche Ergebnisse wie rtPA zeigte. Dabei könnte die Verwendung von rtPAi anstatt rtPA pathophysiologisch denkbare Komplikationen wie beispielsweise Blutungen verhindern. In Versuchen anderer Mitglieder der Arbeitsgruppe wurde die Öffnung der perineuralen Barriere mittels immunhistochemischer und funktioneller Untersuchungen bestätigt. Auch konnten keine akute Neurotoxizität oder Blutungsgefahr beobachtet werden. Somit stellt rtPA in Kombination mit Opioiden eine mögliche Alternative zur Verbesserung der postoperativen Analgesie dar, die jedoch weiterer Untersuchungen hinsichtlich von Nutzen, Risiken und Nebenwirkungen bedarf. / Regional postoperative pain treatment with non-selective local anesthetics does not only block nociception but also the motoric function of the nerve. This thesis describes and examines principles for the utilization of selective co-analgesics. Aim of this study was to analyze the intracellular signaling-pathways after application of rtPA to the peripheral nerve. The application leads to an opening of the blood-nerve-barrier and to an opioid-mediated analgesia. We postulate that rtPA binds to the LRP-1-receptor and leads via phosphorylation of Erk to a downregulation of Claudin-1-transcription. The mechanism of downregulation is unknown. Claudin-1 is less incorporated into the cell membrane and/or it is removed by endocytosis. This leads to an opening of the blood- nerve-barrier and hydrophilic analgesics like opioids can reach the nerve. After the opening of the barrier we analyzed the mechanisms which lead to a restitution of the barrier-function. This step is important to assure that the nerve is protected from the environment. Our theory is that the Wnt-signaling-pathway is responsible for reestablishing the barrier. An accumulation of b-Catenin and Cdx2 leads to a resumption of Claudin-1-transcription. However Western Blot investigations showed an earlier rise of Claudin-1 in the cell-membrane. This indicates that there are other, from transcription independent mechanisms, that lead to restitution of the barrier-function. Catalytic inactive rtPAi is a promising alternative to rtPA as it shows similar effects without possible side effects like bleedings. Immunohistochemistry and behavioral tests performed by other members of the group confirmed the opening of the blood-nerve-barrier after application of rtPA. No acute neurotoxicity or bleedings have been observed. Therefore, we postulate that rtPA in combination with opioids is an interesting new alternative to mediate postoperative analgesia. However, we still need further investigations to learn more about the benefit, risks and side effects of rtPA application to the peripheral nerve.

Einleitung: Periphere Neuropathien sind häufige neurologische Erkrankungen des Rindes. Dabei stellt die Schädigung des Nervus tibialis (Tibialis-Neuropathie; TN) neben Klauenerkrankungen eine häufige Lahmheitsursache bei Milchkühen post partum dar. Erkrankungen des Bewegungsapparates zählen neben Erkrankungen des Euters und Fruchtbarkeitsstörungen zu den Hauptabgangsursachen von Milchkühen. Lahmheiten sind Ausdruck von Schmerzen und beeinträchtigen somit maßgeblich das Tierwohl. Darüber hinaus führen sie zu wirtschaftlichen Verlusten. Weiterhin werden periphere Neuropathien häufig nicht als solche erkannt oder deren Prognose meist zu schlecht eingeschätzt. Dies führt zu einem frühzeitigen Abgang der Tiere, was wiederum unwirtschaftlich ist. Ziele der Untersuchung: Im ersten Schritt sollte anhand einer Literaturübersicht ein Überblick über allgemeingültige Grundlagen der Neurologie sowie die klinische Ausprägung spezieller peripherer Neuropathien beim Rind gewonnen werden. Im zweiten Schritt sollten auf Grundlage einer prospektiven Fallserie Aussagen zum klinischen Bild, zur Ätiologie und zu Therapie und Prognose der TN getroffen werden. Tiere, Material und Methoden: In die Fallserie wurden von Januar 2013 bis Oktober 2017 prospektiv insgesamt 88 Deutsch-Holstein-Kühe mit einseitiger (ETN, n = 71) und beidseitiger (BTN, n = 17) TN eingeschlossen. Einschlusskriterium war das Vorliegen deutlichen Überkötens eines Fesselgelenks einer Hintergliedmaße in der Bewegung. Die Tiere stammten aus 31 verschiedenen Betrieben in Brandenburg (n = 2), Sachsen (n = 21), Sachsen-Anhalt (n = 3) und Thüringen (n = 5) und wurden in 50 Fällen stationär sowie in 38 Fällen im Rahmen von Bestandsbesuchen vorgestellt. Die Studientiere wurden retrospektiv vier Gruppen zugeteilt, abhängig davon, ob eine spontane Ausheilung eintrat, ob behandelt wurde und welche Art der Behandlung gewählt wurde: Gruppe Spontan, spontane Ausheilung innerhalb 48 Stunden; Gruppe 0Cast, keine Behandlung und keine Ausheilung innerhalb 48 Stunden; Gruppe StV, Behandlung mit Dexamethason und Stützverband; Gruppe Cast, Behandlung mit Dexamethason und Kunstharzverband. Nach Ausschluss von 20 Tieren aufgrund fehlerhafter Dokumentation der Tiernummern oder frühzeitigen Abgangs, weshalb in diesen Fällen keine Aussage zu einer möglichen Ausheilung der TN getroffen werden konnte, ergaben sich zur Auswertung Datensätze von insgesamt 68 Kühen (56 ETN, 12 BTN). Deren Aufteilung auf die vier Gruppen war wie folgt: Spontan, 5 ETN; 0Cast, 8 ETN, 3 BTN; StV, 3 ETN; Cast, 40 ETN, 9 BTN. Die Tiere der Gruppe Cast wurden entweder stationär (CastKlin; n = 32, 24 ETN, 8 BTN) oder im Herkunftsbetrieb (CastBetr; n = 17, 16 ETN, 1 BTN) behandelt. Zur Erstvorstellung erfolgte außerdem eine umfassende Datenerhebung zu Vorbericht, klinischer Symptomatik (Einteilung in drei Paresegrade) sowie die labordiagnostische Untersuchung des aus der Vena jugularis entnommenen Blutes. Neben der täglichen Kontrolle der stationär aufgenommenen Tiere in den ersten 14 Tagen wurden alle behandelten Tiere zu fünf Zeitpunkten (14, 21, 28, 42, 56 Tage nach Erstvorstellung) nachuntersucht. Zur Abschlussuntersuchung an Tag 56 erfolgte eine erneute labordiagnostische Untersuchung des Blutes. Bis zum Studienabschluss im Oktober 2021 wurde in regelmäßigen Abständen der Status der Studientiere erfragt. Ergebnisse: Im angegebenen Untersuchungszeitraum trat bei 2,2 % der aufgrund einer Erkrankung des Bewegungsapparates vorgestellten Deutsch-Holstein-Kühe eine TN auf. Die ETN war vorwiegend post partum nach Dystokie oder infolge vermehrten seitlichen Liegens aufgrund einer Grunderkrankung aufgetreten. Kühe mit BTN waren vor allem im Zeitraum der ersten Brunst mit Anzeichen einer zentralen Nachhandparese vorgestellt worden. Bei fast allen untersuchten Tieren wurden an Tag 0 erhöhte Aktivitäten der Muskelenzyme Kreatinkinase (CK; ETN: 98 %, BTN: 100 %) und Aspartataminotransferase (AST; ETN: 89 %, BTN: 100 %) beobachtet. Nach Behandlung der ETN war die ermittelte Ausheilungsrate deutlich höher als ohne Behandlung (Cast 98 % und StV 100 % vs. 0Cast 62 %). Bei den BTN-Tieren fiel dieser beobachtete Unterschied nicht so deutlich aus (78 % vs. 67 %). Insgesamt war nach Ausheilung der TN die ermittelte Überlebensdauer höher als ohne Ausheilung (545 Tage vs. 100 Tage). Zur Abschlussuntersuchung hatten sich bei den Tieren mit ausgeheilter ETN die CK- und AST-Aktivitäten wieder dem Referenzbereich angenähert (CK: von 434 U/l auf 152 U/l; AST: von 169 U/l auf 77 U/l). Schlussfolgerungen: Die TN ist eine regelmäßig vorkommende und somit relevante Erkrankung von Deutsch-Holstein-Kühen im Einzugsgebiet der Klinik für Klauentiere der Veterinärmedizinischen Fakultät Leipzig. ETN und BTN sind als eigenständige Erkrankungen anzusehen, da sie sich maßgeblich in Ätiologie, klinischem Bild und Prognose unterscheiden. Die TN geht mit einer Traumatisierung der ausgefallenen Muskulatur einher und die Stabilisierung der Gliedmaße in physiologsicher Position mittels Cast oder Verband wirkt sich, besonders ab einem Paresegrad 2, positiv auf die Ausheilung aus. Eine genaue Differenzierung zwischen neurogener und myogener Parese ist nur mit weiterführenden Diagnostika wie Elektrodiagnostik und Neurosonographie möglich. Besonders bei ETN scheint nur ein geringgradiger Nervenschaden zugrunde zu liegen, sodass die Prognose günstig und eine Therapie aus wirtschaftlicher Sicht zu empfehlen ist. Da das Wohlbefinden der Tiere durch eine TN aufgrund von Schmerzen und Bewegungseinschränkung nachweislich gestört ist, sollte die Erkrankung in den Fokus der Inzidenz- und Prävalenzanalyse im Rahmen der tierärztlichen Bestandsbetreuung genommen werden.:1. EINLEITUNG 2. LITERATURÜBERSICHT 2.1 Präambel 2.2 Lähmungen vom peripheren Typ im Gliedmaßenbereich des Rindes. Teil 1: Allgemeine Ursachen und spezielle Lähmungen an Vorder- und Hintergliedmaßen (Publikation 1) 2.3 Lähmungen vom peripheren Typ im Gliedmaßenbereich des Rindes. Teil 2: Diagnostik, Prognose und therapeutisches Vorgehen (Publikation 2) 2.4 Schmerz als Symptom einer Neuropathie – neuropathischer Schmerz 2.5 Weiterführende Diagnostik als Ausblick 2.5.1 Elektrodiagnostik 2.5.2 Brightness-Mode-Sonographie peripherer Nerven und der dazugehörigen Muskulatur 2.6 Zusammenfassende Schlussfolgerungen aus der Literaturrecherche 3. MATERIAL UND METHODEN 3.1 Präambel 3.2 Patientengut 3.3 Studienprotokoll und Gruppenzuteilung 3.3.1 Erstuntersuchung 3.3.1.1 Anamnese 3.3.1.2 Klinische Untersuchung 3.3.1.3 Weiterführende Labordiagnostik 3.3.1.4 Herleitung einer möglichen Ätiologie der Tibialis-Neuropathie aus Ergebnissen der Erstuntersuchung 3.3.2 Behandlung 3.3.2.1 Anlegen des Kunstharzverbandes 3.3.2.2 Medikamentöse Behandlung 3.3.3 Stationäre Aufnahme 3.3.4 Nachuntersuchungen und Therapieabschluss 3.3.4.1 Folgeanamnese Einzeltier 3.3.4.2 Klinische Folgeuntersuchung 3.3.4.3 Verbandswechselschema 3.3.4.4 Dokumentation von Druckstellen 3.3.4.5 Abschlussuntersuchung 3.3.5 Studienabschluss 3.4 Foto- und Videodokumentation 3.5 Statistik 4. PUBLIKATION 3 5. PUBLIKATION 4 6. WEITERE ERGEBNISSE 6.1 Präambel 6.2 Zusammenhang zwischen Erkrankungsdauer und Paresegrad zur Erstuntersuchung 6.3 Einfluss des Betreuungsmanagements auf die Ausprägung von Druckstellen während der Behandlung mit Verband 6.3.1 Kühe mit einseitiger, ausgeheilter Tibialis-Neuropathie und initialer Behandlung mit Kunstharzverband in der Klinik 6.3.2 Kühe mit einseitiger, ausgeheilter Tibialis-Neuropathie und initialer Behandlung mit Kunstharzverband im Betrieb 6.3.3 Kühe mit beidseitiger, ausgeheilter Tibialis-Neuropathie und initialer Behandlung mit Kunstharzverband in der Klinik und im Betrieb 7. DISKUSSION 7.1 Studiendesign und Auswahl der Studientiere 7.2 Ätiologie der Tibialis-Parese 7.2.1 Tibialis-Neuropathie – neurogene Parese 7.2.2 Fibrilläre Ruptur der Muskulatur – myogene Parese 7.3 Angewandtes Therapieschema 7.3.1 Antiphlogistika 7.3.2 Verband 7.3.2.1 Verbandsart und Hilfsmittel 7.3.2.2 Verhinderung von Komplikationen 7.4 Wirtschaftliche Aspekte einer Therapie 7.5 Möglichkeiten zur Prävention 7.6 Ausblick: Klärung offener Fragen durch Elektrodiagnostik und Neurosonographie 8. ZUSAMMENFASSUNG 9. SUMMARY 10. LITERATURVERZEICHNIS 11. ANHANG 12. DANKSAGUNG

Charcot-Marie-Tooth disease type 1A (CMT1A) is the most common subtype of congenital polyneuropathies of the peripheral nervous system and is currently incurable. It is characterised by an early onset in the first decades of life and a combination of motor and sensory symptoms. The disease is caused by a duplication of the peripheral myelin protein 22 (PMP22) gene. This is mainly expressed in Schwann cells, which produce the insulating myelin layer of the peripheral nerves. This overexpression leads to primary dysmyelination, demyelination and subsequent axonal loss. Clinically, CMT1A manifests as muscle weakness and atrophy of the extremities progressing from distal to proximal. In the CMT1A animal model, it has been shown that a reduction in the number of macrophages can have a positive effect on the course of the disease. A more detailed understanding of the role of this cell type, in particular their heterogeneity, as demonstrated for example after acute nerve lesions, is currently still lacking for CMT1A, but might be a promising therapeutic target. Our research group showed in preliminary work that the Schwann cell pathology - contrary to the clinical picture - is more pronounced proximally than distally. Based on this, we have taken into account both a temporal as well as a spatial component in our analysis. In this study, we show that in our genetic mouse model of CMT1A disease, there is a ubiquitous increase in macrophage number in peripheral nerves during postnatal development. In addition, we found evidence that this increase may be cell-subgroup specific. In contrast, a more nerve-specific finding was observed at an adult time point. Here, the increase in macrophage density was more pronounced in proximal nerves, such as the primarily motoric ventral root. Moreover, we found an internerval variability in the number of macrophages expressing phagocytosis markers and antigen-presenting MHCII molecules. The results of this study suggest a connection between the proximally pronounced histopathology and an altered interaction of macrophages. They suggest that there are diverse macrophage subpopulations that have adapted to their specific niche according to the environmental conditions in the different peripheral nerves. This hypothesis is supported by the fact that we also found heterogeneity between the nerves of wild-type animals. Within the scope of this project, we have developed the methodological basis to further clarify and confirm the diversity of macrophages in CMT1A. By taking into account the properties of specific macrophage subgroups, this might enable a more precise search for therapeutic targets that act at the site of the pathology itself in the future.:Acronyms 4 Introduction 9 1. The peripheral nervous system . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2. Macrophages in the PNS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2.1. Peripheral nerve macrophages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 3. Peripheral neuropathies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 4. Charcot-Marie-Tooth disease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 5. Charcot-Marie-Tooth disease type 1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 6. Macrophages in CMT1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Research questions and aim of this project 25 Materials and Methods 27 1. Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.1. Mouse lines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.2. Antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.3. Primers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.4. Buffers and solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.5. Apparatus, laboratory equipment and consumables . . . . . . . . . . . . 33 1.6. Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 2. Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.1. Mouse procedures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.2. Histological analysis of diseased and non-diseased mouse peripheral nerves 38 2.3. Spatial analysis of diseased and undiseased mouse peripheral nerves . . . 42 2.4. Fluorescence Activated Cell Sorting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 2.5. Statistical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 Results 47 1. Quantification of macrophages in CMT1A along the proximo-distal axis . . . . . 47 1.1. PMP22-tg mice have increased numbers of nuclei . . . . . . . . . . . . . 48 1.2. Peripheral nerves of PMP22-tg mice display a heterogenous macrophage response . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 1.3. Characterisation of nerve macrophages in WT at different time points . . 55 1.4. There are no differences in the density of macrophages along the proximodistal axis within one nerve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 2. Macrophage characterisation in 3D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 2.1. There is a lack of increase in total volume of CX3CR1+ macrophages in nerves of P18 PMP22-tg mice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 2.2. There are no significant differences in spatial properties . . . . . . . . . . 61 3. Inflammatory profile of macrophages in CMT1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 3.1. There are no changes in the expression of the lysosomal marker CD107b in 6mo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 3.2. DECTIN1 expression is altered in nerve macrophages at 6 months . . . . 66 3.3. The ventral roots of P18 PMP22-tg mice have a higher quantity ofMHCII objects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 3.4. Macrophages in VR have higher MHCII+ content . . . . . . . . . . . . . 69 3.5. The Npero in PMP22-tg mice displays a specific switch in the antigen presenting cell type via MHCII at P18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 4. Establishing a protocol for nerve macrophage isolation for downstream transcriptomic analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.1. Isolating cells from peripheral nerve tissue . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.2. Isolating macrophages using FACS-analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 Discussion 77 1. Macrophage increase in different nerves and at different disease stages is more diverse than previously known . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 2. CX3CR1+ macrophage subpopulation stays quantitatively stable and is spatially unchanged . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 3. Inflammation markers display a diverse pattern in nerve macrophages . . . . . . 86 4. Macrophage separation enables subpopulation-specific analyses . . . . . . . . . . 89 5. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 Abstract 94 Zusammenfassung 95 References 97 A. Appendix i A.1. List of Tables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i A.2. List of Figures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i A.3. Macros in Fiji . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iii A.4. Macros in Imaris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v A.5. Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x A.6. Copyright of figures taken from publications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvii B. Selbstständigkeitserklärung (Declaration of independence) xx C. Curriculum Vitae xxi D. Acknowledgements xxii / Die Charcot-Marie-Tooth-1A (CMT1A) Erkrankung ist die, derzeit unheilbare, häufigste Subform der angeborenen Polyneuropathien des peripheren Nervensystems. Sie zeichnet sich durch einen frühen Beginn bereits in den ersten Lebensdekaden und kombiniert motorisch-sensorische Symptome aus. Ursächlich ist eine Duplikation des peripheren Myelinprotein 22 (PMP22) Gens, welches vornehmlich in Schwannzellen exprimiert wird, die die isolierende Myelinschicht der peripheren Nerven produzieren. Diese Überexpression führt zu primärer Dysmyelinisierung, Demyelinisierung und nachfolgenden axonalen Verlusten. Klinisch äußert sich CMT1A durch eine von distal nach proximal fortschreitende Muskelschwäche und -atrophie der Extremitäten. Im CMT1A Tiermodell zeigte sich, dass eine Verringerung der Makrophagenanzahl den Krankheitsverlauf positiv beeinflussen kann. Ein genaueres Verständnis der Rolle dieser Zellen, insbesondere deren Heterogenität, wie etwa nach akuten Nervenläsionen nachgewiesen, fehlt derzeit noch für CMT1A, könnte jedoch einen vielversprechenden therapeutischen Ansatzpunkt darstellen. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe zeigten eine – konträr zum klinischen Bild – proximal stärker ausgeprägte Schwannzellpathologie. Hieran anknüpfend berücksichtigt unsere Analyse neben einer zeitlichen auch eine räumliche Komponente. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir in peripheren Nerven des genetischen CMT1A Mausmodells eine ubiquitäre Erhöhung der Makrophagenanzahl in der postnatalen Entwicklung. Zusätzlich fanden wir Hinweise, dass diese Erhöhung Zell-subgruppenspezifisch sein könnte. Zu einem adulten Zeitpunkt zeigte sich indes ein Nerven-spezifischeres Bild. Hier war die erhöhte Makrophagendichte in proximalen Nerven, etwa der primär motorischen vorderen Nervenwurzel, stärker betont. Überdies fanden wir eine internervale Variabilität der Anzahl an Makrophagen, die Phagozytosemarker und antigenpräsentierende MHCII-Moleküle exprimierten. Unsere Ergebnisse lassen einen Zusammenhang zwischen der proximal betonten Histopathologie und einer veränderten Interaktion von Makrophagen vermuten. Sie legen nahe, dass es diverse Subpopulationen gibt, die sich entsprechend biologischer Nischen an die jeweiligen Gegebenheiten der peripheren Nerven angepasst haben. Diese These wird unter anderem dadurch unterstützt, dass sich auch die Nerven der Wildtyp Tiere heterogen zeigten. Zur weiteren Abklärung und Bestätigung der Diversität von Makrophagen in CMT1A, haben wir im Rahmen dieser Arbeit die methodischen Grundlagen entwickelt. Dies könnte es in Zukunft ermöglichen, unter Berücksichtigung der Eigenschaften spezifischer Makrophagen-Subgruppen, gezielter nach therapeutischen Ansatzpunkten zu suchen, die am Ort der Pathologie selbst wirken.:Acronyms 4 Introduction 9 1. The peripheral nervous system . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2. Macrophages in the PNS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2.1. Peripheral nerve macrophages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 3. Peripheral neuropathies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 4. Charcot-Marie-Tooth disease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 5. Charcot-Marie-Tooth disease type 1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 6. Macrophages in CMT1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Research questions and aim of this project 25 Materials and Methods 27 1. Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.1. Mouse lines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.2. Antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.3. Primers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.4. Buffers and solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.5. Apparatus, laboratory equipment and consumables . . . . . . . . . . . . 33 1.6. Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 2. Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.1. Mouse procedures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.2. Histological analysis of diseased and non-diseased mouse peripheral nerves 38 2.3. Spatial analysis of diseased and undiseased mouse peripheral nerves . . . 42 2.4. Fluorescence Activated Cell Sorting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 2.5. Statistical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 Results 47 1. Quantification of macrophages in CMT1A along the proximo-distal axis . . . . . 47 1.1. PMP22-tg mice have increased numbers of nuclei . . . . . . . . . . . . . 48 1.2. Peripheral nerves of PMP22-tg mice display a heterogenous macrophage response . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 1.3. Characterisation of nerve macrophages in WT at different time points . . 55 1.4. There are no differences in the density of macrophages along the proximodistal axis within one nerve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 2. Macrophage characterisation in 3D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 2.1. There is a lack of increase in total volume of CX3CR1+ macrophages in nerves of P18 PMP22-tg mice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 2.2. There are no significant differences in spatial properties . . . . . . . . . . 61 3. Inflammatory profile of macrophages in CMT1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 3.1. There are no changes in the expression of the lysosomal marker CD107b in 6mo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 3.2. DECTIN1 expression is altered in nerve macrophages at 6 months . . . . 66 3.3. The ventral roots of P18 PMP22-tg mice have a higher quantity ofMHCII objects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 3.4. Macrophages in VR have higher MHCII+ content . . . . . . . . . . . . . 69 3.5. The Npero in PMP22-tg mice displays a specific switch in the antigen presenting cell type via MHCII at P18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 4. Establishing a protocol for nerve macrophage isolation for downstream transcriptomic analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.1. Isolating cells from peripheral nerve tissue . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.2. Isolating macrophages using FACS-analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 Discussion 77 1. Macrophage increase in different nerves and at different disease stages is more diverse than previously known . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 2. CX3CR1+ macrophage subpopulation stays quantitatively stable and is spatially unchanged . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 3. Inflammation markers display a diverse pattern in nerve macrophages . . . . . . 86 4. Macrophage separation enables subpopulation-specific analyses . . . . . . . . . . 89 5. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 Abstract 94 Zusammenfassung 95 References 97 A. Appendix i A.1. List of Tables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i A.2. List of Figures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i A.3. Macros in Fiji . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iii A.4. Macros in Imaris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v A.5. Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x A.6. Copyright of figures taken from publications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvii B. Selbstständigkeitserklärung (Declaration of independence) xx C. Curriculum Vitae xxi D. Acknowledgements xxii

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Diese Dissertation untersucht die verschiedenen Konstruktionen poetischer Selbstrepräsentationen durch Melancholie in Gedichten englischer Autorinnen des frühen 18. Jahrhunderts (ca. 1680-1750). Die vielfältigen Gedichte stammen von repräsentativen lyrischer Autorinnen dieser Epoche, z.B. Anne Wharton, Anne Finch, Elizabeth Singer Rowe, Henrietta Knight, Elizabeth Carter, Mary Leapor, Mary Chudleigh, Mehetabel Wright und Elizabeth Boyd. Vor einem ausführlichen medizinhistorischen Hintergrund, der die Ablösung der Humoralpathologie durch die Nerven und die daraus resultierende Neupositionierung von Frauen als Melancholikerinnen untersucht, rekurriert die Arbeit auf die Zusammenhänge von Medizin und Literatur im 18. Jahrhundert. Für die Gedichtanalysen werden gezielt Analysekategorien und zwei Typen poetisch-melancholischer Selbstrepräsentationen entwickelt und dann für die Close Readings der Texte eingesetzt. Die Auswahl der Gedicht umfasst sowohl Texte, die auf generisch standardisierte Marker der Melancholie verweisen, als auch Texte, die eine hauptsächlich die melancholische Erfahrung inszenieren, ohne dabei zwangsläufig explizit auf die genretypischen Marker zurück zu greifen. Die detaillierten Close Readings der Gedichte zeigen die oftmals ambivalenten Strategien der poetisch-melancholischen Selbstkonstruktionen der Sprecherinnen in den Gedichttexten und demonstrieren deutlich, dass – entgegen der vorherrschenden kritischen Meinung – auch Autorinnen dieser Epoche zum literarischen Melancholiediskurs beigetragen haben. Die Arbeit legt ein besonderes Augenmerk auf die sog. weibliche Elegie und ihrem Verhältnis zur Melancholie. Dabei wird deutlich, dass gerade Trauer, die oftmals als weiblich konnotierte Gegendiskurs zur männlich konnotierten genialischen Melancholie wahrgenommen wird, und die daraus folgende Elegie von Frauen als wichtiger literarischer Raum für melancholische Dichtung genutzt wurde und somit als Teil des literarischen Melancholiediskurses dient. / This thesis analyses different constructions of poetic self-representations through melancholy in poems written by early eighteenth-century women writers (ca. 1680-1750). The selection of poems includes texts written by representative poets such as Anne Wharton, Anne Finch, Elizabeth Singer Rowe, Henrietta Knight, Elizabeth Carter, Mary Leapor, Mary Chudleigh, Mehetabel Wright und Elizabeth Boyd. Against the background of a detailed analysis of the medical-historical paradigmatic change from humoral pathology to the nerves and the subsequent re-positioning of women as melancholics, the thesis refers to the close relationship of medicine and literature during the eighteenth century. Specifical categories of analysis and two different types of melancholic-poetic self-representations are developed, in order to support the close readings of the literary texts. These poems comprise both texts, which explicitly refer to generically standardized melancholy markers, as well as texts, which negotiate and aestheticize the melancholic experience without necessarily mentioning melancholy. The detailed close readings of the poems discuss the often ambivalent strategies of the poetic speakers to construct and represent their melancholic selves and clearly demonstrate that women writers of that time did – despite the common critical opinion – contribute to the literary discourse of melancholy. The thesis pays special attention to the so-called female elegy and its relationship to melancholy. It becomes clear that mourning and grief, which have often been considered a feminine counter-discourse to the discourse of melancholy as sign of the male intellectual and/or artistic genius, and the resulting female elegy offer an important literary space for women writers and their melancholy poetry, which should thus be recognized as a distinctive part of the literary discourse of melancholy.