Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-26Bitstream added on 2014-06-13T18:46:21Z : No. of bitstreams: 1 apparicioferreira_m_dr_jabo.pdf: 8938205 bytes, checksum: 540b8a495ebda2425790114eece3d47a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este estudo foi realizado com o intuito de avaliar comparativamente os efeitos do emprego de meios seqüenciais com hormônios no desenvolvimento meiótico e citoplasmático de oócitos caninos durante o período de cultivo de 72 horas. Os oócitos foram coletados de 49 cadelas hígidas submetidas à ovariosalpingo-histerectomia ou ovariectomia, divididas em três grupos de acordo com seu status reprodutivo (fase folicular, lútea e anestro). Os óocitos foram aleatoriamente distribuídos em quatro sistemas de cultivo diferentes sendo o meio básico (MB) o TCM 199 suplementado. Os demais consistiam: no sistema A (controle) os oócitos foram maturados por 72 horas no (MB) com 10 UI/mL de hCG, 1 mg/mL de progesterona (P4) e 1 mg/mL de estradiol (E2), ou seja, expostos de forma contínua à estes hormônios; no sistema seqüenciado B os oócitos foram maturados no meio base com hCG por 48 horas e nas 24 horas adicionais no MB com P4; no sistema seqüenciado C os oócitos foram maturados no MB com hCG, P4 e E2 por 48 horas e nas 24 horas adicionais no MB com P4; no sistema D (controle) os oócitos foram maturados no MB, sem hormônios. Nos meios B e C, os hormônios foram suplementados nas mesmas concentrações empregadas no sistema A. Os resultados evidenciaram efeito positivo dos meios seqüenciais na progressão da meiose e na maturação citoplasmática (P<0,05). Não houve influência da condição reprodutiva das fêmeas doadoras nas taxas de maturação oocitária (P>0,05). A presença de espermatozóides nos meios de cultivo não teve efeito benéfico sobre as taxas de MII; em contrapartida, a porcentagem de oócitos degenerados aumentou consideravelmente (P>0,05). / The aim of this work was to study the influence of different bi-phasic systems with gonadotrophins and steroids on meiotic and cytoplasmic development of canine oocytes cultured for 72 hours. Oocytes were collected after ovariohysterectomy or ovariectomy from 49 healthy bitches, divided into 3 groups according to their reproductive status (follicular, luteal and anestrous stages). Oocytes were randomly allocated in four different culture systems with the base medium (BM) consisting of TCM-199. The systems were as follows: in system A oocytes were matured for 72 h in BM with 10 UI/mL hCG, 1 mg/mL progesterone (P4), 1 mg/mL estradiol (E2); in bi-phasic system B oocytes were matured for 48 h in BM with hCG and for 24 h in BM with P4; in bi-phasic system C oocytes were matured for 48 h in BM with hCG, P4 and E2, and for 24 h in BM with P4. In system D (control), oocytes were cultured in BM without hormones. In sytems B and C hormones were supplemented at the same doses as in system A. The results suggest that the use of bi-phasic systems was beneficial for oocyte meiosis and cytoplasmic maturation (P<0,05). No difference was noticed with regards to the influence of reproductive status on maturation rates (P>0,05). The addition of spermatozoa to the medium had no benefit on MII stage rates (P>0,05); however, the percentage of degenerated oocytes has significantly increased.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-23Bitstream added on 2014-06-13T20:46:13Z : No. of bitstreams: 1 barretto_lss_dr_jabo.pdf: 796760 bytes, checksum: 1b897563a911eb0bb996aa629ab300d1 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação do meio de maturação com roscovitina, butirolactona I, cisteamina e b-mercaptoetanol na maturação oocitária e suas conseqüências na fecundação e desenvolvimento embrionário bovino in vitro, além da variabilidade da freqüência de danos ao DNA embrionário. Oócitos foram maturados a 38,8oC em atmosfera de 5% CO2 em ar em meio TCM-199 suplementado com 0,6% BSA, 0,5 mg FSH, 100 UI hCG e 1 mg estradiol/mL (controle - C), adicionado de 50 æM de cisteamina (CC) ou 50 æM de bmercaptoetanol (CM). O grupo padrão do laboratório (S) foi suplementado com 10% de SFB como fonte protéica. Os oócitos em meio suplementado com butirolactona I ou roscovitina foram pré-maturados por 24 horas em meio TCM-199 suplementado com 0,3% BSA, antibiótico e piruvato, de acordo com os grupos: 100 æM de butirolactona I (CB), 100 æM de butirolactona I + 50 æM de cisteamina (CBC), 100 æM de butirolactona I + 50 æM de b-mercaptoetanol (CBM), 25 æM de roscovitina (CR), 25 æM de roscovitina + 50 æM de cisteamina (CRC) e 25 æM de roscovitina + 50 æM de b-mercaptoetanol (CRM). Após o cultivo de pré-maturação, foram transferidos para gotas com meio controle para maturação por 8, 16 e 24 horas, para avaliação da maturação nuclear e citoplasmática, e dosagem da [GSHi]. A fecundação foi realizada após 24 horas do início do cultivo de maturação (grupos sem inibidores), e 20 horas (grupos com inibidores). O cultivo de desenvolvimento foi realizado em meio SOF-Modificado suplementado com 0,5% de BSA e 2,5% de SFB à temperatura de 38,8ºC por 192 horas. Observou-se que a butirolactona I é capaz de bloquear a maturação meiótica de maneira reversível e mais eficiente que a roscovitina, e que os antioxidantes não interferiram na retomada da maturação nuclear... / The aim of this work was to evaluate the effects of maturation media supplementation with roscovitine, butyrolactone I, cysteamine and - mercaptoethanol on oocyte maturation and the consequences on fertilization and bovine embryo development in vitro, and also DNA damage frequency in embryos. Oocytes were matured at 38.8°C under a 5% CO2 in air environment, in TCM-199 medium supplemented with 0.6% BSA, 0.5 mg FSH, 100 IU hCG and 1 mg estradiol/mL (control group - C) and with either 50 æM cysteamine (CC group) or 50 æM b-mercaptoethanol (CM group). The standard group of the laboratory (S group) was supplemented with 10% FCS as protein source. The oocytes in which groups were pre-incubated for 24 hours with butyrolactone I and roscovitine in TCM-199 medium supplemented with 0.3% BSA, antibiotic and pyruvate were culturedaccording to the groups: 100 æM butyrolactone I (CB), 100 æM butyrolactone I + 50 æM cysteamine (CBC), 100 æM butyrolactone I + 50 æM b-mercaptoethanol (CBM), 25 æM roscovitine (CR), 25 æM roscovitine + 50 æM cysteamine (CRC) and 25 æM roscovitine + 50 æM bmercaptoethanol (CRM). After the pre-incubation, the oocytes were transferred to the control maturation medium for 8, 16 and 24 hours for evaluation of nuclear and cytoplasmic maturation and [GSHi] dosage. For IVF, the oocytes were fertilized at 24 hours after the beginning of maturation (groups without inhibition), or 20 hours (groups with inhibition). Embryo culture was in SOF-Modified medium supplemented with 0.5% BSA and 2.5% FCS at 38.8ºC for 192 hours. We observed that butyrolactone I is capable of reversibly blocking meiotic maturation more effectively than roscovitine, and that addition of antioxidants did not interferewith resumption of nuclear maturation...(Complete abstract, acess undermentioned eletronic address)

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCV07MA024.pdf: 1167481 bytes, checksum: 8d46ea0fb9ff81da5a38a6f48e0ef3e1 (MD5) Previous issue date: 2007-06-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The aims of this work were to perform a breeding soundness evaluation in Devon bulls in the State of Santa Catarina, in Southern Brazil, and to propose alternatives to maximize beef cattle production capacity. The contents of this dissertation were divided in four chapters. Chapter one is a review on the breeding soundness evaluation of bulls, which includes clinical exam, semen collection and evaluation, and serving capacity. In Chapter two, the evaluation of the breeding soundness of 207 Devon bulls was used to determine approval rate, based on clinical and seminal evaluation and serving capacity, and potential causes for failure. The bulls approval mean rate was 71.6%. The mean scrotal circumference (CE), according to distinct age periods, was 35.2 ± 2.93 cm for bulls between 18 to 22 months of age; 37.3 ± 2.75 cm for 23 to 27 months, and 38.2 ± 3.6 cm for 30 months or above. In Chapter 3, the internal artificial vagina (IAV) methodology, designed by Dr. Albert Barth, was tested in Devon bulls, simultaneously evaluating their serving capacity and fertility. Out of 52 bulls tested, 60.0% were satisfactory. A semen sample was obtained with the aid of the IAV in 45 bulls (86.5%), from which, 69.0% were approved in the breeding soundness evaluation, and 31.0% were reproved. When the total umber of bulls (n=52) was considered, 60.0% were approved after semen collection and serving capacity using the IAV. The IAV was an effective alternative for semen collection, allowing the simultaneous evaluation of semen quality and serving capacity. The IAV procedures were proven very effective and important, as 11.1% of failed bulls would have been inadequately approved if only clinical and seminal exams were performed. Chapter 4 reports a study to evaluate OPU recovery and efficiency of vitrification in immature OPU or slaughterhouse oocytes, from Devon viii and Nelore cows. Devon OPU mean collection rate was of 4.6 oocytes/female, hich was significantly lower (p<0.05) than in Nelore cows (16.3 oocytes/female). After warming, in vitro maturation, fertilization and culture of vitrified oocytes, cleavage rates were 17.6% in the OPU/Devon group, 29.1% in OPU/Nelore, 22.8% in the slaughterhouse/Devon, and 14.5% in the slaughterhouse/Nelore group. No statistical difference was observed between groups (p>0.05). Only one embryo developed to the blastocyst stage in the OPU/Devon group. Nelore cows had a higher OPU recovery per session in comparison to Devon. We concluded that immature oocyte vitrification obtained by OPU, under field conditions, did not allow acceptable in vitro embryo developmental rates. In conclusion, this study demonstrated the feasibility oftechnical alternatives to improve bovine reproductive capacity, but such alternatives should be tested beforehand and properly adapted previously to the use under field conditions / O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade reprodutiva de touros da raça Devon, criados em Santa Catarina, bem como propor alternativas para maximizar a capacidade produtiva de bovinos de corte. Os conteúdos foram agrupados em quatro capítulos. No Capítulo 1, procedeu-se a revisão bibliográfica do exame andrológico do touro, incluindo o exame clínico, a coleta do ejaculado, a avaliação seminal e a avaliação da capacidade de serviço. No Capítulo 2, foram avaliados dados obtidos de exames andrológicos de 207 touros da raça Devon, sendo determinado o percentual de animais aptos à reprodução, com base no exame clinico, exame seminal e comportamento sexual, bem como as potenciais causas de reprovação. A média de touros aprovados foi de 71,6%. A média de circunferência escrotal (CE) nas diferentes faixas etárias foram 35,2 ± 2,93 cm para animais de 18 a 22 meses, 37,3 ± 2,75 cm para animais de 23 a 27 meses e 38,2 ± 3,6 cm para animais com mais de 30 meses. No Capítulo 3, foi avaliada a metodologia da vagina artificial interna (VAI) proposta pelo Dr. Albert Barth, como forma de coleta do ejaculado e simultânea avaliação do comportamento e a fertilidade de touros da raça Devon. Dos 52 animais examinados, 60,0% foram considerados aptos. A VAI possibilitou a coleta do ejaculado de 45 animais (86,5%). Dos touros coletados com a VAI (n=45) 69% foram considerados aptos à reprodução e 31% inaptos. Quando se considerou o total de touros examinados (n=52), 60,0% dos touros foram aprovados após coleta de sêmen e avaliação da capacidade de cópula com a VAI. Concluiu-se que a VAI foi efetiva na coleta dos ejaculados, permitindo a avaliação simultânea da capacidade de serviço. A técnica mostrou-se importante, já que vi 11,1% dos animais reprovados no teste seriam inadequadamente considerados aptos à reprodução, se apenas os exames clínico e de qualidade seminal fossem empregados. O Capítulo 4 reporta um estudo para avaliar a taxa de recuperação e a eficiência da vitrificação de oócitos imaturos obtidos por OPU, ou de ovários de abatedouro, de fêmeas bovinas das raças Devon e Nelore. O número médio de oócitos por sessão de OPU foi de 4,6 na raça Devon, sendo inferior (p<0,05) aos 16,3 obtidos na raça Nelore. Após o reaquecimento, maturação, fecundação e cultivo dos oócitos vitrificados, foram observadas taxas de clivagem de 17,6% no grupo OPU / Devon, 29,1% no grupo OPU / Nelore, 22,8% no grupo ovários abatedouro / Devon e 14,5% no grupo ovários abatedouro / Nelore, não havendodiferença (p>0,05) entre os grupos. Na avaliação do desenvolvimento embrionário, apenas um embrião atingiu o estágio de blastocisto, no grupo OPU / Devon. As fêmeas da raça Nelore possibilitaram um número significativamente maior de oócitos recuperados por sessão quando comparadas com fêmeas da raça Devon. Concluise que a associação da técnica de OPU com vitrificação dos oócitos, em condições de campo, não produz taxas aceitáveis de desenvolvimento embrionário. O estudo demonstra que existem alternativas para melhorar a capacidade reprodutiva de bovinos que, todavia, devem ser previamente avaliadas e adequadas às condições existentes

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCV07MA024.pdf: 1167481 bytes, checksum: 8d46ea0fb9ff81da5a38a6f48e0ef3e1 (MD5) Previous issue date: 2007-06-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The aims of this work were to perform a breeding soundness evaluation in Devon bulls in the State of Santa Catarina, in Southern Brazil, and to propose alternatives to maximize beef cattle production capacity. The contents of this dissertation were divided in four chapters. Chapter one is a review on the breeding soundness evaluation of bulls, which includes clinical exam, semen collection and evaluation, and serving capacity. In Chapter two, the evaluation of the breeding soundness of 207 Devon bulls was used to determine approval rate, based on clinical and seminal evaluation and serving capacity, and potential causes for failure. The bulls approval mean rate was 71.6%. The mean scrotal circumference (CE), according to distinct age periods, was 35.2 ± 2.93 cm for bulls between 18 to 22 months of age; 37.3 ± 2.75 cm for 23 to 27 months, and 38.2 ± 3.6 cm for 30 months or above. In Chapter 3, the internal artificial vagina (IAV) methodology, designed by Dr. Albert Barth, was tested in Devon bulls, simultaneously evaluating their serving capacity and fertility. Out of 52 bulls tested, 60.0% were satisfactory. A semen sample was obtained with the aid of the IAV in 45 bulls (86.5%), from which, 69.0% were approved in the breeding soundness evaluation, and 31.0% were reproved. When the total number of bulls (n=52) was considered, 60.0% were approved after semen collection and serving capacity using the IAV. The IAV was an effective alternative for semen collection, allowing the simultaneous evaluation of semen quality and serving capacity. The IAV procedures were proven very effective and important, as 11.1% of failed bulls would have been inadequately approved if only clinical and seminal exams were performed. Chapter 4 reports a study to evaluate OPU recovery and efficiency of vitrification in immature OPU or slaughterhouse oocytes, from Devon viii and Nelore cows. Devon OPU mean collection rate was of 4.6 oocytes/female, which was significantly lower (p<0.05) than in Nelore cows (16.3 oocytes/female). After warming, in vitro maturation, fertilization and culture of vitrified oocytes, cleavage rates were 17.6% in the OPU/Devon group, 29.1% in OPU/Nelore, 22.8% in the slaughterhouse/Devon, and 14.5% in the slaughterhouse/Nelore group. No statistical difference was observed between groups (p>0.05). Only one embryo developed to the blastocyst stage in the OPU/Devon group. Nelore cows had a higher OPU recovery per session in comparison to Devon. We concluded that immature oocyte vitrification obtained by OPU, under field conditions, did not allow acceptable in vitro embryo developmental rates. In conclusion, this study demonstrated the feasibility of technical alternatives to improve bovine reproductive capacity, but such alternatives should be tested beforehand and properly adapted previously to the use under field conditions / O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade reprodutiva de touros da raça Devon, criados em Santa Catarina, bem como propor alternativas para maximizar a capacidade produtiva de bovinos de corte. Os conteúdos foram agrupados em quatro capítulos. No Capítulo 1, procedeu-se a revisão bibliográfica do exame andrológico do touro, incluindo o exame clínico, a coleta do ejaculado, a avaliação seminal e a avaliação da capacidade de serviço. No Capítulo 2, foram avaliados dados obtidos de exames andrológicos de 207 touros da raça Devon, sendo determinado o percentual de animais aptos à reprodução, com base no exame clinico, exame seminal e comportamento sexual, bem como as potenciais causas de reprovação. A média de touros aprovados foi de 71,6%. A média de circunferência escrotal (CE) nas diferentes faixas etárias foram 35,2 ± 2,93 cm para animais de 18 a 22 meses, 37,3 ± 2,75 cm para animais de 23 a 27 meses e 38,2 ± 3,6 cm para animais com mais de 30 meses. No Capítulo 3, foi avaliada a metodologia da vagina artificial interna (VAI) proposta pelo Dr. Albert Barth, como forma de coleta do ejaculado e simultânea avaliação do comportamento e a fertilidade de touros da raça Devon. Dos 52 animais examinados, 60,0% foram considerados aptos. A VAI possibilitou a coleta do ejaculado de 45 animais (86,5%). Dos touros coletados com a VAI (n=45) 69% foram considerados aptos à reprodução e 31% inaptos. Quando se considerou o total de touros examinados (n=52), 60,0% dos touros foram aprovados após coleta de sêmen e avaliação da capacidade de cópula com a VAI. Concluiu-se que a VAI foi efetiva na coleta dos ejaculados, permitindo a avaliação simultânea da capacidade de serviço. A técnica mostrou-se importante, já que vi 11,1% dos animais reprovados no teste seriam inadequadamente considerados aptos à reprodução, se apenas os exames clínico e de qualidade seminal fossem empregados. O Capítulo 4 reporta um estudo para avaliar a taxa de recuperação e a eficiência da vitrificação de oócitos imaturos obtidos por OPU, ou de ovários de abatedouro, de fêmeas bovinas das raças Devon e Nelore. O número médio de oócitos por sessão de OPU foi de 4,6 na raça Devon, sendo inferior (p<0,05) aos 16,3 obtidos na raça Nelore. Após o reaquecimento, maturação, fecundação e cultivo dos oócitos vitrificados, foram observadas taxas de clivagem de 17,6% no grupo OPU / Devon, 29,1% no grupo OPU / Nelore, 22,8% no grupo ovários abatedouro / Devon e 14,5% no grupo ovários abatedouro / Nelore, não havendo diferença (p>0,05) entre os grupos. Na avaliação do desenvolvimento embrionário, apenas um embrião atingiu o estágio de blastocisto, no grupo OPU / Devon. As fêmeas da raça Nelore possibilitaram um número significativamente maior de oócitos recuperados por sessão quando comparadas com fêmeas da raça Devon. Concluise que a associação da técnica de OPU com vitrificação dos oócitos, em condições de campo, não produz taxas aceitáveis de desenvolvimento embrionário. O estudo demonstra que existem alternativas para melhorar a capacidade reprodutiva de bovinos que, todavia, devem ser previamente avaliadas e adequadas às condições existentes

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCV07MA018.pdf: 1132263 bytes, checksum: 6e10cf4471ceb93e5b44c3be1e5da2c8 (MD5) Previous issue date: 2007-02-17 / The main objective of Cryobiology is the optimization of an oocyte cryopreservation technique. It will permit to create germoplasm banks for maintenance of animal biodiversity, serving as an important instrument in transgenic, cloned or in vitro produced animals. It is consensus that the vitrification is the best method to cryopreserve oocytes and that high cooling rates improve the viability. To evaluate the use of carrier tools with different thermal conductivity in vitrification, 1.454 oocytes (Experiment 1) were 30 seconds exposed to 10% EG + 10% DMSO + 20% estrus mare serum (SEE) in TCM Hepes. Just after, groups of 5 or 6 oocytes were exposed (20 seconds) to vitrification solution (SV - 20% EG + 20% DMSO and 0.5M Sucrose). They were loaded in PM (stainless metallic straws, n=265), MV (glass micropipette, n=279), PB (straw bevel cuted, n=280), OPS (open pulled straw, n=272) or maintained without vitrification GC (control group n=358). Vitrification was obtained by plunging it in super cooled liquid nitrogen. In the experiment 2 (n=709) the aim was to evaluate bovine oocytes vitrification in reduced (25 and 50%) cryoprotectants concentration. Oocytes were 30 sec. exposed to the first cryoprotectant solution, and just after during 20 seconds to one of the allows vitrification solutions: SV100 (n=187), 20% EG + 20% DMSO + 0.5M Suc; SV75 (n=187), 15% of EG + 15% of DMSO and 0.375M of Suc; or SV50 (n=146), 10% of EG, 10% of DMSO + 0.25M Suc. A non vitrified group (n=189) was used as control. The re-warming was performed by exposure (5 minutes each) to decreasing sucrose solutions (0.30 and 0.15M), heated up to 35ºC. The oocytes were then maturated, fertilized, and the presumptive zygotes cultured in SOFaaci medium, at 39ºC, in saturated humidity. Cleavage, blastocysts and hatching rates were used as viability criteria. In the experiment 1 there was not differences in cleavage rates (p>0.05) among treatments, that were lower (P <0.05) than control group. In the vitrified groups, higher blastocyst rates were obtained with PM treatment (10.2%), that was lower (P <0.05) than the OPS (6.1%) and PB (6.1%) treatments, not differing from the MV group (8.0%), although with tendency of be higher (P <0.1). The treated groups had identical hatching rates, which were lower than the control group. In the second experiment, there was not difference in the cleavage rate among SV100 and SV75 treatments, being both higher (p <0.05) than the SV50 treatment. In the blastocyst rates, there was difference among all groups (P <0.05). The higher rate was obtained in control group (38.0%), followed by the SV100 (10.1%), SV75 (7.6%) and SV50 (0.5%) treatments, respectively. The hatching rates of SV100 and SV75 groups were similar, being lower (P <0.05) than control group. In the SV50 group none blastocyst hatched. We conclude that increasing cooling speed rates improves the viability of immature vitrified bovine oocytes, and that the metallic straws are more effective than recipients of lower conductivity (plastic straws), with a tendency of superiority when compared to the glass micropipette. Still, the reduction of the cryoprotectors in 25% or up does not allow an appropriate cryoprotection to vitrify bovine oocytes, in the conditions of this study / A otimização da técnica de vitrificação de oócitos é um dos principais objetivos da criobiologia, pois possibilitará a formação de bancos de germoplasma para manutenção da biodiversidade animal, além de se constituir num importante instrumento na produção de animais transgênicos, clones ou programas de produção in vitro de animais. É consenso que a vitrificação é o método mais adequado para criopreservar oócitos e que elevadas taxas de resfriamento melhoram a viabilidade da técnica. Para avaliar o uso de materiais com diferentes condutividade térmica na vitrificação (Experimento 1), 1454 oócitos foram utilizados. Inicialmente os oócitos foram expostos a 10% EG + 10% DMSO + 20% soro de égua em estro (SEE), em TCM Hepes, por 30 segundos. Após, grupos de 5 ou 6 oócitos foram submetidos à solução de vitrificação (SV) composta de 20% EG + 20% DMSO e 0,5M Sacarose, durante 20 segundos, período em foram envasados e mergulhados em nitrogênio super-resfriado. O envase foi realizado em PM (palheta metálica inoxidável, n=265), MV (micropipeta de vidro, n=279), PB (palheta cortada em bisel, n=280), OPS (open pulled straw, n=272). Simultaneamente, um grupo não vitrificado serviu como controle, (GC n=358). No Experimento 2, 709 oócitos foram vitrificados com concentrações reduzidas (25 e 50%) de crioprotetores. Inicialmente os oócitos foram expostos, por 30 segundos, a uma solução de 10% EG + 10% DMSO + 20% SEE, em TCM Hepes. Logo após, foram expostos, por 20 segundos, a uma das soluções de vitrificação: SV100 (n=187), 20% EG + 20% DMSO + 0,5M Sacarose; SV75 (n=187), 15% de EG + 15% de DMSO e 0,375M de sacarose; ou SV50 (n=146), 10% de EG, 10% de DMSO + 0,25M de sacarose, além de um grupo controle não vitrificado (n=189). O reaquecimento foi realizado pela exposição (5 minutos cada) às soluções decrescentes de sacarose (0,30 e 0,15M), aquecidas a 35ºC. Os oócitos foram então maturados e fecundados, e os prováveis zigotos cultivados em meio SOFaaci, à 39ºC. As taxas de clivagem, de blastocistos e eclosão foram utilizadas com critérios de viabilidade. No experimento 1 não foram verificadas diferenças (P>0,05) nas taxas de clivagem dos tratamentos, que foram inferiores (P<0,05) ao grupo controle. A maior taxa de blastocistos nos grupos vitrificados foi obtida com o tratamento PM (10,2%), que foi superior (p<0,05) aos tratamentos OPS (6,1%) e PB (6,1%), não diferindo do grupo MV (8,0%), embora com tendência de ser superior (p<0,1). Também as taxas de eclosão nos grupos tratados foram semelhantes, sendo inferiores as do grupo controle. No experimento 2, não houve diferença na clivagem entre os tratamentos SV100 e SV75, sendo ambos superiores (P<0,05) ao tratamento SV50. Na taxa de blastocistos, houve diferença entre todos os tratamentos (p<0,05). A maior taxa foi obtida com o grupo controle (38,0%), seguido do tratamento SV100 (10,1%), SV75 (7,6%) e SV50 (0,5%), respectivamente. As taxas de eclosão dos grupos SV100 e SV75 foram semelhantes, sendo inferiores (p<0,05) ao controle. No grupo SV50 não houve eclosão. Conclui-se que o aumento da velocidade de resfriamento melhora a viabilidade pós vitrificação de oócitos bovinos imaturos, sendo que as palhetas metálicas são mais efetivas que os recipientes de menor condutividade (palhetas plásticas), com uma tendência de superioridade quando comparada à micropipeta de vidro. Ainda, a redução dos crioprotetores em percentual igual ou superior a 25% não permite uma adequada crioproteção na vitrificação de oócitos bovinos, com a metodologia proposta neste estudo

Submitted by Giovana Barros Nunes (giovanabnunes@hotmail.com) on 2018-04-12T15:28:06Z No. of bitstreams: 1 GBN VERSÃO FINAL DISSERTAÇÃO P IMPRESSÃO.pdf: 1111649 bytes, checksum: f77c4c688d28fc8ca13182c8832085f8 (MD5) / Rejected by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: No arquivo submetido ao repositório deve estar inserido o certificado de aprovação (documento obrigatório). A informação sobre a lombada não precisa conter no arquivo pdf inserido. Favor inserir o certificado de aprovação e submeter novamente a sua dissertação no repositório. Agradecemos a compreensão on 2018-04-13T11:25:20Z (GMT) / Submitted by Giovana Barros Nunes (giovanabnunes@hotmail.com) on 2018-04-13T14:08:12Z No. of bitstreams: 1 Dissertação GIOVANA BARROS NUNES VERSÃO DEFINITIVA Repositório.pdf: 1276204 bytes, checksum: 3aba64a51e863966cadeab46cfa01561 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-04-13T17:17:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 nunes_gb_me_jabo.pdf: 1276204 bytes, checksum: 3aba64a51e863966cadeab46cfa01561 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-13T17:17:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nunes_gb_me_jabo.pdf: 1276204 bytes, checksum: 3aba64a51e863966cadeab46cfa01561 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito do precursor do peptídeo natriurético tipo C (NPPC) durante o cultivo de pré-maturação in vitro (pré-MIV) de oócitos bovinos sobre: 1) a progressão da maturação nuclear; 2) a expressão gênica das células do cumulus e 3) a aquisição da competência do oócito para o desenvolvimento embrionário in vitro. Os complexos cumulus-oócito (CCOs) foram pré-MIV com 100 nM NPPC por 8 horas (grupo NPPC) e, ao final do período, foram lavados para completa remoção do NPPC e submetidos à MIV por 22h. Após 8h de pré-MIV e após 8h de pré-MIV seguidas de 22h de MIV (duração total do cultivo = 30h) foram avaliadas a progressão da maturação nuclear e a expressão relativa de mRNA nas células do cumulus. O grupo controle (C) foi maturado na ausência de NPPC por até 30h, e as mesmas avaliações anteriores foram realizadas imediatamente após a remoção do ambiente folicular (C0), após 8h de cultivo (C8), após 22h de cultivo (C22) e após 30h de cultivo (C30). Em outro experimento, cujos tratamentos foram idênticos aos supramencionados, os oócitos foram fecundados ao término da MIV e foi avaliado o desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos. Após 8h de cultivo de pré-MIV, a análise da progressão da meiose demonstrou que o grupo C0 apresentou 58,9% de estruturas com configuração de GV1, enquanto que o grupo C8 apresentou apenas 13,9% de estruturas nesta configuração (P<0,05). A proporção de GV1 no grupo NPPC foi semelhante a ambos estes grupos (22,8%; P>0,05). Por outro lado, o grupo C8 apresentou maior taxa de GV3 em relação ao C0 (53,1% vs. 3,62%; P<0,05), sem diferenças com o grupo NPPC (38,7%; P>0,05). Ao final do cultivo de MIV, não foi observada diferença entre os grupos (C22 vs. NPPC vs. C30) com relação à maturação nuclear, todavia, houve maior taxa de oócitos degenerados no C30 em comparação com C22 (11,4% vs. 2,8%; P<0,05). A análise da expressão relativa de genes das células do cumulus após 8h de pré-MIV com NPPC evidenciou aumento (P<0,05) na expressão de genes relacionados à expansão destas células (GREM1, PTGS2/COX2, PTX3, TNFAIP6 e VCAN), à maturação oocitária (BDNF, EGFR, NOS3, PDE5A, PRKCD e STAT3) e ao desenvolvimento embrionário (IGF1R, KRT8 e LUM). Ao final do cultivo de MIV, observou-se no grupo NPPC que o gene PTX3, relacionado à expansão das células do cumulus, além dos genes AREG e BDNF, relacionados à maturação oocitária, e o gene LUM, relacionado ao desenvolvimento embrionário estavam mais expressos em comparação com o grupo C30 (P<0,05). Com relação ao desenvolvimento embrionário, os grupos experimentais não apresentaram diferença (P>0,05) quanto à taxa de clivagem (média de 73,22%). Embora o grupo NPPC não tenha diferido (P>0,05) de C22 e C30 quanto à taxa de blastocistos, houve diferença entre C22 e C30 (69,3 vs. 37,4; P<0,05). Todavia, não houve diferença entre os grupos com relação ao número de células totais (blastômeros) e apoptóticas (P>0,05). Em conclusão, o cultivo de pré-MIV de oócitos bovinos por 8h com 100nM NPPC não bloqueou a retomada da meiose, mas a progressão da meiose ocorreu de forma mais lenta e impediu o envelhecimento e degeneração dos oócitos. O cultivo de oócitos por tempo prolongado (30h) na ausência de NPPC foi prejudicial para o desenvolvimento embrionário, mas o tratamento com NPPC (8h pré-MIV+22h MIV = duração total de 30h) reverteu parcialmente este índice. / The aim of this study was to evaluate the effect of the C-type natriuretic peptide precursor (NPPC) during pre in vitro maturation culture (pre-IVM) of bovine oocytes on: 1) nuclear maturation progress; 2) gene expression in cumulus cells and 3) acquisition of competence for in vitro embryo development. Cumulus oocyte complexes (COCs) were pre-IVM with 100 nM NPPC for 8 hours (NPPC group) and then were washed for the complete removal of NPPC and submitted to IVM for 22h. After 8h pre-IVM followed by 22h IVM (total culture time = 30h) oocytes were evaluated for nuclear maturation progress and cumulus cells for relative mRNA expression. Control group (C) was IVM in the absence of NPPC for up to 30h and the same evaluations were made immediately after follicle removal (C0) and after 8h (C8), 22h (C22) and after 30h of culture (C30). In another experiment with the same treatment, the oocytes were fertilized at the end of IVM and embryo development to the blastocyst stage was evaluated. After 8 hours of pre-IVM culture, meiosis progression analysis showed 58.9% of oocytes in GV1 configuration in C0, while C8 had only 13.9% (P<0.05). The GV1 rates in NPPC did not differ from any group (22.8%; P>0.05). On the other hand, C8 showed higher rates of GV3 in comparison with C0 (53.1% vs. 3.62%; p<0.05) and no differences compared to NPPC (38.7%; P<0.05). At the end of IVM culture, no differences between groups (C22 vs. NPPC vs. C30) were observed in nuclear maturation, however, higher rates of degenerated oocytes were observed in C30 in comparison with C22 (11.4% vs. 2.8%; P<0.05). The relative gene expression analysis in cumulus cells after 8h pre-IVM with NPPC showed an up-regulation in genes related to cumulus cells expansion (GREM1, PTGS2/COX2, PTX3, TNFAIP6 and VCAN), oocyte maturation (BDNF, EGFR, NOS3, PDE5A, PRKCD e STAT3) and embryo development (IGF1R, KRT8 and LUM). At the end of IVM culture, the cumulus cells expansion related gene, PTX3, the oocyte maturation genes, AREG and BDNF, and the embryo development gene, LUM, were up-regulated in NPPC in comparison with C30 (p<0.05). Regarding embryo development, the cleavage rates did not differ in experimental groups (mean around 73,22%). Besides, blastocyst rates did not differ between NPPC (P>0.05) and the other groups, but there was a difference between C22 and C30 (69.3 vs. 37.4%; P<0.05). There was no difference between the groups in total cell number (blastomeres) and apoptotic cells (P<0.05). In conclusion, the pre-IVM culture of bovine oocytes for 8h with 100nM NPPC did not block meiosis resumption, but meiosis progression occurred more slowly and prevented aging and degeneration of the oocytes. The prolonged time of oocyte culture (30h) in the absence of NPPC was detrimental to embryo development, but NPPC treatment (8h pre-IVM + 22h IVM = total duration of 30h) partially reversed this effect.

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico detectado em vários tipos celulares como células endoteliais, neurônios e macrófagos, desempenhando também funções variadas como vasodilatação, neurotransmissão e indução de morte celular. O NO é gerado pela atividade da enzima óxido nítrico sintase (NOS), a qual foi detectada em vários órgãos incluindo o sistema reprodutor. O sistema NOS/NO parece desempenhar papel importante na maturação oocitária entre outras funções. No entanto, apesar das evidências, há poucos estudos sobre o possível papel desse sistema em oócitos da espécie bovina. O presente estudo teve por objetivo investigar a importância do sistema NOS/NO na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos. Para isso, foram avaliados os efeitos da inibição da NOS durante a MIV na presença de concentrações crescentes do inibidor de NOS (L-NAME, 0-1mM) e do aumento do NO durante a MIV na presença de concentrações crescentes do doador de NO (SNAP, 0-1mM) sobre a taxa de maturação (metáfase II) e formação de blastocistos após a fecundação in vitro. Também foi avaliado o efeito da pré-maturação com butirolactona (10µM BLI), seguida de MIV, na presença ou não de doador ou inibidor de NO em cada fase de cultivo, sobre o desenvolvimento de blastocistos. Após 22h de MIV os grupos tratados com L-NAME apresentaram uma taxa de metáfase II (MII) inferior (~80%, P<0,05) ao controle (95,5%). A taxa de blastocisto foi similar entre os grupos (34 a 41,5%, P>0,05). Apenas 7,2% (P<0,05) dos oócitos maturados com a maior concentração de SNAP (10-3M), atingiram o estádio de MII. Os demais tratamentos (71,6; 72,4 e 54,8% para controle, 10-7 e 10-5M, respectivamente) não diferiram entre si (P>0,05). Altos níveis de SNAP (10-3M) bloquearam o desenvolvimento embrionário, enquanto os demais tratamentos apresentaram cerca de 38% de blastocistos (P>0,05). As taxas de blastocistos (26,3 a 34,1%) e de eclosão (14,8 a 22,0%) adicionando ou não L-NAME em baixa concentração (10-7M) durante a pré-maturação, a maturação ou ambas as fases foram similares (P>0,05). Também não houve diferença (P>0,05) na taxa de blastocistos (25,5 a 39,7%) com a adição ou não de baixa concentração de SNAP (10-7M) durante a pré-maturação, a maturação ou ambas as fases. O grupo com SNAP (10-7M) na pré-maturação e MIV superou a taxa de eclosão (27,5%, P<0,05) dos demais grupos que tiveram SNAP adicionado somente no bloqueio, na MIV ou sem adição de SNAP (14,2 a 18,6 %, P>0,05). Esses resultados exibiram o duplo efeito do NO sobre oócitos bovinos, que tiveram a maturação reduzida com a inibição da síntese de NO e a maturação nuclear e citoplasmática bloqueadas pelo excesso de NO. / Nitric oxide (NO) is a chemical messenger detected in several cell types such as endothelial cells, neurons and macrophages, performing also varied functions as vasodilatation, neurotransmission and induction of cell death. NO is generated by the activity of the enzyme nitric oxide synthase (NOS), which has been detected in several organs including the reproductive system. The NOS/NO system seems to play an important role in oocyte maturation besides other functions. However, despite the evidence, there are few studies on the possible role of this system in bovine oocytes. The present study aimed to investigate the importance of the NOS/NO system on in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes. The effects of NOS inhibition during IVM in the presence of increasing concentrations of NOS inhibitor (L-NAME, 0-1mM) and of the increase in NO during IVM with the NO donor SNAP (0-1mM) on maturation rates (metaphase II) and on blastocyst development after in vitro fertilization were assessed. The effect of prematuration with butyrolactone I (10µM BLI) followed by IVM, in the presence or not of NO inhibitor or donor in each culture period on blastocyst development was also investigated. After 22h IVM, L-NAME treated groups showed a lower (~80%, P<0.05) metaphase II (MII) rate when compared with controls (95.5%). Blastocyst rates were similar among all groups (34 to 41.5%, P>0.05). Only 7.2% (P<0.05) of oocytes matured with the highest SNAP concentration (10-3M) reached MII. The other treatments (71.6; 72.4 and 54.8% for control, 10-7 and 10-5M, respectively) were similar among them (P>0.05). High SNAP concentration (10-3M) blocked blastocyst development, while the other treatments presented about 38% blastocyst rates (P<0.05). Blastocyst (26.3 to 34.1%) and hatching rates (14.8 and 22.0%) were similar (P>0.05) when low L-NAME concentration (10-7M) was added or not during prematuration, maturation or both. Blastocyst rates (25.5 to 39.7%) were also similar (P>0.05) whether SNAP (10-7M) was added or not during prematuration, IVM or both. When low concentration of SNAP (10-7M) was added during both prematuration and IVM, hatching rates were increased (27.5%, P<0.05) when compared with oocytes cultured in the presence of SNAP only during prematuration or IVM or without it (14.2 to 18.6 %, P>0.05). These results shoe the dual effect of NO on bovine oocytes, which had maturation rates decreased when NO synthesis was inhibited and nuclear maturation and blastocyst development were blocked by excess NO.

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico gerado pela atividade da enzima óxido nítrico sintase (NOS) a qual foi detectada em vários órgãos incluídos os do sistema reprodutor e parece estar envolvido na maturação oocitária. No entanto, há poucos estudos sobre o papel desse sistema em oócitos da espécie bovina. Sabe-se que o NO atua pela via da guanilato ciclase (GC) estimulando a produção do nucleotídeo GMPc, que por sua vez é capaz de influenciar nos níveis de outro nucleotídeo (AMPc) via fosfodiesterases (PDE). O AMPc é um importante elemento da via de sinalização do FSH nos complexos cumulus-oócitos e no controle da maturação oocitária. O objetivo do presente projeto foi investigar a influência do FSH na via do NOS/NO e seus componentes em oócitos bovinos maturados in vitro e o envolvimento das células do cumulus (CC) na via de sinalização. Para tanto, complexos cumulus-oócito (CCO) e oócitos desnudos (OD - maturados sem células do cumulus) foram maturados in vitro por 24h na presença ou ausência de FSH. As amostras foram avaliadas quanto a: 1) taxa da maturação nuclear; 2) níveis de produção de NO; 3) níveis de AMPc e GMPc; 4) abundância relativa de RNAm de NOS2, PDE5A, PDE6C, PKG1, PKG2, ADCY6, ADCY9, PDE3A e PKA1. O FSH, na concentração de 0,05UI/mL, estimulou positivamente a maturação nuclear em CCO e OD, com 80,6 e 89% de oócitos maturados, respectivamente. Quando comparados diretamente os grupos CCO e OD, o FSH não influenciou as taxas de maturação (71 e 71,3%, p>0,05), nem os níveis de produção de NO (12,8 e 7,4 µM/mL, p>0,05). Os níveis de GMPc em CCO aumentaram após 1 e 3 h de MIV na presença de FSH (266,3 e 187,2 pmol/pool com FSH e 240,5 e 168,5 pmol/pool sem FSH, respectivamente, p<0,05). Após 6 h os níveis de GMPc declinaram de forma mais acentuada no grupo sem FSH (46,3 e 106,9 pmol/pool, com e sem FSH, respectivamente, p<0,05). Os níveis de AMPc em CCO também foram mais elevados na presença de FSH à 1 e 3 h de MIV (7,60 e 7,81 pmol/pool, respectivamente) em comparação com CCO maturados sem FSH (0.30 e 0,76 pmol/pool, respectivamente, p<0,05). Após 6h, os níveis declinaram e foram similares para ambos os grupos (0,43 pmol/pool, p>0,05). Em relação à expressão dos genes selecionados, todos foram detectados nos oócitos (CCO e OD), porém, em células do cumulus, foram detectados apenas PDE5A, ADCY6, ADCY9 e PKA1. Quando observados os resultados do grupo CCO, apenas os genes PKG1, ADCY6 e PDE3A sofreram influência do FSH (p<0,05), apresentando um aumento destes transcritos. No grupo OD, apenas o gene PKG1 sofreu influência do FSH, também apresentando um aumento destes transcritos (p<0,05). Em células do cumulus, os genes ADCY6 e ADCY9 sofreram influência do FSH, sendo que para a ADCY6 provocou um aumentos destes transcritos, e para a ADCY9 provocou uma queda dos mesmos (p<0,05). Em conclusão, o FSH pode exercer influência positiva na maturação nuclear de oócitos bovinos, agindo sobre os níveis de GMPc e AMPc, mas não sobre o NO. O FSH pode influenciar a expressão gênica em oócitos e em células do cumulus de bovinos. / Nitric oxide (NO) is a chemical messenger generated by the nitric oxide synthase (NOS) enzyme, which was detected in several organs including the reproductive system and appears too involved in oocyte maturation. However, there are few studies on the role of this system in bovine oocytes. NO is known to act via guanylate cyclase (GC) stimulating the production of the nucleotide cGMP, which in turn is capable of influencing the levels of another nucleotide, cAMP via phosphodiesterases (PDE). cAMP is an important factor in FSH signaling in cumulus-oocyte complexes (COC) for the control of maturation. The aim of the present work was to investigate the influence of FSH on the NOS/NO pathway and its components in bovine oocytes matured in vitro and the involvement of cumulus cells (CC) in the signaling pathway. COC and denuded oocytes (DO - matured without cumulus cells) were matured in vitro for 24 h with or without FSH. Samples were assessed for: 1) maturation rate; 2) levels of NO production; 3) levels of cGMP and cAMP; 4) relative abundance for mRNA of NOS2, PDE5A, PDE6C, PKG1, PKG2, ADCY6, ADCY9, PDE3A and PKA1. FSH positively stimulated oocyte maturation at 0.05UI/mL concentration for both COC and OD (80.6 and 89% maturation rates, respectively). When COC and OD were compared directly, FSH did not affect maturation rates (71 and 71.3%, p>0.05) nor NO production levels (12,8 and 7,4 µM/mL), p>0.05). cGMP levels increased after 1 and 3 h in vitro maturation (IVM) with FSH (266.3 and 187.2 pmol/pool with FSH and 240.5 and 168.5 pmol/pool without FSH, respectively, p<0.05). After 6 h IVM, cGMP levels in COC declined more in the group cultured with FSH (46.3 and 106.9 pmol/pool, with and without FSH, respectively, p<0.05). cAMP levels in COC were also increased in the presence of FSH at 1 and 3 h IVM (7.60 and 7.81 pmol/pool, respectively) in comparison to COC cultured without the hormone (0.30 and 0.76 pmol/pool, respectively, p<0.05). After 6 h, the levels declined and were similar for both groups (0.43 and 0.02 pmol/pool, p>0.05). Regarding mRNA expression for the selected genes, all of them were detected in oocytes, but only four of them were detected in cumulus cells: PDE5A, ADCY6, ADCY9 and PKA1. For COC only PKG1, ADCY6 and PDE3A were influenced by FSH (p<0.05), with an increase in transcript relative abundance, For DO, only PKG1 was influenced by FSH and also showed an increase in these transcripts (p<0.05). In cumulus cells, ADCY6 and ADCY9 were affected by FSH, with an increase for ADCY6 and a decrease in ADCY9 transcripts (p<0.05). In conclusion, FSH may positively influence nuclear maturation, acting on cGMP and cAMP levels, but not on NO. FSH may also influence gene expression in bovine oocytes and cumulus cells.

The aim of the present study was to evaluate the action of angiotensin II (Ang II), insulin-like growth factor-I (IGF-I) and insulin (Ins) on bovine oocyte nuclear and cytoplasmic maturation with follicular cells. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were cultured for 22 h with follicular cells and Ang II, IGF-I or Ins. In this experiment, two control groups were used, where the oocytes were cultured with (control with cells) or without (control without cells) follicular cells. Two experiments were performed with these five groups, in the presence or absence of LH and FSH. Only the oocytes cultured in the Ang II group (88.2±1.8 and 90.7±4.3%), respectively without and with LH/FSH) had resumption of meiosis in similar rates than those cultured in the absence of follicular cells (89.7±0.3 and 92.6±2.6; P<0.01). In a second experiment, the action of Ang II and its association with IGF-I or insulin on oocyte meiotic maturation was observed for 7 (germinal vesicle breakdown - GVBD), 12 (metaphase I - MI) and 22 (metaphase II - MII) hours, in a similar experimental design of the previous experiment. The Ang II, Ang II + IGF-I and Ang II + Ins, independent of gonadotrophins, were able to overturns the inhibition of meiotic maturation caused by follicular cells, in the same rates of control group without cells, in the three evaluated period (P<0.01). One last study was performed to investigate the effect of follicular cells, Ang II, IGF-I, Ins and its associations during oocyte maturation on the rate of subsequent embryo development. The oocytes were submitted to maturation similarly to the second experiment for 1 h (1+23 h), 12 h (12+12 h) or 24 h in the presence of follicular cells and its respective treatments + the period to complete 24 h in maturation media. In 1 + 23 h, the cleavage, blastocyst and hatching rates were not different among these five groups. In 12 + 12 h, the oocytes matured in the Ang II + IGF-I group developed into blastocyst (43.8±0.6) and hatching/total oocytes (17.1±1.2) in a higher rates than the others treatments (P<0.05). In 24 h, the association of Ang II + IGF-I improved blastocyst rate in comparison to the others treatments with follicular cells (P<0.05). Also, only in this group hatched blastocysts were obtained after 24 h in the presence of follicular cells. In conclusion, Ang II overturned the inhibitory effect on bovine oocyte nuclear maturation caused by follicular cells, independent of the presence of gonadotrophins, IGF-I and insulin. However, the oocyte cytoplasmic maturation evaluated through embryo development was improved when the Ang II and IGF-I were presents in maturation media with follicular cells for 12 + 12 hours. / O objetivo do presente estudo foi de avaliar a ação da angiotensina II (Ang II), fator-I de crescimento semelhante à insulina (IGF-I) e insulina (Ins) na maturação nuclear e citoplasmática de oócitos bovinos na presença de células foliculares. Os complexos cumulus-oócitos (CCOs) foram cultivados por 22 h na presença de células foliculares e Ang II, IGF-I ou Ins. Nesse experimento, foram utilizados dois grupos controles, onde os oócitos foram cultivados na presença (controle com células) ou na ausência (controle sem células) de células foliculares. Dois experimentos foram realizados com esses cinco grupos, sendo um com e outro sem adição de LH e FSH. Somente os oócitos cultivados no grupo Ang II (88,2±1,8 e 90,7±4,3%, respectivamente sem e com LH/FSH) reiniciaram a meiose em índices similares àqueles cultivados na ausência de células foliculares (89,7±0,3 e 92,6±2,6; P<0,01). Em um segundo experimento, foi avaliada a ação da Ang II e sua associação ao IGF-I ou insulina na maturação de oócitos por 7 (rompimento da vesícula germinativa - RVG), 12 (metáfase I - MI) e 22 (metáfase II - MII) horas, em um delineamento similar ao do experimento anterior. A Ang II, Ang II + IGF-I e Ang II + Ins, independente de gonadotrofinas, foram capazes de reverter a inibição da maturação causada pelas células foliculares, nos mesmos níveis do grupo controle sem células (P<0,01), nos três horários estudados. Um último experimento foi realizado para avaliar o efeito das células foliculares, Ang II, IGF-I, Ins e suas associações durante a maturação de oócitos sobre o índice de desenvolvimento embrionário subseqüente. Os oócitos foram maturados em grupos similares aos do segundo experimento por 1 h (1+23 h), 12 h (12+12 h) ou 24 h na presença de células foliculares e seus respectivos tratamentos + o período para completar 24 h em meio de maturação. Em 1 + 23 h, não houve diferença nos resultados de clivagem, blastocistos e eclosão entre os cinco grupos. No sistema 12 + 12 h, os oócitos no grupo Ang II + IGF-I atingiram índices de blastocistos (43,8±0,6) e eclosão/total de oócitos (17,1±1,2) superiores aos outros tratamentos (P<0,05). Em 24 h, a associação de Ang II + IGF-I obteve maiores índices de blastocistos em comparação aos demais tratamentos contendo células foliculares (P<0,05). Somente nesse grupo foram obtidos blastocistos eclodidos após 24 h na presença de células foliculares. Em conclusão, a Ang II reverte o efeito inibitório da maturação nuclear de oócitos bovinos causado pelas células foliculares, independente da presença de gonadotrofinas, IGF-I e insulina. No entanto, a capacitação oocitária, medida pelo desenvolvimento embrionário, é superior quando a Ang II e IGF-I estão presentes em meios contendo células foliculares em cultivos de 12 + 12 horas.

Orientador: Fabíola Freitas de Paula Lopes / Resumo: A série de eventos desencadeados durante o período de maturação oocitária é muito susceptível ao estresse ambiental. Condições adversas tais como agentes pró-oxidantes e temperatura ambiente comprometem a função oocitária, reduzindo a capacidade de fertilização e o posterior desenvolvimento embrionário. O efeito negativo do estresse térmico sobre a fertilidade de bovinos já foi bem caracterizado. Entre os efeitos celulares do estresse térmico no oócito bovino podemos destacar a desorganização do citoesqueleto, aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), danos mitocondriais e ativação da morte celular por apoptose. Um efeito conservado do choque térmico em diferentes tipos celulares é a desnaturação de proteínas, ativando mecanismos de proteção no citoplasma celular e no retículo endoplasmático (RE) para manutenção da proteostasis. O RE funciona como sensor de estresse ambiental ativando a Unfolded Protein Response (UPR), podendo desencadear autofagia e/ou apoptose, dependendo da intensidade do estresse. Apesar da importância do RE para a função oocitária, os efeitos do choque térmico nesta organela nunca foram investigados. Portanto, os objetivos gerais desta dissertação foram determinar o papel do estresse do RE na função de oócitos bovinos submetidos ao choque térmico (Capítulo 2) e o papel da autofagia na expressão gênica e competência de desenvolvimento de oócitos bovinos submetidos a choque térmico durante a maturação in vitro (MIV) (Capítulo 3). Para os ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The series of events triggered during the oocyte maturation is very susceptible to environmental stress. Adverse conditions such as pro-oxidant agents and environmental temperature compromise oocyte function, reducing fertilization capacity and subsequent embryonic development. The negative effect of heat stress on bovine fertility has been well characterized. Among the cellular effects of heat stress on bovine oocytes, one can highlight cytoskeletal disorganization, increased production of reactive oxygen species (ROS), mitochondrial damage, and activation of cell death by apoptosis. A conserved effect of heat shock on different cell types is protein denaturation, activating protection mechanisms in the cytoplasm and endoplasmic reticulum (ER) to maintain proteostasis. The ER acts as an environmental stress sensor activating Unfolded Protein Response (UPR), which can trigger autophagy and/or apoptosis, depending on the intensity of the stress. Despite the importance of ER for oocyte function, the effects of heat shock on this organelle have never been investigated. Therefore, the general objectives of this dissertation were to determine the role of ER stress on function of bovine oocytes submitted to heat shock (Chapter 2) and the role of autophagy on gene expression and developmental competence of bovine oocytes submitted to heat shock during in vitro maturation (IVM) (Chapter 3). For the ER studies, cumulus-oocyte complexes (COCs) were initially distributed in the followin... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre