A qualidade do oócito é um fator limitante na fertilidade das fêmeas e reflete seu intrínseco potencial ao desenvolvimento embrionário subsequente. As alterações moleculares e bioquímicas no processo de maturação dos oócitos são necessárias para permitir a fecundação destes. Sob influência das gonadotrofinas, uma cascata de eventos é desencadeada, alterando a expressão gênica e a estrutura dos folículos. A maturação ocorre pelo intercâmbio entre o oócito e as células do cumulus que irão fornecer fatores para o desenvolvimento do oócito e criar o microambiente necessário para garantir o sucesso na maturação. A ação do FSH sobre a retomada da meiose ocorre, possivelmente, por ativação da proteína quinase C (PKC). A via de sinalização desta proteína parece estar envolvida na ativação da quinase ativada por mitógeno (MAPK) em oócitos e células do cumulus, na maturação induzida por FSH e LH, além de regular a síntese do Fator de Crescimento Epidermal (EGF). Deste modo, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a ação da PKC na maturação de oócitos bovinos e se esta ativação envolve o EGF. Para tal foram realizados dois experimentos. Em ambos, a progressão do ciclo celular foi avaliada utilizando a sonda fluorescente Hoechst 33342. A expansão das células do cumulus foi avaliada utilizando-se o software Image Pro Plus 5.1 para análise das imagens dos oócitos geradas em microscópio Olympus IX81. O maior diâmetro de cada complexo cumulus oócito foi adotado como parâmetro de mensuração da expansão. A dosagem de progesterona do meio de cultivo foi realizada pela técnica de RIA. A ativação da PKC e da MAPK foi avaliada pela técnica de Western blot. Os dados foram avaliados pelo software SigmaPlot versão 12.2 e submetidos ao teste de normalidade (Shapiro-Wilk). Quando necessário, os dados foram transformados. Para comparação entre dois tratamentos, utilizou-se o teste t-student. Para mais de dois tratamentos foi realizada análise de variância e teste de comparação de médias (TUKEY), considerando-se 0,05 para rejeitar a hipótese de nulidade. No experimento 1 foi avaliado se a ativação da PKC foi estimulada por gonadotrofinas. Os oócitos foram maturados in vitro tratados com gonadotrofinas, na presença ou ausência do inibidor de PKC. A presença do inibidor de PKC diminuiu as taxas de quebra de vesícula germinativa e a expansão das células do cumulus, sem alterar a esteroidogênese. Estes resultados demonstram que a PKC participa da via de sinalização da retomada da meiose. No experimento 2 foi avaliado se o EGF está envolvido na via regulada pela PKC. Os oócitos foram maturados in vitro, na presença ou ausência de LH e FSH, do inibidor de PKC e do EGF. O EGF foi capaz de reverter os efeitos do inibidor de PKC, aumentando as taxas de quebra de vesícula germinativa e a expansão de células do cumulus. Não foi possível detectar, nas condições deste experimento, a ativação das proteínas PKC e MAPK através do Western Blot. Este trabalho permite concluir que a via de sinalização da maturação de oócitos bovinos envolve a PKC e sugere a participação do EGF nesta via. / Oocyte quality is a limiting factor in female fertility and reflects its potential to the subsequent embryonic development. Molecular and biochemical alterations during the oocyte maturation process are needed to allow fecundation. Under gonadotropin influence, cascade of events occurs changing gene expression and follicle structure. Maturation depends on the interaction between oocyte and cumulus cells interaction, which provides factors for oocyte development and create the ideal microenvironment for the success of the maturation process. The FSH stimulation of meiosis resumption probably occurs through PKC activation. The signaling pathway of PKC might be involved by the mitogen activated protein kinase (MAPK) in oocytes and cumulus cells during FSH-LH induced maturation. Furthermore, MAPK regulates the epidermal growth factor (EGF) synthesis. The aim of the present study was to evaluate PKC function during bovine oocyte maturation and if its activity involves EGF. Two experiments were performed. In both experiments, the cell cycle progression was analyzed by Hoechst 33342 fluorescent dye. The cumulus cells expansion was performed using software Image Pro Plus 5.1 by the analysis of oocyte images taken in Olympus IX81 microscope. The highest diameter of each cumulus oocyte complex was recorded as the expansion value. The RIA and Western Blot techniques were used to measure progesterone concentration in the culture media and the PKC and MAPK activity, respectively. Data was analyzed by SigmaPlot software, version 12.2. The Shapiro-Wilk test was used to assess for normality and, when needed, the data was transformed. Student t tests were carried out to compare two treatments. Differences between more than two means were assessed by analysis of variance followed by Tukey test, considering P-value lower than 0.05 as statistically significant. Experiment 1 studied whether PKC function was stimulated by gonadotropins. FSH and LH were used for oocyte maturation in vitro, with or without PKC inhibitor. The presence of PKC inhibitor decreased germinal vesicle breakdown and the cumulus cells expansion, but did not alter the steroidogenesis. These results show that PKC participates in the signaling pathway of meiosis resumption. The Experiment 2 evaluated whether EGF influences PKC signaling pathway. The oocytes were matured in vitro, in the presence or absence of LH and FSH, PKC inhibitor and EGF. Epidermal Growth Factor was able to reverse PKC inhibitor effects, increasing germinal vesicle breakdown rates and cumulus cells expansion. The Western Blot technique was not able to detect PKC and MAPK activity, considering the conditions of this study. In conclusion, PKC is involved in the signaling pathway of bovine oocytes maturation and its pathway is mediated by EGF.

A transição materno-embrionária é um fenômeno complexo caracterizado pela iniciação da transcrição no embrião e a substituição do mRNA materno pelo mRNA embrionário. O mRNA e as proteínas estocadas no oócito são utilizados nas primeiras clivagens e, posteriormente, o embrião deve iniciar a transcrição dos genes necessários ao seu desenvolvimento, que ocorre no estádio de oito células em embriões bovinos. Nesta etapa, podem ser observados embriões competentes a continuar o desenvolvimento, enquanto embriões incompetentes sofrem bloqueio. Pelo fato do bloqueio ocorrer na fase de ativação do genoma embrionário, formulou-se a hipótese de que o bloqueio estaria associado a genes transcritos neste momento, contrariamente à hipótese mais aceita de bloqueio passivo. O objetivo deste trabalho foi de identificar, categorizar e avaliar transcritos diferencialmente expressos entre embriões bovinos de desenvolvimento rápido e lento, além de elucidar possíveis vias de sinalização de morte ou sobrevivência celular. Para isso, foi feita uma hibridação em membrana de macro arranjo contendo genes humanos relacionados a ciclo celular, hibridada com aRNA marcado radioativamente oriundo de embriões bovinos produzidos in vitro de acordo com sua velocidade de desenvolvimento, seguido por RT-PCR e análise de vias de sinalização para validação da hibridação. A média de similaridade entre estes genes humanos e bovinos de 89,3%. Pelas membranas de macro arranjos foram identificados 120 genes com modulação diferencial entre embriões lentos e rápidos, sendo 100 genes com regulação superior nos embriões lentos. Entre os genes com modulação positiva nos embriões rápidos, 40% foram primariamente identificados como ligantes a proteínas e 25% têm atividade catalítica, com resultados similares no grupo de genes com modulação positiva nos embriões lentos. Por um lado, as diferenças de transcrição entre embriões de desenvolvimento rápido e lento não foram confirmadas pelo RTPCR. Mas os genes diferencialmente modulados estão associados e constitutivamente presentes em algumas vias de sinalização para morte celular. Os resultados sugerem que a ativação do genoma embrionário é necessária para a sinalização de vias de sobrevivência ou morte celular programada. Assim, o bloqueio do desenvolvimento não é um processo passivo, mas sim um processo ativo de transcrição de genes, ativando tanto a cascata de sobrevivência quanto a cascata de morte em embriões com baixo potencial de desenvolvimento. / Maternal-zygotic transition is a complex phenomenon characterized by the initiation of transcription in the embryo and the transition of maternal mRNA with embryonic mRNA. It is believed that the mRNAs and proteins synthethized by the oocyte during its growth and final maturation allow the zygote to develop during the early stages of embryo development up to the 8 cell-stage, the moment when the bovine embryo acquires transcriptional competence. Competent embryos are able to develop until blastocyst, while incompetent embryos block. Since the blockage occurs during embryo genome activation, we developed the hypothesis that gene transcription in incompetent embryos is associated with the blockage, instead of passive blockage. The aim of this work was to identify, categorize and analyze gene expression differences between fast cleavage and slow cleavage embryos, and discover possible signaling pathways to cell death or cell survival. We used a macroarray membrane spotted with human genes related to cell cycle and hybridizated with a radioactive labeled aRNA from fast or slow in vitro produced embryos. Real-time PCR and signaling pathways analysis were designed for further validation of the array. The mean similarity between human and bovine genes was 89,3%. According to the array membranes, it was possible to identify 120 genes differentially expressed between slow and fast cleavage embryos. Hence, the majority of the genes were more expressed in slow embryos (100 genes versus 20 genes in fast group). Among genes more expressed at fast embryos, 40% were identified as protein binding and 25% have catalytic activity, with similar results in slow embryos. In one hand, differences between fast and slow embryos transcripts were not confirmed by real-time PCR analysis. But on the other hand, the differentially expressed genes are somehow related to and constitutively present in some recognized death pathways. Together, these results presented herein suggest that embryonic genome activation is necessary for survival or cell death signaling. Moreover, developmental block is not a passive pathway, but rather a very active transcriptional pathway, leading to activation of cell survival genes prior to genes related to death in slow-developing embryos.

A fecundação resulta no aumento intracelular de cálcio que é necessário para a transição do oócito até o estádio de zigoto. Os eventos que ocorrem durante esta transição são caracterizados como ativação, sendo estes dependentes de cálcio. Entretanto, os eventos bioquímicos que ocorrem durante a ativação ainda não estão completamente elucidados. A proteína quinase C (PKC) e a proteína quinase dependente de cálcio/calmodulina (CaMKII), por apresentarem atividade durante a fecundação e por serem ativadas por cálcio são implicadas na regulação dos eventos da ativação. Entretanto, existem muitas dúvidas sobre o real papel destas proteínas na ativação do oócito. Deste modo, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o papel da PKC e da CaMKII na ativação de oócitos bovinos. Para tal, oócitos bovinos maturados in vitro foram ativados partenogeneticamente (AP) com cálcio ionóforo A23187 (5μM) por 5 minutos, sendo a retomada da meiose, a organização do citoesqueleto e do retículo endoplasmático (RE) avaliada 1 hora após a ativação. No experimento 1 foi avaliado o papel da CaMKII nestes eventos. Os oócitos foram AP na presença ou ausência de 100M do inibidor de CaMKII (Autocamtide-2 Related Inhibitory Peptide, Myristoylated). A inibição da CaMKII não afetou a retomada da meiose e nem a distribuição dos RE, após a AP. Entretanto, não ocorreu a rotação do fuso meiótico no estádio de telófase II quando a CaMKII foi inibidada. Estes resultados demonstram que embora a CaMKII não tenha efeito na retomada da meiose, esta proteína participa na progressão do ciclo celular de oócitos bovinos, após a AP. No experimento 2 foi avaliado o papel da PKC em oócitos bovinos AP. Os oócitos foram ativados partenogeneticamente na presença ou ausência de 10μM do inibidor de PKC (Bisindolymaleimide I). A inibição da PKC não afetou a retomada da meiose e nem a progressão pelo ciclo celular até o estádio de telófase II. Entretanto, a organização do RE foi afetada pela inibição da PKC. Resultado semelhante foi obtido quando os oócitos foram ativados na presença de citocalasina C, um despolimerizador de filamentos de actina. O presente experimento demonstra a participação da via PKC-actina na organização do RE na ativação de oócitos bovinos. / The intracellular calcium increase resulting from fertilization is necessary for oocyte transition to zygote. The events that occur during this transition are characterized as activation, which are dependent on calcium. However the biochemical events that occur during this activation are still not fully elucidated. The protein kinase C (PKC) and the calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII), are involved in regulating the events of activation, since these proteins have activity during fertilization and are activated by calcium. However there are many doubts about the real role of these proteins in the oocyte activation. Thus, the objective of this study was to evaluate the role of PKC and CaMKII in bovine oocyte activation. For this purpose, in vitro matured bovines oocytes were parthenogenetically activated (PA) by using calcium ionophore A23187 (5μM) for five minutes, and the resumption of meiosis, the cytoskeleton organization and the endoplasmic reticulum (ER) organization were evaluated 1 hour post-activation. In experiment 1, were evaluated the role of CaMKII in these events. The oocytes were PA in the presence or absence of 100M of CaMKII inhibitor (Autocamtide-2 Related Inhibitory Peptide, Myristoylated). The inhibition of CaMKII did not affect the meiosis resumption and the ER after the PA. However, there was no spindle rotation at telophase II stage when the CaMKII was inhibited. These results showed that although the CamKII has no effect on resumption of meiosis, it participates in the regulation of cell cycle progression after PA of bovine oocytes. In experiment 2, was evaluated the role of PKC on PA bovine oocytes. The oocytes were parthenogenetically activated in the presence or absence of 10μM of PKC inhibitor (Bisindolymaleimide I). The PKC inhibition did not affected the resumption of meiosis and the progression through the cell cycle until the stage of telophase II. However, the ER organization was affected by PKC inhibition. A similar result was obtained when the oocytes were activated in the presence of cytochalasin C, which promotes the depolymerization of the actin filaments. The current experiment showed the participation of the PKC-actin pathway at the ER organization in the bovine oocytes activation.

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico gerado pela atividade da enzima óxido nítrico sintase (NOS) a qual foi detectada em vários órgãos incluído o sistema reprodutor. O sistema NOS/NO parece desempenhar papel importante na maturação oocitária entre outras funções. No entanto, apesar das evidências, há poucos estudos sobre o papel desse sistema em oócitos da espécie bovina. Sabe-se que o NO atua pela via da guanilato ciclase (GC) estimulando a produção do nucleotídeo GMPc, que por sua vez é capaz de influenciar os níveis de outro nucleotídeo, o AMPc, que é um importante elemento da via de sinalização das gonadotrofinas nos oócitos e no controle da maturação oocitária. O objetivo do presente estudo foi de investigar o envolvimento da via do GMPc na ação do sistema NOS/NO na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos e seu efeito sobre a via do AMPc. Com a maior concentração estudada do doador de NO (10-7M de SNAP), apenas 36% dos oócitos conseguiram alcançar o estágio de RVG (P< 0,05), após 9 horas de maturação. Esse atraso também foi observado com diferentes concentrações do estimulador de GC (5, 10 ou 50&mu;M de Proptoporfirina IX) e pelo análogo de GMPc (1, 2 e 4mM de 8-Br-GMPc ), que apresentaram uma taxa média de RVG de 50% para os tratamentos e 70% para os grupos controles sem as drogas (P<0,05). No início da maturação (0h), os níveis de GMPc foram de 5,29 pmol/oócito sofrendo uma queda logo na primeira hora de cultivo para 2,97 pmol nos oócitos do grupo controle e 1,54 pmol nos cultivados com associação de 10-7M de SNAP (doador de NO) e 100&mu;M de OQD (inibidor de GC (P<0,05). No grupo de oócitos cultivados apenas com SNAP, os níveis de GMPc se mantiveram em 4,51 pmol/oócito, semelhante ao grupo imaturo (0h de cultivo, P>0,05). O doador de NO manteve estável o nível de GMPc somente na primeira hora de maturação. Após 3 e 6 h de MIV, os níveis de GMPc permaneceram baixos e similares (0,07 a 2,46 pmol/oócito, P>0,05) nos grupos controle (sem drogas), tratado com doador de NO (10-7M de SNAP) associado ou não ao inibidor de guanilato ciclase (100&mu;M de OQD). Também foi observada uma queda nos níveis de AMPc em relação ao grupo imaturo (32,42 fmol de AMPc/oócito) para os demais grupos (P<0,05), que apresentaram aproximadamente, 12,0 a 16,0 fmol de AMPc/oócito durante a primeira hora, 3,3 a 8,0 fmol/oócito durante a terceira hora e 7,4 a 18,3 durante a sexta hora de maturação (P>0,05). O NO afetou os níveis de GMPc no início da maturação, mas não os níveis de AMPc. O NO e o GMPc podem atuar no controle da expressão gênica de uma série de proteínas envolvidas no controles dos níveis de AMPc e GMPc ou suas funções. Esse controle pode ser efeito direto do NO (PKG2, PDE3A, PDE4D e PDE8A), do GMPc (ADCY6) ou do NO via GMPc (PKA1) e varia com o compartimento considerado (oócito ou células do cumulus). Esses resultados demonstraram a inter-relação das vias NO/GMPc/AMPc e toda a sua complexidade dependendo do tipo celular e da fase da maturação de oócitos bovinos. / The NOS/NO system seems to play an important role in oocyte maturation besides other functions. However, despite the evidence, there are few studies on the possible role of this system in bovine oocytes. It is known that NO acts via guanylate cyclase (GC) by stimulating the production of the nucleotide cGMP, which in turn can influence the levels of another nucleotide, cAMP, which is an important element of the signaling pathway of gonadotropins in oocytes and in the control of oocyte maturation. The aim of the present study was to investigate the involvement of the cGMP pathway in the action of the NOS/NO system on the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes and its effect on the cAMP pathway. The highest studied concentration of the NO donor (10-7M SNAP), only 36% of oocytes were able to undergo GVBD (P<0.05) after 9 hours of maturation. This delay was also observed with different concentrations of the GC stimulator (5, 10 or 50&mu;M Proptoporfirin IX) and the cGMP analogue (1, 2 and 4 mM 8-Br-cGMP), which had an average of 50% GVBD for treatment groups and 70% for control groups without drugs (P<0.05). At the beginning of maturation (0 h) cGMP levels were 5.29 pmol/oocyte and decreased within the first hour of culture to 2.97 pmol and 1.54 pmol in the control group and in oocytes cultured in 10-7M SNAP (NO donor) associated with 100&mu;M OQD (GC inhibitor; P<0.05). In the group of oocytes cultured only with SNAP, cGMP levels remained at 4.51 pmol/oocyte similar to the immature group (0 h culture, P> 0.05). The increase of NO maintained cGMP levels stable only during the first hours of maturation. After 3 and 6 h IVM, cGMP levels remained low and similar (0.01 to 2.5 pmol/ ocyte, P>0.05) in control (without drugs), treated with NO donor (SNAP 10-7M) with or without the guanylate cyclase inhibitor (100&mu;M OQD). A decrease in cAMP levels was also observed when compared with the immature group (32.42 fmol cAMP/oocyte) for the other groups (P <0.05), which showed 12.0 to 16.0 fmol cAMP/oocyte after the first hour, 3.3 to 8.0 fmol/oocyte after the third hour and 7.4 to 18.3 after the sixth hour of IVM (P>0.05). NO and cGMP may act to control gene expression in a series of proteins involved in control of the levels of cAMP and cGMP or their functions. The control may be a direct effect of NO (PKG2, PDE3, PDE4D and PDE8A), cGMP (ADCY6) or NO via cGMP (PKA1) and varies with the compartment considered (oocyte or cumulus cells). The results showed the interrelationship of the NO/cGMP/cAMP pathway and all its complexity depending on the cell type and the stage of maturation in bovine oocytes.

Este estudo demonstrou que oócitos bovinos são capazes de progredir normalmente a maturação nuclear até a fase de M II quando cultivados in vitro na presença ou ausência de células da granulosa, na presença ou ausência de soro de vaca nas diversas fases do ciclo estral e/ou SFB e na presença de BSA. A progesterona promoveu um retardo na retomada da meiose, mas não impediu que os oócitos atingissem M II, exceto na concentração de 2,5 µg/ml. Além de promover um retardo inicial na retomada da meiose, a testosterona também prejudicou a progressão da meiose até M II. O estradiol também promoveu este retardo inicial, mas isto foi revertido no final da cultura, onde se verificou que quanto maior a concentração de estradiol até a dose de 5,0 µg/ml, maior a porcentagem de oócitos que atingiram M II. Porém, não se observou diferença significativa da porcentagem de oócitos que atingiram M II após maturação no grupo controle (TCM199 com BSA) e nos grupos onde se adicionou estradiol ao meio, em concentrações crescentes. Verificou-se que as células da granulosa e/ou células do cumulus foram capazes de secretar progesterona e estradiol no meio de cultura, quando estimuladas pelo soro bovino, que lhes forneceu precursores (testosterona). As células do cumulus dos COCs cultivados foram capazes de secretar progesterona quando estimuladas por BSA, SFB e estradiol e foram capazes de secretar estradiol quando estimuladas por BSA, progesterona e testosterona. O trabalho demonstrou que a MIV de oócitos bovinos ocorre normalmente na ausência de soro bovino e na ausência de células foliculares e demonstrou que a adição de estradiol não afeta a maturação e é desnecessária, uma vez que as células do cumulus o produzem no meio durante as 24 horas de cultura. / This study has demonstrated that culture medium supplementation with cycling cow serum and/or FCS, granulosa cells or BSA did not affect meiosis progression from GV to M II stage of bovine oocytes matured in vitro. Progesterone impaired meiosis resumption, but it was reverted after 24 hours of culture, except in the concentration of 2,5 µg/ml. Testosterone impaired meiosis resumption and meiosis progression to M II. Estradiol impaired meiosis progression, but it was reverted at the end of the culture, when it was observed that the higher the estradiol concentration in the medium, the higher the number of oocytes reaching M II. However, when IVM of bovine oocytes matured in medium supplemented with only BSA was compared to IVM of bovine oocytes matured in medium supplemented with BSA plus estradiol, no statistical difference was found. Data showed that granulosa cells and/or cumulus cells were able to produce progesterone and estradiol in the culture medium, when stimulated by bovine serum. Cumulus cells were able to produce progesterone when stimulated by BSA, FCS and estradiol and were still able to produce estradiol when stimulated by BSA, progesterone and testosterone. This study has demonstrated that IVM of bovine oocytes can proceed normally in the absence of bovine serum and granulosa cells, and has additionally demonstrated that the medium supplementation with estradiol did not affect nuclear maturation and it is still not necessary, once cumulus cells are able to produce it during the 24 hours of culture.

O objetivo deste estudo foi analisar as concentrações do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF1) e insulina (INS) no fluido folicular durante foliculogênese em éguas, e localizar o receptor tipo 1 de IGF (IGF1R) nas paredes foliculares. Durante a estação reprodutiva, 40 éguas mestiças enviadas para abate em matadouro, com idades variando entre 6 e 16 anos foram utilizadas. As éguas foram abatidas de forma humanitária. Os tratos reprodutivos internos foram recuperados dentro de 10 min após o abate, ovários de éguas cíclicas foram separados do resto do aparelho. As éguas foram classificadas em quatro grupos: G1 – Folículo ≤ 13,5 mm e CL identificável; G2 – Folículo de 13,6 - 22,5 mm e CL identificável; G3 – Folículo de 22,6 - 31,5 mm e CL identificável; G4 – Folículo ≥ 31,6 mm e CL difícil de identificar. O fluido folicular (FF) foi aspirado e armazenado a -80 ° C até a sua utilização. Após a punção do FF, um fragmento da porção ventral da parede folicular foi removido para realizar a imunohistoquímica para localização de receptores IGF1R. O IGF1 livre foi determinado por ensaio imunoradiométrico. A INS foi determinada por um radioimunoensaio de fase líquida. A concentração de IGF1 livre e INS no FF aumentou com o crescimento folicular (P < 0,05). O escore imunohistoquímico de IGF1R nas células da granulosa e da teca interna da parede folicular equina em diferentes grupos aumentou (P < 0,05) com aumento folicular. Concluímos que as concentrações de IGF1 livre e INS no FF e de IGF1R em paredes foliculares de éguas aumentam com o crescimento folicular durante a foliculogênese, dando evidência do papel importante do IGF1 e INS no desenvolvimento folicular, e uma interação entre ambos hormônios na fisiologia reprodutiva ovariana. Sendo a égua um modelo de pesquisa para estudos comparativos na dinâmica folicular para consideração em mulheres, a conclusão deste estudo pode ser aplicada, também, a humanos. / The aim of this study was to analyze free type 1 insulin-like growth factor (IGF1) and insulin (INS) concentrations in follicular fluid during folliculogenesis in mares, and to localize type 1 IGF receptor (IGF1R) on follicular walls. During the breeding season, 40 mixed-breed mares sent to slaughter at an abattoir, with ages ranging between 6 to 16 years were used. Mares were humanely slaughtered. Internal reproductive tracts were recovered within 10 min after slaughter; ovaries of cyclic mares were separated from the rest of the tract. Mares were categorized into four groups: G1 – Follicle ≤ 13.5 mm and CL identifiable; G2 – Follicle of 13.6 to 22.5 mm and CL identifiable; G3 – Follicle of 22.6 to 31.5 mm and CL identifiable; G4 – Follicle ≥ 31.6 mm and CL difficult to identify. The follicular fluid (FF) was aspirated and stored at -80°C until use. After puncture of the FF, a fragment of the ventral portion of the follicular wall was removed to perform immunohistochemistry to localize IGF1R receptors. Free IGF1 was determined by immunoradiometric assay. INS was determined by a liquid phase radioimmunoassay. The concentration of free IGF1 and INS in FF increased with follicle growth (P < 0.05). Immunohistochemical score of IGF1R on granulosa and internal theca cells from equine follicular wall on different groups increase (P < 0.05) with follicular raise. We conclude that free IGF1 and INS concentrations in FF and IGF1R in follicular walls of mares increase with follicular growth during folliculogenesis, giving evidence of important role of IGF1 and INS in follicular development, and an interaction between both hormones in ovarian reproductive physiology. As the mare is a model research for comparative studies in follicular dynamics for consideration in women, the conclusion of this study can be applied to humans also.

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O objetivo do presente estudo foi analisar a expressão gênica dos receptores de estrógeno (ER&alpha; e ER&beta;) e progesterona (PR) em oócitos e células do cumulus de cadelas nas diferentes fases do ciclo estral. Ovários de cadelas previamente avaliadas e submetidas à ovário-histerectomia foram fatiados, sob refrigeração, em PBS com 10% de SFB. No momento imediatamente pré-cirúrgico foi colhido sangue da cadela, que foi submetido posteriormente à dosagem de estradiol e progesterona. As cadelas foram agrupadas nas diferentes fases do ciclo estral de acordo com a avaliação prévia por colpocitologia, colposcopia e dosagem sérica de progesterona. Os oócitos recuperados após o fatiamento foram denudados mecanicamente. Oócitos e células do cumulus foram criopreservados separadamente e posteriormente foram submetidas a PCR em tempo real para quantificação relativa dos genes de interesse. A expressão gênica de ER&alpha;, ER&beta; e PR em oócitos e células do cumulus não foi diferente nas fases do ciclo estral. Foi possível, pela primeira vez, relatar a presença de ER&alpha; e ER&beta; em oócitos de cadelas. / The objective of the present study was to analyze the gene expression of estrogen (ER&alpha; and ER&beta;) and progesterone (PR) receptors in oocytes and cumulus cells on different phases of the estrous cycle in dogs. Ovaries from selected bitches were recovered after ovary-hysterectomy and sliced at low temperatures in PBS supplemented with 10% FCS. Immediately after surgery, blood samples were harvested for measurement of estrogen and progesterone serum concentration. Bitches were grouped within different phases of the estrous cycles, according to previous evaluation of colpocytology, colposcopy and serum progesterone levels. Oocytes recovered after slicing were mechanically denuded. Isolated oocytes and cumulus cells were cryopreserved and submitted to RT-PCR followed by a real time PCR for relative quantification of gene expression. Gene expression of ER&alpha;, ER&beta; and PR in oocytes and cumulus cells was not different among phases of the estrous cycles. For the first time it was possible to demonstrate ER&alpha; and ER&beta; in dog oocytes.

A qualidade do oócito é um fator limitante na fertilidade das fêmeas e reflete seu intrínseco potencial ao desenvolvimento embrionário subsequente. As alterações moleculares e bioquímicas no processo de maturação dos oócitos são necessárias para permitir a fecundação destes. Sob influência das gonadotrofinas, uma cascata de eventos é desencadeada, alterando a expressão gênica e a estrutura dos folículos. A maturação ocorre pelo intercâmbio entre o oócito e as células do cumulus que irão fornecer fatores para o desenvolvimento do oócito e criar o microambiente necessário para garantir o sucesso na maturação. A ação do FSH sobre a retomada da meiose ocorre, possivelmente, por ativação da proteína quinase C (PKC). A via de sinalização desta proteína parece estar envolvida na ativação da quinase ativada por mitógeno (MAPK) em oócitos e células do cumulus, na maturação induzida por FSH e LH, além de regular a síntese do Fator de Crescimento Epidermal (EGF). Deste modo, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a ação da PKC na maturação de oócitos bovinos e se esta ativação envolve o EGF. Para tal foram realizados dois experimentos. Em ambos, a progressão do ciclo celular foi avaliada utilizando a sonda fluorescente Hoechst 33342. A expansão das células do cumulus foi avaliada utilizando-se o software Image Pro Plus 5.1 para análise das imagens dos oócitos geradas em microscópio Olympus IX81. O maior diâmetro de cada complexo cumulus oócito foi adotado como parâmetro de mensuração da expansão. A dosagem de progesterona do meio de cultivo foi realizada pela técnica de RIA. A ativação da PKC e da MAPK foi avaliada pela técnica de Western blot. Os dados foram avaliados pelo software SigmaPlot versão 12.2 e submetidos ao teste de normalidade (Shapiro-Wilk). Quando necessário, os dados foram transformados. Para comparação entre dois tratamentos, utilizou-se o teste t-student. Para mais de dois tratamentos foi realizada análise de variância e teste de comparação de médias (TUKEY), considerando-se 0,05 para rejeitar a hipótese de nulidade. No experimento 1 foi avaliado se a ativação da PKC foi estimulada por gonadotrofinas. Os oócitos foram maturados in vitro tratados com gonadotrofinas, na presença ou ausência do inibidor de PKC. A presença do inibidor de PKC diminuiu as taxas de quebra de vesícula germinativa e a expansão das células do cumulus, sem alterar a esteroidogênese. Estes resultados demonstram que a PKC participa da via de sinalização da retomada da meiose. No experimento 2 foi avaliado se o EGF está envolvido na via regulada pela PKC. Os oócitos foram maturados in vitro, na presença ou ausência de LH e FSH, do inibidor de PKC e do EGF. O EGF foi capaz de reverter os efeitos do inibidor de PKC, aumentando as taxas de quebra de vesícula germinativa e a expansão de células do cumulus. Não foi possível detectar, nas condições deste experimento, a ativação das proteínas PKC e MAPK através do Western Blot. Este trabalho permite concluir que a via de sinalização da maturação de oócitos bovinos envolve a PKC e sugere a participação do EGF nesta via. / Oocyte quality is a limiting factor in female fertility and reflects its potential to the subsequent embryonic development. Molecular and biochemical alterations during the oocyte maturation process are needed to allow fecundation. Under gonadotropin influence, cascade of events occurs changing gene expression and follicle structure. Maturation depends on the interaction between oocyte and cumulus cells interaction, which provides factors for oocyte development and create the ideal microenvironment for the success of the maturation process. The FSH stimulation of meiosis resumption probably occurs through PKC activation. The signaling pathway of PKC might be involved by the mitogen activated protein kinase (MAPK) in oocytes and cumulus cells during FSH-LH induced maturation. Furthermore, MAPK regulates the epidermal growth factor (EGF) synthesis. The aim of the present study was to evaluate PKC function during bovine oocyte maturation and if its activity involves EGF. Two experiments were performed. In both experiments, the cell cycle progression was analyzed by Hoechst 33342 fluorescent dye. The cumulus cells expansion was performed using software Image Pro Plus 5.1 by the analysis of oocyte images taken in Olympus IX81 microscope. The highest diameter of each cumulus oocyte complex was recorded as the expansion value. The RIA and Western Blot techniques were used to measure progesterone concentration in the culture media and the PKC and MAPK activity, respectively. Data was analyzed by SigmaPlot software, version 12.2. The Shapiro-Wilk test was used to assess for normality and, when needed, the data was transformed. Student t tests were carried out to compare two treatments. Differences between more than two means were assessed by analysis of variance followed by Tukey test, considering P-value lower than 0.05 as statistically significant. Experiment 1 studied whether PKC function was stimulated by gonadotropins. FSH and LH were used for oocyte maturation in vitro, with or without PKC inhibitor. The presence of PKC inhibitor decreased germinal vesicle breakdown and the cumulus cells expansion, but did not alter the steroidogenesis. These results show that PKC participates in the signaling pathway of meiosis resumption. The Experiment 2 evaluated whether EGF influences PKC signaling pathway. The oocytes were matured in vitro, in the presence or absence of LH and FSH, PKC inhibitor and EGF. Epidermal Growth Factor was able to reverse PKC inhibitor effects, increasing germinal vesicle breakdown rates and cumulus cells expansion. The Western Blot technique was not able to detect PKC and MAPK activity, considering the conditions of this study. In conclusion, PKC is involved in the signaling pathway of bovine oocytes maturation and its pathway is mediated by EGF.

As novas biotécnicas são ferramentas inovadoras no estudo da fisiologia da reprodução de cães, bem como na preservação do material genético de espécies ameaçadas de extinção. Tendo em vista, pois, a relevância de tais ferramentas, emprestou-se a este estudo o objetivo maior de avaliar os efeitos do 17-ß estradiol, progesterona e do co-cultivo em células da tuba uterina na maturação in vitro de oócitos de cães. Ovários de cadelas em anestro foram fatiados em PBS com 10% SFB. Os oócitos foram selecionados e divididos em 8 grupos: grupo 1 (sem suplementação hormonal), grupo 2 (20 µg/ml de 17-ß estradiol), grupo 3 (20 µg/ml de progesterona), grupo 4 (20 µg/ml de 17-ß estradiol e 20 µg/ml de progesterona), grupo 5 (co-cultivo em células da tuba uterina sem suplementação hormonal), grupo 6 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 mg/ml de 17-ß estradiol), grupo 7 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 µg/ml de progesterona) e grupo 8 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 µg/ml de 17-ß estradiol + 20 µg/ml de progesterona). O cultivo das células da tuba uterina foi realizado por no mínimo 48 horas previamente à adição dos oócitos. Para a maturação, utilizou-se TCM 199 suplementado com 2,5 µg/ml de FSH e 5 µg/ml de LH. Decorridas 48, 72 e 96 horas em estufa a 39&ordm;C, 5% de CO2 em ar e alta umidade, os oócitos foram fixados em paraformaldeído a 4% com Triton 10X e corados com Hoescht 33342 (10 µg/ml) em glicerol. O estágio de maturação nuclear (vesícula germinativa - VG, quebra da vesícula germinativa – QVG, metáfase I – MI, metáfase II – MII, degenerados ou não passíveis de determinação) foi avaliado em microscópio invertido equipado com luz ultravioleta e filtro de 365-420 de excitação/emissão. Os dados foram analisados mediante o PROC NPAR1WAY de análise de variância não paramétrica, sendo o efeito dos tratamentos verificado por meio do teste de Kruskal-Wallis, e as comparações múltiplas do teste de Wilcoxon com os tratamentos comparados dois a dois, considerando as diferenças significativas quando p<0,05. Verificou-se influência positiva da suplementação hormonal no desenvolvimento oocitário in vitro, particularmente com referência à adição de progesterona, associada ou não ao estrógeno. Não houve influência significativa do co-cultivo de células da tuba uterina na maturação oocitária em comparação aos meios de cultivo, sem presença de células epiteliais da tuba uterina, suplementados com hormônios esteróides. Conquanto sem significância estatística, verificou-se tendência de os oócitos, obtidos de cadelas em anestro, desenvolverem-se ao estágio de metáfase II após o período de maturação de 96 horas. Demonstrou-se, portanto, ser plenamente exeqüível o estudo da maturação de oócitos de cães em sistemas de cultivo in vitro a partir de ovários obtidos por ovário-histerectomia, tal estudo propicia, ademais, a pesquisa de características reprodutivas fisiológicas da espécie. / Recent biotechniques are innovative tools for the canine reproductive physiology research, as well as for assisted reproduction of endangered species. The aim of this study was to evaluate the effects of estradiol-17ß, progesterone and the co-culture with oviductal ephitelial cells on in vitro maturation. Ovaries from anestrous bitches were sliced in PBS with 10% FCS. Oocytes were selected and distributed in 8 groups: group 1 (no hormonal suplementation), group 2 (estradiol-17ß at 20 µg/ml), group 3 (progesterone at 20 µg/ml), group 4 (estradiol-17ß at 20 µg/ml + progesterone at 20 µg/ml), group 5 (co-culture in oviductal ephitelial cells without hormonal suplementation), group 6 (co-culture in oviductal ephitelial cells + estradiol-17ß at 20 µg/ml), group 7 (co-culture with oviductal ephitelial cells + progesterone at 20 µg/ml) and group 8 (co-culture with oviductal ephitelial cells + estradiol-17ß at 20 µg/ml + progesterone at 20 µg/ml). Oviductal ephitelial cells culture was performed at least 48 hours prior to oocyte co-culture. For in vitro maturation, TCM 199 supplemented with FSH (2.5 &micro;g/ml) and LH (5 &micro;g/ml) was utilized. After periods of 48, 72 and 96 hour at 39ºC in humidified atmosphere of 5% CO2 in air, oocytes were fixed with Triton-X10 in paraformaldehyde at 4% and and stained with Hoescht 33342 (10 µg/ml) in glycerol. Oocytes were examined through an inverted fluorescence microscope equipped with a 365-420 nm wavelength excitation/emisson filter. Nuclear maturation was classified according to chromatin configuration as: germinal vesicle stage (GV), germinal vesicle break down (GVBD), metaphase I (MI), metaphase II (MII) and degenerated and unidentifiable oocytes. Data was evaluated through PROC NPAR1WAY of non parametrical variance analysis and treatment was verified by the Kruskal-Wallis test and the Wilcoxon test for multiple comparisions. Differences were considered significant at p<0.05. Positive influence of hormonal supplementation for oocyte development rates was verified, particularly with respec to progesterone. No significant influence of oviductal cells co-culture was however verified. In addition, a tendency of the oocytes reaching metaphase II in the 96 hour period was observed. Therefore, the study of canine in vitro oocyte maturation is feasible and provides an important tool for reproductive physiology research.