Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-01-07Bitstream added on 2014-06-13T21:02:17Z : No. of bitstreams: 1 piresbuttler_eap_dr_jabo.pdf: 3600406 bytes, checksum: 9e69525f1c9229baeef8ef0e206e49e2 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este estudo foi desenvolvido com o intuito de avaliar comparativamente o efeito do estádio do ciclo estral, bem como a adição de hormônios aos meios de cultivo in vitro sobre a morfologia do complexo cumulus-oócito canino. Os oócitos foram coletados de 30 cadelas hígidas submetidas à ovariosalpingo-histerectomia, divididas em dois grupos de acordo com a condição reprodutiva (fase folicular e anestro). A avaliação foi feita por microscopia eletrônica de varredura e transmissão, antes e após o período de cultivo in vitro por 72h em dois diferentes meios: meio controle - A (TCM199) e meio B: TCM199 adicionado de 10UI/mL de LH, 2μg/mL de progesterona (P4) e 2μg/mL de Estradiol(E2). Os resultados revelaram que o diâmetro oocitário não é influenciado pela fase reprodutiva, assim como a comunicação intercelular, e os aspectos morfológicos relacionados à forma e arranjo das células do cumulus, in vivo. A fase do ciclo estral exerceu influência sobre a morfologia do complexo cumulus-oócito, de tal forma que oócitos pertencentes ao grupo folicular apresentaram-se com maior grau de maturidade nuclear e citoplasmática do que oócitos do grupo do anestro. A suplementação hormonal afetou positivamente a maturação nuclear, mas não exerceu efeito sobre a maturação citoplasmática. Com relação à ultra-estrutura a presença de hormônios nos meios de cultivo foi benéficas tanto para a comunicação entre as células do cumulus como para a manutenção da integridade oocitária / This study was developed in order to comparatively evaluate the effects of stages of the estrous cycle, as well as the addition of hormones to culture media in vitro on the morphology of cumulus-oocyte complex canine. The oocytes were collected from 30 healthy bitches ovariosalpingo underwent hysterectomy were divided into two groups according to reproductive condition (follicular phase and anestrus). The evaluation was performed by scanning electron microscopy and transmission, before and after cultivation in vitro for 72h in two different media: control medium - A (TCM199) and medium B: TCM199 added 10IU/mL LH, 2μg / mL progesterone (P4) and 2μg/mL Estradiol (E2). The results revealed that the oocyte diameter is not influenced by reproductive stage, as well as intercellular communication, and morphological aspects related to the shape and arrangement of cumulus cells, in vivo. The estrous cycle phase influenced the morphology of cumulus-oocyte complex, such that follicular oocytes in the group presented with greater maturity than nuclear and cytoplasmic oocyte group of anestrus. The hormonal supplementation positively affected nuclear maturation, but had no effect on cytoplasmic maturation. Regarding the ultrastructural presence of hormones in culture media was beneficial both for communication between the cumulus cells as well as preserving the integrity of oocyte

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-05Bitstream added on 2014-06-13T20:46:13Z : No. of bitstreams: 1 machado_ma_dr_jabo.pdf: 454873 bytes, checksum: f0e2d02e3267e96118f80b1075dda8c3 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A presente pesquisa foi desenvolvida com o objetivo de avaliar os prováveis efeitos do fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I) sobre a maturação in vitro (MIV), nuclear e citoplasmática, de oócitos caninos retirados de ovários de cadelas. Os complexos cumulus oócitos (COCs) foram maturados in vitro em meio SOF (“synthetic oviductal fluid”). Foram utilizadas 40 cadelas submetidas ovario-histerectomias para esterilização cirúrgica ou para o tratamento de piometra. As doadoras foram classificadas em grupos conforme raça, faixa etária, condição reprodutiva e fase do ciclo estral. Os COCs (n=1474) foram liberados dos folículos pela técnica de fatiamento dos ovarios e maturados por 72 horas, exceto o grupo M0 (momento zero). O meio de cultivo base, foi o SOF, suplementado ou não com o IGF-I. Foram selecionados apenas COCs classificados como grau 1 para a MIV. Os COCs foram distribuidos em três grupos / This study was performed to identify the possible effects of insulin-like growth factor-i (IGF-I) on in vitro maturation (IVM) evaluated by nuclear and cytoplasmic of bitch cumulus oocyte complexes (COCs) matured in vitro in synthetic oviductal fluid (SOF) medium. For this purpose ovaries were collected from 40 bitches undergoing ovariohysterectomy for neutering or due to pyometra. The donors females were classified into groups based on breed, age, reproductive status and stage of the estrous cycle. The COCs (n=1474) were released from the follicles by slicing the ovaries and matured in vitro for 72 hours in the base culture medium SOF supplemented or no with IGF-I. Only grade 1 COCs were used for IVM, and were divided into three groups: M0 (zero collection time), C (SOF) and E (SOF + IGF-I). After incubation period, the maturation of the nucleus was examined by staining the oocytes with Hoechst 33342 and the cytoplasmic maturation by means of Lens culinaris agglutinin. The M0 group also was examined to cytoplasmic and nuclear maturation with the same staining dyes. From all females donors were collected 35.21, 39.69, 39.83 and 39.2% COCs per bitch were collected from mongrel, adult (>10 months), multiparous, and diestrus females, respectively (P<0.05). The percentage of degenerated oocytes was very high in the total sum (74.0%) and amongst experimental groups (M0=59.43; C=75.44; E=80.52%) with significant statistical differences (P<0.05) between them. And from all groups only 3.02% oocytes reached MI (M0= 2.83; C=4.19; E=2.10%). Alike nuclear meiotic resumption the cytoplasmic maturation rates were low, 15.83% in the total and 12.90 (M0); 25.58 (C); E (8.69%)...(Complete abstract, click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-07-27Bitstream added on 2014-06-13T19:30:09Z : No. of bitstreams: 1 pires_ea_me_jabo.pdf: 426419 bytes, checksum: b57d15a1404fbc5b5fdc2c88bcefb224 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo desta pesquisa foi avaliar os efeitos da suplementação de cisteína e cisteamina no desenvolvimento meiótico de oócitos caninos durante o processo de maturação ín vítro. Os oócitos foram coletados de sete cadelas hígidas em fase pré-ovulatória imediata, submetidas à ovario-histerectomia. Os COC's selecionados foram cultivados por um período de 72 horas em quatro meios diferentes: A (controle) - TCM199 suplementado com BSA (3 mg/mL) + FSH (5 J.Lg/mL) + LH (10 f.Lg/mL) + progesterona (2 f.Lg/mL) + estradiol (2 f.Lglml); 8 - controle + 0,1mM de cisteína; C - controle + 100J.1M de cisteamina; D - controle + 0,1 mM de cisteína + 100J.1M de cisteamina. Os resultados demonstraram que não houve diferença significativa entre os tratamentos (p<0,05), ou seja, a suplementação de compostos antioxidantes no meio de maturação não favoreceu a competência meiótica. Além disso, neste estudo pode-se inferir que para cada fase do ciclo estral, talvez seja necessário um período de maturação diferenciado. / The aim of this research was to evaluate the effects of the cysteine and cysteamine supplementation on meiotic deveropment of canine oocytes dunng the process of in vitro maturation. The oocytes were collected atter ovanohysterectomy from seven healthy bitches in immediate preovulatory stage. The selected COC's were cultured by a period of 72 hours in four different media: A (control) - TCM199 supplemented with BSA (3 mg/mL) + FSH (5 J-Lg/mL) + LH (10 J-Lg/mL) + progesterone (2 f.Lg/mL) + estradiol (2 f.LglmL); 8 - control + 0,1mM of cysteine; C - control + 100JlM of cysteamine; O - control + 0,1 mM of cysteine + 100J,lM of cysteamine. The present study demonstrated that there was not significant difference among the treatments (p<0,05), in other words, the supplementation of antioxidant in the medium of maturation didn't favor the meiotic competence. Besides, in this study it can be inferred that for each stage of the oestrus cycle, perhaps it is necessary a different maturation penod.

Submitted by LORENA SANCHES (losanches25@yahoo.com.br) on 2016-09-05T23:48:16Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Lorena Sanches.pdf: 910469 bytes, checksum: c0365e51eb8f6cf8b8d23bb263de599e (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-09-06T12:34:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sanches_l_me_bot.pdf: 910469 bytes, checksum: c0365e51eb8f6cf8b8d23bb263de599e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-06T12:34:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sanches_l_me_bot.pdf: 910469 bytes, checksum: c0365e51eb8f6cf8b8d23bb263de599e (MD5) Previous issue date: 2016-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A maturação in vitro (MIV) é uma etapa fundamental da produção in vitro de embriões bovinos (PIV). A conclusão prematura da maturação nuclear durante a MIV é considerada como uma das principais causas da eficiência limitada da PIV. Em camundongos, o fator de crescimento dos fibroblastos 8 (FGF8) regula a atividade do peptÌdeo natriurético tipo C (NPPC) aumentando a expressão de seu receptor (NPR2) e contribuindo assim para o bloqueio meiótico. O principal objetivo deste trabalho foi testar os efeitos do FGF8 sobre a dinâmica da quebra da vesícula germinativa e progresso da meiose durante a MIV induzida com FSH ou ampirregulina (AREG) em bovinos. Paralelamente, os efeitos do FGF8 sobre a expansão do cumulus e metabolismo da glicose também foram testados. Na MIV induzida com AREG, mas não com FSH, o FGF8 diminuiu a porcentagem de oócitos com quebra da vesícula germinativa às 6 e 9 horas do cultivo, enquanto aumentou a expressão do RNAm do NPPC, mas não do NPR2, nas células do cumulus. Distintamente, na MIV com FSH, o FGF8 diminuiu a porcentagem de oócitos em Meiose I às 9 horas de cultivo. O FGF8 não afetou a porcentagem de oócitos em Meiose II às 22 horas da MIV, nem a expansão do cumulus, embora tenha aumentado a expressão do RNAm de genes da cascata ovulatória [prostaglandina endoperoxido sintase 2 (PTGS2) e desintegrina e metaloproteinase de domínio contendo proteÌna 10 (ADAM 10)]. Além disso, o FGF8 diminuiu o consumo de glicose e a produção de lactato na MIV com FSH, mas não com AREG. Em conclusão, o FGF8 desacelera a dinâmica da maturação nuclear enquanto aumento a expressão do NPPC nas células do cumulus durante MIV induzida com AREG e, portanto, apresenta-se como fator potencialmente útil para melhorar a eficiÍncia da MIV. / FAPESP: 2012/06417-8

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-06-18T13:31:56Z No. of bitstreams: 1 Bruna Sabino Pinho de Oliveira.pdf: 2489659 bytes, checksum: e99e7aba577a1858487c0c89c8d45213 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-18T13:31:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruna Sabino Pinho de Oliveira.pdf: 2489659 bytes, checksum: e99e7aba577a1858487c0c89c8d45213 (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Adiponectin is a adipokine secreted mainly from adipocytes, involved in the control of male and female reproductive functions. Adiponectin circulating levels presents an inverse correlation with fat body mass and its biological effects are mediated mainly through two receptors AdipoR1 and AdipoR2. The aim of the present study, was to verify the expression of adiponectin system (Adiponectin and its receptors, AdipoR1 and AdipoR2) in goat ovary through qPCR and immunohistochemistry, and further investigate the in vitro effects of recombinant adiponectin (5 μg/mL and 10 μg/mL) on goat oocytes nuclear maturation. We demonstrated that adiponectin system’s mRNA and proteins are present in goat ovary. Gene and protein expression of AdipoR1 and AdipoR2 were detected in follicular cells (oocyte, cumulus, granulosa and teca) of small and large antral follicles, while Adiponectin mRNA was not detected in small and large follicles oocytes, neither in large follicles cumulus cells. Finally, addition of adiponectin in maturation medium, in tested concentrations, affected the number of oocytes that reached metaphase II. In conclusion, in the present study, we demonstrated Adiponectin and its receptors AdipoR1 and AdipoR2 expression in goat ovarian follicles. Furthermore, was demonstrated that rh adiponectin increases nuclear maturation progression in vitro of goat oocyte. / A adiponectina é uma adipocina majoritariamente secretada por adipócitos que está envolvida na regulação da função reprodutiva de machos e fêmeas. Seus níveis de circulação têm correlação inversa com a quantidade de tecido adiposo corporal e seus efeitos biológicos são mediados principalmente através de dois receptores, AdipoR1 e AdipoR2. O objetivo deste estudo foi verificar a presença do sistema adiponectina (Adiponectina, e seus receptores, AdipoR1 e AdipoR2) em ovário caprinos através de qPCR e imunohistoquímica. Além disso, avaliar o efeito da adição de adiponectina recombinante humana (5 e 10 μg/mL) sobre a maturação de oócitos caprinos in vitro. Nós demonstramos que o RNAm e proteína para o sistema adiponectina estão presentes no ovário caprino. A expressão gênica e proteíca dos receptores AdipoR1 e AdipoR2 foi detectada nas células foliculares (oócito, cumulus, granulosa e teca) de pequenos e grandes folículos antrais, enquanto que RNAm de adiponectina não foi detectada em oócitos de pequenos e grandes folículos e em células do cumulus de grandes folículos antrais. Finalmente, a adição de adiponectina, nas concentrações testadas, durante a maturação in vitro afetou a porcentagem de oócitos em metafáse II. Em conclusão, neste estudo, demonstramos a expressão da adiponectina e seus receptores AdipoR1 e AdipoR2 em folículos ovarianos de caprinos. Além disso, demonstrouse que a adiponectina rh aumenta a progressão da maturação nuclear de oócitos caprinos in vitro.

O objetivo do presente estudo foi comparar o efeito da idade de doadores de oócitos sobre os parâmetros reprodutivos, a taxa de recuperação e qualidade de oócitos após ICSI utilizando sêmen sexado. Éguas Pôneis de Polo (n = 79) e Puro-Sangue (n = 23) doadoras de oócitos (400-600kg e 3-29 anos) foram utilizados durante as estações reprodutivas de 2009/2010 e 2011 no hemisfério Sul (San Luis, Argentina) e norte (Kentucky, EUA), respectivamente. As éguas foram divididas em três categorias experimentais: Jovens (YM: 3-10 anos), Meia Idade (MA: 11-17a) e Idosas (OM&ge;18a). Um total de 326 oócitos recuperados in vivo a partir de folículos pré-ovulatórios (n=279) e folículos imaturos em crescimento (n=47). Desses, 224 oócitos foram recuperados, classificado e dirigido a um programa comercial ICSI com Pôneis de Polo (primeira estação). Durante a segunda estação, 57 oócitos foram recuperados a partir de folículos pré-ovulatórios e 47 oócitos de folículos em crescimento e congelados em nitrogênio líquido para ser usado posteriormente em outro estudo. Os pontos experimentais avaliados foram: intervalos (dias) entre a aspiração ou a ovulação (AS/OV) ao PGF, PGF ao GnRH (Dia 0=GnRH), AS/OV ao Dia 0, e AS/OV ao Dia&#43;1; edema uterino (UE); tonus cervical (CT); diâmetro máximo do folículo dominante (MdF1) em D0 e D&#43;1, e a taxa de crescimento folicular. O número total de aspirações, o número de folículos aspirados e oócitos por aspiração e/ou folículo, o grau de expansão das células do cúmulos, a presença e qualidade do corpo polar (PB), o volume ooplasma, o intervalo de GnRH a aspiração, a GnRH a ICSI, e a taxa de clivagem (CR) depois da ICSI também foram avaliados. Foram observadas diferenças significativas entre as três categorias experimentais (YM, MA e OM) para: intervalos (dias) entre PGF-GnRH, AS/OV-GnRH, AS/OV-Day 1, edema uterino no Dia 0, CT em Dia 1, MdF1 no D0 e D&#43;1 e volume de ooplasma. A taxa de recuperação in vivo (RR) não foi afetada pela idade (média de 102%, 85% e 73,4% de oócitos recuperados por ciclo, por F1 e por folículo, respectivamente, P> 0,05). O CR não diferiu entre as por ciclo, por F1 e por folículo, respectivamente, P> 0,05). O CR não diferiu entre as categorias experimentais. Em conclusão, um efeito de envelhecimento pode ser observado em vários parâmetros reprodutivos em éguas. Os ovócitos no presente estudo tiveram um menor volume de ooplasma para OM comparados com YM, mas isso não foi eficaz em predizer a viabilidade dos oócitos ou o potencial para o desenvolvimento para a avaliação da taxa de clivagem após ICSI utilizando sêmen sexado / The aim of the present study was to compare the effect of oocyte donors` age on reproductive parameters, recovery rate and quality of oocytes after ICSI using sexed semen. Polo Ponies (n=79) and Thoroughbred (n=23) oocyte donor mares (400-600kg and 3-29 years) were used during the 2009/2010 and 2011 reproductive seasons in the Southern (San Luis, Argentina) and in the Northern hemispheres (Kentucky, USA), respectively. Mares were divided into three experimental categories: Young Mares (YM: 3-10&#1059;), Middle Age Mares (MA: 11-17&#1059;) and Old Mares (OM18&#1059;). A total of 326 oocytes were recovered in vivo from pre-ovulatory follicles (n=279) and immature-growing follicles (n=47). From those, 224 oocytes were recovered, sorted and directed to a commercial ICSI program with Polo Ponies (first season). During the study`s second season, 57 oocytes were recovered from pre-ovulatory follicles and 47 oocytes from growing follicles and frozen in liquid nitrogen to be used in another study. The evaluated experimental end-points were: Intervals (days) between aspiration or ovulation (AS/OV) to PGF, PGF to GnRH (Day 0=GnRH), AS/OV to Day 0, and AS/OV to Day &#43; 1; uterine edema (UE); cervical tone (CT); maximum diameter of dominant follicle (MdF1) on D0 and D&#43;1, and follicular growth rate. Total number of aspirations, number of follicles aspirated and oocytes recovered per aspiration and/or follicle, the degree of cumulus cell expansion, the presence and quality of polar body (PB), the ooplasm volume, the interval from GnRH to aspiration, GnRH to ICSI, and the cleavage rate (CR) after ICSI were also evaluated. Significant differences between the three experimental categories (YM, MA and OM) were observed for: intervals (days) between PGF-GnRH, AS/OV-GnRH, AS/OV-Day &#43;1, uterine edema on Day 0, CT on Day &#43;1, MdF1 on D0 and D&#43;1 and ooplasm volume. The in vivo recovery rate (RR) was not affected by age (average of 102%, 85% and 73.4% of oocyte recovered per cycle, per F1 and per follicle, respectively; P>0.05). The CR did not differ among experimental categories. In conclusion, an effect of aging could be observed in several reproductive parameters in mares. The oocytes in the present study had a smaller ooplasm volume for OM compared to YM, but this was not effective in predicting oocyte viability or the potential to development through evaluation of the cleavage rate after ICSI using sexed semen

Para aferir as prováveis causas da baixa taxa de recuperação de estruturas embrionárias em búfalas superovuladas, foram realizados 4 experimentos. No Exp.1, foram utilizados sistemas genitais de búfalas e de vacas tratadas para a indução de ovulações única ou múltipla (fatorial 2x2). Os sistemas genitais foram submetidos à morfometria, os ovidutos foram lavados para a recuperação dos oócitos e, posteriormente, foram encaminhados à histologia. A taxa de recuperação de oócitos e o volume dos ovários foram maiores para as vacas que para as búfalas (P&lt;0,05). A área das fímbrias foi maior para as búfalas que para as vacas (P&lt;0,05). As camadas musculares do infundíbulo e do istmo foram mais espessas para as búfalas que para as vacas (P&lt;0,05) e, na ampola, não foi verificado diferença nesta medida entre as espécies (P&gt;0,05). No Exp.2 foram utilizados ovidutos de búfalas e de vacas, tratadas para a indução de ovulação única. Os ovidutos foram abertos, colocados em meio de cultura com ou sem E2 (fatorial 2x2) e incubados por 30 minutos. Após o período de incubação, foram colocadas microesferas na superfície dos ovidutos para a aferição do movimento ciliar. As microesferas no infundíbulo direcionaram-se para o útero (P&gt;0,05). Na ampola, direcionaram-se para o útero e para o ovário (P&gt;0,05). No istmo das vacas, direcionaram-se para o ovário e no das búfalas, para o útero (P&lt;0,05). A presença de E2 no meio de cultura não interferiu na direção do deslocamento das microesferas em nenhuma porção dos ovidutos de búfalas e de vacas. No Exp.3 foram utilizados ovidutos de búfalas e de vacas tratadas para a indução de ovulação única. Os ovidutos foram colocados em meio de cultura com ou sem E2 e receberam oócitos de búfalas ou de vacas (fatorial 2x2x2). Posteriormente, foram incubados por 24 horas e, após isso, foram lavados para a recuperação e contagem dos oócitos. O número e a taxa de recuperação de oócitos foi maior para as vacas que para as búfalas (P&lt;0,05) e, estas variáveis não foram influenciadas pelo tratamento (P&gt;0,05). Não foi verificada diferença no número de oócitos de búfalas ou de vacas recuperados (P&gt;0,05). Os dados são indicativos de que o transporte de oócitos pelo oviduto de búfalas e de vacas independe da espécie do oócito e não é influenciado pelo E2. No Exp.4, búfalas e vacas foram tratadas para a indução de ovulações única ou múltipla. As fêmeas foram inseminadas e submetidas à laparotomia para a inserção no interior do oviduto de oócitos de búfalas ou de vacas (fatorial 2x2x2). Os sistemas genitais foram lavados 5 (oócitos de búfala) e 6 dias (oócitos de vaca) após a laparotomia para a recuperação das estruturas embrionárias. O número de estruturas embrionárias recuperadas foi maior para as vacas que para as búfalas (P&lt;0,05) e, o número e a taxa de recuperação de estruturas embrionárias não foram influenciados pelo tratamento ou pela espécie dos oócitos (P&gt;0,05). A espécie dos oócitos e o tratamento parecem não influenciar no transporte dos oócitos pelos ovidutos de búfalas e de vacas / In order to study the probable causes of the low embryo recovery rates in superovulated buffaloes, 4 experiments were performed. The experiment 1, consisted of treating buffaloes and cows in order to induce single or multiple ovulation (2x2 factorial). Genital systems were morphometrycally evaluated; oviducts were flushed in order to recover the oocytes, and subsequently submitted to histological examination. The oocyte recovery rate and the ovarian volume were higher for cows when compared to buffaloes (P&lt;0.05). In contrast, fimbria area was higher for buffaloes than cows (P&lt;0.05). Likewise, infundibulum and isthmus muscle layers were thicker in buffalo than cows (P&lt;0.05). In addition, histological measurements were similar in cows and buffaloes (P&gt;0.05). In the experiment 2, oviducts of buffaloes and cows treated to show a single ovulation, were dissected and placed in two media (with or without estradiol [E2] in a 2x2 factorial) and incubated for 30 minutes. After this period, microesferes were used to assess of the cilia movements. When placed in the infundibulum, microesferes moved toward the uterus (P&gt;0.05). The microesferes in the ampulla moved towards the uterus and ovary in a similar fashion in both genetic groups (P&gt;0.05). The microesferes in the isthmus, moved towards the ovary in cows; whereas, they moved towards the uterus in buffalo (P&lt;0.05). There was no effect of media in the cilia movements at any portion of the oviduct neither in buffaloes or cows. In the experiment 3, oviducts of buffaloes and cows in the same conditions as in the previous experiment (single ovulation in with or without E2), received oocytes originated from buffaloes or cows (2x2x2 factorial). These oviducts were incubated for 24h and then flushed for oocyte recovery. The total number and the recovery rate of oocytes were higher for cows than for buffaloes (P&lt;0.05). Interestingly, there was no effect of treatment in these same variables (P&gt;0.05). The number of oocytes from buffaloes and cows that were recovered was similar (P&gt;0.05). These results indicate that oocytes transport through the oviduct of buffaloes or cows does not depend on the oocyte specie and is not influenced by the E2. In the experiment 4, buffaloes and cows were treated in order to induce single or multiple ovulation. Females were inseminated and submitted to laparotomy in order to insert, inside the oviduct, oocytes of buffaloes or cows (2x2x2 factorial). Genital tracts were flushed on day 5 (oocytes from buffaloes) and on day 6 (oocytes from cows) after laparotomy for recovery of embryonic structures. The number of embryonic structures recovered was higher for cows when compared to the buffaloes (P&lt;0.05). No effect of treatment or oocyte origin were found for the number or the rate of embryonic structures recovery (P&gt;0.05). In conclusion, it is likely that type of oocyte and treatment do not affect transport of oocytes in the oviducts of buffaloes and cows

A busca por melhores resultados nas biotecnologias reprodutivas leva a um estudo dos mecanismos fisiológicos básicos dos gametas e embriões em estágios iniciais. Entender como funciona o desenvolvimento destes, quais os nutrientes que eles precisam para se desenvolver in vitro e quais as condições ambientais necessárias permitem maiores taxas de sucesso. Tendo em vista a heterogeneidade dos complexos cumulus-oócito (COC) bovinos recuperados de ovários obtidos em frigorífico para a maturação in vitro e a relação entre oócito e células do cumulus nos resultados da produção in vitro de embriões, esse trabalho visa a identificação de fatores moleculares que possam explicar as melhores taxas de blastocistos obtidas por COCs com mais de três camadas de células do cumulus compactas e ooplasma homogêneo (COCI) quando comparados com COCs com menos de duas camadas de células do cumulus, com parte da zona pelúcida exposta e ooplasma homogêneo ou heterogêneo (COCIII). Para isso, COCI e III foram maturados in vitro separadamente, foram vortexados para retirada das células do cumulus e os oócitos foram submetidos a extração de RNA. O RNA foi amplificado em aRNA, marcado com biotina, fragmentado e hibridizado em microarray. Os arrays foram escaneados e os dados gerados analisados pelo métodos Significance Analysis of Microarrays e Rank Products em busca de genes diferencialmente expressos (DEG). A análise funcional in silico foi realizada com a ferramenta Ingenuity Pathway Analysis. Os resultados mostraram que o perfil de expressão dos oócitos de COCIII é diferente do perfil dos oócitos de COCI, como pode ser observado pelos 446 DEGs identificados, sendo 24 com expressão aumentada em oócitos de COCIII. Os genes com expressão alterada estão envolvidos em processos básicos da célula, como reassumição da meiose, metabolismo do oócito e maturação molecular, o que corrobora a ideia de que uma grande quantidade de células do cumulus interagindo com o oócito é crucial para a competência de desenvolvimento. / The researches for better results in reproductive biotechnologies have leading to studies of the basic physiological mechanisms of gametes and embryos in the early stages of developmental. Understand about their development, which nutrients they need and what environmental conditions are necessary to allow higher success rates. Because of the cumulus-oocyte complexes (COC) heterogeneous recovered from bovine ovaries obtained from an abattoir used for in vitro maturation and the relationship between oocyte and cumulus cells in the in vitro production of embryos, this study aims to identify molecular factors which might explain the improved rates of blastocyst obtained by COCs with more than three compact layers of cumulus cells and homogeneous ooplasm (COCI) compared with COC with less than two layers of cumulus cells, with part of the zona pellucida exposed and homogeneous or heterogeneous ooplasm (COCIII). For this, COCI and III were matured in vitro separately, their cumulus cells were removed and oocytes were subjected to RNA extraction. The RNA was amplified in aRNA, biotin labeled, fragmented and hybridized on microarray. The arrays were scanned and the data generated analyzed by the Significance Analysis of Microarrays and Rank Products methods in search of differentially expressed genes (DEG). In silico functional analysis were performed using Ingenuity Pathway Analysis. The results showed that the expression profile of COCIII oocytes is different from the profile of COCI oocytes. 446 DEGs were identified of which 24 presented increased expression in COCIII oocytes. Genes with altered expression are, in general, involved in the basic processes of the cell, as reassume of meiosis, metabolism of the oocyte and molecular maturation, which confirms the idea that a large amount of cumulus cells interacting with the oocyte is crucial for the development of competence.

As novas biotécnicas são ferramentas inovadoras no estudo da fisiologia da reprodução de cães, bem como na preservação do material genético de espécies ameaçadas de extinção. Tendo em vista, pois, a relevância de tais ferramentas, emprestou-se a este estudo o objetivo maior de avaliar os efeitos do 17-ß estradiol, progesterona e do co-cultivo em células da tuba uterina na maturação in vitro de oócitos de cães. Ovários de cadelas em anestro foram fatiados em PBS com 10% SFB. Os oócitos foram selecionados e divididos em 8 grupos: grupo 1 (sem suplementação hormonal), grupo 2 (20 µg/ml de 17-ß estradiol), grupo 3 (20 µg/ml de progesterona), grupo 4 (20 µg/ml de 17-ß estradiol e 20 µg/ml de progesterona), grupo 5 (co-cultivo em células da tuba uterina sem suplementação hormonal), grupo 6 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 mg/ml de 17-ß estradiol), grupo 7 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 µg/ml de progesterona) e grupo 8 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 µg/ml de 17-ß estradiol + 20 µg/ml de progesterona). O cultivo das células da tuba uterina foi realizado por no mínimo 48 horas previamente à adição dos oócitos. Para a maturação, utilizou-se TCM 199 suplementado com 2,5 µg/ml de FSH e 5 µg/ml de LH. Decorridas 48, 72 e 96 horas em estufa a 39&ordm;C, 5% de CO2 em ar e alta umidade, os oócitos foram fixados em paraformaldeído a 4% com Triton 10X e corados com Hoescht 33342 (10 µg/ml) em glicerol. O estágio de maturação nuclear (vesícula germinativa - VG, quebra da vesícula germinativa – QVG, metáfase I – MI, metáfase II – MII, degenerados ou não passíveis de determinação) foi avaliado em microscópio invertido equipado com luz ultravioleta e filtro de 365-420 de excitação/emissão. Os dados foram analisados mediante o PROC NPAR1WAY de análise de variância não paramétrica, sendo o efeito dos tratamentos verificado por meio do teste de Kruskal-Wallis, e as comparações múltiplas do teste de Wilcoxon com os tratamentos comparados dois a dois, considerando as diferenças significativas quando p<0,05. Verificou-se influência positiva da suplementação hormonal no desenvolvimento oocitário in vitro, particularmente com referência à adição de progesterona, associada ou não ao estrógeno. Não houve influência significativa do co-cultivo de células da tuba uterina na maturação oocitária em comparação aos meios de cultivo, sem presença de células epiteliais da tuba uterina, suplementados com hormônios esteróides. Conquanto sem significância estatística, verificou-se tendência de os oócitos, obtidos de cadelas em anestro, desenvolverem-se ao estágio de metáfase II após o período de maturação de 96 horas. Demonstrou-se, portanto, ser plenamente exeqüível o estudo da maturação de oócitos de cães em sistemas de cultivo in vitro a partir de ovários obtidos por ovário-histerectomia, tal estudo propicia, ademais, a pesquisa de características reprodutivas fisiológicas da espécie. / Recent biotechniques are innovative tools for the canine reproductive physiology research, as well as for assisted reproduction of endangered species. The aim of this study was to evaluate the effects of estradiol-17ß, progesterone and the co-culture with oviductal ephitelial cells on in vitro maturation. Ovaries from anestrous bitches were sliced in PBS with 10% FCS. Oocytes were selected and distributed in 8 groups: group 1 (no hormonal suplementation), group 2 (estradiol-17ß at 20 µg/ml), group 3 (progesterone at 20 µg/ml), group 4 (estradiol-17ß at 20 µg/ml + progesterone at 20 µg/ml), group 5 (co-culture in oviductal ephitelial cells without hormonal suplementation), group 6 (co-culture in oviductal ephitelial cells + estradiol-17ß at 20 µg/ml), group 7 (co-culture with oviductal ephitelial cells + progesterone at 20 µg/ml) and group 8 (co-culture with oviductal ephitelial cells + estradiol-17ß at 20 µg/ml + progesterone at 20 µg/ml). Oviductal ephitelial cells culture was performed at least 48 hours prior to oocyte co-culture. For in vitro maturation, TCM 199 supplemented with FSH (2.5 &micro;g/ml) and LH (5 &micro;g/ml) was utilized. After periods of 48, 72 and 96 hour at 39ºC in humidified atmosphere of 5% CO2 in air, oocytes were fixed with Triton-X10 in paraformaldehyde at 4% and and stained with Hoescht 33342 (10 µg/ml) in glycerol. Oocytes were examined through an inverted fluorescence microscope equipped with a 365-420 nm wavelength excitation/emisson filter. Nuclear maturation was classified according to chromatin configuration as: germinal vesicle stage (GV), germinal vesicle break down (GVBD), metaphase I (MI), metaphase II (MII) and degenerated and unidentifiable oocytes. Data was evaluated through PROC NPAR1WAY of non parametrical variance analysis and treatment was verified by the Kruskal-Wallis test and the Wilcoxon test for multiple comparisions. Differences were considered significant at p<0.05. Positive influence of hormonal supplementation for oocyte development rates was verified, particularly with respec to progesterone. No significant influence of oviductal cells co-culture was however verified. In addition, a tendency of the oocytes reaching metaphase II in the 96 hour period was observed. Therefore, the study of canine in vitro oocyte maturation is feasible and provides an important tool for reproductive physiology research.

O objetivo do presente estudo foi analisar a expressão gênica dos receptores de estrógeno (ER&alpha; e ER&beta;) e progesterona (PR) em oócitos e células do cumulus de cadelas nas diferentes fases do ciclo estral. Ovários de cadelas previamente avaliadas e submetidas à ovário-histerectomia foram fatiados, sob refrigeração, em PBS com 10% de SFB. No momento imediatamente pré-cirúrgico foi colhido sangue da cadela, que foi submetido posteriormente à dosagem de estradiol e progesterona. As cadelas foram agrupadas nas diferentes fases do ciclo estral de acordo com a avaliação prévia por colpocitologia, colposcopia e dosagem sérica de progesterona. Os oócitos recuperados após o fatiamento foram denudados mecanicamente. Oócitos e células do cumulus foram criopreservados separadamente e posteriormente foram submetidas a PCR em tempo real para quantificação relativa dos genes de interesse. A expressão gênica de ER&alpha;, ER&beta; e PR em oócitos e células do cumulus não foi diferente nas fases do ciclo estral. Foi possível, pela primeira vez, relatar a presença de ER&alpha; e ER&beta; em oócitos de cadelas. / The objective of the present study was to analyze the gene expression of estrogen (ER&alpha; and ER&beta;) and progesterone (PR) receptors in oocytes and cumulus cells on different phases of the estrous cycle in dogs. Ovaries from selected bitches were recovered after ovary-hysterectomy and sliced at low temperatures in PBS supplemented with 10% FCS. Immediately after surgery, blood samples were harvested for measurement of estrogen and progesterone serum concentration. Bitches were grouped within different phases of the estrous cycles, according to previous evaluation of colpocytology, colposcopy and serum progesterone levels. Oocytes recovered after slicing were mechanically denuded. Isolated oocytes and cumulus cells were cryopreserved and submitted to RT-PCR followed by a real time PCR for relative quantification of gene expression. Gene expression of ER&alpha;, ER&beta; and PR in oocytes and cumulus cells was not different among phases of the estrous cycles. For the first time it was possible to demonstrate ER&alpha; and ER&beta; in dog oocytes.