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Das Membranstrommuster von Oligodendrozyten verändert sich während der Entwicklung dieser zellen sehr stark. Während die Membranleitfähigkeit von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen von auswärts rektifizierenden Kaliumkanälen geprägt ist, exprimieren reife Oligodendrozyten passive, nicht spannungsabhängige Kaliumkanäle. Die Aktivität dieser Kanäle beeinflußt die Proliferation und Differenzierung dieser Zellen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von spannungsaktivierbaren Kaliumkanälen des Kv1-Typs (Shaker-Typ) in kultivierten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen anhand der Transkriptexpression, der Expression von Kv1-Proteinen und der elektrophysiologischen und pharmakologischen Analyse der Membranströme untersucht. Auf mRNA Ebene wurden unterschiediche Kombinationen von Kv1.1, Kv1.4; Kv1.5 und Kv1.6 Transkripten gefunden. Ebenfalls wurde in einigen Zellen eine signifikante Menge an Kv1.2 und Kv1.3 Transkripten gefunden. Die Heterogenität der Transkriptexpression konnte nicht mit Unterschieden in den elektrophysiologischen Eigenschaften korrelliert werden. Die Expression der Kv1 Proteine wurde mit Hilfe von immunozytochemischen Färbungen mit spezifischen polyklonalen Antikörpern gegen die Kanäle Kv1.1 bis Kv1.6 untersucht. Alle Oligodendrozyten-Vorläuferzellen exprimierten die Kanäle Kv1.4 (85% der Zellen), Kv1.5 (99 %) und Kv1.6 (99 %), Kv1.1 Proteine wurden von 10 % der Zellen gebildet. Um den funktionellen Beitrag der Kv1 Kanäle zum Gesamtzellstrom zu bestimmen, wurde die Stromaktivierung und -inaktivierung sowie die Sensitivität der Ströme gegen die spezifischen Kaliumkanalblocker getestet. Dabei wurden durch TEA (1-100 mM), 4-AP (0,125-1 mM) und Chinidin (5-100 mM) jeweils ein großer Teil der Ströme gehemmt, durch CTX, DTX und MCDP wurde die Kanalaktivität nicht beeinflußt. Um den Beitrag der Kanalproteine Kv1.4 bzw. Kv1.1 zu den elektrophysiologischen Eigenschaften des Gesamtzellstromes zu testen, wurden an einzelnen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen kombinierte elektrophysiologische Untersuchungen und immunozytochemische Färbungen durchgeführt. Dabei konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen Kv1./Kv1.4 positiven und Kv1.1/Kv1.4 negativen Zellen festgestellt werden. Aus den Untersuchungen ergeben sich folgende Schlußfolgerungen: Oligodendrozyten exprimieren eine Vielzahl unterschiedlicher Kv1 Transkripte.Die überwiegende Mehrzahl der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen exprimieren die Kv1 Proteine Kv1.4, Kv1.5 und Kv1.6.Der Gesamtzellstrom kann vorwiegend durch Kv1.5 Kanäle oder durch eine Kombination von Kv1.4/Kv1.6 Kanälen sowie durch Mitglieder anderer Familien spannungsabhängiger Kaliumkanäle getragen werden. Um zu untersuchen, ob spannungsabhängige Kaliumkanäle durch die Aktivierung von inhibitorischen Neurotransmitterrezeptoren beeinflußt werden, wurden kultivierte Körnerzellen als Modellsystem verwendet, da diese eine hohe Dichte an Kv Kanälen sowie an GABA Rezeptoren exprimieren. Im "cell-attached" Modus der Patch-Clamp-Technik wurde die Reaktion von einzelnen auswärts rektifizierenden Kaliumkanälen während der GABA-Antwort untersucht. Mit diesem Ansatz konnte gezeigt werden, daß die Öffnungswahrscheinlichkeit dieser Kanäle während der Reaktion der Zelle auf GABA stark zurückgeht. Da Oligodendrozyten-Vorläuferzellen ebenfalls GABAA-Rezeptoren exprimieren, ist anzunehmen, daß deren Aktivierung über einen analogen Mechanismus zur Blockierung von Kaliumkanälen führt. / The membrane current pattern of oligodendrocytes changes dramatically during cell development. In oligodendrocyte precursor cells the membrane conductance is dominated by outwardly rectifying potassium channels, mature oligodendrocytes on the other hand express passive, not voltage-gated potassium channels. The activity of these channels influences the proliferation and differentiation of the cells. In the present work the expression of outwardly-rectifying potassium channels of the Kv1-type (Shaker-type) was analysed in oligodendrocyte precursor cells in culture. Expression of Kv1 transcripts, Kv1 proteins as well as electrophysiological and pharmacological properties of these channels were tested. Different combinations of Kv1.1, Kv1.4, Kv1.5 and Kv1.6 transcripts were detected at mRNA level. In some cells also a significant amount of Kv1.2 and Kv1.3 transcripts was found. The heterogeneity of transcript expression could not be correlated with differences in electrophysiological properties. The expression of Kv1 channel proteins was analysed using immunocytochemical stainings with specific monoclonal antibodies against the channel molecules Kv1.1 to Kv1.6. All oligodendrocyte precursor cells expressed the channel molecules Kv1.4 (85 % of the cells), Kv1.5 (99 %) and Kv1.6 (99 %), Kv1.1 proteins were detected in 10 % of the cells. To find out the functional contribution of Kv1 channels to the whole-cell current of the cells the activation and inactivation characteristics as well as the sensitivity of the potassium current to different potassium channel specific antagonists was tested. Parts of the current were inhibited by TEA (1-100 mM), 4-AP (0,125-1 mM) and Chinidin (5-100 mM), CTX, DTX and MCDP had no effect on the channel activity. To isolate the contribution of the channel molecules Kv1.1 and Kv1.4 the electrophysiological properties of the whole cell current electrophysiological analysis of single cells using whole-cell patch-clamp technique and immunocytochemical stainings were combined. With this method no significant differences between Kv1.1/Kv1.4-positive and Kv1.1/Kv1.4 negative cells could be detected. From these findings the following conclusions could be drawn: Oligodendrocyte precursors express various different Kv1 transcripts.The majority of oligodendrocyte precursor cells expresses the Kv1 proteins Kv1.4, Kv1.5 and Kv1.6.The total current (whole-cell current) most likely is carried through Kv1.5 channels or a combination of Kv1.4/Kv1.6 channels and probably another type of voltage-gated potassium channels. To find out if voltage-gated potassium channels are related to the activation of inhibitory neurotransmitter receptors a model system of cultured granule cells was used. This cell type was selected because they are known to express a high density of Kv channels as well as GABAA receptors as well. The activity of single outwardly rectifying potassium channels was detected using the cell-attached mode of patch-clamp technique. With this method it could be demonstrated that the open probability of voltage-gated potassium channels is markedly decreased during GABAA response. It could be concluded that the activation of GABAA receptors on oligodendrocyte precursor cells leads to the inhibition of potassium channels in the same way as in cultured granule cells.

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Myelin wird durch einem speziellen Membran von Oligodendrozyten im ZNS hergestellt. Diese mehrschichtige Struktur umhüllt Axonen mit ihner trophischen Unterstützung und erleichtert die schnelle Übertragung von elektrischen Signalen. Um die kurzfristigen Auswirkungen der Demyelinisierung zu untersuchen, die histologische Analyse in einem Maus-Modell wurde durchgeführt, wo die myelinisierende Oligodendrozyten wurden abgetragen durch die Expression von Diphtherie-Toxin-Rezeptor in reifen Oligodendrozyten und systemische Diphtherie-Toxin Injektionen. Wir beobachteten, dass so eine Abtragung in einer tödlichen Krankheit resultiert, wo Demyelinisierung der weißen Substanz Bahnen durch Mikroglia Aktivierung von der axonalen Schäden begleitet wurde. Wir haben gezeigt, dass dieses Modell daher auch für das Studium von der kurzfristigen Demyelinisierung-vermittelte axonale Schädigung und Myelin Abbau geeignet ist. Um die Auswirkungen der reversibel Demyelinisierungepisoden auf langfristige Bewegungsapparates Leistung und neuro-axonalen Integrität zu untersuchen, wurden Cuprizon-behandelten Tieren mit motorischen Sequenz (MOSS) überwachtet. Mit MOSS haben wir beobachtet, ob eine funktionelle Erholung erreicht und in langfristig erhalten konnte. Trotz die komplette scheinbare Erholung, die behandelte Tieren zeigten eine late-onset motorischen Beeinträchtigung und laufenden akuten axonalen Schädigung. Dieses Modell imitiert viele Aspekte der axonalen Pathologie bei chronisch progredienter MS und könnte daher bei der Untersuchung der Faktoren, die Initiierung, Aufrechterhaltung oder Kompensation axonalen Schädigunggenutzt werden. Schließlich, weil Myelin Neuroprotektionwahrscheinlich eine direkte Kommunikation zwischen Axonen und Oligodendrozyten beinhaltet/braucht , Proteomanalyse der Myelin-Fraktionen in axo glialen Regionen ist durchgeführt, um neue Kandidaten in axo-glialen Interaktion im Rahmen des Myelin Biogenese beteiligt sind zu finden. Zahlreiche funktionalle Assays wurden gegründet und verwenden, um identifizierten Kandidaten zu bewerten, um ihre Rolle in axoglial Kommunikation und Myelinbildung zu bestimmen. Wir haben festgestellt, dass einige Mitglieder der IgLON Familie binden beide Oligodendrozyten und Axone. Wir beobachteten, dass diese Proteine kein Effekt auf die Migration, Proliferation, Differenzierung von der Oligodendrozyte-Vorläuferzellen haben. Allerdings beobachteten wir, dass ein Mitglied, Ntm wirkt sich negativ auf die frühen Phasen der Myelinisierung.

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Die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen wird durch eine Vielzahl verschiedener Faktoren verursacht, darunter gewisse Umwelteinflüsse, genetische Veranlagungen oder Virusinfektionen. So vielfältig die Ursprünge von Autoimmunerkrankungen sind, so divers sind die daraus resultierenden Erkrankungen, wodurch die Entwicklung zuverlässiger Therapien erschwert wird. Obwohl verschiedene Behandlungsmöglichkeiten existieren, welche die Symptome bei Autoimmunerkrankungen wie neuroinflammatorischer Multipler Sklerose (MS) mildern können, z.B. mit monoklonalen Antikörpern (mAk), wirken die meisten Medikamente breit und unspezifisch. Dies beeinträchtigt die Funktionalität des Immunsystems, was wiederum zu einem höheren Risiko für bakterielle und virale Infektionen, maligne Erkrankungen oder sekundäre Autoimmunität führen kann. Andere Therapieansätze untersuchen daher Möglichkeiten einer Antigen-abhängigen Immuntoleranz-Induktion. Allerdings befinden sich diese noch in den frühen Entwicklungsphasen und deren klinische Wirksamkeit muss noch bewiesen werden. Alternativ hat es sich in der onkologischen Immuntherapie als erfolgreich erwiesen, entweder natürliche oder gentechnisch veränderte Immunzellen zu aktivieren. Bisher wurden humane T-Zellen, welche mit Hilfe chimärer Antigenrezeptoren (CAR) mit ausgewählter Spezifität ausgestattet sind, sehr erfolgreich in der Klinik gegen Tumorerkrankungen genutzt. Basierend auf diesen klinischen Erfolgen stellt sich die Frage, ob CAR T-Zellen auch zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen eingesetzt werden können. Herkömmlichen CAR T-Zellen mangelt es jedoch sowohl an Flexibilität als auch an Kontrollierbarkeit, da sie mit einem CAR gegen ein einzelnes Antigen ausgestattet sind und in Gegenwart des Zielantigens dauerhaft aktiviert und nicht kontrollierbar sind. Um Limitationen konventioneller CARs zu überwinden, wurden universelle Adapter-CARs (UniCARs, RevCARs) in der Gruppe von Prof. Bachmann entwickelt. Die modulare UniCAR-Plattform besteht aus universell einsetzbaren UniCAR T-Zellen und anpassbaren antigenspezifischen Zielmodulen (TMs). Die Bindungseinheit des UniCAR basiert auf einem mAk mit Spezifität gegen ein Peptidepitop, das Teil des TMs ist und welches spezifisch an Zielantigene auf Tumorzellen bindet. Das TM fungiert als Adaptermolekül, das eine Vernetzung der UniCAR T-Zelle mit der Zielzelle herstellt. Nach der Vernetzung mit der Zielzelle über das TM wird die UniCAR T-Zelle aktiviert, so dass die Zielzelle eliminiert wird. Eine vor Kurzem vorgenommene Modifikation der extrazellulären UniCAR-Domäne führte zu der Reverse CAR (RevCAR)-Plattform, welche die Spezifität und Sicherheit noch weiter erhöhen sowie tonische Signale konventioneller CARs reduzieren soll. Dabei wurde die extrazelluläre mAk-basierte UniCAR-Domäne mit dem Peptidepitop des TM ausgetauscht. Eines der am besten untersuchten Autoantigene bei neuroinflammatorischen Erkrankungen ist das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG). Dieses Protein befindet sich ausschließlich im zentralen Nervensystem an der abaxonalen Membran der nervenschützenden Myelinscheide. Obwohl neuroinflammatorische Erkrankungen wie MS hauptsächlich durch T-Zellen verursacht werden, wurden bei MS-Patienten auch Autoantikörper gegen MOG nachgewiesen, was auf die Beteiligung autoreaktiver B-Zellen an der Verschlimmerung der Krankheit hinweist. Diese Ergebnisse werden durch die wirksame Behandlung von MS-Patienten mit anti-CD20-mAks belegt. In dieser Arbeit wurde MOG als erstes Modell-Zielantigen für das Retargeting von CAR-modifizierten T-Zellen gegen anti-MOG-Ak-exprimierende humane Zellen verwendet. Ziel dieser Arbeit war neue TMs basierend auf der extrazellulären Domäne des MOG Antigens zu entwickeln, die dazu dienen, UniCAR oder RevCAR T-Zellen zur Eliminierung von anti-MOG Ak-exprimierenden Zielzellen zu aktivieren. Zur Bestimmung des optimalen MOG-Antigen TM-Formats wurden für die UniCAR-Plattform ein monovalentes (25 kDa) und ein bivalentes MOG-Antigen TM (50 kDa) entwickelt. Die Wirksamkeit des UniCAR-Systems wurde in vitro demonstriert. Es konnte dabei gezeigt werden, dass beide TMs bereits nach einer kurzen Inkubationszeit von 8 Stunden eine TM-spezifische Lyse Anti-MOG scFv-exprimierender menschlicher Zelllinien durch UniCAR-T-Zellen vermitteln. Darüber hinaus war es möglich, das zytotoxische Potential der UniCAR-T-Zellen durch die Dosierung der TMs zu kontrollieren. Um zu überprüfen, ob der Effekt basierend auf der UniCAR-Platform gegen anti-MOG scFv-exprimierende Zielzellen noch gesteigert werden kann, wurde ein monovalentes MOG-Antigen RevTM für die RevCAR-Plattform entwickelt. In Kombination mit RevCAR-T-Zellen übertraf die Anwendung des RevTM beide UniCAR TMs hinsichtlich Bindungsaffinität und dosisabhängiger Zytotoxizität gegen zwei anti-MOG scFv-exprimierende Zelllinien in vitro. Außerdem war die Freisetzung proinflammatorischer und T-Zellwachstum-fördernder Zytokine im Vergleich zu UniCAR T-Zellen höher und ausgeprägter. Weiterhin wurde die Funktionalität des RevCAR-Systems gegen anti-MOG-scFv-exprimierende Zielzellen in vivo bewiesen. Zusammenfassend kann geschlussfolgert werden, dass die modularen Adapter-CAR T-Zell-Plattformen neben der Krebsimmuntherapie auch bemerkenswertes Potential für die Behandlung von MOG-assoziierten Autoimmunerkrankungen hat. Damit konnte ein erster Grundstein dafür gelegt werden, CAR T-Zellen auf die Anwendung in Autoimmunerkrankungen zu übertragen, um zukünftig gezielt fehlerhafte Immunzellen zu beseitigen, die nachweislich zur Verschlimmerung von Autoimmunerkrankungen beitragen.:Table of contents I List of abbreviations VI 1 Introduction 1 1.1 The human immune system 2 1.2 B cells and antibodies 3 1.2.1 Antibody structure 3 1.2.2 Tolerance induction 4 1.2.3 B cell activation 5 1.2.4 B cell functions in autoimmune diseases 6 1.3 Multiple sclerosis – an example for neuroinflammatory demyelination diseases 8 1.3.1.1 Disease phenotypes 9 1.3.1.2 Immunopathogenesis 9 1.3.2 Autoantigen myelin oligodendrocyte glycoprotein 11 1.4 Immunotherapy 14 1.4.1 Monoclonal antibody therapy 14 1.4.2 Chimeric antigen receptor therapy 16 1.4.2.1 UniCAR and RevCAR T cell system 18 1.4.2.2 CAR T cells in autoimmune diseases 22 1.5 Objectives 23 2 Materials and Methods 25 2.1 Materials 25 2.1.1 Consumables 25 2.1.2 Devices and software 27 2.1.3 Chemicals and reagents 32 2.1.4 Buffers and solutions 36 2.1.5 Enzymes and enzyme buffers 38 2.1.6 Kit systems 39 2.1.7 Plasmid vectors 39 2.1.8 Oligonucleotides 41 2.1.9 Antibodies 41 2.1.10 Basic media, additives, and recombinant proteins 43 2.1.11 Composition of culture media 44 2.1.12 Bacterial strain 46 2.1.13 Cell lines 46 2.1.14 Mouse strain 47 2.2 Methods 47 2.2.1 Molecular biological and microbiology methods 47 2.2.1.1 DNA digestion with restriction enzymes 47 2.2.1.2 Dephosphorylation of vectors 48 2.2.1.3 Agarose gel electrophoresis 48 2.2.1.4 Isolation and purification of DNA fragments from agarose gels 48 2.2.1.5 Ligation of DNA fragments 49 2.2.1.6 Heat-shock transformation of competent E. colis 49 2.2.1.7 Plasmid mini preparation 49 2.2.1.8 Plasmid midi preparation 50 2.2.1.9 Determination of DNA concentration 50 2.2.1.10 DNA sequencing 50 2.2.2 Cell biology methods 50 2.2.2.1 Cultivation of eukaryotic cells 50 2.2.2.2 Freezing and thawing cultured cells 51 2.2.2.3 Determination of cell number 52 2.2.2.4 Lentiviral transduction of eukaryotic cells 52 2.2.2.5 Immunofluorescence labeling 54 2.2.2.6 Flow cytometry and analysis of flow cytometry data 55 2.2.2.7 Isolation of human peripheral blood mononuclear cells 57 2.2.2.8 Isolation of T cells from PBMCs with magnetic-activated cell sorting 58 2.2.2.9 Stimulation of isolated human T cells 58 2.2.2.10 Engraftment of T cells with chimeric antigen receptors 59 2.2.3 Methods of protein biochemistry 59 2.2.3.1 Isolation of target module constructs 59 2.2.3.2 Dialysis of purified target module constructs 60 2.2.3.3 Discontinuous Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis 60 2.2.3.4 Determination of concentration and immunochemical detection of target module constructs 62 2.2.3.5 Determination of binding affinities of target modules using enzyme-linked immunosorbent assay 63 2.2.4 In vitro functional studies 64 2.2.4.1 T cell activation and exhaustion assay 65 2.2.4.2 Luciferase assay (cytotoxicity assay) 65 2.2.4.3 Determination of cytokine concentration 65 2.2.5 In vivo functionality studies 66 2.2.5.1 Evaluation of tumor killing in vivo 66 2.2.5.2 Optical imaging of luciferase-expressing tumors in vivo 67 2.2.6 Statistical evaluation 67 3 Results 68 3.1 Design and generation of novel MOG target modules 68 3.1.1 MOG target module constructs 68 3.1.2 Expression of target modules 69 3.2 Establishment of scFv MOG-presenting cell models 72 3.3 Binding properties of MOG target modules 74 3.3.1 Determination of binding affinity between anti-MOG antibody and MOG target modules with enzyme-linked immunosorbent assay 74 3.3.2 Determination of binding affinity between anti-MOG receptor-expressing cell lines and MOG target modules with flow cytometry 75 3.4 Generation of human CAR-expressing T cells and binding of MOG target modules 80 3.4.1.1 Genetic modification of human T cells for UniCAR expression 81 3.4.1.2 Genetic modification of human T cells for RevCAR expression 83 3.5 Redirection of UniCAR T cells in vitro 85 3.5.1 Activation of redirected UniCAR T cells 85 3.5.2 Cytokine profile of redirected UniCAR T cells 87 3.5.3 Elimination of scFv MOG-positive target cells by UniCAR T cells 89 3.5.3.1 Time-dependent retargeting of scFv MOG-positive target cells by UniCAR T cells 89 3.5.3.2 Efficacy of UniCAR target modules 91 3.6 Redirection of RevCAR T cells in vitro 92 3.6.1 Activation of redirected RevCAR T cells 92 3.6.2 Cytokine profile of redirected RevCAR T cells 95 3.6.3 Elimination of scFv MOG-positive target cells by RevCAR T cells 99 3.6.3.1 Time-dependent retargeting of scFv MOG-positive target cells using RevCAR T cells 99 3.6.3.2 Efficacy of RevCAR target module 101 3.7 Investigation of RevCAR T cell-mediated cytotoxicity in vivo 103 4 Discussion 105 4.1 Structure and purification of MOG target modules 106 4.2 Expression and purification of target modules 107 4.3 Binding properties of MOG target modules 107 4.4 In vitro cytotoxic potential of UniCAR and RevCAR T cells redirected by MOG target modules 110 4.4.1 Target module-specific redirection of UniCAR T cells to scFv MOG-expressing target cells 110 4.4.2 Target module-specific redirection of RevCAR T cells to scFv MOG-expressing target cells 112 4.5 Future prospective 116 5 Summary 119 6 Zusammenfassung 121 7 References 124 List of figures 145 List of tables 147 Acknowledgement 148

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