Fertilization is a multiple step process leading to fusion of female and male gametes resulting in a formation of a zygote. Besides direct gamete interaction via binding receptors localized on both oocyte and sperm surface, fertilization also involves communication based on chemical molecules triggering various signalling pathways. This work is aimed to characterize chemical communication of gametes of a model organism Mus musculus. For this purpose, modern proteomic and visualisation methods like nano-liquid chromatography tandem mass spectrometry (nLC-MS/MS), selected reaction monitoring (SRM) and immunofluorescent microscopy were used. Lipocalins were identified as candidate proteins involved in communication including those from major urinary proteins (MUPs), LCN lipocalins and fatty acid binding proteins (FABPs). For the first time, we report their presence in the sperm acrosome. Based on lipocalins capacity to bind and transport other molecules, we propose that these proteins have a protective and/or signalling role for gametes. Furthermore, chemical communication between sperm and oocyte is based on chemotaxis which enables their interaction before their fusion. In this work, we detected that spermatozoa show chemotactic responses in the presence of L-glutamate. This amino acid naturally...

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Traditionally, fish oil (FO) has been used extensively in aquafeeds. The stagnation in global fish oil production coupled with an increased demand for its use in aquaculture feeds, especially salmonid feeds, has greatly inflated fish oil prices. Therefore, in order to sustain the rapid growth of the tilapia industry, the dependence on these commodities in feeds should be reduced through use of cheaper and more sustainable sources of dietary lipids, such as palm oil. This study therefore investigated several, previously poorly understood, effects of palm oil on reproductive performance of the commercial tilapia species, Oreochromis niloticus; which currently ranks as second most popular species in world aquaculture. In the present study broodstock were fed on experimental diets at full and half ration regimes throughout their entire life cycle from exogenous feeding. Studies were conducted in standardised and controlled hatchery conditions, thereby reducing the potential influence of environmental variations. First feeding O. niloticus fry were fed on four diets, cod liver oil (D 1), palm oil (D 2), mixed palm and cod liver oil (D 3) (9:1 ration) and a commercial trout diet as control (D 4) (Skretting, U.K.) on a reducing ration based on fish size. The present study investigated the effect of dietary lipid sources on (1) growth performance, (2) biochemical composition of eggs (total lipid and fatty acid composition), (3) morphological parameters of eggs (total and relative fecundity, egg size, egg weight and EW:BW), (4) larval quality (larval length and weight) and (5) oocyte recruitment and its associated sex steroid hormones. Experimental diets and feeding ration significantly influenced (p<0.05) the growth performance over a period of 120 days. Total lipid and fatty acid composition of eggs originating from broodstock fed on palm oil, mixed palm and cod liver oil (9:1) or a control diet were not significantly different (P>0.05) when fed at either full (3% BWday-1) or half ration (1.5% BWday-1). The present study, however, confirmed that fatty acid composition of fish eggs reflected the fatty acid composition of the diet, although specific fatty acids were selectively utilized or retained in the eggs. The mean inter-spawning interval (ISI) increased with increasing fish size and averaged 14, 19 and 24 days for fish fed on palm oil, mixed palm and cod liver oil or control diets, respectively. The shortest ISI observed was 7 days for fish fed a palm oil diet. Total fecundity ranged from 660 - 820 eggs/clutch. Mean total fecundity was 750, 820 and 660 eggs/clutch for fish fed a palm, mixed palm and cod liver oil or a control diet, respectively, but these differences were not significant (P>0.05). However, relative fecundity and egg weight to body weight rates as a percentage (EW: BW) were found significantly differ (p<0.05) between fish fed the control diet and experimental diets. Mean egg diameter (2.2 mm) was not significantly influenced (p>0.05) by experimental diets. The egg volume, egg dry and wet weight, fertilisation and hatching rate were also not significantly different between fish fed the experimental diets. Oocyte development was classified into distinct stages based upon oocyte size, biochemical properties and structure. The recrudescence to these stages was not significantly influenced by broodstock fed experimental diets either at full or half ration. Steroid hormones and histological analyses provided valuable data concerning the oocyte development and recruitment in this species. Levels of 17ß-oestradiol (E2) and testosterone (T) peaked within 6 days of spawning, suggesting that vitellogenesis began as early as day 2 or 3 post-spawning. By day 6, ovaries were dominated by large late-vitellogenic/maturing oocytes (stages 6 & 7) occupying about 70% of the ovary. Gonadosomatic index (GSI) reached maximal levels by day 6. It is suggested that pre-vitellogenic oocytes are recruited into vitellogenic growth immediately after spawning and complete vitellogenesis on day 6 post-spawning. Finally, the present study investigated the effect of food restriction at two rations (full and half) on broodstock reproductive performance. Oreochromis niloticus were rationed from first feeding and throughout their life-cycle. The dietary regime, full ration (3%) and half ration (1.5%), influenced fish size but despite this variation no significant differences (p>0.05) were detected in total lipid and fatty acid composition in the eggs, total fecundity, egg diameter, total egg volume and larval size. These results suggested that despite large differences in food availability throughout their life cycle, investment in reproduction had remained remarkably consistent. It appeared that during food restriction, O. niloticus sacrificed body weight and growth so as to maintain reproductive investment. In summary, this study provides valuable information using a novel experimental design on the effects of dietary lipid sources on reproductive performance of female O. niloticus. Substituting palm oil for fish oil as the dietary lipid source and reducing ration by half (1.5% BWday-1) had no significant effect on reproductive performance. Therefore it is suggested that under controlled conditions, lipids of non-marine origin, such as palm oil, can be successfully substituted for broodstock diets. Halving feed requirement should also increase profitability of seed production. KEYWORDS: Tilapia; O. niloticus; palm oil; diet; fecundity; spawning periodicity; oocyte recruitment; reproductive performance.

Holothuria scabra est l'holothurie comestible à haute valeur marchande la plus distribuée et la plus exploitée dans l'Indo-Pacifique tropical. Dès lors, et à cause de la demande croissante des pays importateurs et consommateurs, les stocks naturels de l'espèce sont confrontés actuellement un problème de surexploitation. A Madagascar, les situations économique, sociale et politique difficiles ainsi que l'insuffisance d'un plan efficace pour l'aménagement de cette exploitation, rendent la situation plus délicate encore. La surexploitation se traduit par la diminution de la production, la raréfaction de certaines espèces, la dégradation de la qualité du produit et entraîne une forte concurrence entre les exploitants et le non respect de la législation existante. Un plan d'aménagement de cette exploitation est proposé dans ce travail. Celui-ci concerne la gestion de la pêche, la restauration et la pérennisation des stocks naturels, et la valorisation des produits. L'holothuriculture est considérée comme la solution d'avenir pour pallier une demande sans cesse croissante en trépang, restaurer les stocks naturels et sauver les espèces d'holothuries menacées d'extinction. Dans ce travail, il s'agissait d'étudier les aspects biologiques de l'espèce liés à la réalisation de l'élevage de ses larves et juvéniles. Des études concernant le cycle de reproduction de la population locale (baie de Toliara 23° 27' S; 43°41' E côte Sud-ouest de Madagascar), l'induction de la maturation ovocytaire, le développement larvaire et post-larvaire, le développement squelettique chez les larves et les juvéniles, et la croissance des larves et des juvéniles ont été menées. Le but était d'optimaliser la production de juvéniles de H. scabra en écloserie en s'appuyant sur les connaissances préexistantes et acquises. Le cycle de reproduction de H. scabra a été étudié de novembre 1998 à avril 2001 par le suivi de la variation mensuelle de l'indice gonadique, de l'indice de maturité sexuelle et du pourcentage de chaque stade de maturité sexuelle. La population étudiée présente un cycle de reproduction annuel. Toutefois, des gonades mûres sont présentes dans la population presque toute l'année. Les individus mûrs et prêts à pondre sont toutefois plus nombreux entre novembre et avril. Le cycle annuel comporte cinq périodes mais la population étudiée n'a jamais présenté un cycle bien défini et stable. Les échantillons mensuels de gonades sont relativement hétérogènes. La gonade de Holothuria scabra est formée d'une touffe de plusieurs tubules ramifiés. Le développement des gonades ne suit pas le modèle de recrutement progressif des tubules. Si les tubules constitutif d'une gonade n'ont pas les mêmes longueurs, ils sont par contre au même stade de maturité sexuelle. La troisième partie du travail porte sur le développement et l'élevage de H. scabra en structures aquacoles et plus particulièrement sur la production des juvéniles. Ceci débute par l'obtention des œufs fécondés. Pour ce faire, une procédure artificielle recourant à l'induction de la maturation ovocytaire a été utilisée. L'utilisation d'une substance nouvelle (la Nirina) s'est avérée très efficace pour induire la maturation ovocytaire de l'espèce H. scabra. Plus de 90% des ovocytes deviennent matures et sont fécondables après avoir été mis en sa présence. Contrairement aux effets de diverses molécules connues pour induire la maturation chez certaines espèces (dithiothreitol, L-cysteine), les œufs fécondés obtenus par cette méthode sont viables et ont de développement normal. Le développement larvaire se fait en moyenne en deux semaines mais il est influencé par les facteurs température et densité d'élevage. Les élevages conduits à basse température et faible densité ont de meilleure performance de croissance et un meilleur taux de survie. Par contre, le développement est plus lent à basse température. La durée de la phase épibionte des juvéniles est évaluée à environ six semaines, période après laquelle les juvéniles atteignent une longueur moyenne de 20mm (0,5g). Leurs croissance et développement sont moins influencés par la température que ceux des larves. Leur croissance est influencée par la qualité de la nourriture. Les juvéniles épibiontes ont une croissance en longueur plus élevée (0,356 mm/j) et une croissance pondérale moins élevée (12,89mg/j) que les juvéniles fouisseurs (endobiontes). L'apparition et le développement des structures squelettiques ont été observé chez les larves et juvéniles de H. scabra. L'apparition des nouvelles spicules calcaires a pu être suivi chez les juvéniles épibiontes . Ce travail met en évidence de nouveaux aspects de la biologie et de l'élevage de H. scabra, espèce aux rôles économiques et écologiques importants dans les régions de l'Indo-Pacifique. La connaissance des aspects reproducteurs et du développementaux est essentielle pour une gestion durable des pêches et exploitation.

Proteins are known to form functional clusters in plasma membranes. In order to identify individual proteins within clusters we developed a method to visualize by atomic force microscopy (AFM) the cytoplasmic surface of native plasma membrane, excised from Xenopus laevis oocyte and spread on poly-L-lysine coated glass. After removal of the vitelline membrane intact oocytes were brought in contact with coated glass and then rolled off. Inside-out oriented plasma membrane patches left at the glass surface were first identified with the lipid fluorescent marker FM1-43 and then scanned by AFM. Membrane patches exhibiting the typical phospholipid bilayer height of 5 nm showed multiple proteins, protruding from the inner surface of the membrane, with heights of 5 to 20 nm. Modelling plasma membrane proteins as spherical structures embedded in the lipid bilayer and protruding into the cytoplasm allowed an estimation of the respective molecular masses. Proteins ranged from 35 to 2,000 kDa with a peak value of 280 kDa. The most frequently found membrane protein structure (40/μm2) had a total height of 10 nm and an estimated molecular mass of 280 kDa. Membrane proteins were found firmly attached to the poly-L-lysine coated glass surface while the lipid bilayer was found highly mobile. We detected protein structures with distinguishable subunits of still unknown identity. Since X. laevis oocyte is a generally accepted expression system for foreign proteins, this method could turn out to be useful to structurally identify specific proteins in their native environment at the molecular level. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Les marqueurs épigénétiques, en particulier la méthylation de l’ADN des gènes soumis à empreinte parentale, sont sensibles aux changements environnementaux. Les techniques de l’aide médicalisée à la procréation (AMP) nécessitant la manipulation des gamètes et des embryons in vitro et dans la plupart des cas la stimulation hormonale de l’ovulation des patientes, peuvent interférer avec la reprogrammation et/ou le maintien de la méthylation des gènes soumis à empreinte. Afin d’évaluer ce risque nous avons analysé le profil de méthylation de KvDMR1, qui régule l’expression de KCNQ1OT1, dans des ovocytes humains mûris in vivo ou in vitro, provenant de patientes stimulées ou non. Nos résultats montrent que la mise en place de la méthylation au niveau de KvDMR1 se poursuit au cours de la maturation de l’ovocyte après reprise de la méiose, in vivo et in vitro et que la superovulation des patientes en AMP génère des ovocytes épigénétiquement immatures. Par ailleurs, l’étude de la méthylation de KvDMR1 et de H19 DMR (qui régule l’expression d’Igf2 et H19) dans des embryons issus d’ICSI, évolutifs ou présentant un défaut de développement, n’établit pas de lien entre les dérégulations de l’empreinte et l’arrêt du développement embryonnaire au stade blastocyste. / Epigenetic modifications, particularly DNA methylation of imprinted genes are sensible to environment. Techniques of assisted reproduction require in vitro manipulation of gamete and embryos and currently superovulation of patients. These technologies may interfere with eprogramming and maintenance of methylation at imprinted genes. To evaluate such a risk, we have determined the methylation profile of KvDMR1, the region that regulates KCNQ1OT1 imprinted gene, in human oocytes retrieved from stimulated or unstimulated cycles, at different phases of their maturation in vivo or in vitro. Our results show that the timing of establishment of the methylation profile of KvDMR1 covers the maturation phase of 199 oocyte growth, in vivo and in vitro, and that hyperstimulation likely recruits young follicles epigenetically immature. Analysis of the methylation profile of KvDMR1 and H19DMR (DMR of IGF2/H19) in ICSI embryos suggests that imprinting disorders are not responsible of embryo developmental failure prior the blastocyst stage

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À partir des ovocytes de la palourde Spisula solidissima, un ADNc codant un récepteur nommé Spi-OAR a été cloné et séquencé. Une analyse de la séquence en acides aminés a indiqué que ce nouveau récepteur possède une forte similarité avec les récepteurs β-adrénergiques et les récepteurs à octopamine. En effet, il est étroitement lié à la classe des récepteurs à octopamine « β-adrénergique-like » couplés à une protéine Gs. L’ADNc de Spi-OAR a été introduit dans un vecteur d'expression (pCEP4) et un épitope reconnaissable par un anticorps commercial a été ajouté au segment N-terminal. Cette construction a été transfectée dans des cellules hôtes (HEK 293) et des études d’immunofluorescence ont montré une expression efficace du récepteur au niveau membranaire. Également, des mesures d'AMPc pour les cellules exprimant Spi-OAR ont révélé une augmentation de ce messager secondaire lors de l'ajout de l'octopamine, et dans une moindre mesure, la tyramine, tandis que la dopamine, la sérotonine et l'histamine n’ont engendré aucun effet. Une légère activité constitutive de ce récepteur dans les cellules hôtes a été observée. De plus, une analyse RT-PCR avec des oligonucléotides spécifiques a révélé l'ARNm de Spi-OAR non seulement dans les ovocytes, mais aussi dans les gonades, le cœur, les muscles adducteurs, les branchies et les ganglions suggérant que ce récepteur soit exprimé de façon ubiquitaire dans divers tissus et dans différents stades embryonnaires chez la palourde. En outre, des études avec des ovocytes isolés n'ont montré aucun effet de l’octopamine sur la réactivation méiotique. Des études éventuelles pourront finalement confirmer le rôle fonctionnel de Spi-OAR. / A cDNA encoding for an octopamine receptor named Spi-OAR was cloned and sequenced from the surf clam Spisula solidissima oocytes. An analysis of its predicted amino acid sequence showed a high degree of similarity with β-adrenergic and octopamine receptors. This receptor qualifies as a novel receptor closely related to the proposed class of insect octopamine « β-adrenergic–like » receptors coupled to Gs protein. This cDNA was introduced into an expression vector (pCEP4), with an added N-terminal FLAG tag sequence, and transfected in host cells (HEK 293). Immunofluorescence studies showed expression of the receptor with a proper localization to the plasma membrane. Measurements of cAMP in transfected cells revealed that addition of octopamine, and to a lower extent, tyramine induced a rise in cAMP while dopamine, serotonine and histamine had no effect. Overexpression of Spi-OAR in mammalian cells induced slight constitutive increase of cAMP. An RT-PCR analysis with specific oligonucleotides revealed the presence of the receptor mRNA not only in oocytes but also in whole gonads, heart, adductor muscle, gills and ganglia suggesting that this receptor is likely ubiquitously expressed. Expression of Spi-OAR was also detected at different embryonic stages. Despite the demonstrated expression of Spi-OAR in oocytes, octopamine had no effect on meiotic reinitiation. Further studies will examine the function of Spi-OAR.