A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos é uma das biotécnicas de reprodução que mais evoluíram nas últimas duas décadas. No Brasil, a associação com a técnica de aspiração folicular guiada por ultra-som determinou uma significativa disseminação do uso comercial da PIV. A produção em larga escala de embriões PIV associada à dificuldade em criopreservá-los, determinou que um número significativo desses embriões passasse a ser descartado nas atividades de campo, gerando prejuízos aos produtores e técnicos envolvidos no processo. Os experimentos realizados no âmbito desta tese tiveram como objetivo identificar e propor soluções para um aproveitamento mais eficiente dos ovócitos e embriões PIV. Em virtude da qualidade dos embriões poder ser influenciada pelo sistema de produção in vitro, foi realizado um experimento (Capítulo 1) para determinar a capacidade dos embriões derivados de dois sistemas de PIV em resistir à vitrificação. Entretanto, nas condições testadas, não foram verificadas influências significativas do efeito do sistema de PIV. No segundo experimento (Capítulo 2), buscou-se identificar a influência da solução crioprotetora sobre a taxa de sobrevivência embrionária in vitro e in vivo. Os resultados obtidos revelaram um efeito significativo da solução de vitrificação sobre a sobrevivência in vitro, por outro lado as taxas de prenhez foram semelhantes. Estes resultados também comprovaram a viabilidade do método de transferência direta desenvolvido neste experimento. Finalmente, em um terceiro grupo de experimentos (Capítulo 3), foi determinada a viabilidade da vitrificação de ovócitos imaturos usando duas estratégias de resfriamento. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos. Entretanto, a obtenção de produtos nascidos de embriões vitrificados, derivados de ovócitos imaturos vitrificados, confirma a viabilidade de criopreservação desses ovócitos como alternativa para programação das atividades de PIV. / The in vitro production (IVP) of bovine embryos has achieved an important development during the last two decades. In Brazil the large scale use of the follicular aspiration guided by ultrasonography has determined a significant improvement in the in vitro embryo production as a commercial tool. The difficulties to cryopreserve bovine oocytes and IVP embryos are at the moment the greatest barrier impairing the efficient application of this reproductive biotechnology which results in the disposal of large numbers of bovine IVP embryos. Considering these factors, this Thesis aimed to highlight new approaches to reduce embryo disposal and improve the pregnancies rates after the cryopreservation of bovine immature oocytes and IVP blastocysts. The first experiment (Chapter 1) was designed to observe the cryotolorance of embryos produced by two different IVP systems. The tested in-vitro systems did not show differences in the cryotolerance by in vitro production system. A second experiment (Chapter 2), was carried out to determine in vitro and in vivo embryo survival rates of IVP blastocysts cryopreserved using different vitrifications solutions. The results showed a significant vitrification solution effect on in vitro survival, however, when in vivo, the pregnancy rates were not different. This experiment also verified the feasibility of the direct transfer method for vitrified embryos. Finally, in a third experiment (Chapter 3) the viability of the vitrification of immature oocytes was determined using two cooling strategies. Differences among the treatments were not observed. However, calves born from the transfer of vitrified embryos, derived from vitrified immature oocytes, highlighted that the increase in cryopreservation efficiency of immature oocytes may be an important alternative to improve the IVP commercial application.

Chez la vache Prim’Holstein, un QTL de fertilité a été localisé sur le chromosome 3, et deux haplotypes ont été déterminés : « Fertil+ » et « Fertil- ». Les « Fertil- » ont un plus fort taux d’échec de gestation précoce. Le 1er objectif de cette thèse était de déterminer si un dysfonctionnement des complexes ovocyte-cumulus (COC) pouvait expliquer l’échec précoce de gestation chez les « Fertil- ». L’analyse révèle un retard de maturation, une dérégulation de gènes appartenant aux voies des prostaglandines et des MAPK, et à la famille des Tribbles dans les CC ou l’ovocyte des « Fertil- ». Trois gènes composent la famille des Tribbles chez le bovin: TRIB1, TRIB2 et TRIB3, leur fonction est indéterminée dans le COC. Le 2nd objectif était de caractériser le patron d’expression des Tribbles et leur(s) fonction(s) au sein du COC bovin. Les Tribbles joueraient un rôle dans le métabolisme lipidique et l’inflammation au niveau folliculaire. Le métabolisme lipidique au sein du COC bovin étant peu caractérisé, le 3ème objectif était d’appréhender les profils des gènes du métabolisme des acides gras (AG) dans les CC au cours de la maturation. Ainsi, les CC expriment les gènes lipotytiques et lipogéniques. Enfin, la β-oxydation des AG est une fonction primordiale pour la maturation ovocytaire. / In Prim’Holstein cow, a fertility QTL was localized on chromosome 3 and two haplotypes were determined: « Fertil+ » and « Fertil- ». « Fertil- » have a higher early pregnancy failure rate. The 1st objective of the thesis was to define if complex oocyte-cumulus COC dysfunction could explain the early pregnancy failure in « Fertil- ». Analysis highlighted a maturation delay, a dysregulation of genes involved in prostaglandin and MAPK pathway along with one member of the Tribbles family in « Fertil- » CC or oocyte. In bovine, the Tribbles family is composed of three genes: TRIB1, TRIB2 and TRIB3, their function is unknown within the COC. The 2nd objective was to characterize the Tribbles expression pattern and their function in the bovine COC. The tribbles might play a role in lipid metabolism and in inflammation at the follicular level. Lipid metabolism within bovine COC is poorly understood, thus the third objective was to apprehend fatty acid (FA) genes pattern in CC during maturation. Thus, CC express lipolytic and lipogenic genes. Lastly, FA β oxidation is found to be important for oocyte maturation.

A vitrificação de ovócitos pode ser de grande auxílio na manutenção genética após a morte e na pesquisa científica preservando ovócitos em diferentes estágios de maturação. Esta técnica é uma biotecnologia pouco utilizada na espécie equina devido às baixas taxas de viabilidade celular após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar a expressão de genes ligados a viabilidade celular e apoptose em complexos cúmulus ovócitos (CCOs) antes e após à vitrificação. Com este propósito, folículos entre 5 a 30 mm foram aspirados e 240 CCOs imaturos foram recuperados em abatedouro localizado em São Gabriel, RS, durante a estação reprodutiva. Os CCOs foram divididos em dois grupos: não vitrificados (n=120) e vitrificados (n=120). O protocolo de vitrificação foi realizado de acordo com método comercial EquiPro-VitKit (Minitube-Alemanha). Após vitrificação, CCOs foram mantidos em meio de maturação in vitro durante 6 horas e avaliados imediatamente. Os genes utilizados para análise de viabilidade dos CCOs foram: “bone morphogenetic protein” 15 (BMP 15); bcl-2- “like protein” 4 (BAX); Caspase 3 (CASP 3) e GAPDH (controle). A análise gênica foi realizada através do método de real-time PCR quantitativo (qRT-PCR). Foi observada diferença na expressão de mRNA do gene BAX (0.85 ± 0.08) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.05 ± 0.47; P = 0.03). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do BMP15 (1.55 ± 0.73) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.84 ± 2.20; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Em conclusão, os resultados observados na expressão de BMP15 sugerem a permanência da viabilidade celular em CCOs equinos, porém, BAX sugere a ativação do processo de apoptose nas células expostas ao processo de vitrificação. / Oocyte vitrification is a modern technique that can be used to ensure genetic maintenance after animal death and to improve oocyte cryopreservation at different stages of maturation. Equine oocyte vitrification is a biotechnology rarely used in horses due to the low post-cryopreservation cell viability. The aim of this study was to determine the expression of genes linked to cell viability and apoptosis in equine cumulus-oocyte complexes (COCs) prior and after vitrification. With this purpose, 5 to 30 mm ovarian follicles were aspirated and 240 COCs were collected from a slaughterhouse in Southern Brazil during breeding season. The COCs were divided into two groups: non-vitrified control COCs (CON, n=120) and vitrified oocytes (VIT, n=120). Vitrification protocol was provided according to a commercially available method from EquiPro-VitKit. After vitrification, COCs were in vitro matured for 6 hours and immediately evaluated. Genes product abundance were: Bone morphogenetic protein 15 (Bmp 15); Bcl-2-associated X protein (Bax); Caspase 3 (Casp 3); and GAPDH (control). The gene expression analysis was performed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Difference was observed in COCs mRNA abundance for Bax gene from non-vitrified (0.85 ± 0.08) compared to vitrified (2.05 ± 0.47; P = 0.03). No difference was observed in the COCs mRNA abundance for Bmp 15 from non-vitrified (1.55 ± 0.73) compared to vitrified (2.84 ± 2.20; P > 0.05). There was no difference in mRNA abundance for Casp 3 in non-vitrified (0.63 ± 0.20) compared to vitrified (0.64 ± 0.01; P > 0.05). In conclusion, results demonstrate that Bmp 15 expression in vitrified COCs indicate cell viability; however, Bax suggest the activation of apoptosis cascade in cells exposed to vitrification process.

A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos é uma das biotécnicas de reprodução que mais evoluíram nas últimas duas décadas. No Brasil, a associação com a técnica de aspiração folicular guiada por ultra-som determinou uma significativa disseminação do uso comercial da PIV. A produção em larga escala de embriões PIV associada à dificuldade em criopreservá-los, determinou que um número significativo desses embriões passasse a ser descartado nas atividades de campo, gerando prejuízos aos produtores e técnicos envolvidos no processo. Os experimentos realizados no âmbito desta tese tiveram como objetivo identificar e propor soluções para um aproveitamento mais eficiente dos ovócitos e embriões PIV. Em virtude da qualidade dos embriões poder ser influenciada pelo sistema de produção in vitro, foi realizado um experimento (Capítulo 1) para determinar a capacidade dos embriões derivados de dois sistemas de PIV em resistir à vitrificação. Entretanto, nas condições testadas, não foram verificadas influências significativas do efeito do sistema de PIV. No segundo experimento (Capítulo 2), buscou-se identificar a influência da solução crioprotetora sobre a taxa de sobrevivência embrionária in vitro e in vivo. Os resultados obtidos revelaram um efeito significativo da solução de vitrificação sobre a sobrevivência in vitro, por outro lado as taxas de prenhez foram semelhantes. Estes resultados também comprovaram a viabilidade do método de transferência direta desenvolvido neste experimento. Finalmente, em um terceiro grupo de experimentos (Capítulo 3), foi determinada a viabilidade da vitrificação de ovócitos imaturos usando duas estratégias de resfriamento. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos. Entretanto, a obtenção de produtos nascidos de embriões vitrificados, derivados de ovócitos imaturos vitrificados, confirma a viabilidade de criopreservação desses ovócitos como alternativa para programação das atividades de PIV. / The in vitro production (IVP) of bovine embryos has achieved an important development during the last two decades. In Brazil the large scale use of the follicular aspiration guided by ultrasonography has determined a significant improvement in the in vitro embryo production as a commercial tool. The difficulties to cryopreserve bovine oocytes and IVP embryos are at the moment the greatest barrier impairing the efficient application of this reproductive biotechnology which results in the disposal of large numbers of bovine IVP embryos. Considering these factors, this Thesis aimed to highlight new approaches to reduce embryo disposal and improve the pregnancies rates after the cryopreservation of bovine immature oocytes and IVP blastocysts. The first experiment (Chapter 1) was designed to observe the cryotolorance of embryos produced by two different IVP systems. The tested in-vitro systems did not show differences in the cryotolerance by in vitro production system. A second experiment (Chapter 2), was carried out to determine in vitro and in vivo embryo survival rates of IVP blastocysts cryopreserved using different vitrifications solutions. The results showed a significant vitrification solution effect on in vitro survival, however, when in vivo, the pregnancy rates were not different. This experiment also verified the feasibility of the direct transfer method for vitrified embryos. Finally, in a third experiment (Chapter 3) the viability of the vitrification of immature oocytes was determined using two cooling strategies. Differences among the treatments were not observed. However, calves born from the transfer of vitrified embryos, derived from vitrified immature oocytes, highlighted that the increase in cryopreservation efficiency of immature oocytes may be an important alternative to improve the IVP commercial application.

A vitrificação de ovócitos pode ser de grande auxílio na manutenção genética após a morte e na pesquisa científica preservando ovócitos em diferentes estágios de maturação. Esta técnica é uma biotecnologia pouco utilizada na espécie equina devido às baixas taxas de viabilidade celular após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar a expressão de genes ligados a viabilidade celular e apoptose em complexos cúmulus ovócitos (CCOs) antes e após à vitrificação. Com este propósito, folículos entre 5 a 30 mm foram aspirados e 240 CCOs imaturos foram recuperados em abatedouro localizado em São Gabriel, RS, durante a estação reprodutiva. Os CCOs foram divididos em dois grupos: não vitrificados (n=120) e vitrificados (n=120). O protocolo de vitrificação foi realizado de acordo com método comercial EquiPro-VitKit (Minitube-Alemanha). Após vitrificação, CCOs foram mantidos em meio de maturação in vitro durante 6 horas e avaliados imediatamente. Os genes utilizados para análise de viabilidade dos CCOs foram: “bone morphogenetic protein” 15 (BMP 15); bcl-2- “like protein” 4 (BAX); Caspase 3 (CASP 3) e GAPDH (controle). A análise gênica foi realizada através do método de real-time PCR quantitativo (qRT-PCR). Foi observada diferença na expressão de mRNA do gene BAX (0.85 ± 0.08) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.05 ± 0.47; P = 0.03). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do BMP15 (1.55 ± 0.73) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.84 ± 2.20; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Em conclusão, os resultados observados na expressão de BMP15 sugerem a permanência da viabilidade celular em CCOs equinos, porém, BAX sugere a ativação do processo de apoptose nas células expostas ao processo de vitrificação. / Oocyte vitrification is a modern technique that can be used to ensure genetic maintenance after animal death and to improve oocyte cryopreservation at different stages of maturation. Equine oocyte vitrification is a biotechnology rarely used in horses due to the low post-cryopreservation cell viability. The aim of this study was to determine the expression of genes linked to cell viability and apoptosis in equine cumulus-oocyte complexes (COCs) prior and after vitrification. With this purpose, 5 to 30 mm ovarian follicles were aspirated and 240 COCs were collected from a slaughterhouse in Southern Brazil during breeding season. The COCs were divided into two groups: non-vitrified control COCs (CON, n=120) and vitrified oocytes (VIT, n=120). Vitrification protocol was provided according to a commercially available method from EquiPro-VitKit. After vitrification, COCs were in vitro matured for 6 hours and immediately evaluated. Genes product abundance were: Bone morphogenetic protein 15 (Bmp 15); Bcl-2-associated X protein (Bax); Caspase 3 (Casp 3); and GAPDH (control). The gene expression analysis was performed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Difference was observed in COCs mRNA abundance for Bax gene from non-vitrified (0.85 ± 0.08) compared to vitrified (2.05 ± 0.47; P = 0.03). No difference was observed in the COCs mRNA abundance for Bmp 15 from non-vitrified (1.55 ± 0.73) compared to vitrified (2.84 ± 2.20; P > 0.05). There was no difference in mRNA abundance for Casp 3 in non-vitrified (0.63 ± 0.20) compared to vitrified (0.64 ± 0.01; P > 0.05). In conclusion, results demonstrate that Bmp 15 expression in vitrified COCs indicate cell viability; however, Bax suggest the activation of apoptosis cascade in cells exposed to vitrification process.

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In the first study, we characterized an in vitro culture system able to delaying meiosis resumption of bovine oocytes. Firstly, we demonstrated that the use of an EGFR inhibitor (AG1478; 5μM) in a culture system with follicular hemisections (FHS) was effective to maintain 89.3% of the oocytes in germinal vesicle stage (GV) during 15 h. This blocking effect was dependent on the FHS, since in its absence only 40% of the oocytes remain in GV stage. The meiosis blockage was totally reversible, since the oocytes reached matured stages after an additional 18 and 20 h maturation period and were able to support the embryonic development after in vitro fertilization. Regarding the molecular profile of the cells involved in the blocking system, we did not observe treatment effect on mRNA expression of the genes evaluated in oocyte. However, in cumulus cells, whereas the expression of EGR-1, TNFAIP6 and HAS2 was inhibited by AG1478 treatment, the expression of CX43 and IMPDH1 was decreased by FHS influence. Moreover, in the granulosa cells we observed a downregulation in the expression levels of PGR and ADAMTS1 by AG1478 treatment. The Western blot data revealed that the treatment with AG1478 plus FHS induces a downregulation in p-ERK1/2 protein abundance. In the next experiment, we verified that the AngII or PGE2 and PGF2α did not reverse the inhibitory effect of AG1478 plus FHS on meiosis resumption. In conclusion, findings from this study revealed an effective and reversible system to prevent meiosis resumption of bovine oocytes. In the second study, we investigate the role of mTOR system and its relation with LH regulated genes during preovulatory period in cattle. Using an in vivo model, we demonstrated mTOR kinase activity in granulosa cells 3 and 6 h after induction of ovulation with GnRH. In the similar moments (3 h after GnRH), we observed an increase in p-ERK1/2, STAR and EGR1 protein abundance. The inhibition of mTOR kinase activity by intrafollicular injection of rapamycin did not alter the ovulation rate. However, the treatment of granulosa cells in vitro with rapamycin interrupted the LH-induced increase in EREG mRNA levels. Moreover, the effect of rapamycin in culture was proved by inhibiting the p-P70S6K protein levels. In the same Western blot analysis, we verified that rapamycin may be inducing AKT activity and did not alter Phospho-ERK1/2 status and EGR1 protein abundance. These results provided the first evidence in cattle that mTOR system is upregulated by LH at time points similar to p-ERK1/2, STAR and EGR1. In addition, the mTOR inhibition data contribute to suggest an AKT dependent pathway during ovulation process, in which occurs ERK1/2 activation in a pathway independent of EREG, AREG and PTGS2 mRNA levels. / O primeiro estudo caracterizou um modelo in vitro de bloqueio do reinício da meiose de oócitos bovinos. Em um primeiro momento, demonstramos que o uso de um inibidor dos EGFR (AG1478; 5μM) em um sistema de cultivo com metades foliculares (FHS) foi eficiente para manter 89,3% dos oócitos em vesícula germinativa durante 15 h. Esse efeito de bloqueio foi dependente das FHS uma vez que na sua ausência apenas 40% dos oócitos permanecem em vesícula germinativa. O sistema de bloqueio foi totalmente reversível, tendo em vista que os oócitos completaram a maturação após um período adicional de 18 e 20 h, e suportaram o desenvolvimento embrionário subsequente após fertilização in vitro. Quanto ao perfil molecular das células envolvidas no bloqueio, no oócito não foi verificado efeito do tratamento na expressão dos genes avaliados. Entretanto, nas células do cumulus, enquanto a expressão de EGR1, TNFAIP6 e HAS2 foi diminuída pelo tratamento com AG1478, a expressão de CX43 e IMPDH1 foi diminuída pela influência das FHS. Além disso, nas células da granulosa observamos uma diminuição nos níveis de expressão de PGR e ADAMTS1 pelo tratamento com AG1478. Os dados de Western blot nos mostraram que a abundância de p-ERK1/2 diminui em decorrência do tratamento com AG1478 associado as FHS. Posteriormente, verificamos que o efeito inibitório do AG1478 juntamente com as FHS não foi revertido pelo tratamento com AngII ou PGs. Em conclusão, este estudo propõem um modelo efetivo e reversível para o bloqueio do reinício da meiose de oócitos bovinos. Em um segundo estudo, investigamos o papel do sistema mTOR e sua relação com genes regulados pelo LH durante o período pré-ovulatório em bovinos. Utilizando um modelo in vivo, demonstramos que ocorre um aumento na atividade do mTOR em células da granulosa 3 e 6 h após indução da ovulação com GnRH. Em momentos similares (3 h após GnRH) ocorreu maior abundância proteica para p-ERK1/2, STAR e EGR1. Ao injetar rapamicina no ambiente intrafolicular in vivo, não foram observadas alterações nas taxas de ovulação. Entretanto, o uso da rapamicina em cultivo in vitro de células da granulosa inibiu a expressão de RNAm para EREG induzida pelo LH. Além disso, os dados de cultivo comprovaram o efeito da rapamicina em bloquear a atividade do mTOR, caracterizada pela abundância proteica de p-P70S6K, induzir um provável aumento na abundância de p-AKT e não alterar os níveis de p-ERK1/2 e EGR1. Esses resultados fornecem a primeira evidência em bovinos que o sistema mTOR é regulado positivamente pelo LH em momentos similares a p-ERK1/2, STAR e EGR1. Além disso, os dados de inibição do mTOR contribuem para sugerir uma outra rota para a ovulação controlada pela p-AKT, na qual ocorre ativação de ERK1/2 em uma via independente dos níveis de expressão de EREG, AREG e PTGS2.

The aim of this study was test the effect of Cordicepim (CY), an inhibitor of mRNA translation, associate with growth factor (IGF-I), in the presence or absence of Roscovitina (Ros), a mitogen promoting factor blocker. Twelve hours in culture media with CY plus 18 or 24 hours of maturation resulted in an average of 80% of oocytes reaching metaphase II. The blastocyst yield after 12 hours culture media with CY plus 18 hours of maturation without inhibition (32.3%) was similar (P>0.05) to the control group (39.6%). A negative effect of Ros on blastocyst yield was observed when not associated to CY, (16.7% in Ros vs 49% in control group). When the concentration of Ros associated with CY was reduced, the blastocyst yield was lower (8.3%) compared with the control group (36.4%). Transmission electron microscopy evaluation showed characteristics like a mature oocyte but also some characteristics of immature oocyte after 12 hours of inhibition. In conclusion, the temporary exposure of bovine oocytes to CY associated with IGF-I during in vitro maturation allowed an increase in culture time with no effect on cytoplasm ultra-structure and blastocyst yield, associated or not with Roscovitina / O objetivo desse trabalho foi testar o efeito do Cordicepim (CY), um bloqueador da tradução do RNAm, na maturação citoplasmática do oócito bovino juntamente a um fator de crescimento (IGF-I), associado ou não ao Roscovitina (Ros), um bloqueador do fator promotor da mitose. Doze horas em cultivo com CY seguidos de 18 ou 24 horas de maturação foi suficente para que 80% dos oócitos, em média, atingissem metáfase II. A produção de blastocisto após 12 horas de cultivo em meio com CY seguido de 18 horas (32,3%) de cultivo livre de inibição não apresentou diferença significativa em relação ao grupo controle (39,6%; P>0,05). Um efeito negativo do Ros na produção de blastocistos foi observado quando não associado ao CY (16,7% e 49% de blastocistos, respectivamente). A diminuição na concentração de CY e Ros, quando associados, causou uma queda na produção de blastocisto (8,3% e 36,4% de blastocistos, respectivamente). Utilizando técnica de microscopia eletrônica de transmissão foi possível observar que o cultivo por 12 horas em CY manteve o oócito com algumas características de imaturo, porém com acúmulo e atividades de algumas organelas característico de oócito maturo. Em conclusão, a exposição temporária de oócitos bovinos ao CY associado ao IGF-I, durante a maturação in vitro, permite um aumento no tempo de cultivo, sem afetar a ultra-estrutura citoplasmática do oócito e sem afetar os índices de desenvolvimento embrionário, associado ao Roscovitina ou não

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-11-23Bitstream added on 2014-06-13T20:24:31Z : No. of bitstreams: 1 borgesjunior_e_dr_botfm.pdf: 275485 bytes, checksum: 68fdbf94b0908ce788462bae7d5d1161 (MD5) / Cpdp - Centro Paulista de Pesquisa e Diagnostico / Desde o primeiro relato de sucesso em humanos, a Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide (ICSI) tem sido particularmente indicada para casos de alterações seminais graves, sendo já demonstrada uma relação diretamente proporcional entre os resultados deste procedimento e a qualidade seminal. Tem sido sugerido que a incapacidade de o espermatozóide iniciar a ativação oocitária seja uma das principais causas de falha de fertilização após a ICSI. Estudos prévios identificaram o cálcio como um importante segundo mensageiro durante a ativação oocitária e que o tratamento com ionoforo do calcio e capaz de favorecer a ativação oocitária, resultando em fertilização, desenvolvimento embrionário e gestações normais. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da Ativação Oocitária Artificial (AOA) com ionoforo do calcio A23187 em ciclos de ICSI quando utilizados espermatozóides de diferentes origens. Foram avaliados 314 ciclos de ICSI divididos em tres Grupos: EJACULADO (n = 92), EPIDIDIMARIO (n = 82) e TESTICULAR (n = 140), sendo cada um deles dividido em subgrupos, dependendo da realizacao (Subgrupo AOA) ou nao de AOA (Subgrupo Controle . CT). Foram avaliados tambem separadamente os ciclos de mulheres com idade inferior a 36 anos, objetivando minimizar o efeito da idade sobre os resultados dos tratamentos. Para a ativação oocitária, os oócitos foram mantidos por 30 minutos apos a ICSI em meio de cultivo para AOA, contendo 5ÊM de ionoforo de calcio A23187 e em aproximadamente 20 horas a fertilizacao foi confirmada pela presenca de 2 Pro-Nucleos. Para cada grupo experimental foram comparados, entre os Subgrupos AOA e CT, os seguintes parametros: taxa de fertilizacao normal, taxa de falha parcial de fertilizacao, porcentagem de bons embrioes no dia da transferencia, taxa de gestacao clinica, taxa de implantacao e taxa de abortamento... / Since the first report of a birth after ICSI, it has been specially used for severe male factor of infertility and it was demonstrated that the semen quality influences the ICSI outcomes. Previous studies suggested that failure of fertilization after ICSI may be due to a spermatozoa inability in trigger the oocyte activation. Calcium has long been identified as a universally important second messenger during oocyte activation and many studies demonstrated that treatment with calcium ionophore may increase the free intracellular calcium, promoting oocyte activation, resulting in fertilization, embryo development and pregnancies. The aim of this study was to evaluate the effect of artificial oocyte activation (AOA) with calcium ionophore A23187 in ICSI cycles using sperm from different origins. It was evaluated 314 ICSI cycles divided in groups according to the origin of spermatozoa: EJACULATED group (n = 92), EPIDIDYMAL group (n = 82) and TESTICULAR group (n = 140). Each group was split into sub-groups depending on the AOA treatment: sub-group AOA, when it was performed AOA and sub-group Control-CT, when it was not performed AOA. Furthermore, it was evaluated separately only cycles in each woman were younger then 36 years old. After ICSI, oocytes were incubated in culture medium containing calcium ionophore A23187 (5ìM concentration) for 30 minutes and in approximately 20 hours oocytes were checked for normal fertilization, defined as observation of two distinct pronucleous. For each experimental group the following parameters were compared between the sub-groups AOA and CT: normal fertilization rate; partial fertilization fail rate; percentage of high quality embryos on the transfer day; implantation rate; pregnancy rate and miscarriage rate. For all the evaluated parameters, it was not observed any significant difference between the subgroups for the three spermatozoa origin groups.... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-12-19Bitstream added on 2014-06-13T19:24:36Z : No. of bitstreams: 1 niciura_scm_dr_jabo.pdf: 1029270 bytes, checksum: 8a93cc4207fdb3426be68df4fa064ef9 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A maturação oocitária é marcada pela retomada da primeira divisão da meiose, com progressão do estádio de Vesícula Germinativa (GV) da Prófase I até a Metáfase II (MII), e inclui todos os eventos necessários para que o oócito expresse seu potencial máximo de desenvolvimento após a fecundação. Para avaliarmos a eficiência da maturação in vitro (MIV), utilizamos oócitos classificados em viáveis (graus I, II e III) e inviáveis (atrésico e desnudo), e acompanhamos a progressão nuclear e a distribuição dos grânulos corticais (GC) como indício de maturação citoplasmática, após MIV em TCM 199 com soro fetal bovino, hormônios, antibiótico e piruvato, por 24h em 5% de CO2 em ar. Maturação nuclear (78,4-87,8%) e citoplasmática (GC periféricos; 67,2-79,3%) foram semelhantes entre as diferentes classes de oócitos e apresentaramse como eventos independentes. Para o acompanhamento dos eventos desencadeados pelo espermatozóide, avaliamos a dinâmica nuclear e de microtúbulos, em intervalos de 2h, após fecundação in vitro (FIV), em meio TALP com heparina, PHE e sêmen preparado em gradiente de Percoll. Observamos que o estádio de MII foi predominante de 2 a 8h; MII e Anáfase/Telófase (A/T) predominaram às 10h; MII, A/T e estádio pronuclear (PN) de 14 a 16h; e PN a partir de 18h. A penetração do espermatozóide ocorreu após 4h da inseminação dos oócitos; a diferenciação dos PN 14 masculino e feminino pelo tamanho foi possível de 14 a 18h e a singamia ocorreu a partir de 24h. O período de 10h pode ser suficiente para que a FIV seja efetiva em oócitos bovinos, nas condições aqui descritas. / We aimed to evaluate events involved in in vitro maturation, fertilization and development, and parthenogenetic activation of bovine oocytes assessed by nuclear-cytoplasmic interaction and gene expression. Oocyte morphological selection did not affect nuclear maturation (78.4-87.8%) and cytoplasmic cortical granule distribution (67.2-79.3%). Following nuclear and microtubular dynamics after fertilization (IVF), we observed sperm penetration 4h after insemination; male and female pronuclei differentiation by size from 14 to 18h; syngamy after 24h; and sufficient co-incubation of spermatozoa and oocytes for 10h. Pronuclear transfer to study the interaction between nucleus (N) and cytoplasm (C) in parthenogenetic embryos produced by ionomycin followed by strontium (S) or 6-DMAP (D) was assessed by cleavage, eight-cell, and blastocyst development rates: CSND (76.5, 36.4, and 6.8%) and CDNS (69.5, 25.0, and 4.9%). S cytoplasm promoted dominant effect on D nucleus. Higher rates of developmental arrest up to the eight-cell stage were observed by the combination of cytoplasm and nucleus produced by the two different activation treatments. We recovered parthenogenetic D fetuses on Day 35, which were small but normal in formation and in appearance of chorio-alantoic membranes. Genomic imprinting of IGF2 was observed, but XIST was maternally expressed in extra-embryonic tissues. In vitro culture promoted higher expression of IGF2 and H19 genes and also increased IGF2/IGF2r ratio in IVF embryos compared to in vivo produced ones.